Validação de Métodos Bioanalíticos para

Estudos em Humanos

Sumário

• Introdução

• Padrões

• Pré-Estudo

• Estudo

• Documentação

Introdução

Estudos Aplicáveis:• Farmacologia Clínica• Biodisponibilidade• Bioequivalência

Não Aplicáveis:• Toxicológicos ou

Farmacológicos em animais.

• Dissociação in vitro.

Metodologias

• Cromatografia Líquida de Alta Resolução (HPLC)• Cromatografia Gasosa (GC)• Métodos Imunológicos e Microbiológicos

Matrizes Biológicas• Sangue, • Soro, • Plasma, • Urina e • Outros (Ex: Pele).

HPLC-MS/MS

Padrões• Análise de Drogas ou seus Metabólitos é

invariávelmete feita através de amostras “contaminadas”, curvas de calibração e amostras de controle de qualidade (QC).

• Padrões de Referência autenticados devem ser utilizados no estudo. Preferivelmente o mesmo composto.

• Caso contrário um sal, base, ácido ou éster do composto pode ser usado.

Escolha da Procedência:

• Padrões certificados (U.S.Pharmacopea)

• Padrões disponíveis comercialmente de fontes de conhecida reputação.

• Padrões com pureza documentada, específicamente sintetízados por laboratórios comerciais.

Deflazacort (DFZ) 21-Hydroxy DFZ (21-OH DFZ)

21-Acetate Dexamethazone (21-Ac DXM, I.S.)

O

HO

H H

H O

NO

OH

O

HO

H H

H O

NO

O

O

O

HO

F H

H

OHO

O

O

Pré-Estudo

• Objetivo: Avaliar os parâmetros de desempenho do método.

• Deve ser documentado e conter o desenvolvimento do método.

• Deve ser realizado para cada matriz biológica e cada espécie química estudada.

• Pré-Estudos de validação de um método analítico deve ser realizado com pelo menos 3 lotes da matriz biológica, onde cada lote é coletado de uma fonte diferente.

• Cada lote deve conter:– (1) uma curva de calibração utilizando a matriz pura, matriz +

I.S. e 5 a 8 pontos com a faixa de aplicação do método.

– (2) Amostras de Controle (n 5) de Qualidade de Baixa concentração (QCA) Média concentração e (QCB) Alta concentração (QCC) e Limite de Detecção (LOQ QC).

Parâmetros de Desempenho

• Especificidade• Linearidade - Curva de Calibração • Exatidão, Precisão e Recuperação• Controles de Qualidade (QCs)• Estabilidade

Especificidade

• Especificidade é a capacidade do método analítico em diferenciar e quantificar o analíto na presença de outros constituintes da amostra e refere-se diretamente a capaciadade do método em produzir resposta frente a um único analíto. (Karnes, 1991)

• Análise da matriz biológica de 6 indivíduos são realizadas sob condições controladas, avaliando-se o horário da coleta, ingestão de alimentos, e outros fatores considerados importantes ao método.

• Cada “branco” deve ser avaliado em relação a interferentes, utilizando-se o método de extração proposto e as condições analíticas em questão (HPLC, LC/MS/MS).

• Os resultados são confrontados com os obtidos de uma solução aquosa do analíto em concentrações próximas ao Limite de Quantificação (LOQ).

• Qualquer interferência significativa no tempo de retenção da droga, do metabólitos ou do padrão interno (I.S.) deve ser rejeitado.

• Interferência em mais que 10% o método deve ser alterado para eliminar os interferentes.

• Interferentes na matriz biológica incluem: componentes endógenos, metabólitos, produtos de decomposição e medicação concomitante.

• Nicotina, drogas OTC e seus metabólitos, como cafeína, aspirina, acetoaminofen e ibuprofeno devem ser testados.

• Se mais de um analíto é avaliado, cada um deve ser injetado separadamente.

Blank SampleI.S.

21-OH DFZ

I.S.

21-OH DFZ

21-OH DFZ (1ng/mL) + I.S.

Linearidade: Curva de Calibração

21-OH DFZ

0 100 200 300 4000

100

200

300

400

500

Concentração Teórica (ng/mL)

Co

nce

ntr

açã

o E

xpe

rim

en

tal

(ng

/mL)

r>0.999

21-Hydroxy DFZ (21-OH DFZ)

O

HO

H H

H O

NO

OH

21-Acetate Dexamethazone (21-Ac DXM, I.S.)

O

HO

F H

H

OHO

O

O

100ng/mL

20ng/mL

100L

Razão: 5

O Padrão Interno (I.S.) tem como finalidade

corrigir erros e\ou perdaspor transferências e

pipetagem. Uma vez quesua concentração é conhecida podemos

corrigir a concentração do analito desassociando

o volume.

I.S.

21-OH DFZ

Voluntário 08 - 1:30h após administração

Exatidão, Precisão e Recuperação

Exatidão RuimPrecisão Boa

Exatidão BoaPrecisão Boa

Exatidão RuimPrecisão Ruim

Exatidão BoaPrecisão Ruim

Precisão

Precisão mede a reprodutibilidade de múltiplas medidas e é usualmente descrita como desvio padrão,

erro padrão e intervalo de confiança.

CV% = i = 1

Ni

_ ( x - x )

2

N

_x

100

Exatidão

Exatidão de um método analítico mede o quão próximo um resultado esta do seu valor REAL.

Determinar a exatidão de uma medida geralmente requer a calibração do método analítico com um padão conhecido.

Erro Relativo% = 100 1 - Média Exp.

Valor Teórico

Recuperação

Recuperação de um analíto em um estudo é a resposta obtida deuma quantidade do analito adicionada e recuperada da matrix

biológica e comparada a resposta obtida do padrão puro.A recuperação avalia a eficiência da extração e sua variabilidade.

Embora recuperações próximas de 100% sejam desejáveis, baixas recuperações podem ser utilizadas (50-60%) se forem precisas, exatas

e reprodutíveis. Os experimentos de recuperação devem serrealizados comparando-se os resuldatos de amostras extraidas

a três concentrações diferentes ( alta, média e baixa ) com padrõesnão extraidos que representam 100%.

Estabilidade

• Teste de Longo-Prazo• Curto-Prazo• Freezer and Thaw• Soluções de Estoque e • Auto-Sampler

Critérios de Aprovação:Precisão

• Os CV% do inter-day para os QCs é 15%, e 20% para o LOQ QC, avaliados em um mínimo de 3 lotes.

Critérios de Aprovação:Exatidão

• A média dos valores do inter-day devem ser menores que 15% do valor nominal dos QCs, e não desviar mais que 20% para LOQ QC

Critérios de Aprovação:Sensibilidade

• O menor ponto da curva de calibração aceitável como limite de quantificação (LOQ) do método é aquele com CV% 20% (inter-day).

Critérios de Aprovação:Especificidade

• Respostas de picos interferentes no mesmo tempo de retenção do analíto devem ser menores que 20% da resposta de um LOQ.

• Respostas de picos interferentes no mesmo tempo de retenção do padrão interno (I.S.) devem ser menores que 5% da resposta de um I.S. utilizado nos estudos.

Critérios de Aprovação:Estabilidade

• Teste de Longo-Prazo, Curto-Prazo, Freezer and Thaw, Soluções de Estoque e Auto-Sampler são propostos no SOP e variam de estudo para estudo.

Estudo• O ensaio de todas as amostras de um analito na matriz biológica deve ser realizado em

um período de tempo cujo os dados de estabilidade sejam desponíveis. Em geral, a análise de amostras biológicas pode ser feita em determinações simples, sem a analise de duplicatas ou replicatas se estudo da metodologia tiver variabilidade aceitável como definido pelos dados da validação.

• Isso é utilizado em procedimentos onde as variáveis precisão e exatidão estão dentro dos limites de tolerância aceitávies. Para procedimentos com analitos labeis, onde alta precisão e exatidão são dificeis, análises em duplicata ou triplicata são recomendados para melhor estimar os análitos.

•

• .

• A curva de calibração deve ser gerada para cada analito para ensaiar cada corrida analítica e deve ser usada para calcular a concentração do analito nas amostras de concentração desconhecida na corrida. As amostras contaminadas podem conter mais de um analito. Uma corrida analítica deve possuir todas amostras processadas a serem analisadas como um lote ou um lote composto de amostras de um ou mais voluntários, Controles de Qualidade (QC) e Padrões de Calibração.

• A Calibração deve cobrir o intervalo de concentração esperado para as amostras com adição do LOQ. Estimações das concentrações de amostras por extrapolação na curva de calibração abaixo do LOQ ou acima do maior padrão não são recomendadas. Embora a curva possa ser redefinida ou as amostras com alta concentração possam ser diluidas e analizadas. Todas as amostras do mesmo voluntário deve ser analisada em um único lote.

• Uma vez que o método analítico foi validado para uso rotineiro, sua precisão e exatidão deve ser monitorada regularmente para garantir que o método continua satisfatório. Para atingir este objetivo, um número de QCs deve ser analisados em intervalos baseados no numero total de amostras. Controles de qualidade em duplicata deve ser incorporado em cada corrida. Os resultados dos QC são as bases para aceitar ou rejeitar uma corrida. Pelo menos 4 de 6 devem estar em ±20% dos respectivos valores nominais. 2 de 6 Cs podem estar fora dos valores nominais, mas não na mesma concentação.

Documentação

• A validade de um método analitico deve ser estabelecida e verificada por estudos laboratoriais.

• A documentação da conclusão destes estudos deve ser efetivada no relatório de validação.

• Protocolos que definem um grupo de diretrizes específicas que devem ser seguidas são importantes se os resultados analíticos forem utéis a algum propósito.

• SOPs específicos ou gerais são partes essenciais do método analítico validado.

• Os protocolos analíticos e SOPs devem ser assinados e datados pelo diretor do laboratório e regularmente atualizados.

• Os dados gerados pelos experimentos de pré-estudo devem ser arquivados em um caderno de laboratório. Devem ser assinados pelo supervisor. Estes dados devem estar disponiveis para inspeções e auditorias.

A documentação para o pré-estudo de validação deve conter:

Descrição do método analítico.

Descrição e resultados dos estudos de estabilidade.

Descrição dos experimentos realizados para determinação da

precisão, exatidão, recuperação, especificidade, linearidade,

limite de quantificação e dados relevantes destes estudos.

Tabelas com precisão e exatidão dos intra - e inter-day.

Evidência da pureza das drogas, metabólitos e padrões

internos utilizados nos experimentos de validação.

Modificações do SOP, se houver, e justificação destas.

Documentação do Estudo deve conter:

Curvas de calibração usadas na análise das amostras e intra-dia exatidão e

precisão.

Informações dos valores inter-dia dos QC e dados do inter-dia exatidão e

precisão da curva de calibração e QCs usados para aceitar a corrida.

Protocolo para re-ensaio de amostras que descreve as razões do re-ensaio e os

critérios para aceite destas amostras.

Motivo para falta de amostras.

Critérios de reprovação de amostras para analises em duplicata ( diferenca 15%)

Modificações do SOP, se houver, e justificação destas.

Documentação para submissão às agências solicitantes:

Dados do estudo de pré-validação.

Curvas de calibração, equações e fatores de tranformação

(ex. 1/x2) se houver.

Dados de validação do estudo.

Série completa de cromatogramas de 20% dos voluntários,

com padrões e QCs

Todos SOP, dados obtidos, cálculos de concentração, e re-

ensaio de amostras

Unidade Analítica Cartesius

•Prof. Dr. Gilberto De Nucci•Demian R. Ifa•Eduardo Zappi•Fabiana G. Menezes•Leonardo A. Moraes•Márcio Motta•Mauro Sucupira•Wellington Ribeiro