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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
Co nta cto :Co nta cto : [email protected]
Tesis de Posgrado
Valoración de nistatina residual enValoración de nistatina residual enalimentos aplicando un nuevoalimentos aplicando un nuevo
métodométodo
Cerdán, Carlos Julio
1958
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis FedericoLeloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the correspondingcitation acknowledging the source.
Cita tipo APA:Cerdán, Carlos Julio. (1958). Valoración de nistatina residual en alimentos aplicando un nuevométodo. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_0984_Cerdan.pdf
Cita tipo Chicago:Cerdán, Carlos Julio. "Valoración de nistatina residual en alimentos aplicando un nuevo método".Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1958.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_0984_Cerdan.pdf
CARLOS JULIO CERDAN
UNIVERSIDAD NACIONAL DE BUENOS AIRES
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
VALORACIONy NISTATINA RESIDUAL
E ALIMENTOS APLICANDO U_NNUEVO METODO
TESIS
Para optar al título de:Doctor en Ciencias Químicas(Orientación QuímicaAnalítica).
fijaba? 7FJ/f.’ 98?;
-1958
-1_.
En el presente trabajo se determina un nuevo método, deltipo turbidimétrico, para la valoración de la actividad de la nistatina, antibiótico fungicida obtenido por fermentacion del Streptgmyces neursei,y.se efectúan ensayos de aplicación de la mismaenla conservacion de vegetales, determinandolos valores residualesluego de diferentes tiempos de contacto del antibiótico con esosalimentos.
PARTE EXPERIMENTAL
El trabajo fué desarrollado en la siguiente forma:
PRIMERA PARTE: ENSAYO Y AJUSTE DE UN NUEVO METODO
PARA VALORAR NISTATINA
I.- DETERMINACION PRIMARIA DE LAS CONDICIONES DE ENSAYO.
La idea inicial fué probar la eficacia del germende en,sayo y el medio de cultivo del mismoutilizados para el método de
difusión en agar condicionándolos para obtener un procedimiento rápido para la valoración del antibiótico con lo que se logrará además de rapidez, mayor exactitud y economia (menor número de opengdores,de material, medios, etc.)
FUNDAMENTODEL ENSAYOA DESARROLLAR:Medir el grado de crecimiento
del germen (fiaccharomyces Cerevfáe Amic 9763) en función de distigtas cdbentraciones de antibióticos standard; trazar con las dos variables una curva (curva standard) y leer en ella los valores delgrado de crecimiento obtenidos con la muestra problema los que, mgdiante el cálculo correspondiente, darán la potencia buscada.
-2
133% ‘¡IINACION DE LA CONCENTRACION DE INOCULO Y EL TIEMPO
y; INCUBACION NECESARIO
OBJETO:Determinar si con las condiciones impuestas es posible obtener un crecimiento del germen de ensayo que haga factible la ejecución del método proyectado y elegir las más convenientes.
CONCLUSIONES:a) Las condiciones impuestas permiten el crecimientoadecuado del microorganismo de ensayo.
b) Las condciones elegidas son: concentración de inóculo: 6%;tiempo de incubación 37°C: 3 horas.
II. ELECCION DEL SOLVENTE ABBOPIADO PARA LA DISOLUCIQN;DEL ANTIBIO
TICO A DOSAR.
a) ESTUDIO DE LA MISCIBILIDAD EN AGUA DE LOS POSIBLES SOL
VáNTES A UTILIZAR.OBJETO:Delimitar los solventes en los que se determinarán luego,la solubflidaddel antibiótico.
b) PRUEBA DE LA SOLUBILIDAD DE LA NISTATINA EN LOS SOLVEN
TES ELEGIDOS.
OBJETO:Estudiar comparativamente, dentro de las condiciones requgridas para el ensayo, la disolución del antibiótico en los solventes definidos en el ensayo anterior.
c) INTERFERENCIA EN EL QBJCIMIENTO EQ; GERHEN DE ENSAYO
DE A UELLOS SOLVENTSS AUE CUMPLAN LAS CONDICIONES DE
LOS ITEMS a I b.
OBJETO:Seleccionar aquellos solventes que no modifiquen el normaldesarrollo del germen durante el período de incubación del ensayo.
-3
d) DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE ANTIBIOTICO A UTI
LIZAR EN LOS ENSAYOS.
OBJETO:Determinar si dentro de las limitaciones establecidas en los
apartados anteriore; es posible obtener una concentración de antibiático conveniente, para la realización del ensayo.
' e) ESTABILIDAD DE LA NISTATINA EN LOS SOLVENTES NO INTER
FERENTES.
OBJETO:Elegir el solvente que produzca la menor variación en la agtividad biológica del antibiótico durante el mayortiempo posiblecon lo que se logrará: l) Eliminar del método los errores que se pproducirían por la variación de la potenmadel antibiótico durante el tiempo de ensayo. y 2) Usar la solución standard en más de un
ensayo con las consiguientes ventajas de comparación de datos y ecgnomía.
f) CONTROL DE LA SOLVBILIDAD DEL ANTIBIOTICO EN EL SOLVEN
TE FINALELNTE ELEGIDO.
OBJETO:Asegurar que la nistatina en las conditiones definidas sedisuelve totalmente.
CONCLUSIONBS:De los ensayos realizados se determina:
a) Comosolvente más conveniente la mezcla al 50%de propilenglicolmetanol.
bV
La concentración de la solución de antibiótico a utilizar deberáestar comprendida entre lOO y 200 u/ml.
c) Se establece como tiempo máximo de conserVación de una soluciónstock de concentración 4.000 u/ml de mistatina en el solventeelegido: 3 días.
III.- DETERMINACIONDEÍLAS CONDICIONES DEFINITIVAS DE ENSAYO.
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OBJETO:Considerando las experiencias anteriores, determinar las ccondiciones óptimas de ensayo (concentración de inóculo y tiempode incubación).
CONCLUSIONES:Se confirman las condiciones primarias determinadasanteriormente (concentración de inóculo: 6%y tiempo de incubacióna 37° C:3 horas).
SEGUNDA PARTE: REPRODUCIBILIDAD DEL METODO EN LAS CONDICIO
NES QUE PERMITAN SU APLICACION PARA LA DETERMINACION DE VA
LORES RESIDUALES EN ALIMENTOS.
I.- REPRODUCIBILIDAD DE DATOSv
OBJETO:Determinar si la variación de los resultados obtenidos con
la aplicación del método definido para las condiciones convenientes,está dentro de los límites aceptados para este tipo de ensayos.
CONCLUSIONES:Realizados 188 ensayos individuales se obtiene como
variación máximade las potencias obtenidas un 4,2%. Este valor egtá dentro de lo exigido para este tipo de métodos.
II.- COMPARACIONgDELOS RESULTADOS OBTENIDOS CQNÍEL PRESENQE METO
DO Y EL DE DIFUSIQNgEN PLACAS DE AGAR.
OBJETO:Determinar si los valores de la actividad biológica de lamuestra, resultantes del ensayo de reproducibilidad de datos, concuerdan con los obtenidos con el método de difusión en placas deagar al que se considera comoreferencia por ser el de uso comúnenla actualidad.
CONCLUSIONES:Los resultados obtenidos con los dos métodos son comparables.
-5
TERCERA PARTE: EHSAYOS DE APLICACION DE LA NISTATINA PA
RA LA CONSERVACION TEMPORARIA DE FRUTAS Y HORTALIZAS.- 1
I) EFECTO CONSERVADOR EN ACBLGAJ TOMATE, LIEQN Y UVAS.
OBJETO:Determinar si la aplicación de una solución de nistatina sgbre estos alimentos tiene algún efecto benéfico en su conservación.
CONCLUSIONES:Se determina una evidente acción conservadora del an
tibiótico en tomate y limón en los quek luego de un tratamiento conuna solución de lOOppmde nistatina, no se observó la aparición dehongos contaminantes hasta 4 a 5 dias después de su aparición en loscontroles. En uva, en casi todos los ensayos, las frutas tratadasse mantuvieron alrededor de ldia más que en los controles sin pre
sentar aparición de hongos siendo además en ellas la cantidad de contaminantes menor.
II) VALORACÉQE DEL ANTIBIOTICO RESIDUAL APLICANDO EL METODO ENSAYA
m.OBJETO:Determinar la cantidad de nistatina residual que hay en cgda uno de los vegetales tratados con el antibiótico, y su variaciónen función del tiempo, aplicando el método de valoración rápida ensayado.
CONCLUSIONES:Luego del secado de la solución de 100 ppm. agregada
a los alimentos, en el que la potencia se reduce aproximadamenteun 40%,1a actividad del antibiótico residual se mantiene con valgres aceptables hasta los 7 días, no se observaron interferenciasentre los vegetales ensayadosy la nistatina.4/
(mms m CERDA!
“MSIIMD IACIONAI.DE 3015303 AIRES
¡ACUMADDI CIENCIASmom Y IANRALES
!AIORACIOE QE NISTATINA RESIDUAL
EA.___LIMBNT°3L cmo 91mm
, ¡E818
Pará optar ¡1 título no. 1Doctor on 0101101“ Quinien
(OrientaciónQuino. Mítica).
755/57. 98€:
4.958‘w\
Brpreeo ¡1 reconocimientoel lr. AdolfoIn lentes, Profesor Ad:unto de 1. cátedra de Brontologh yAnálisi- Industriales por haber tonedo bajo en dirección el presente trebajo.
Agradezoo,“121m. a 3.2.Sqnibb e Sons. Argentina, 8.A.. porhaber facilitado ene Laboratorio. pere la ejecución del himno.
7'“
4VAIDRACION ¿El NISTATINA BESIDUAL El ALIMENTOS APLICANID
g!_NUEVD [ETODO
I-PARTE BIBLIOGRAPICÁ
1) Anteoodenteosobre el no de antibiótico. on elnentoav2) Generalidades sobre la nistatinno3) ¡atodos de valoracion a. antibiótico. y perticulononto de 1.
n13tat1na.
II-PARTEMEME!“
1) Ensayoy ¡Justo do un nuevométodopara valorar mutua.2) Reprodnoibilidad del mi.an en la. condiciones que permitan II. g
tuizaoión para la (¡atenuación de valores residuales en slipnontoe.- .
3) koaon do aplicación de la Matutino para la conservaciónte.porarta de frutas y hortalizas.
o) Efeoto conservadorb) Valoracióndel antibiótico residual
WNCLUSIOIES
4ETROIUCCIO!
Varios fueron los nativos que impulsaron 1a realizacióndel presente trabajo.
El ¡isno tuvo en origen en el interes de encontrar un nátodo pare le valoración de le actividad de le nistatina que resultara másenoto y rápido que los somente usados y que pudieresuministrar el Valor requerido con una Jornada de labor.
lás tarde, ante el hecho de que le proliferaoián de hongos y levaduras constituía un grave problem en le conservación delos vegetales, se pensó en efectuar ensayos de eplicaoión de esteantibiótico, esencialmentefungicidn, para contrarrestar ese destrucción.
Por último, si las pruebasanteriores resultaran satisfactorias, ee decidió determinar los valores residuales del entibiático luego de diferentes tiempos de contacto con esos alimentos. atilizendc el Iétodo de valoración ensayedcw
-6—
ANTECEDENTESSOBREuso y: ANTIBIOTIOOS ¿211amamos
Generalidades
Desdeel descubrimiento de loa antibióticos, grupo deaustenciae con actividad snti microbiana, loa técnicos en_a11nenh¿ción han contemplado el neo de los nianoe comopreservativos en a;_ticuloa alimenticios.
Loe resultados en un principio fueron bastante desslentgHdores puee loa primeroe antibióticos tenían un espectro antibscteriano limitado. Sin embargo, más tarde con 1a aparición de otros,de eepectroe mas amplios, el panoramafue variando y sus posibilidadea en el campode 1a tecnologia alimenticia aumentaron extraorbdinarianente.
Se pudo obtener con el meode loa antibióticos de amplioespectro, particularmente los del grupo de las tstraciclinae, unaprolongación en 1a vida de una buena parte de los slilentos perqudores, retrasando 1a deetruoción bacteriana de loa mismos.
En general, perecederos son loa alimentos que permiten ¡1crecimiento de una gran variedad de licroorganisnos, teniendo, encondiciones naturales, una vida extremadamentecorta, tan corta quealgunas voces se puede nedir en horas. Esto ee produce porque losgérmenespueden. en ellos, proliferar rápidamente, resultando de q;to una explosión nicrobiana (Fig.ll. El período de vida fresca deun alimento perecedero ea el intervalo de tiempo que transcurre agtee de que el número de microorganienoa contaminantes entre en eaeausente explosivo.
En general, hay dos formas de ausentar el tiempo de vidafresca de loa alisentos: Primero: disminuyendols población inicial
.7.de sermones que son capaces de proliferar y Segundo: disminuyendols Velocidad de crecimiento. o sea aumentando el tiempo en que lapoblación total se pueda duplicar.
Los antibióticos pueden actuar en ambasformas. En prosencia de una concentración efectiva de un antibiótico dc amplioespectro bacteriano, solo unas pocas bacterias podrán crecer y estas lo harán a velocidades reducidas. En la figura 1 se nuestra 1.‘"ventaja ds limitar el número inicial de gérmenes y de disminuir 1a
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velocidad de reproducción.Fignra 1 ExplosionssI d. géHCHÓBsoeeoo00.000....-¡escasos-soesooeo35"” I MEP-x
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5
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La acción de los antibióticos se ve muyfavorecida por lnretrigsrscián ys que solamente los germen“ psicrláfilos pueden ¡argbliferar a bajas temperaturas.
Es tanbián muyimportante ls higiene durante la manufactura del producto ya que con ¿sta el númeroinicial de bacterias;yhongos se vs reducido.
-8—
E1 uso de los antibióticos en el procesamiento de los slinentos es su: simple y es ademásadaptable s casi cualquier teonica existente. La nayor parte de ellos, a las concentraciones enque tienen que ser usados, son solubles en agua y además son generalmente difisibles. pudiendoser varias las tecnicas eficaces para su aplicación. ¿si por ejenplo el alimento puede ser sumergido,enjuagado o hunedecido en sus soluciones aoucsas o bien estas seraplicadas o tunigadas sobre el nisnoi Pueden ser también agregadass los tanques de enfrianiento. o al hielo usado en la conservación,comotambién ser inyectadae en Los animales antes de su atenas.
Por comparación con los preservativos quimicos conocidos.la cantidad de antibióticos. requerida para conseguir un alargamie;to significativo en la vida fiasco, es ¡uy pequeña. Concentracionesdel orden de l ppm. o nenores son menudo mrcadanente efectivas.
Conrespecto a los residuos. no solo los niveles efectivos son bajos sino que ademásson relativamente inestables, sobretodo a las temperaturas empleadas en la cocción. Comparandolosconlos tipos comunesde pesticidas el problem residual con antibiotlcos es casi inexistente. Los residuos en los alimentos. cuandosonsonidos, son generalmente tan pequeños que no son detectables.
Evidentenente, comopudiera haber manufactureras sin rs;ponsabilidad que usaran grandes cantidades de algunos antibióticospara la conservación de sus productos. o bien que usaran sntibióticos cuya toxicidad no ha sido perfectanente determinada, el LILA.(Food, Drug and Coeneteo Act) de los Estados Unidos, es sanamente
estricto en las regulaciones de estas sustancias. Así, el primer 3eo comercial de un antibiótico en ls conservación de un alinento
fu
-9
perecederc pudo ser posible recién en novia-bre de 1955. en que elP.D.A. permitió usar la clorotetrsciclina “en y sobre" carne de eves nc cocidas. estableciendo la tolerancia de 1 partes por millón.Esta decisión se basó en la evidencia cientifica de que la coccióndestruiria esta cantidad de antibiótico, de tal maneraque no quedara nada cuandola carne fuera utilizada.
Los puntos de vista del F.D.A. sobre uso de antibióticosen alimentos son (30-11-55):
1) Constituye un riesgo para le salud pública, pues su consumepu;de producir la aparición de microorganismosresistentes n losmismos.
2) La presencia de antibióticos en alimentos para uso humano, e snadición directa o indirecta e tales alisentoe puedeconsiderarse comouna adulteración según el significado de ls sección 402del F.D.A. and Cosmetic Act (Sección 402-52 Stat. 1046; 21 0.8.C 342).Esto no será obstáculo para el establecimiento de toleranciaspara antibióticos bajo las estipulaciones de la sección 408 delacta. cuando se pueda tener una adecuada evidencia de 1a utilidad de los sismos y de la seguridad de los residuos.
J.T.chue, H.Goldberg y R. Goodman.de la Universidad deMissouri, Columbia, han presentado un prograna de investigación seerca del significado de los residuos de antibióticos en la SaludPública.
V3
Consideran que luego del priner paso. que es determinar:s) que antibióticos son efectivos en la producción, procesamientoy preservación de un producto; b) a quó niveles deberán ser usados
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y o) que residuoa resultarán de tales usoe. 1a segunda etapa eeríestudiar experimentalmente el efecto de esoo residuos. alimentandouna variedad de animales de laboratorio y determinando la resisten;cia, al antibiótico. de la flora bacteriana normaly patógenay ademásefectuando estudios toxicológicoo a fin de determinar ei oeos niveles bajos, luego de un tiempo, interfieren con las funciones fisiológicas normales. Así oe efectuarán estudios de 1a funciónhepática. renal,de la sangre, etc.
Lógicamente, siempre que oe pueda, la experimentaoion enaereo humanosserá muyvaliosa. Ademñe¡aquellas personas que estenen contacto con loe antibióticos. por nanipuleo prolongado durantela producción de alimentos, deberían ser sometidas a pruebas de nipereensibilided.
RESULTADOS OBTENIIDS
PESCADOSg ALIMENTOSpg ¡un
Conesta clase de alimentos ee puede deoir definitivameg_te que un efecto oonoiderablenente beneficial puede ser obtenidocon el uso de antibióticos en su conservación. Evidentementeha:que dejar bien aclarado que este efecto ee obtiene en mayorgradocon la ayudade la refrigeración.
marr H.L.; Southeott B. y Biaett 3.; estudiaron la preeervaoión del pescado con entreptomicina, penicilina. eubtilina.polimixinaB, neonicina. baoitracina. gramioinina, tirotrioina, r1mooidina.oxitetracíclina. cloramíenicol y olorotetraoiclina. Laolorotetraciolina, oxitetraoielina y oloramfeniool, en eee orden,demostraron ser loa más efectivos. a temperaturas entre 0‘ y 21’0..
-llp
para inhibir la flora bacteriana normal. mientras la riuocidinammm! .1 crecimiento de levaduras.
El mismoTerr H.L., después de estudiar las formas lasconvenientes en que la clorotetraciclina puede ser aplicada en lospescados, aconseja que las bacterias contaminantes sean expuestasa los antibióticos tan pronto comosea posible luego que el anilalha sido casado y considea que esto puede ser conseguido de variasnanerae:
(l) Incorporando el antibiótico a razón de 1 a Sfmgágo sea l a Sppmen hielo molido o en bloque. En esta última forma (en bloque) encontraron que hay una migración de la clorotetraciclinaa un pequeñonucleo. Para evitarlo agregan al hielo 0.005! decarbozynetilcelulosa de alta viscosidad.
(2) Sunergiendoel pescado entero y preferiblemente “sin vieceras',
en agua conteniendo 25 a lOO/pg/ul. de antibiGticoo(3) Incorporando una muypequeña concentración de antibiótico, por
ejemplo: 0.5 a 0,1/ug/nl., en agua de lar refrigerada (-l,l° CJ,en la cuál el pescado ee guardado o transportado.
Unavez que los pescados son traidos a tierra, los fileteso tajadas cortadas de ellos, pueden ser sumergida. en una solución
conteniendo aproximadamenteSlpg/hú. de clorotetraoiclina para ev1_tar ulteriores contaninaciones.
En ballenas la destrucción bacteriana puede ser retardsdaconsiderablemente inyeotándoles grandes volúmenes de solución de zclorotetraciclina en agua de nar.
El Problema de residuos de antibióticos en estos productos debe ser considerado. ya que las ostras y les mejillones son
.12.
frecuentemente comidas crudos, y la carne de mariscos, por ejemplocangrejos y camarones, puedenser tratados con clorotetraciclinaluego del cocido usual, que precede e la separación de la corteza.
S. Yamazakiy colaboradores del Instituto Nacional de a;1nd de Tokio y rakatsuka N. y Higeshi K. de la Tokyo Fishing Comp;ny, determinaron un métodopara la determinación de la clorotetraciclins en pescados, que es una adaptacion del metodo de la copadel F.D.A.. y comprobaron que en pescados preservados 12 dias en
hielo conteniendo 5 a lO/ug/k. de olorotetraciclina, no quedaba másde 0,005/pg/k. tanto en la piel cono en la carne de los mismos. Evidentemente este nivel no puede tener ningún significado para lasalud.
C.L.Wrenshall da los siguientes resultados obtenidos usqgdc oxitetracielina, que muestran practicamente los beneficios quese pueden obtener con estos alimentos:
e) Cuandose usa para envaear pescados, hielo contenienpdo 5 ppm. de oxytetraoiclina ls vida fresca del pescado se alargaalrededor del 80 al 150 fi. El "Red fish" se mantuvo fresco durante20 dias conaervadden hielo con oxytetracicline, mientras el control se echó a perder a los 14 dias. El pescado curado y seco semantiene con hielo-antibiótico, fresco durante 25 dias mientrasque los controles se arrainan en l} dias.
h) Sumergiendofillets de bacalao en una solución de esus de mar con 25 ppm. de oxytetraciclina se triplicó la vida freeca de los mismose 0° c. Evidentemente ese prolongación de la vidapuederevolucionar ls distribución de tillets de pescadofresco.
c) En cuanto a la carne de langosta cocida. que ee echaa perder en aproximadamente 6 dias mantenida a O°c.. sumergiéndola
.13
instsntáneasente en una solución de 150 pps. de ozytetraciclins,semantiene fresca por más de un nes.
d) Las almejas desosscaradas sumergidsa en una solucionde 5 pps. de entemoiolins y luego santenidas s 0°e., se ¡d‘unafrescas por 35 dias. Las almejas no tratadas se echan s perder ensenos de uns semana.
Las Agencias reguladoras del Csnsdi ya han permitido eluso de estas sustancias para ls conservación de este tipo de slinegtes.
CARNES
Estas son excelentes Indios de cultivo para las bacterias,produciéndose por lo tanto rápidamente su deeoosposición. Solo pequeñas cantidades pueden ser saladas, desecadas. ahnmndas, enlstadsso aüobadas. nientras grandes cantidades son distribuidas s1 estadofresco. En estas condiciones, en las que hay mayores problemas, sedeben matener s bajas temperaturas para retardar la descomposiciónbacteriana, o sinó, en los países dondeno hay refrigeración, serusadas rápidamente.
Los antibióticos de amplio espectro demuestran poder inn;bir el desarrollo bacteriana aún manteniendolas carnes a mayorestemperaturas.¿
F.E. aatherage y colaboradores, de ls Universidad deOhio, Estados Unidos, han desarrollado técnicas por infusión delas csrnes,csn soluciones salinas conteniendo antibióticos. En unode esos procesos el antibiótico es añadido a los cortes de carne:intentando ls solución. En otro, el animal es sangrado cortandole
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le Venayugular, insertándolo una cánula en la arteria oarótida yhaciéndole pasar por ésta, a través del sistema circulatorio, unssolución conteniendo 3 gr. de antibiótico, el cual es luego drenadop
Cortes de carne, tales comobirteos, costillas y rosbifpueden ser lantenidos bacteriológicanente frescos muchomás tiempo,sumfgiéndoloso rumigándolos con soluciones antibióticas diluidas.Asimism. en los productos comosalchichas de cerdo, añadiendo 3 a5 pp). de ontetracielins. su vida i’reaca se alarga sn ur'SO a 100%.
UnadietribuciSn muyoospleta del antibiótico. ae obtiepne utilizando el sistema circulatorio de los ani-alos. antes de serestados. En esta forma el antibiótico sera llevado por la sangre yla linfa a las zonas másremotas del cuerpo y distribuido e travésde todos los tejidos.
Pareee que la inyección intraperitoneal es ls vis másconvenientepara la introducción del antibiótico.
Se han efectuado estudios con este sistema en vacunas. gvejas y cerdos. utilizando soluciones de oxytetraciolina. Se obtuvieron los siguientes resultados:Vacunas: Niveles de oxytetraciolina en tejidos, del órden de 0,5ppm., son efectivos para inhibir las bacterias put-efectivas por48 horas a temperatura ambiente. koslentea bifteos se han cortadode res colgadas durante más de 6 Bananas, a temperatura ambiente(de 5 a 25° c. ), sin refrigeración.
Iuamatanza de los anisalss se puede efectuar de 1 a 4 bgras después de las inyecciones.Ovejas: Dosis de l s 3 mg. de ometraoiilinn por libra ds peseds cuerpo dan una proteccion adecuada para varios días, s teuperstara ambiente. Noparece haber diferencias significativas, en los ni
.15
ídles de antibióticos encontrados en tejidos esperando. después dela inyección. l 62 horas para ¡atar loa animales.gggggg: Dosis de 3 mg. de ozytetraciolina por libra de peso decuerpo, mostraron tener un erecto retardador en la putretaeción.Eltratamiento no es solo valioso para ls preservación de ls carnefresca, sinó que probablementereducirí la gran cantidad de bacterias nrrsigadss profundamente, de tal forma que ls descomposici6nde lgs carnes tratadas, comopor ejemplo Jamones. ser‘ reducida.Aves de corral
En la historia de ls conservación de alimentos por antibióticos. estas carnes tienen un significado especial ys que conode dijo anteriormente, fueron los primeros productos que pudieronsalir el nerondo, luego de un tratamiento previo con estas sustancias.
Los estudios que se efectuaron con ellas. indicaron queademásde ln olorotetraoiclinn, la oxytetraciolina y la tetraciolins resultan efectivas para controlar el crecimiento de los orgnisnos causantes de su descomposición.
La clcrctetraoiclins es absorbida mejor por la piel y tgJidoe superficiales a bajas temperaturas y es destruida en esos tgJidos por 15 a 30 minutos de cocción.
Medioe pollos sumergidos lO minutos en;soluciones de lOppm. de elorotetraeiclina y mantenidos s 2° c.. prolongan en vidapor más de una semana. En general se mostrá que con un uso ¡propiado de antibióticos, el tiempo de conservación de las carnes de avespuede ser duplicado.
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msnm _!_mn;
h los EstadosUnidosse ha estime que el m de le pl!dnccián de frutas y e]. 13%de 1.a de vegetales se pierde durante olestacionamiento'ea los notando..
Ia refrigeración es uns gran defensa pero tiene sus 1111taciones porque una vos que el producto ha sido sacado del trio.se produce un rápido deterioro.
m las frutas, los mini-os responsables de ese deterioroson los hongos (especies de los géneros Bottytis, Ponicillinn y otros) y on los vegetales las bacterias, aunquelos hongostanbi‘lestán presentes.
El notado actual do aplicación de].antibiótico es finignr antes de le cosecha o sunorgir los prodnctos despues de 1a ni;na. Ambosprocedisiontcs son eficaces. lógica-ente aquí no se trote do esterilisar los vegetales o tratos sinó de poder prolongarsn vida útil en ¡no e dos días. particulsrssnte en le industria de].¡reenvasadow
¡n ensayos con papas, se observó que algunos antibióticosreducen o clininan las bacterias pero queuna ves que estos desaparoocn, enpiozsn a proliferar en abundancia hongosy levaduras.
Pnrs controlar ambostipos de ¡iz-senos se pensó en neschr un antibiotico del tipo entibactoriano conopor ejenplo leclorotctraciclinn con unoanti-icotico. In nyor parte del trabajosegún el Dr. Wilson L. Smith (en sn infone on una reciente discosión sobre nso de antibióticos en 1a conservación de alissntos, egtro nie-bros de nn Jurado de1"0.8. nep. of Real“ Education ¡alfaro. P.D.A..')se hs realizado con Niststins. Eh ese nio-o inform el
-11.
Dr. Smithaanifiesta que el trabajo efectuado en vegetales adolecede algunas fallas. tales como:l) Esceses en datos de valores res;duales; y 2) Utilización de altas concentraciones de antibióticos.
En EE.UU., 3.3. Cox comprobóque la layer parte de la lgchngs sumergida en una combinación de estreptonicina y ozytetraciclina en concentracióuea de 50 a 1.000 ppa., evita su infecciónbacteriana. El porcentaje de nuestras que no fueron tratadas y seecharona perder resultó del 60%,mientras que en nuestras tratadas fue del 2 al 9%.
Brad: E. Francis y el sancionado Saith I.L., obtuvieronbuenos resultados tratando espinaca con 500 a 1.000 pplo de estrep_tcaicina. Logrsrcn así una reducción del decaimiento de la espinaca del 50 fo si ¡sta se mantiene a 18' C. durante 4 días y del 40*santsniéndola 21 días a 7° C.
Sin esbargc, recientemente 3.1. Becker. R.N. Good-sa y3.8. Goldberg, de la Universidaide Missouri. Coluabia, determinaron estudiando el efecto conservador de la estreptonicina, clorotgtreciclina y ozytetraciclina en espinacas contaminadasartificialnente con Erwinia carotovors. que las tree en concentraciones de
25/ng/ul. retardan el decaimiento de la verdura refrigerada antesde envaaar, pero que en el caso de la estreptoaicina quedan, des
pués de la cocción, residuos de Z/ng/al., por lo que no se podrípensar en el uso de este antibiótico soso conservador de espinaca,hasta tanto no ae realicen estudios adicionales que determinen laimportancia que puedentener estos residuos en la salud.
Se obtuvieron tanbiin resultados satisfactorios tratandoverduras para envasar con una solución de subtilina de 20 pps. e
toco-ola333k;alhanson!Icuando.la.gitana.o.unacanong:hnom-humano{inundan¡algang¡acecha3g.I¡0300.3-Ioho-u9-8-3.quoca-ga
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.19
OTROS PRODUCTOS
ngggs En esta se demostró que tanto 1a Psnioilina como1a eetreptonicina, Clorotetraoiolina y ozytstraciclins. sn ooncsntracfilnes de 25 ppl.. pnedsn alargar el tiempo de conservación de la lsohe pastenrizads, pero no de 1a cruda. Los dos priaeros aejoran q;sho tiempo en 7 a 8 días, nientras que los dos últimos lo hacen sndos o tres semanas.
En la Universidad de Osaka. Japón, ss estudió .1 problede la leche cruda y se llegó a los siguientes resultados: l) Msnelsa de patulina (0.01 f) y anrsonicina (0,01 fi), conservan la leche durante 10 días; 2) Penioilins (0.01 fi) mi. anreoaioins (0.01%)por ocho días y 3) Penicilina ¡ás oloronioetinay patulinn afin anrg,onicina y penicilina más anreoaioina (cada ans 0.002%). durante 3dias.
Conssto se han dado los principales resultados obtenidosde ls aplicaoi6n de los antibióticos en 1a conservación de los al;mentos de layer importancia.
Si se considera que los Estados Unidos. donde ae tienenlos mitades ¡is modernosde cosecha, sluacsnsniento. transporte,distribución, sanidad, refrigeración. ets. las autoridades sonaiigran que nns cuarta parte de la producción de aliasntos es perdida,se ooaprsnderí la iaportanoia que tiene para la hnlanidsd. todo adelanto que se pnsda hacer en este campo.
Evidsntsaents, controlando la proliferación aiorobianaen los alimentos, no solo se logra salvar gran parte de esa yirdida. sino que se puede mejorar la calidad, tanto de los aliaentoa
.20
rrosool oonodo lo. envasados, congelados. m. lodo “to you'd”.ri m man elevaciónde].un). nutritivo, a nobo- lngaru 6‘ando con¡camilo todavíarosario.
GBNLRALIDADLS LA NISTATINA
La NISTATINAo FUNGICIDINA,antibiótico fungicida deeorbierto por E.L. Razon y R. Brownen 1950. ee obtiene por fermentación del Streptonvcee nouraei.
1) PROPIÜADES FISICAS _Y_QUIMICAS
Ee un polvo cristalino de eolor marino que poeee unepotencia que puede variar. según el grado de purificación, de2.500 e 3.500 dns.Sglubilidadte) En insoluble en agua; oloroi’orno; hanna y “tetona.b) Parcialmente soluble en netanol; solución ecuoee de etanol.
N-propanole iso propenol; butenol-turedo de agua y dionnowo) Solubleen piridinn, temida. ácido acético glacial, n-n un;
til acetamidey propilengliooLIn eolubilidad en eolventee polares ee incrementada por
le presencia de un lo e zo! de egue dependiendo en todoo los oaeoe.de la pureea de le mestre (el polvo eeniorietelino con potenciade 2.500 e 3.000 u/ng. ee más soluble en loe eolventee oomunee.queel polvoliorooristalino eltanente purificado debidoe le eolubililación de lee inpurezee presentes) y le Velocidad de dieolución,del tamañode lee particulas.Puntg de Mig’n:
Se empieze e deeoolponer gmduelnente e lee 160%.. einfundir aún e 250° C..
-22
Rotación Esgccífica: (0012)5
- 10° (ácido acético glacial)+ 21° ( piridina )4-12° (dinctilfornanida)
Frente a diferentes reacciones oc obtienen los siguientesresultados:a) 013 rc a negativo.b) Reactivo fcnólico dc llinonc: negativo.o) Reacción dc Moliccht positivo.d) Reacción de Carbazolc: positivo.f) + 504 32 cono: cambio dc color dol violeta c1 negro o nin]..g) React. de Pabling: no hay reducción.
h) o rc 613 K3 rc (C106 n fuerte color azul.i) Reaccióndc ndehidc dc Schifft positiva (reacción lenta)1) Doooiora cl ¡ln 04x .‘—
k) Decolorajl 0140 k2 .
AEALIsgs ELEMENTá;
o. 58.86 - 58,50 ..n; 6.97; 8.57 .I. 1.7 - 1,6 .
EguiValente de neutralización.956 z titulado cn ácido acético glacial con ácido porción».922 l titulado comoun ácido cn piridina»
Estructura.
In llistatinn cc unn sustancia cnfótcrc (poco. un grupoácido y uno básico), con una composición que parecc sor: 04587511019.
El tratamiento de la mismacon un exceso de álcali natsnólico seguido de una titulación nuestra el consumode un n01 adicional de e1oali, ademásdel utilizado para neutralizar el grupo ácido. un:presente por lo tanto, un grupo ácido potencial tal comoserie unalactona o un estar, aunque el primero es las probable. pués no haydisminución en el peso equivalente básico del producto seponifioado, no habiendo aparentemente "ruptura" de la nochula.
Nohay presencia de halógenos, aaufre o grupos tenólioo,acetilo o netdílo.
La existencia de un grupo carbohidrato se estableció pormediode una reacción hidrolitica. Esta se pudo llevar a cabo conanhídrido acético y ácido sulfúrico concentrado. Se obtuvo asi unfragmento que se caracterizó cono un derivado aeátilico de una en;no desoxihozoea, a la que se llamó 'MIOOSAHINA".Parece así que lanistatina posee una unión glucceídica. ademásde los grupos carbonilo y lactona y aún nas: que el aaino grupo esta presente en 1a ‘heroes.
Resultó interesante encontrar que la nioosamina ee obtig_ne tambiénde ll hidrolisis de la Anfotericina B. otro antibióticoantinicótico. Esto, Junto a1 hecho de que el espectro de absorciónultravioleta de la Niatatina ee casi idéntico al de la Binocidina,también antibiótico fungicida, o al que surge de la oonparacián delas propiedades químicasy físicas de estos y otros polienos relocionados, todos antinicóticoe (Anfotericina n, Rimocidina, Candia;dina. ete.) fortifican aún másla teoria, que ya existía. de quedebenposeer caracteristicas similares en sus noléoulas. Conobasepara proseguir la investigación ee está tratando de determinar lanaturaleza del esqueleto carbonado de estos productos. El descubri
.miento de que el grupo animo y sois átomos de carbono de la moloqgla están presentes comouna amino desoxihoxosa, sugiere que la rolaoión entre aquellou policnos que contienen nitrógeno, cono la Ni!tatina, y sqnellos que no lo contienen, comola Filipinn. Iungich:g_nina y irichonwcins, se que todos possen una parts ds carbono, hidrógeno y oxigeno y que algunos están oonJugados con un azúcar su;
nado y otros no.- 'Es evidente que sl esclarecimiento definitivo ds ls 99
tructura quimica de ésto grupo ds Instancias. Bari aulanonto inpqg,tanto para la Quimoterapia.
Todos estos datos permiten la concepción de uns gran molécula de Nistatins compuestadot
l) una unidad de 40 carbonoe conteniendo ligaduras poliánicas, un grupo carboxilo, un grupo laotonn y oncegrupos hieroziloe.
2) Una unidad ds sois carbonos: azúcar sminado.
EgTABILIDAD
La Iistatina sn solucionen no butarissdss os bastante ineatable y es rápidamente inactivads por los iones hidrógeno u ong;drilo y ademáspor s1 calor, la luz y sl oxigeno. Sus soluciones enszclas: solventes orgánicos-agus, s temporaturaanbisntss, protagidaa ds ln lus y del airs, pierden sl 40 s1 50%do ls actividad encinco diso.- Los sólidos secos, guardados en frascos estrados sn ngfrigoraoión, no pierdan potencia sn 12 sesos.
Sus sales sódicas o potásicss no son ni solubles sn aguani sstables. El clorhidrato ss solubls pero sltanente inestable.
-25.
En el comercio el antibiátioo aa puede presentar tambiénen tabletas, las que mantenidas perfectamente secas y a 40° 0.. ggtienen su potencia durante 12 meses o en ungüentoa. en loq que laactividad se mantiene (a 25°C.). tres nenes.
La solubilidad y estabilidad de una preparación de nietatina se muestra en la siguiente tablet
solvente BImitode solubilida Estabilidad__ n/ml. a
Agus 300 u 600. completamente estable por
Metanol y propanol 75% (agua)Isapropanol
Propilengliool
Dimetil formamidsN.N. Diletilaoetamida.
7.500 - 15.000
100.000
I 112.500 a 150.000
2 semanas.
pérdida del 40 e 50%en 5dia..
4 a 5% en 1 e;mans a 5°o.40 al 50% en 1semana a 30°c.
¡pérdida del
Degradación evidente en 1hora.
2) ¿CTHIDAD BIOLOGICA2g LA NISTATgA
a) Acciónfungistatica: Inhibe el crecimiento o destruye activamqgte los hongos. especialmente las levaduras a hongos de ese tipo.Es menosefectivo sobre las esporas que sobre las oilulas vegetativas. In vitro es fuertemente fungistatioo contra una variodad de formas saprófitas y parásitas. Las concentraciones nini
-¿5..
masnecesarias para inhibir el mazuuisntu de un considerablenúmerode espacios (tabla I) fueron compiladas por la 3ra. Hazenon los Laboratorioa (191Departamento de Salud del ¿atado de Nu;va York“
Eéïullrsgectro antigietítiü de ¿a 3:13“ng
c 1am ¿mw 1-1¡”5" q) to u/m1.lfihgiarn?.,(g)n cm e!
(s) kz) (n) (2)—
Canal...Alblcm 7,81¡Mew mn 7,81' maiden 7,81¡11mm cm. 15,62' manes-mn 1,81 " ¡mmm 15,62
' ILL-und. 7,81 WW becom- 7,81' 7,81mmm m- 31,25
CW m 3,9)Cmmu ¡pr 31,25Instalan-When“ line) 3,90mm»; ep. 31,25WM“ bmnm (') 3,90m sp. 1,81amm. daa-Istituto (') 1,95mama Macu 7,81Bporotflcln- ¡enmcu1 (') 31,2 ' Op. 7,81
machado. 1703611 <5oo’ " ¡atún 15,62
llanosporimmeapun- 42WWu: m 7,81¡BW upon-(Mm) 62,5 Alarma-1.a). 3,”mm VW 31.25“AspergillusIp. 31,25MW mutua-¡Who 31,25Bondad“ a). 7,81
" tpnmrrans. p.262mmm. amm 3990Carstan “(plant pm) 7,81 tal-¡nnIntl-sim. 7,81(¡actrichm 5,62 chun-yenmas. 7,81
47¿eción Bactegigstátioa: Prácticasento no tiene actividad, in vita)contra las bacterias comunes.
oxicidad: es no tGIica. Se realizaron gran númerode ensayos en r;tones, ratas. perros, y tanbien en el hoabre.Se obtuvieron los siguientes resultados!Ratones:
a) Via intraperitoneal {Ln ,0 s 29430a 50040una.“ peso.IlD02. . d.p.50.b) Vía oral: lo hubo Inertes ni efectos tóxicos luego de dosis de
8.100.000 a 12.500.000 u/Xz. de peso
¿2222*
I. n 5° a 35068 a 93440 n/Kg. de peso.a) Via intraperitoneal ÉI. n 2 a 51152a 550405/“. a. peso.
b) Via oral: no hubo suertes ni efectos tóxicos con dosis de7.630.000 u/kg. de peso.
Ademáscon éste tipo de animales y con perros se estudiela toxicidad crónica del antibiótico administrado por via oral.Losgrupos de ratas en experiaentaeión recibieron listatina en dosisde 810.000 a 121.500 u/kg. de peso, diaria-ente. En todos los casosla dosis diaria se dió por sodio de un tubo estoaacal en dos dosisiguales, a la mañanay a la tarde, durante 90 a 93 días consecutivos. En estos animales, se estudiaron los efectos en sangre. peso.apariencia y en algunos de ellos. seleccionados. se les efectn6 laautopsia para observar cambios patológicos "grandes" y para examinar a1 microscopio secciones del corasán. pol-osos, tiroides, hig¡_do, bazo, pancreas. estómago. intestinos, riñones, etc. lo se not;
-28
ron diferencias entre los grupos en experimentacióny los controlestanto en los recuentos de globales rojos y blancos, cono en la determinación de hemoglobina. Una disninnción de crecimiento se obsegv6 en las ratas machosque recibían dosis diarias de 202.500 e j540.000n/Kg. de peso. In dosis ¡ás alta. 810.000 n/kg. diarias,rgenltó ser tóxica tanto para los lechos cono para las hembras.
Io se observaron lesiones patológicos. gruesas ni nicrog_cópicas en ningunode los animles sacrificados y no 'se pndo dar 3na explicación definitiva a la disminución de crecimiento viste enlas ratas lechos.
En los perros, la toxicidad crónica se eetnd16 administrándoles Nietatina por vie oral y por inyección intravenosa. Porvia oral las dosis diarias fueron de 90.000 e 450.000 n/Kg. de peeo. durante 185 e 211 dias consecutivos. Todos los perros fueronsacrificados de ano e siete dias después de le terminación del enninistro del antibiótico y sus organismosfueron examinados.al igual que en las ratas, para poder deterninar cambiospatológicosgrandes o nicroecópicos (en corenón. pulmones, higado. pancreas,bano. riñones. intestino, tiroides. tino. vejiga y aorta). Ningunode los perros exhibió alteraciones o reacciones_signiticantes.
Por via intravenosa 1. Histatina se administró en sti-pensión ecuoee al 0,1% en dosis diarias de 3.200 n/kg. de peso, por35 a 37 dias consecutivos.- Todoslos sninales fueron sacrificadosl e 2 dias después de terminar el tratlniento y ninguno nostró oq;bios en peso. apetito, apariencia, actividad o en el estudio nlterior microscopios.En Hombre:Ningún signo de toxicidad se pudo observar luego de ls
administración diaria oral a. Nistatina, durante nn nos. ni tampoco'evidenciande sensibilización ¡1 sntibiático.
Ads-ás no ss observaron signos ds irritación local cnpiel. tejido snbcutánso y músculo sn ninguna dc las personas trttgdas con Histatina al 0,2 s 0,8 fi un P1sstibass.Acciónen cultivos en tejidos:
Ls Nistatina, agregada cn cultivos un tejidos. on un nivel aproximadods 20 |/hl., previene contaninsciones do hongos ylevaduras y no afecta las célulss dc los tejidos. Por esta falta dstoxicidad ha sido asada con into para .1 tratamiento contra hongosds cultivos por Ward, Okar, Blowy otros. Girardi ha informado lsaislación exitosa del virus ds 1a policnislitis. cn cultivos sn tgJidos tratados con Nistatins y Granotf no observó efectos tóxicosdel antibiótico cn niveles ds 20 s 30 n/hl.. ni cn 01 virus dc laenfermedadde Newcastle. ni sn las células del cultivo en tejido.usado para sl mismo.
-30
Metodosde valoración de antibióticosPueden ser de dos tipos! quimicos o biológicos.Cuandose demuestra ls propiedad de un antibiótico de ng
tar o inhibir el crecimiento de un germenvivo tal cono ce hace snlos metodos nicrobiológicos. se obtiene lógicamente unn nedida de.”la actividad biológica o potencia a. dicho antibiótico. De esto r_e_salta que para que un nítodc quimicoo fisico tenga real-ente vslcr tiene que ser capaz de dar resultados que concuerden con losobtenidos en los métodosnicrobiolégicos. Obtenida tal oonccrdsncia, los ¡atodos quimicos o fisicos podrán ser asados sobre todopor tener le ventaja de ser másrápidos,-ls que resalta de sano ggterás en la fabricación de estas sustancias ya que posibilita seguirel curso del proceso muyde cerca. Dichos métodos quinioos en geng_ral se basan en reacciones que algún.grupo funcional de ls sustancia, puedadar con ciertos reactivos. ya sesn.del tipo colerim‘trlco. iodcnétrico, etc.. o en ls determinación de alguns constantefisica de los productos tornados en esas reacciones o de las snstuq;cias puras, tal comoocurre por ejemplo en el nótodo espectrofctométrico. Por todo eetc sus usos están bastante limitados, ya que .e_sas reacciones pueden algunas veces producirse igualmente con productos de degradacián o con otras sustancias.
Loe metodosbiológicos que se describirán enseguida. ti;nen algunas ventajas sobre los anteriores, tales cono:1) Ser generalmente más sensibles.2) Poder ser utilizados tanto para ls valoración de antibióticos
conocidos comode desconocidos.
3) Ser asados sin grandes dificultades cuandols nuestra es quinicanente heterogenes y de conpcsición variable, conoserá el os
-3l
so de 1a valoración en alimentos, fluidos orgánicos, etc.Métodos 3101591008:
Pueden ser;J.- Metodos por dilución. \2- Estados por difusión.3- :zátodoa turbidimétricos. ‘
En realidad la distinción entre metodospor dilución yturbidimétricos puede parecer injustificada pero es sin embargoeglamento práctica y conveniente, ya que tanto las condiciones generales comoel cálculo de ambosnótcdcs, son diferentes.1- Método¡gr dilución. Se base en preparar diferentes diluciones
del material cuya potencia se quiere determinar y agregarlo. encantidades crecientes e una serie de tubos e los que se les ed;cionari un volumendeterminado (generalmente 2.oc.) del nsdio decultivo en el que ee be inoculeds el microorganismo de ensayo.Se deberá observar. despues de una incubación, la minina ooncqgtración de la sustancia que inhibe el crecimiento o alguns otrafunción observable del germen. (Punto final). Conoel titulo pu;de variar con muchosfactores, ee necesario comparar el puntofinal obtenido con el de un ensayo completansnte similar en elque se usa una muestre del antibiótico de potencia perfectamente determinada (muestra standard).
El cálculo a efectuar es el siguiente:a) Determinar el "factor standard" que es el númerode unidades del
antibiótico standard necesarias para no permitir crecimiento enel volumende caldo inoculado. agregado e cada tubo.
Pare obtenerlo se multiplica el punto final de cada ense
yo con "standard" por la concentración (unidades por ¡1) de lndilucián usada. El factor Standard finales nn pronedie de todo.los Valores parciales que son estadisticanente razonables.Factor Standard (u) 8 punto final standard (Il) Por concentreción standard (u/nl).
b) La potencia de la muestra se calcule multiplicando el factor etqgdard por la dilución de la nienn y dividiendo por el punto finalde cada ensayo con ella.
Potencia (¡l/m- Factor standard(u) x dilución (¡J/mg.)punto final nuestra (mi)
Para ¡ete métodoy con algunas pequeñas variantes para tg.dos los métodosbiológicos se deberán tener en cuenta las siguientee condiciones:
l) Microgrganisnode ensgxg: debe ser: a) sensible al antibióticoa ser ensayado, b) fácilmente actiVado y mantenido. c) no suecatible e cambios de sensibilidad y d) preferentemente no patógeno...
2) Mediode cultivos-conviene determinar perfectanente el medio ¡21;picio para el desarrollo del germenya que la composición delmismotiene gran influencia en la sensibilidad del punto final.
3) ggéculgt ee preferible inocular el medio de cultivo antes de serdistribuido en lee tubos. Coneste se gana en tiempo y además
ee obtiene un inóculo homogéneopara todo el ensayo. lo qne eede fundamental importancia¡ La cantidad a inocnler. una vez stq!dardizadas tanto las condiciones del ensayo comolas de ¡antonimiento del germen, conviene que sea constante para no correr elriesgo de tener ensayos irregulares c malos, yn sea por estar tgtalnente crecidos o por falta de crecimiento.
-31.
4) Tegperatnre de incubación: debe ser la apropiada para el crecimientc del microorganismo de ensayo.
5) 219229 de incubación! en realidad puede variar de unas pocas hg_ras s varios días según la Velocidad de crecimiento del germen.En este método gsneralnente es de 16 a 24 horas.
6) rento el material comola técnica debenser estériles.2- IétoúOS por difasiGn
En estos métodosse utiliza un medio de cultivo sólido.el cual es tracionadc en cajas de Petri. La inoculación se efectúaa granel, cuando el medio se mantiene todavía fluido, o sobre lasuperficie, una ven solidificadc.
La solución cuya potencia se quiere determinar, se poneen contacto con el medio cálido y el conjunto es incubado. La distancia entre el lugar original de contacto y el que alcanza por d;fusión una concentración inhibidora de la sustancia, se determinapor la ausencia o disminución de crecimiento del nicrocrganisno encss zona y con ella se tiene una medida de la concentración del inn;bidor en la solución original o en la muestra sólida. La distanciade difusión efectiva puede variar con machosfactores, pero si elmismotiempo se colocan soluciones conteniendo cantidades conocidasdel antibiótico (soluciones Standard) se puede obtener una curvacuyas coordenadas son en ordenadas las concentraciones de antibiófiicos y en absicaslas respuestas obtenidas y con ella, conocer la pgtencia de la muestra desconocida.
Uno de los metodos por difusión más asados, es el métodode la copa. En ‘ste las soluciones s ser ensayadas se colocan dentro de pequeños cilindros de 'a prox.10 Im de altura y 5 a 6 m dediámetro interno. que poeden.ser de vidrio. porcelana o acero inerg
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dable. y que se disponen previamente sobre ls capa de agar nntriegte, inoculado y endnreoido. Despues de la incubación (generalmente16-20 horas) se observarí un crecimiento bomcgencodel hicroorganig.mo, excepto alrededor de los cilindros donde el antibiótico difunde produciendo balon de inhibición circulares. Los diámetros de caos halos deben ser nedidos y comparados con los obtenidos con coacentraciones conocidas del antibiótico (soluciones standard). Otraposibilidad es la de colocar el material a ensayar en cavidades bgchas en el mismoagar. Este mótodc tiene la mismapreciai6n que elmétodode la copa y en algunas oportunidades tiene algunas ventajascomoen el caso de que se quiera determinar la potencia de una solución'qne tenga particulas en suspensión, que puedaninterferircon la difusión del antibiótico. Abrahamet al (1941) encontr6 quecuandoee queria deterninar potencia de penicilina en fluidos oonpteniendo globnlos rojos, por el sitodo de la copa. las celulas delos globalos interferian en la difusión de la penicilina.
Otra alternativa conveniente a los dos metodosanteriores. la constituye el neo de discos de papel de filtro. En ¿ste c5so los discos son embebidos en las solucionen en ensayo y luego cg_locados sobre la superficie del agar nutritivo. inoculadc y andar;01‘00
lientras que en el mctodode la copa la concentración dela sustancia. es la que determina el diámetro de la sona de inhibíción, en el metododel disco la responsable es la cantidad de dichasustancia.
Ios calculos son similares para todas las tecnicas por d;fusión y consisten en lo siguiente:
ï_-35
l) Usandopapel semilcgaritnico se construye una linea standard.no absisas se colocan los diámetros de los halos de inhibicióny en ordenadas las unidades del antibiótico standard.
2) Obteniendo los valores promedios de los diámetros de las sonasde inhibición producidas por cada dilución de la muestra y llevándolcs sobre la curva standard obtenida, se puedenhallar lasunidades de antibiótico que los provocan. Estas unidades multiplicadas por ls dilución de ln muestra, dan ls potencia de lsmisma.
3- ¡{É-todoturbidimétricgEn este método, al igual que sn el método por dilución,
se debenpreparar diferentes diluciones del standard y del materialcuya potencia se desea determinar, las que se agregarán en diferq!tes cantidades a tubos e los que se les adicionarí luego un volumendel medio de cultivo previamente inoculado.
Luego de una corta incubación,generalmente de 3 a 5 hs..las variaciones de crecimiento del microorganismo de ensayo en elmedionutritivo liquido son determinadas turbidimetricamcnte. Lsturbidez o más s ¡cundo la transmisicn de luz es generalmente nod;ds rotcelectricamentc.
Para efectuar el cálculo de potencia se hace uso de unacurva standard que se obtiene considerando en ordenadas las lecturas del galvnnómetroy en sbsisss las concentraciones del antibiótico stlndard. Luego. con los valores obtenidos para cada diluciónde ls muestra s ensayar, se recurre e ls citada curva y se cbtienoIn valor que mediante una simple operación da ls potencia buscada.
En este método, comose dijo anteriormente, los tiempos
-3s—
de 1nenbec16ncon la: cortos con le que ee ahorra, en le ¿eta-nin;ción, moho tiempo. nte. unido e que le. resultados obtenido. cons1 tienen mayorprecisión quelos comunión con lee otros n‘thde valoración. lo hacen eminente ventajoso.
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METOIDEy; ummcxog y; I._A_ smcnm
¡auque la Nistatina tiene un espectro de absorción carasteristioo, la intensidad del miximono puede ser usada comouna ugdida de la potencia de la mismaya que se observó que en algunas gportunidades una casi completa pérdida de su actividad biológicano produjo ningún cambio en dicho espectro.
Varios son los métodos biológicos que han aparecido parala valoración de la actividad de la nistatina a partir del comienzode su producción comercial en 1953.
Gold w.. Stander B. y Pennyr. del "Squibb Institute forMedical Research: llewBrunswick. NewJersey describieron dos métodos, uno por difusián en agar y cl otro por diluciones!I - Métodomr difusig'n en ya (1)
Consiste en colocar en fuentes pyrez especiales 160 nl deagar-basal inoculadc con 2 al de un cultivo de Candidaalbicans, d;Jer solidificar y mantener 2 s 3 horas a 5°C.
Para colocar las diferentes diluciones de la nuestra ydel standard se usan discos estériles de fi pulgada de papel absorbente, los que son sumergidos 2 a J segundos en las soluciones ypuestos, luego de eliminar el exceso del liquido, sobre el agar.
Las fuentes son incubadas a 37’0. durante 16 a 17 horas.La humedadambiente durante la incubación nc debe ser menor del
65%.
Lss lecturas se efectúan fotografiando las fuentes y determinando las sonas de inhibición alrededor de cada disco. Luegopor comparaciónde los resultados obtenidos con el standard y conla nuestra desconocidaae obtiene la potencia de la lisas.
.33.
II- Métodoggr diluciones (Para dosarel antibiático en fluidos ormdlnicos: sangre. orina y materias recalca).
Conaiste en fraccionar cantidades de 0,5 nl de medio decultivo, caldo extracto de carne y levadura, en tubos de Waeeerman.
(A1medio de cultivo se le adiciona Estreptomicina (S/pg/ml) paraevitar el desarrollo de contaminacioneebacterianas durante el ensayo) y luego agregar las diferentes dilucicnee del antibiótico.
Se utiliza comomicroorganismo de ensayo el Saccharomyceecerevieiae.
La incubación se efectúa a 25°C durante 16 horas.
La lectura ee puede hacer visualmente examinandoel sed;mento producido por el crecimiento dal germen o bien. comofrecuentementese encontraron dificultades para determinar el punto finalcon eee procedimiento, ee pueden agregar a cada tubo 0,5 ml de solución de cloruro de trifeniltetra zolium; ponerlos nuevamenteaincubar a 37°Cpor media hora y luego efectuar la lectura. Cualquierpequeñodesarrollo es se! fácilmente visible por la formación de unsedimentode color rojo.
Se han descripto además los siguientes metodos:III- Métodoespecia; 9252 sangre, definido por Tarbet J. Our! I. ySternberg, 1.3.
Utiliza el recuento microscópicodirecto de las blastoeperas de Candidatropicallia, desarrolladas durante 15 a 18 horasen las nue-trae de sangre diluidaa en un mediosintético.
El número de las mismas se una funcion de la cantidad de
nietatina presente. Comoen otros métodos, tambiín en ¡ete se detq;mina una curva standard cuyas coordenadas son: logaritmo del número
r__-39
deblnstosporns (ordenada) y unidades de nists‘cina por nl (choice).IV- ¡“todo mr digsifin en 352 (2). descripto por DonaldGroveyy William Randall ("División of Antibiotics, Food and Drug Administration, ILS. Dopartnwntof Health, Education and Wolters").
Eete método de difusión emplea para la colocación del en.tibiótico cilindros de acero inoxidable de diámetro interior iguale 6m (¿0,1 mm)y exterior a 8 mn(¿0.11113) y de altura iguala10II (3 0.1 m).
Comosolvente para el standard y las maestras utilize to;mamide.E1 primero se mantiene diluido en este solvente n una conce;trecián de 1.000 n/nl, durante 3 dias. Ia posterior dilución e leconcentración de ensayo se efectúa con buffer ph 6.
El microorganismode ensuo es el SeoohsronwcescerovisiseA.T.C.C. 9763.
El ensayo se incnba 16 e 18 horas s 37’0.La lectura y c-ïloulo de potencia se efectúan de acuerdo
e lo expresado anteriormente para métodosde difusión de sntibióticos.Y- Métodopgr difusión en agar (3), actualmente usado para la valgración del antibiótico.
Se diferencia del anterior en lo siguiente (ademásde algnnos pequeños detalles de técnica)!l) Enle para la colocaciónde las soluciones de nistatine discos
de papel de filtro (s es: 740-1:de i pulgada).2) Comosolvente utiliza propanol 70%. Las nuestras deben ser agita
das durante 3 horas pero favorecer ls disolución.VI.)Métodoturbidimétrig, recientemente aparecido, tn‘ descripto
4opor Julian Kramer del “Food and Drag Administration. Department ofHealth, education and Weuare, Washington".
Conniatc, comotodos loa métodos turbidinétrioon, en pr;parar diferentes diluciones del antibiótico standard y do la nue.tra incógnita y agregarlas en diferentes cantidades a tubos a lo.que ao los adicionará. luego, un volumendel medio de cultivo inoculado, pero se diferencia de la mayoría do ellos gn que la inca]!ción (a 26°C)-dura 16 a 18 horas»
Utiliza comomicroorganismo de ensayo Baochammycea cer;viaiae, A.‘I‘.C.C.9763, ol que se inocula. una vos ajustado a un v;lor de absorcián definido on fotocolorínetro. al 3 a 5130en el nodio de ensayo.
El solvente es NnE-dinetilformida ajustada a ph 6.5_‘_’D.3.Conél se diluye, el standard y las nuestras, a una concentraciónb1000 a 5000 u/ml y luego a 160 n/ml. Posteriormente a. efectúan nn;m diluciones en agua destilada estéril a concentracionesdel rango de 15 Vall.
La solución stock de standard so usará solamente l din.
Se pide que todas las diluciones del ensayo. tanto del ¡tantard cgno de laa nuestras, ¡o preparen simultáneamentepara evitar error“por pórdida .do potencia del antibiótico on el solvente.
Para efectuar las lecturas se utiliza un fotónetro apro
piado, con una longitud de onda de 530 n}: (Benach/t CombSpectronio20).
-41.
¿".ARIE EXPERIMENTAL
Per TRABAJOá DESARROLLAR
¡ga Parto:
ENSAYOI AJUSTE El! NUEVO MPÏIOTD PARA VAI/DRAE NISTATINA
I- Determinación primaria de las condiciones-de ensuyo.II- Elección del solvente apropiado para la disolución del antibiá_
tico a dosar.a) Estudio de la miscibilidad en agua de los posibles solventes
o utilizar.b) Prueba de la solubilidad do la Niatatina en loa uolvanton‘g
legidoo.o) Interferencia en el crecimiento del germen de ensayo de aqqg
llos que cumplanlas condiciones de los itons a y b.d) Deterninaoión do la concentración de antibiático a utilizur /
en los ensayos.o) Estabilidad de la Nistetina en los solventes no interforontoa.r) Control de solubilidad del antibiótico on el solvente una].
916.51onIII-Determinación de las condiciones definitivas de onaayo.
23, Parto:
REPROWCIBILIDAD DEL MF‘TOIDE LAS CONDICIOEIES QUE PEBJEITQ 3-0. APE
CACIUI PARA lá DETÏRMINACION VALCRESR'ÏSIDUALL‘S ALIMENTOS.
1- Boprodnoibilidad do datos.II- Corporaoi6n do los resultados obtonidoo con ol presento método
y con ol do difusión on placa. do agar.
a, Parto:
a 3111032521401101011m: ag asume; pm a consmvncwnM-*'“g;z.mn ¿ag 195221151 maga;ng “g
I- Hocto conservadoren “olga. tonto, limóny mn.II- Valoraciónde].antibiótico residual aplicando 01 “todo una";
“o
COICIBS IONE‘ GENERALES
-43
BROGAS, APARATOS,I MATERIALES A UTILIZAR
Drogas:l-Agar, meto.2-Aleoholetílico3- ' hobutflioo4- " inapropflioo5- ' ¡etílico6- ' propdlioo1-Anh1dr1doacéticoB-Dextronn. Roto9-Dionno
lO-Etuenglieollil-Extractode mana, ¡acto12- " "- Malta, "13-thlkrornollHistntin16-P1r1d1m '17-mPflengliool18-mPtonn. ¡acto
Apu-¡tonl-Autochn2-3-1.“ analítica (a 0.1 Ig)34W. 0-100g (.t 0,015)
termostatlndo.¡arcalam. Son-nun5M ¡ariaS-cinrn hunden do 37°C
447-Cámra incubadora de 25’0Futura de enterilizacfinw‘otocurínetro marca Matton, modelo402 -—m"provisto lo r1;
tro 640 Ay tubo para lectura con drenaje accionado porlnoio.
¡{J-{oruga automática para 2 oo. marca Comtrquu-iíéquina agitadom rotativa12-Mun pipetaadora, marcaBrowerMotencióneü'o a electrodo de vidrio marca Bochum modeloGM-Rflfirigarudora.
Materiales:“ram de alambrepara 36 tubos de 18 X150unZ-Hntarial de vidrio estéril: pipetaa (1 m1. 1/10; 5 m1, 1/10;
10 ml. 1/10 y 25 ml. 1/10), probetaa (250 nl). Erlenneyora y;rex (250 nl) y tu.de de 13 I 150 mn con tapa de aluminio.
J-Ma‘terial de vidrio no estéril! pjpetas (5 nl y 10 nl). probotaa (50 y 500 nl). francos graduados pyrex (de 3500 m1), orlonneyera pyren (1000 y 2000 nl) y vasos de precijitado (100y 250 ml).
Maduro bnnsen5-Pape1absorbente estérilG-Pupelpara esterilizaciónT-Trípode con tela metálica.
4smmENA PARTE¡asno g AJUer 2g y; NUEVO¡mono PARAVAIDBARM
I-DETERMINACION PRIMARIA QE LAS CONDICIONES y ENSAYO
La idea inicial ha sido probar 1a eficacia delganen de ensayoy el aedio de cultivo do].aisno atilizgdos para el nótodo de difusión en agar condicionándoloepara obtener un procedimientorápido. del tipo turbinátrico. para la valoración del antibiótico con lo qae eelagrar‘ ademásde rapidos, nayor exactitud y economia(nonor minero de Operadores. de laterial, aedioe eto.).
MAMENIO 2E_L ENSAYOA DESARROLLAR
Ea tenir el grado de oreoiliento del germende enano enfunción de distintas oonoentraoioneede antibiótico etandard. Iraear oon laa doe variablee una curva (curva etandard) y leer en analoa valores del grado de ereoiaiento obtenidos oon 1a nuestra problema. Realizar con loa datoe resultante. el oflcnle oorreapondie;te para obtener 1a potencia bancada.
carmen de magos Saooharowoee oereviaiae 1.2.0.0.9763Hgdioai ¡tilizarz
a)ledig de ensalggonmeiciánzl‘ripgona 0.5i; Extraoto de ¡alta 0.3%¡Ertraoto de Levadura 0,3%;Dextroea 1.0i.Pregaraciónareaar las drogae en elorden indicado.
Calentar hasta aprox.100.0 en Bañohria.
.46
l'iltrar a traves de p;pe].de filtro para clarificar elmedie.
Ajustar el ph de manera que despues de 1a esterilizaciónse obtenga ph 5.8.
Esterilizar en antoni;ve durante 15 minutos a 15 1h de pr:¡ión (121°C).
¡Medios de cultivo para el mantenimienMi1)lledio sólido: Idemanterior con
el agregado de 15h de agar.2)ledio líquido: Idemmedio de ens;
yo.Mantenimith de cepa: Se realizará con técnica esterilen la siguiente roms
1)Repiear semanalmenteel cultivo en egtries de mediosólido.
2)Inombar 16 horas a 37°C. Conservar enrefrigeradora.
3)E1 día antes del ensayo sembrar nn a3ea en 150 al de medio líquido.
4)Inonbar 16 a 20 horas 37°C.5)Usar este cultivo comoinócnls para
e]. ensayo.
¿47+
DETERMINACIONg}; a CONCENTRACIONgg moct_rm g g TIEMPO D_B
INCUBACIOI NECESAREO
OBJETO
Determinar ei con las condiciones inpneatae ee posible
obtener un crecimiento del germen de ensayo qne haga fectible 1a.;¡canción del métodoproyectado y elegir les nie convenientee,
FUNDAMENTO
Realizar incubecionee vnriando el tienpo y ln concentreoión del gerlon en el nedio de ensayo. Para obtener unn nedide del
grado de crecimiento erectnnr comparaciones en cada case contrn elmedio inoculndo ein incubar.
QECNICA
1) Preparar 1500 nl de ¡odio de ensayo.2) Fraccionar en 3 porciones de 500 nl cada unn en erlenneyere de
1000 nl y taperloe con tapón de algodón y oepnchón de papel.3) Esterilizer durante 15 ninutoe e 15 libras de presión (121'C.).
Deeata maneralo. nedice e utilizar para la. distintae conoce,trnoiones de inócnlo provendrfin de unn nienn preparación.
4) Entrinr e temperatura ambiente.5) Identificar los erlenneyere como3° 1. I' 2 y N' 3 e inconlerloe
con las siguientes cantidades de cultivo líquido:H’ 1: 7,5 ¡1 (concentración 1.5%)r 2: 15.0 ¡1 ( ' 3.0%)N. 3! 30,0 nl ( ' 5,0f)(Estes concentraciones han cido elegidas por estar en 1a q;na de 1o habitual-ente utilizado en ensayos de este tipo a;rn etroe antibióticos).
6)
7)8)
9)
10)
-4a
Fraccionar. cuidando las condiciones de noepnia. cada uno de ellos por 10 nl en 24 tubos de la X 150 In oon tape de aluninioeetoriloo convenientementeidentificadoe.Separar de cada grupo 12 tubos y refrigerarlos.Colocar loe restantee en una ¿rodilla para cada tio-po de incubación comonuestra el eequennt
aim. 31m. una. 4m. She.si 'o o o "6'6'6' o o o o o o _._..3% -—- o o o o o o o o o o o o
1,5% —- ¿ooo ooo ooo oood—-— e
Incubar on baño de agua termostatizedo n 31'0. durante los dietintoe tiempos.ledir en el rotocolorimetro Lumetron. calibrado e 100%con ei¡odio de ensayo sin inoculnr y con una sensibilidad, medida enel galvanónotro, de 15 divisiones para 10%de variación en lnescala del fotooolórínotro (100%:0div.- 10%de variaciónzlsdiv.), ln trnnsn1516n de los oultivoe sin incubar e inonbadoe.De esta manera ae obtendrán los vnloree del porcentaje de tran!nisión originados por la suspensión del germen en el medio decultivo en el momentoiztaiol del mm y los debidos al crecimiento del nisno durante los distintos tiempos de incubaoián.respectivamente.Lne diferencian (JCBentre estao transmisiones posibilitnr‘nlos resultados para la discusión del ensayo.
+49
DETERMINACIONgli ¿A ooncmwmczon pg mocum 1 g
2312:2590gg nnggacmn
Concentraciónd. lo, 5 3 fi 6 f
Ino'culo
Horas do Poroontajos de Transm1916nIncubación - A - Il 37° C.
2 i
A a — —— 23,095,0 70.7 90.3 62,0 77.5 43.0
3 95.0 71,0 90,3 59.5 77.0 ¡1,52h}. _-:'_. 0 221i 71.2 ¿.141
¿.8 70l8 90.3 60.3 77.3 42:0¿3 a 24.0 30,0 35.3
92.7 62.7 53.5 52.7 76.3 55.03 i 91,8 63,5 88,5 50.7 75,3 33.3
92,; 61,0 sono —— 12,1 32,892.3 62A 58.6 51.7 76.1 33.7¿su 29.9 36.9 42.4
93.5 58.0 89.0 46.7 76.7 28,796.0 57.3 88.3 44.3 76.0 28,5
4 29": 26.} 89.0 ¿id 16,0 21,194.6 5712 88.7 ¿15g? '16j2 28.3
Ax: 37.4 43.5 47.993.0 44.5 ‘53 32.792,8 42.7 85,5 32,7 .. _
5 23,0 ¿1,2 88 o ¿1d92.7 42.9 88.2 32.2
ZX: 49.8 56,0 -——.
e)
b v
o)
-50.
CONCLQSIOHEB
Inc condiciones ilpucstas (germen, mantenimiento del lisno y ngdios de cultivo) permiten el crecimiento sdecusdo del nicroor55_nisso de enssyc.- _Del estudio de los incrementos de crecimiento obtenidos cn funpción de les distintas concentraciones de inóaulo y tiempos deincubación se deduce que las condiciones sis propicios son:
Cono= de Inócg;o Tiempg de Inggbsción ¿31.5 S 4 e S horas 37.4 e 49.83,0 fi 3} a 5 " 36,9 e 56,06.0 f 3 e 4 ' 35.3 e 47.9
Considerando que será óptimo al menor tiempo de incubación noc;serio que produzca un crecimiento adecuado (¿3 - 30 s 40), y cgno de los datos consignados se deduce que pere un crecimiento ¿_gusl s1 obtenido con el 6%en 3 horas de incubación, se necesitan 3* horas con el 3* y-4-hoaa6—áe—inoubaeióny—eo—seceoitaa—3}
holas-oon—43—3#y 4 horao con el 1.5%. se eligen como condiciones s utilizar en los futuros ensayos los siguientes:
6 fi
3 hores1) CONCENTRACIoN DE INOCULO a
2) TIEMPO DE INCUBACION ¡
ILQECCICN DEL sommn APROPIAID PARA __T__L_A_DISOLUCION pg;
AN._'r14.3OlLCO¿mm
a) ESTUDIO DE LA MISCIBILIDAD EN AGUA DE LOS POSIBLES SOLVENTES A
UTILIEAR.
ogg¿mo
Realizada la dislluoión de la droga a donar en el eoívqgto aproyiado será necesaria una posterior dilución a la concentración de ensayo. Conoeo conveniente 1a realización de la misma onagua, para disminuir ln posibilidad de interferencias en el crecimiento del organismoutilizado, este estudio delimitari loa salve!tee en-loe que ee deberá determinar o confirmar lo solubilidad delantibiótico .
Solulïlidud cn g. porHOlvente 100 ml de ggua
A100“). 0.60.0000.-00....OOIOUOODOOOOOOOmIOOIOOOOOIC.etílico.........,......................................propílico.................................Ï............cisopropílico.........o...................Ï............o
(20°c.)......( Ü
O0.0.0.0.,000000OCIOOOOOOOOI C.)OOOOO.
ooo-ooooooooooooOOOoooe-ooo7.9).0.0.0hobutílico 0.0.00ooo-oooooooooooooolo
isoamilico nooo-ooo...00000000000... 2 (14. Co)oocoeobOROíliCO ooooo-oooooeoooooeooeoeoeo 0.073(22° Co)oooooo
Acetato de etilo ooocoeoooeeoooooooooooooooo8,5 (15° Co)oooeeo. propilo oooooooooooooooooooeooooo1.‘ 31‘s co)oooooe' butilo o.¡ooo-ooooeoeooooooeoooeo 0.5 (20. Ce)oeoooo' ¡mile ooooooooooooooeoooooooooooe 0.18 ( . )Oooooo
-52
ÉtilfiflfiliCOl o...000.00.90.0o00000oooottoooostoootoOOOOOOOOOOOGOGnPropilenglicol...oooo.......... OOOOoGotoGOGOOOG‘OtboGOGOO‘OOGCO.
0.0.6.60... 0.07 (22. c.)ooooooo0000000.... 0.05 (16° co)oooooooooo-009900. 0’08 (2°. co)ooooooo
enceno ooo-oooooooooooooooooooo
‘oluano ooooooóoooooooooooooooooretracloruro de carbono........L-l diCIOÏOGÑBHO00000000000000. 0.000000... 0'55 ( ' )oonoooo
l’z n OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOIOO0.9 ( )IOIO..O
.Pioxano OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOooooooooo;.o¡osoJÏaogosocoo-oooo
lnhidrido acético 00.00.0600... oooosoooooolz 000.000a0...0..0..O..0.00D0.000000.ÓOI.0O
.—?crmam1daoooooooooooooooooooóoo“Juridinaofoooooooooooooooooooooo .0....0....OOO7]O:OOO‘OOOI.00...
ENCLUS IONES
Considerando comolímite de solubilidad aplicable! 10%,los solventes a estudiar con:
ALmHCL ¡{UTIL-ICO
" ETII ICO
' PROPILICO" ISOPRCPILICO
" ISC-IÉUTILICO
ETILENGLI COL
FROPILEBGIICÜL
ANHIDRIIX.) A02721100
DIO RARO
P IR IDINA
FÓRMÁMIDA
¿sq-JJ..I
b) PRUEBA Dp LA SÜLUTITIÏKF DE IA NISTATINA EN ”" SO "'“”“" ELEGIA/n, 1 il.L_.u
DOS.—OBJETO
Estudiar comparativnmonto, dentro do las condiciones ro
qporidas para ol ensayo, la disolución do 1a nistatina en los solventes elegidos.
TECNICA
Disolver 10 mg de nistatinn en 2 y 5 y 10 m1 de cada solvento concentrado y diluido al 70 á on agua. Agitar durante 30 y
60 minutos y obaorVHr. Cono una de las ventajaa de los métodoa tu;lidinótrioos radica en su corto tiempo de incubación, que permitola realización completa del ensayo en una Jornada, es convenienteqno la preparaoi6n de las muestras insuman cl menor tiempo posible.
Por esta razón on el presente ensayo se limitan los tiempos de ag;tación para la selección de lo. solventea por su poder de disolu——ción del antibiótico a 30 y 60 minutos.
RESULTAÏDS OBTHNIDOS"10“..." ConmnNn'do' ¡Lhn¿o¡1 7° í
"1"“ 2.1 - su ion 2m 5m mui("Escow'nn"Emu/ml)(mamada)Ham (¿montovw
uflnlgnflüioo xa ¡xa un: z: ¡11'. O - - o - ‘l Mi” - - a. 0 I Il' inopnufihieo c- -' «a o - I' ¡conducto - - o no noo. un ¡su ¡.1701,
hnluunimn. I: al: ¡Il o - .broma-menea n n: n. - . .‘hmüdrukpomfinoo - o o no:úoo.dnxqgnnfl 70!¡kununo - o o I: un: xx:¡innumn ¡a III IIIanfllúdl ¡a ¡:1 3:: ¡ü
44poco soluble I Algo soluble t xBastante soluble s zxSoluble a zx:
5925}no existieron diferencias apreciables en los resultados cbtgnidos en 30 y 60 ¡inutoe de agitación;En los solventes en que se consideró el antibiótico solublese observaron algunas pequeñas particulas en suspensión lasque según lo determinado en el ¡Stado de difusión en agar setrata de material inerte.
CONCLQSIONES
a) Los solventes que onnplsn las condiciones propuestas lan!ALCOHOLIETILICO
" PROPILICO 70%
ETILENGLICOL
PROPILENGLIOOL
momo 10%ÏIRIDINA
FORMAMIDA
b) El tiempode agitación propicio para ls disoluoi6n del antibiótioo en los solventes elegidos es de 30 minutos.
e) La concentración .4:1.. de nistatins que. de aonordocon las llnitaoionss ispuestee. puede ser obtenida con los solventes ens;ciados esti en ls sona de 2500 a 5000a/hl.
-55
o) mmrmmcn g gg CRECIMIENTODEI.03mm 21; ENSAYOgn; ¿302.199
sonvmss íïUE CUMPM ms CONDICIONESQE LOS mms 3 1 1.
OBJETO
Seleccionar aquellos solventes que no modifiquen el nornal desarrollo del germenkdursnteel periodo de incubación del ensayc.
FUNDAMENTO
¡hair el grado de crecimiento del geraen de ensayo en ¡r3senoia de oantldadoa crecientes de cada uno de los solventes a ens!yar y deterlinar la Variación del mismopor comparación con ensayostestigos sin soIVento.
:ggNICAl) Colocar en tubos estériles de 18 I 150 un con'tape de aluminio
las siguientes cantidades de los solvontes a ensayar: 0.0 - 0,050.1 -. 0.2 - 0.4 - 0.6 - 0.a y 1.o ni.
2 Completarel volumena 1 nl con agua destilada estéril.3) Extraer, esterilnsnte, 100 Il del nedio de ensayo para calibra
ción del totcoolímetro.—4) Inocular el medio resjante al 6%con un cultivo de 16 a 24 horas
de Saccharonyosscerevisiae.
V
V5 Fraccionar, cuidando las condiciones de asepsia, este medio enlos tubos anteriores colocando 9 nl en cada uno.
C) Incubar en baño termostatizado a 37°C durante 3 horas.7) Agregar a cada tubo 0.5 a1 de solución de torno]. 1:3 utilizando
una Jeringa Cronwall de 2 al y agitar vigorosanente.
-56—
8) Leer el porcentaje de transniaión de cada ensayo con el fotocorínetrc Lunetrcn (Calibradc. 100%:0 div.) 10%de variaciónn 15div.).
9) Calcular la variación en el grado de crecimiento del germendeensayo para cada concentración de lcc distintos aclventee uaadceefectuando las diferencian entre las lecturas de loa fi de tran;sición obtenidos con y sin ellcc (ruben teatigcaa 0.0 nl).
ObaervacicnegtDeacuerdo a las cantidadea de solvente. agregadae a ca
da tube, la concentración final de lea mismceen el medio de ensayoeerfit
Cantidades agregada. fl de solvente
de aclvÍ2Ï; por tubo obt.nido
0.0 00,05 0.50,1 l0,2 20.4 40,6 60,8 81,0 lo
Dichas cantidades ae han completado antea del agregado del mediede ensayo inoculadc al volumende l nl.con agua destilada estérilpara evitar la variación de la concentración del inóculc que de lecontrario ee produciría y obtener loa porcentajes de eclvente previstos.
-57.
El egresado de eolnoio'n de rom]. deepufie de h ineubeoión ee he gtechado para inpedir el crecimientopoeterior del screen de me¡00"Conlos resultados obtenidos se han trazado lee eemapondienteeme de variación ueandocomoordenada-loe f de Misión yabsiaae las cantidades agregadas.
¿58
EMT}!C
sObe n
1JL'
C‘a0'11:I‘m‘n‘ófiP‘Gfi‘69:‘6'!‘99“89‘69¡‘69‘l-tWith ‘l-iSO"“y9‘61ros‘05esves‘as'zs'u.‘u.‘urueq‘asu‘mt‘o'L'tso'a;p'rs‘m'099‘09'09‘09"ce'aa"evn‘15"ISrms‘15:‘oí‘ls1'15--‘15L‘otB‘u‘oL‘óz‘Ee‘69‘íome‘09‘09¡0‘09‘t9«‘o6‘a9t‘c9b‘a9‘a9r‘ae¿“to‘aa‘ao‘99‘90‘10p‘la‘u"a.E‘oL‘u9‘.:‘u«‘uru'umep‘ce‘ce‘sele‘ta‘¿oI‘laoa'cop‘a‘cac'oo‘u.o‘u.ru.‘u.i‘mE‘vnn‘w‘59‘Lc‘93‘13p‘lg{o‘aah‘saVía"o't“¡InanmnïzÏrnnzbruta?. I'm-Innnm '‘'
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O‘Gfi
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Q‘SL
0‘61
¿‘19
5‘69
0‘61a‘Lq
9‘6!¿‘91
0‘09q‘ts5'156‘15
6‘9L6‘990‘159‘06
9'9‘69339€6‘99
fi‘8‘010‘818'69
o‘st‘gLo‘eL6‘41
E‘LaS‘Lq
¡‘910‘61
:11111!¡H‘flmnrjmnz.“dis:“WWWJ¿l
I
-69
.60.
Cálgglg de ¿a variación máximaggeptable del porcentaje de tragggiI
giga producida por la interferencia del solvente.Considerandolas limitaciones y conclusiones efectuadas
en los siguientes ensayos anteriores:1) Determinsgién de la concentración de inócglo l o; tiegpg de ¿gp
ggbacióg necesario:Conlas condiciones elegidas, ooncontrscián de inóculo: 6%ytiempo de incubación, 3 horas, se obtiene un incremento en elgrado de crecimiento de 35.3 (expresado en porciento de trenes;sión).
2) Mscib lidad en ua de os osibles solventes t lizar:Limite de solubilidad del solvente en agus no menor s 105
3) Prueba de solubilidad de nistatina en los solventes elegidos:Ls concentración máximado niststins en los solventes que puedeser obtenida, esta en ls sona de 2500 a 5000 u/hl..
se efectuara el siguiente planteo:Trabajando con:e) Solución del antibiótico en el solvente: 4000 n/hl (de acuerdo
el)b) Posterior dilución en agus e 400 u/sl, lo que corresponde s uns
concentración del solvente en agus igual sl 101 (de acuerdo s 2)yo) Incresente total en el crecimiento del germenen el ensayo de
35.0 (de acuerdo a l) que se establece cono posible vnriaoión sproducirse en el ensayo con antibiótico.
se obtendrá que: diferencias del lfi de transnisión serán debidass uns cantidad de antibiótico que results de ls siguiente proporción:
-61
351 e 400 n i n 15 e ¡n
/ g. ¿ago-11.8 unidades de antiiiótice
Esta cantidad de antibiótico aignifica una Variación del2;9%en 1a potencia de ln solución empleada (400 u/bl).
Proporcionalmente a estos valores se obtendrá para un 2%de transmisión 3 2_z, s unidades de antibióticos y 5.3, 76de variacion
de potencia y para nn Ji de transmisión i 39.2 unidades de antibifltico y 8.63 de variación de potencia.
¿etiaando comoerror aceptable en loa métodoa de valoreoión turlidinetriooe hasta un 6 fi ae deberí limitar 1a interferencia del aolvente a variaciones de hasta un 2%de transmisión.
Comoel ensayo se basa en 1a comparación de 1a soluciónatandard con la solución de 1a nuestra incógnita dicha interferencia ee anula cuando ambas aolucicnea con equivalentes pues en estecaso 1a cantidad de oOIVenteque ateotarí a ceda tubo ¡eri identioe.
La estimación aproximada de 1a potencia de la nuestra avalorar coloca a1 ensayo cerca de esta condición opti-a y permiteampliar 1a variación de transmisión producida por el solvente einque el nieto afecte aignitivnnente el ensayo.
Aunadmitiendo un error en 1a potencia del deaoonoeidedel 50%1a cantidad del aolvente que interferir‘ en el ensayo quedará reducida a 1a mitad. Por ello 1a limitación de transmisión ggro la elección de los solvontee de acuerdo a en interferencia abaglata será estimada en un 4%. 1a que por lo que antecede, en las pgcree condiciones ooeeionar‘ en el ensayo una interferencia relativade un 2%(correspondiente a un 5.81 de variación de potencia).
variaciones de crecimiangDe los datos obtenidos en el ensayo resulta ol siguientc
-62
cuadro:
fi de Transmision
SOHEITE ‘H x. x, A. xz A2 x3 A3,ïxúgggquZQÉQ. xl-xn Efijfi!z_¿2:¿gLngz_gglv. x3rxn,
matan 45.9 47.2 1,3 48,1. 2,2 51,0 5.1LPl'opilcnglicol 45.9 47.2 1.3 48,7 2,8 51.4 9.5
tmenguooi 45.9 48.3 2.4 49.9 4.o 51.7 5,8omnidn 45.9 49.4 3.5 50,2 4,3 59.5 13.6Dioxnno 45.9 49,1 3.2 5391 792 6004 14”Alumni!!!) 45.9 68.3 22.9 77.2 31.3 81.4 35.5Piridina 45,9 69,1 23.2 78.5 32.6 80.5 34.6
¡GTA!No se tuvieron en cuenta laa variaciones obtonidaa con conce;tracionea superiores al 2%por resultar francamente interrorentes.
Isoasolventes elegido. y la. concentraciones finales máx;CONC SION
las a que los mismospueden usaran
Solvento Cono. final máxima
Alcohol metílicoPropilenglicol .E'bilenglicolFormamidaDioxano
-63
d) DETERMINACION .123:¿LA CDNCENTRACIONQE; ANTIBIOTQCD á QEILIZAI fl
LOS ENSAYOS
OBJETO
Determinarsi dentro de las limitaciones establecidas en
los ensayos anteriores, es posible obtener una concentración de agtibiótico conveniente, para la realización del ensayo.
ZQEQAMENTQ
COnsiderando;
l) Concentraciónprimaria de antibiótico en el soltente I 4000 u/nl(de acuerdo al apartado b) y
2) Concentración final máximano interferente de los solventes enel ensayo = 0.5% (de acuerdo al apartado o),
1a cantidad mínimade antibiótico por nl a utilizar en la determinación debera ser de 20 unidades (0.51 de 4000).
El presente ensayo consiste en medir el grado de creci-—niento del germen enfrentado con concentraciones de 0 a 20 I/hl denistatina para determinar cual de ellas resulta másconveniente.
IÉQHIQA
l) Pesar 25 e 50 a5 (;_O,l mg) de antibiótico por duplicado.2) Disolver en la cantidad necesaria de alcohol ndtilico para obtg
ner una concentración de 4000 u/nl.3) ¿gitar durante 30 minutos en máquinaagitadora.4) Diluir cada una de las soluciones e una concentración de 200 u/hl
con agua destilada estéril.5) Pipetoar por duplicado cada una de las diluciones obtenidas en
tubos estériles de lB X 150 un con tape de aluminio las siguiqg
6)
7)
V
v9
10)
11)
12U
13)
tec cantidades!0.o - 0.1- 0.2- 0.3- o.+—0.5- 0.6- 0.7- 0.8- 0,9 y 1.o ni.Couplctar n 1 m1. el contenido dc cada tubo con agua destiladacstéril.Extraer, ostérilmento 100 ¡1 del medio do ensayo para calibración del fotocolcrimetro.
Inocular 01 mediorestante al 6%con cl cultivo líquido dc ngcharomyceccercvisiae.Fraccionar, cuidando las condiciones dc esterilidad, 9 m1delmedio ensayo inoculado en cada tubo utilizando máquina pipetegdora. En esta forma las concentraciones de nistatina en cada gno dc ¡lloc serán:o. 2- 4- 6- 8- 10- 12- 14- 16- 18 y 20 u/hi.Inoubar los tubos en baño tornostatizado a 37°C durante 3 horan.Agregar a cado tubo 0,5 ¡1 dc una solución dc formal 1:3 y ng;tar vigorosanento.Mcdir cl f de transmisión do cada ensayo con ol fotocoloríno-—tro Lunctron (calibrado 100%:0div.¡ 10%dc variaciónlIS div.)Calcular los incremento: (A) obtenidos antro la transmisionos originadas cun cada concentración de antibiótico y sin 61.
O
solventesMetanol
ENSAYOS.
mmsmacmn ¿A CONCENTRACIONDE .ANTIBIOTICO¿4,UTILIZAR
¡nea-ara:nietaunaenpolvo,pot2600¡1/114
Prap.delInóculo
CantdeCant.deCultivo MdeEan“11a.Agregado
(ml)ml)
delaaSolucione
SolventeAeregaddp/ob-t.43oon/mJJ
1mm
lPrep. [iCant.peuada
(me)
I31,2
DilJnAgua det.p/obt. 200n/ml
20,31/20
700
18,5"
El! ze.
45
-66—
Bosgltadoa Obtenidos:
Cant. UnidadesAgregada de Nistg fi de Transmisión801.Ant¿ tina Iden+ L [5biética por mLen
(ml) 108mboa I II I II ¡odia 11"!)0,5. ¡90.8 ¡e0,7 x70,5 12 X6 79,0 79.1 78.9 78.5 78.9 36,90,5 10 x5 78,0 77,9 77,9 77,4 77.8 35.80.48 R40,3 6 X3 739° 31.70,2 4 x2 59,9 70.0 69.9 69.9 69.9 27.9
o‘o o zo 42.5 41.6 42.0 42,1 42.0 I I
CONCIQ SIC 1115.2
Admitiendo comoincremento mínimo total de transmisión
para el ensayos 35,0% 1a concentración do ln solución de antibiót}oo a utilizar podrá esta: comprandidaentre 100 y 200 n/nl (conertración máximaque enfrentará al germen de ensayo: 10 y 20 n/Ilrespectivamente).
e) ESTABILIDADDE ¿A NISTATINAy; ¿gg SOLVENTES¿[q grmmzmns
Qfiiïgl_ Elegir el solvente que produzca le menor varinoi6n en In
actividad biológica del antibiótico durante el mayortiempo posiblecon lo que se logrurá! 1) Eliminar del método los errores que seproducirían por la variación de la potencia del antibiótico duranteel tiempo de ensayo y 2) Usar 1a solución standard en más de un q!nayo con las consiguientes ventajas de comparación de datos y economia.
FUNDAMENTO
Compararla actividad biológica del antibiótico entre unsolución recibntumente preparada y otra conservada a 5°c duranteun tiempo determinado, para cada uno de loa solventes consideradosno interferentea.
QEQNICA
A-Prepirición de la mgcstrg1) Pasar 25 a so mg (.t 0,1 mg) de antibiótico por duplicado.2) Disolver en cada uno de los solventes e ensayar para obtener
una concentración de 4000 u/nl. (Dílaa’o’n: fics)Asitar durante 30 minutos en máquina agitadora.V3
4) Conservar estao soluciones a É 5° C durante el tiempo estabigoido en los distintos ensayos.
5) El día a efectuar 1a deterninaoión preparar por duplicado aolución reciente procedimiento en la forma indicada en l),2)33).
6 Diluir las soluciones recientes y las conservadas n una conV
ZÉÉ -68—
cent-ración de 200 u/nl con agua destilada estéril. (Dílva'oívrfio)7),?1petcar por cuatriplioado, cuidando las condiciones dc onto
rilidad, cn tubos cct‘riloc de 18 X150 II con tapa dc ¿lulinic, las siguientes cantidades dc catas solucionen: 0.0- 0,10,2- 0.3- 0.4- 0.5- 0,6- 0,7. 0.8- 0,9 y 1,0 ¡1.
B-¿gggplación y fraccionamiento del;ggdio de cuna1) Extraer, octárilmcnte, 100 m1 del medio de ensayo para ser u
sado en la calibración del fotocolorímetro.
2) Inooular al medio restante al 6%con c1 cultivo líquido de Segcharomyccs cereviciae.
3) Fraccionar, cuidando las condiciones de esterilidad, 9 nl delmedio de oncayc inoculado en cada tubo utilizando níquinn pingtoadorl.
c-Incgbación del onagloColocar los tubos en el baño termostatizado n 37° O. durante 3ng1'83.
IbInnctivaciógAgregar a cada tubo, 0.5 ml de una lolución dc formal 1a 3 y 351tor vigoroaamcnte.
E-LegturaMedir ol porcentaje de transminión de cada ensayo con cl fotocolorímetro Lumetron (calibrado. 100%!0 div.¡ 10%dc variacion:15 div.).
P-Maroar dichos Valores cn un eiatoma do coordenadas utilizando p;pel milinotrado aritmética considerando en crdcnddaa los porcentajcc de transmisión y en nbeiana las cantidades de solución doantibiótico agregadasy trazar las curvas por ellos definidas.
¡naa pernitirán la visualización de la posible variación do lapotencia del antibiótico por efecto de an conservación en cadaeolventeo
G-CQQQQgo 1a ¡ciencia de las aglgoionoo conservadas on gada og;lento.1) Proaodiar laa 1ectaraa de porcentajes de transmisión oorroopog
dientes a loa tubo- con 0.2- 0.3- y 0,4 nl de la viola.2)2) Leer en la curva obtenida con 1a colación reciente 1a cantidad
de antibiótico correspondiente a cada pronodio hallado para1a solución conservada.
3) Determinar con cada uno de estos valoren la cantidad niatatina en u/nl aplicando la aigniento fórmula:
¡I
leot.en gráficoI factor dil. - n uno/¡1n’ nl de col. conomgreg. ‘
4) Eliminar-loa Valores aberranteo. Pro-odiar loa valoren restanteo y desechar loa «¡noee separen en más de]. 1071do]. valorpromedio. l
S) Obtener el 'pronedio final.ll-Deteminar e]. fi de variación en cada cano.
X Para +odo= €5+03 cnñd)‘°5 la ¿[Odón Final semi: %3(%"5'/¿°)
mas.70.W
¡dv-¡tmm mmm El!mmm“W lo1- mw M del1116:1111
l canaria-gmmmmu WhMfiofi a. . r to {diod. ná. 'm y I I 2331173561)mg?“ m (nl) «¡3,15011
M I 15,2 . 16,8_ ¡la1 n 27.8 ‘ 18,1. "
¡1- . . m 721' 29.2 19.0 "m _ yn a» 15,8 "
-71.Reenltadgg Obtenidos a
‘Cmtida f de Transmisión“una Solución Reciento Solución conservada 1 dia
(nl) I II #1 II rom. I II I II Prom.
1.o 76.3 75.6 75.0 75.3 75.5 70.! 270.0- 69.3' 69.6 69.80.o 74.7 74.3 13.8 74.0 74,2 68.3 67.7 68.8 68,3 68,20.a 72,1 72,7 72.3 11,1 72,3 66,8 66.8 68.0 67.5 67.20.1 72.5 71.1 71.3 71.0 71.6 65.7 66.5 66.5 66.0 66,1
0.6 69.7 70.3 70.3 v0.5 ho.2 63.9 64.3 64.5 64.3 64.20.5 944á'sa.o 67,7 67.7 7.a 60.3 61,3 60,9 59.8 60.50.4 66.1 64.8 65.0 64.3 5.2 53.5 54.3 56,3 55.9 55.10.3 60.3 59,3 56.7 57.7 8.5 44.3 44.3 46.3 46.3 45.80.2 48.1 48.5 46.7 46.1 7.5 38.0 38.5 37.7 38.8 38.20,1 40,7 39.3 38.0 38,3 9.2 34.5 34.0 34.0 35.3 34.4
0.o 31,7 31.7 32.0 32.8 32.1 30.7 32.3 32.6 |31.5 31.8
Variación de la Potencia deen
gráfico (n/il)
¡MvWwiz.«h
-73
ESTABILQQ
[numMinimum 26mm.Preparaeióndel 116mm
¡a“m ma“ 5- "‘ “‘“"" 323;?m ¡mapuch-Aand-u- un! qu;1adapanel: “Aeris-b(la) meno J (11;
W‘ I 30.2 19.6 1fish1
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Reggina“ Obtengdou-74
W s u muda"2:3" 801mbhace. muakm 1 un
x n x n run. ‘ r n z n nu.
1,0 11.5 71.5 19.5 71.5 71.7 63.5 ¿Mi “.0 63.5 6M
0.9 me 13.6 71.5 11,5 70.9 62,0 60.0 62.2 63.0 62.5
0,8 7a,. 70,0 11,8 70,5 70,5 61,5 60,0 61,¡ 61,9 61,1
0.1 69.0 69,0 68,: 63,2 63,6 60,5 60.5 60,0 60,9 60,5
0.6 67.0 67.0 67.5 67.6 67,! 57.7 57.3 57.9 58.2 57.!
0.5 63.0 63,0 6h) 65,0 63.3 52.6 Si) 58.7 52.3 58.!
o» 58.6 57.5 55.1 99,6 57.8 ¡5.6 ¡5,2 ¡6.o ¡5.6 ¡5.6
0,3 50,0 ¡9,6 ¡7.o ¡9.5 l¡9.o ¡0,6 ¡9.o ¡1.¡ ¡0,0 ¡un
9,: ¡3,6 ¡2,6 ¡1,9 ¡1,5 ¡2,2 36,0 36,¡ 36,: 37,0 36,6
0,1 37.0 37.0 35.0 31.0 36.5 32.0 33.0 32.6 .h 32.3
-o,o 29.5 ¡6,1 29,0 30.1 29,3 39.0 9.013,1 :0 En
W‘W hemunm. M M m
Lwash (fé) (ul-4) (v/II) (i)o,¡ 5°,: ¡su
0.3 35.3 2350 m ¡2,0
0,: 21,0 noo
-7s
ogsmncgogm ENSAYOE s (Corresponde.¡»8. 86)
Si bien los resultados obtenidos con lo. nolvvntoo proa;langlicol y otilongltool son igualncntq satisfactorios. su ¡lo rosnlta poco práctico ¿debido a la viscosidad do los ¡18.05.
Para trntar de eliminar esta inconvontonto. Cl la próxiIl determinación, ¡o onsaylrí a uno de 0119- en ¡ancla con notanolm
EESAEILIQAB
mas un 3
posada(me)
33.3 21.7
31.3 20.3
29.9 19.4
oa ado b an 8!
Can't. í de TransmieiágMr°g' Sol. reciente Sol. coa-¿mmm5 digi
ml) i II I II ¿om I 11 I ¿I PrggH1.0 79.6 79.0|80a0 0.4 79.7 Emili-M3 Wifi 76.0 74.0099 79.0 79.0 79.2 9.2 79.1 73.0 71.8 75,0 75.0 73.70.8 78.0 73.0 73.0 {3.3 73.0 72.5 71.7 72.7 73,5 72"
0.7 77.0 L77.377.0 71.3 bom 72.7 72.9 11.30.6 75.5 75.5 74.8 67.0 9.4 71.5 70.6 ¡9"0.5 74.0 bm 74.0 65.5 ¡.5 9.o 67.6 66.60.4 L12.5h2.5 71.3 60,0 3.o 5.o 63,6 62,9
0.3 9.9 9.5 69.9 5x6 5.o '.o 54.5 57.30.2 3.5 .6 64.6 51.6 1.6 1.3 52.3 51,70.1 .0 0.a 49.5 41,0 1.o 0,4 43.0 41.20.0 33.3 33,0 33.7 37.5 .0 9.0 33,6 38.2
Variación do 1.a Potencia de Sol. Cana. 5 diasSantidad. Lectura en Potencia Potencia Promedio PérdidaPgregada Gráfico dal) ulnl fi(m1) (MMM
0.4 37.5 18800.3 30.0 aooo 2030 49,20.2 22,0 2200
3.79- {WETHESGLICOL mm msnm“ ENPOLVO;Mmm u/m
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ELz 29,8 ' 19.3 1/20 '
n 29,7 19,3 z un {La
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n 32,8 21.3 "
Beaultadga thenidgsn
Cantidad1 it de TransmisiónAgrogadal
(m1) 80;, rflgte ahogger'mda 2 <ng_g__I L1: 1 II Prom. I II I II Prom.
1.0 79. 79.9 79.0 79.2 79.5 79.0 80.0 30.0 79.9 79.7
2.9 79. 73.0 79,3 79.379"? 79.0 79,1 79.7 79.5 79.3.8 79. 92.4 78.6 79.1 78.9 18.9 79,0 79.4 78.5 78.90,7 78, 78.0 17,6 78.0 77,9 73.0 77,6 78,1 78,3 73,0096 77. 77.2 77.6 77.5 77.3 17,0 76,8 77,0 77.6 77,10.5 75. 75,9 75,5 75.9 75.9 75.2 75,8 75.4 76.3 75.90.4 75. 74,2 75.0 75.1 74.8 73.9 74.3 74,9 74.9 74.50.3 71. 71,5 72.0 72,2 71.3 72.5 71.6 72.0 71.6 71.90.2 — 67,8 68,0 68,6 67.8 66.8 — 67,6 67,2 66,90,1 53. 53.5 55.0 55.0 54.0 52.3 54.5 52.4 54.5 53.4
0.o 33.9 37.5 38.6 33.3 38.0 38.1 39.3 33.0 38.3
Variación de la Potencia de Solución Conacrvada 5 ciasCantidad Lectura en Potencia Potencia PérdidaAh: réf ico u/mlz Promedio f
(mi) {yidadeel n/ml0.4» 79.5 3970
0,3 60.0 4000 3940 1.50.2 38.5 3850
-82
., ESTABILIDAD
M122
361.1!thFERROL mm: “¡him m Domo-roma m n/nz.
hopqracián de lu sanciones Prepa-¿ción m Itñculq'
Cmudnd‘lMvenh mm Bmfldiíh aut. dempuedaAmadomm. Idioülgthough(m) plate“: n/ob' wo HaedoMMM“LJLH
Con. 22,8urna”. I 35,0 1/3 h ¡k d5 ¿{a
n 3'52 22,3 ' mm 491
I 33,2 21:5 "¡calmo w n 321,3 "
Reeg;jadga Obtenidoat
-83
Cantidad f d. TransmisiónAgregada Sol. reciente Sol.Conaervada 5 días
("1) I II I II Proa. I II I II Prom.
1.o 6,6 80.6 80,6leo,5 80,6 80,5 80.5 80.6 0.2|80.40.9 79.6 79.9 80.0 79.7 79.3 79.5 79.5 79.8 79.6 79.60.a 79.0 79.0 79.5 79.1 79.1 79.3 79.0 79.5 79.2 79.30.7 58.9 78.3 78,6 78.5 78.6 78.3 78.0 78.3 78.5 78.40.6 fia,o 77.6 77.6 77.7 77.7 77.5 77.6 77.5 - 77.50.5 76.8 76.8 76.8 76.7 76.8' 76.4 76.3 76.6 - 76.40.4 75.5 75.5 75.4 75.5 75.5 74.6 74.3 74.8 75.0 14.70.3 73.9 73.4 72.6 W3.273.3 12.1 71.5 73.2 ¿2.o 72,2
0,2 59.559,5 69.6 ¡69.4 69,5 68.4 ¿8.5 fióBJ 68.5 68,50.1 56.1 58.1 61,4 58.4 58.5 53.0 52.4 54.6 2.5 53,10.o 37.9 38.6 38.5 9.o 38.2 38.7 38.3 38.0 8.2 33,3
Variación de la Potencia de Solución Cnnservadn 5 días
Cangidzs LEOÏÉÏ: en Potonoia ggfogfga PérdidaASÏmÏÏ (¿ÏdaggaL "{"L "'1- "
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¡olvcnto ul/ biótico en el aq; Intenci( ml) vente (días)
tooo 1 37,0 - I“¿,0
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" 3 o,o
" 5 1,0
. 3 0,0 1,2 - 0,0
‘ h 5.7
' 5 3,5
QQEA;1) Los resultados obtenidos con formanida contradicen 1o o;preaado on el libro "AzuayIcthodn of Antibotioa' de Grg_
ve D. y gandall w.. pág. 116, donde ae considera que unasolución de 1000a/il del antibiótico en el aotvcnte eocetable, lantenida a É 5°c,durante 3 días.
2) E1 hecho de que 1a solución Standard pueda utilizarsedurant. 3 dias resulta sumamenteconveniente si ne ticne en cuenta ¡no cn los métodos on uso ¡e cita ln nec;
-110;
nidad do exponnr ol ontibtátioo 01 ¡{nino tio-po posiblefront. al solvente aunado (propano).70! on 61 do phou y ¡.1 anota torna-¡idaen .1 mbmnótruo aaamollado por P.D.A.)o
QQEQLHÉIQEEÉ
o) Doacuerdo ¡1 estudio del porcentajo do p‘rdida do potencia do
bV
la ooluotón ¡took del antibiotioo lo. oolventoo nio oonvonicntonresultan nor!rnonnmcucoz.y ¡Ezcu 501a. mormcncomruou Doma.o qu. la viscosidad del propilongliool 1o hace poco práctico.ol solvente de elección oo:¡32cm50%dempmcucomuonSo establece comotiempo máximodo conservación do la solucionIto’k (¿oooVal): 3 diu.
-111
1>LL_MR0DEQWQEBWEHiLW mg:IENTE ELEGIID w
Asegurarque la'nlstatina en las condiciones dofinidas ndisuelve totallonto, oonfirnando lo apuntado on ol 1ta b. do quoha partículas chau-md“ en suspensl‘n corresponden.¡anual noactivo.
MMTratar de disolver la droga a la concentración do 4000
l/IJ. agttindola durant. 30y 90 unha y dotar-1m la potenciado onda una do ha solucion“ aplicando ol ¡{todo de rutina.m1) rozar. por duplicado. 25 a 501g (3 0,1 l‘) de Mat-tina.2) Agregarla cantidad necesaria do inch SOSInhml-Propllongu
col obtuer unaoonoontraol‘ndo4000¡Il-l.3) ¡altar “tu ¡upon-tono-Jo y 90llanto- respectivas“. on4
quina agitador..4) num ln ¡tam a la oonoontrnclónde mayo instantanea“
despu‘ndo ser rotuhm do asunción.9) Valorar 1a actividad do “tu. solucion” ningún.1 ¿todo do at
fuián onagar utilizando discos absorben“.
-112
comnggsoumnmgumxmcoggsowmnmMr].Bolvonte:meu 50%mmmcomr. mmzm'r.» polvo.pot:2600u/Ïn
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1 26,7 18,7
2 30,1 19,6I
Resultados Obtenidos:
3810-3660.
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o (minutos) fit (u/mll (u/nl)
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3600 - 352° - 3660 3965
uno - hllo.
3920 - 3920 - 3360
2 9° 3730 - 3360 - 3610 3670
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Bolvsntezmcu50%mmm Muestrszm'rmnpolvo-pot.2600u/mmm d. ls MUESTRA
Solución Palad- Cuuu a. lolvents(le) p/obtener nooou/¡n
(al)
1 32, 5 21,1
. 2 29,1 18,9
Resultados Obtenidos:
, Tingo de ResultadosParciales Obt. trueno“mi” mación cons1nétododedifusión nm
0‘Mmtoe) en agar (u/nl) (ll/¡1)
un o 38m o ¡mo ’
1 30 3560 «obom - han han
kono - kono
‘31’o“a Cm2 90 3800- lanzo- han han
kg”DHamnfl'13am mami ya
30 nooo
9o 39'00
QUEQConsiderandoles experiencias anteriores. detsrninsr las
oondioionos óptimas de ensayo (concentración de inóculo y tiempo deincubación) para soluciones de antibiótico de 100 y 200 ulnl.
EQEDÉMENTO
Determinar el grado de oreoiniento del gornen de ensayoen tubos sin antibiótico y con 100 y 200 unidades del mismo. Variqndo 1a concentración del inóculo y los tiempos de incubación. Gonestos valores obtener el incremento correspondiente n-osde uns delas condiciones de ensayo y elegir 1a más propicie.
:mNICA
1) Pesar 25 e 50 ng (;_O,1 ng) do entibi6tioo por duplicado.2) Disolvor en la cantidad necesaria de nosols 50%de propilengli
ool-nstanol para obtener uns concentración de 4000u/¡l.J) Agiter durante JO ninutoe en máquinangitedors.4) Diluir ceda uns de les solucionestn 100 y 200 ¡lui oon ¡gun dq!
tilsds ostárilo5) Pipetsar en 16 tubos estériles de 18 X 150 In. con tope de slug;
nio. 1 ¡1 de onda uns de las dos diluciones correspondientes eoads concentración.
6) Distribuir los tubos en 9 grupos oadn uno de los ounlee entar‘tornado de le nsnern que nuestra el esquema.
1)
8 V
9)
10)
11)
13)
14)
antibiótico o
“¡Ill 0
u/IIJ.
Identificar e 3 erlonmeyern conteniendo cada uno 600 ¡1 de meatde ensayo estéril con los números 3, 6 y 8 respectivamente.Retirar de uno do ellos 100 al para la posterior.cclibrcción delfotocolorinetrooInocular las 3 fraccionoe con cenccntrccionce de 3. 6 y 8! delcultivo líquido del germen.Do cada una de estao agregar 9 m1en'los tubos correspondientese 3 de los grupos esquematizadoc dejando lo que recto do ella.c 5°C comotestigo sin incubar.- Irar-ar 3 conjunto! de tubos (A, n y c) constituido. con 1 grupode cada una de las treo conoontrocioneao- iIncubar el conjunto A: 2} horas, el la 3 horas y el C: 3} horas.cn baño tormoatatizcdo a 37°C.Loer en el fotocolorí-otro Lumotrcn. (calibrado 100i: 0 div.¡10 f de Variación: 15 div.), los fi do transmisión de cada ensayo.Pronodicr los valores correspondientes c cada condición de cnc;,0 e
15) Mercat Ice pro-edic- obtenidos pare cada tiempo de incubaciónenscycdo en un eintena de coordenadas cobre papel lllinetrado.considerando en ordenada í de transmisión y en ebeiece oentidg
dosdochinita. m ¡aroom _u) ¡mai no condicion“¡la miniatura
oll8
WM ¡BIMCNICIONESWAS D!MAYO— _ .——_-—.—
Resultados Obtenidos;
5‘91L‘91‘916‘919‘91t‘oe9‘099‘09t‘099‘090‘999‘699‘999‘19:‘19¡n"m",,¡’9‘119‘119‘I1.0‘119‘316‘11.9‘11.9‘113611,9‘112‘999‘999‘990‘99¿‘99.00:19(0)9‘993‘199‘999‘190‘999‘31k1).t‘31,9‘319‘91q‘t99‘I93‘t99‘I91‘19tu/rloot/a{6
6‘93b‘ge9‘93!0‘93¡0‘936‘12Fu: 0‘350‘360‘369‘990‘992‘999‘999‘19‘mm
1‘310‘31.9‘91.9‘310‘31.6‘91¡9‘91¿‘910‘91.0‘919‘999‘9919‘99I‘qg9‘99IIK/nooa/o(a)9‘196‘199-‘19‘19P9‘199‘319‘310‘91.9‘31.9‘616‘399‘39-“(‘999‘39tI/noot/oí
1‘630‘069‘9‘630‘092‘920‘9':0‘95E‘9íU9‘9EE‘r99‘t99‘090‘199‘39wmun
9‘119‘119‘I19‘110‘319‘910‘910‘119‘91‘t‘u.[‘99{‘990‘991‘999‘99.003/:(v)0‘690‘690‘696‘690‘690‘919‘910‘910‘91.I11‘9m9‘999‘690‘990‘999‘39Ill/mot/a{a
0‘090‘923‘969‘99t‘eE0‘999‘290‘590‘99¿‘996‘t90‘199‘1910‘192‘39‘Wm
oauyv-uauvrrï_Zwnznzmnznzrunznzn,m”m
iei91»E‘_
om«una
Unamops
-120—
CDNCLUSIONES
Ia ¡{nina concentración de 111601110y 01 ¡mr ttupo do 1gcabecián neeoaarios para obtener una variación tota). on 01 grado decrecimiento del ensayo do aproximada-ente 35%resultan ser!
CONCENTRACIONDE INOCUID: si
TIEMPODE IICUBACIÜI l 37. Cl 3 horas
Conestos resultados definitivos se confirman las conductanos primarias que fueron determinadas para la realización de los oncayos quo ¡“atendem
am
Entnprima parto do].trabajo nrealisá con 1a colaboración del Sr. Angol3.ran Mao. conun” de u trabajo dotoni""lindo umbiológioo pnra la "¡oración doun antibiótico contra hongos:In Ihtnttn yun aplicación a nacho conteu-actuan". (1';cultad de Quino. y rar-acta. ¡haver-14:4uotonal de Ia Plata).
.122.
SEGUNDAPfiTE: amonucnspgin DEL¡(2mm g LAECONDICIONESm
EHRMITANfl APLICÁCIÓN PARA ¿A DETERMINAC;U! 2B; VAIDRES BESIWALE!
' m 9151123. '
I-REPROECIBMDQ EE. DALog
OBJE
Determinarsi la variación de los resultados obtenidoscon la aplicación del notado definido (ntilisando la concentraci6nde solución de antibiótico de 100 n/il) esta dentro de los límitesaceptados para este tipo de ensayos.
M12Obtener por ensayos sucesivos un número conveniente de
datos de la potencia de una nuestra de nistatina y con ellos ca1q¡_lar la variación¡inn registrada.
¿034: Para posibilitar la aplicación del ¡hace sn 1- determinaci6nde cantidades pequeñas del antibi6tioo. coso son en.gencrallos residuos en aliasntcs de este tipo de sustancias, se nt;lisarí la ¡{nina concontracián de nistatina que permita larcalisación del ensaya dentro de las limitaciones sstablecitu (100dni).
MSAA. e arao e arWM (3-wow-riporduplicado)l) Pesar 25 a 50 ag (¿_0,l a3) ¡e antibiótico standard.2) Disolver en aesola 50%de propilengliccl-aetanol para obtener
una concentración de 4000 n/hla
-123
3) Agitar durante 30 minutos In ¡{quina agitadora. Esta soluciónpodra oonsorvarac durante 3 dias a una temperatura ESs°c.
3933355 Siagdarg go trabaja
1) El día que ao efectúe la valoración, diluir laa dos aoluoio—nos ¡took a 100 u/hl con agua destilada oat‘ril.
2) Pipotaar do cada colación standard obtenida, por triplicadoun tnboa do 18 I 150 II oat‘rilca con tapa do aluminio. lassiguientes cantidades:0.o - 0.1 - 0,2 - 0.3 - 0.4 - 0.9 - 0,1 - 0,9 y 1.o ni.
B-Pronargogóg go la ¡gangas1) Pesar 25 a 50 ng (:_O,l ng) do la nuestra a valorar, por dn
plioado.2) Disolver en ¡ancla 50%do propilonglioolpnetanol para obtcner
una concentración aproximada de 4000 u/hl.3) Agitar durant. JO minutos on náquina agitadorno4) Diluir a aproximadamente100 n/hl.S) Pipotoar do cada solución obtenida. por triplicado. en tubo
do 18 X 150 m oatírilea con tapa de aluminio, ha cimiento.cantidadoat001 " 002 ' 093 Y 0.4 ll.
G- c ao fra c onauiento de nod de ones
1) Extraar, oatárilnento, 100 al del ¡odio de ensayo para lor uaado on la calibración del fotooolorílotroo
2) macular .1 mediorestante al si con .1 cultivo liquido do 3-3charonvoaacaroviaiao.
3) Fraccionar. cuidando las condicional do eatcrilidad 9 ll dal
.124.
ledic de ensaya inoculado en cada tubo ntiliaando maquina pipgteadorao
D- c bac e e s
Colocar los tubos en el bano termostatiaado a 31° C durante 3 hs.
LgnagtivaciénAgregar a cada tube 0.5 al de una solución de tor-cl 133 y agitarvigoroeancnte.
Í-Leg‘tgsIedir el porcentaje de transmisión de cada ensayo con el fotocolorinetrc Innetrcn (calibrado, 100%:O div. lOf de variaciónzlsdiv.).o
0-Ca c de tene
1) Pronodiar las lecturas de transmisión gara cada cantidad de aglución standard agregada.
2) Iarcar dichos Valores en un sietena de coordenadas utilizandopapel ailiaetradc arita‘tico considerandoen ordenadaslos pc;cientos de transmisión y en abeieas las cantidades de soluciónde standard agregadas.
3) trazar la curva representativa con los puntos obtenidos.4) Proaediar las lecturas de los porcientce de transmisión corre‘
pendientes a cada cantidad de la solución de mentre agregada.5) Leer en la cnrva la cantidad de standard correspondiente a o;
de valor promediohallada para la ¡teatra6) Determinar con cada uno de estos valores la cantidad de nieta
tina en n/Is. aplicando la siguiente fórmulasect en réf c fa r e d lució
n' nl de aol. de muestrammm“. rrl cien/s5.
.125
7) Eliminarlos valoro- abomntcs. Promediolo. valoro. mts;toa y dos-char los que n ¡cpu-en en ¡fis de]. 101€del valor mM4100“
8) Oman 01 pronodiofinal.
E-Dotmtmro].porcientoa. variación antrolos valor“ o!tenido-.
m2.;
nep. del Standard Pnep.de 1: nuestra i del InóculoCant. Salvo! Jn v0! .- . nn . ‘lesa- te Ip- ñesal te A-o Mus D110- Cultivo "‘--_
P1 da gres. 001:. IS d. . Int. ción 80 ¡003 11g. W(-3.) ¡V5000 (IB) /m «tay Pin-1vo 'u/nl 4 A (ll) (¡1)
(n11 m1) (
I 31.5 20,8 1/¡0 x 28,6 18,6 1/80 L/zó 1000 60
n 32,3 a» ' n 30,5 19,8 " "
mw obama:
srAnnann
Conti“ S F MisiónEn.) I n I n I n nin-01o1,0 82,5 82,0 83,0 83,1 83,2 82,9 82,8
0,9 82,0 81,9 82,0 81,9 82,8 81,8 82,0
0,1 80,2 80,0 80,0 80,0 b,0 19,9 80,0
0.5 73,2 77.2 78.0 73,0 77,3 77,3 77,6
o» 75.1 7h, 78.9 75.5 73,5 78,9 78,9
0.3 73.3 70.0 70.9 69,7 69.0 59.9 70,0
0,0 60,8 60,2 61,2 59,1 60,2 60,5 60,8
0,1 503° b9:5 “,5 ¡03,5 “9,8 .9), ‘90,
0,0 81,6 80,0 bm u,5 81,3 81,8 81,5
.m
Cantidad ‘L de him-misión _I.ect.onvreunen¡pesada fi Guru u/n‘{al} I II I II I II Mo
o,» 7m 1MB m6 75.0 75,6 m9 me ¡ ¡0,0 asco
0,3 70,0 70.0 ¡9,5 70,3 70.3 63.3 69.7 29.5 2510
o)! 1,5 üya“,5 “,5 61,. ag,0,1 .5 k9» 1.9.5 59,1 ¡9.5 ¡8,7 ¡9,3 10,0 aseo
.Prauüo 81de¿tuM1
2535 ü
-129.
mm H32
l’l'ep- del Standard Preparación de 1a Magma pm. del InóculqCant. Solveg Dil.en. Cant. Solveg ¡911.000 10012.40 Cant. depesa- te A- Agus pes- te A- Agua lu Medio Cultivo
1|: de pag. aut. u: da. grua. deat. ciáï le lung líq.(ng) ¡VM-000estéril (u) p/qnl. estéril nl).ya (ll)
u/nl 1/190 mts/Il p/lowfill (-1)“¿ImI 33,8 22.5 W 1 30,1 19,5 1/100 1/26 1000 60
II 35,0 23,1 ' II 29,7 19A ' '
Buultadon Obtenidos;
STANDARD
muda a; DEmmmbancada
(¿1) I II I II II Prandi»F1,0 82,2 81,8 81,7 81,0 81,8 82,0 81,6
0,9 81,2 81,2 81,2 81,0 81,5 81,0 81,1
0.7 78,6 78,9 79.9 73.3 79.0 79,0 78.8
0.5 76.1 76.5 76.1 76,0 75.7 75.9 16,0
0,8 73,9 73,5 73.6 me 73,5 73,8 73,8
9,3 70,0 “,5 69,2 69:2 69,8 69:3 69,1
0,2 59.3 59,3 53,5 53,5 59:2 59,1 59:0
0,1 13,0 ¡mo ¡16,5 ¡17.2 ¡mo ¡7,0 WA
0,0 ¡10,0 ¡»0,5 h0,6 81,0 h0,6 80,8 l¡0,5
.130.
I u n a r n A
Cantidad 1 a. mmm het.“ PotenciaGuru u/ng
im.) I II I II I n Fran-dio
0,1. 1m 7MB 73.2 13,2 7m 73.2 73.7 39,5 2560
0,3 69.7 69,3 60,0 69.1 63.0 68.2 69.2 30,0 8500
.32 59,8 &,a 59,5 “1° 57,8 59" “,5 m0.1 ha» ¡6,5 ¡8.5 km 37.1 56.0 km ¡»,5 2650
WW‘Prcnediou
2615
ekifiaáïï.Esfiiïáfi.‘«fl.79€?“Eee,
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«1aunin?É ,si,¿af
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432
lnsgo H3 3
Prep. pel suman mp; de 1.0.Muestra . de]. InóculoCant. Eoler ELen C2113. Sol-¡ogEÏIABOII “Cant.de aut. de
B3 pesa.- te Ap- Agua peen- te A-o Agua medio Cultivoda arca. dest. B3 da srcg. dest. Dilu- de ¡una 11g. Agrq(ns- p/WO est-p/ (nz) p/m estop/ ción yo
u/ml loan/ü l¿occufit‘ m1 nun (-1) (al)(11) ¿EL
I 29,5 19.5 1/ko I 28,1 18,3 1/00 1/26 1000 60
II 31,0 20,6 ' n 31,8 3,7 ' '
Resultado. Obtenidos:
arAnnAnn
Cantidad. * a. “Wi-'16“¡crew
(m1 I II I II I II medio1,0 81,9 81,5 80,8 81,2 81,7 81,6 81,0
0,9 80,6 80,6 81,2 81,2 81,2 80,8 80,9
0,7 30,2 30,0 79,9 79,0 79.3 30,0 79,7
.15 77,2 76's “Ia 7792 ",1 77,.o» 76,6 76,0 75.5 15,3 m9 78.7 75.5
0.3 73.0 71.3 72,3 72.9 71,0 11,0 71,9
0,2 55.0 03.9 611,0 65.0 53.1 63.3 63,9
0,1 53,2 52,0 52,0 53.11 50,8 52,0 52,:
0,0 ¡6,0 ¡6p 115,9 “1.8 l¡5.5 ¡15,1 ¡5,5
433
IUIB‘TIAsztifiad 1 dc Maga LennonPotenciaA6383“ 1 n I n I n Promedio m. u/mc
0,! 77,9 76,9 763 16A 76,3 76,3 76.7 km 2km
0,“ 7*,3 76.2 76,0 75.5 75,9 73.9 75.1 39,0 25'00
0,3 71,6 72.0 72,5 72,5 71.3 71.3 71.9 30,0 2600
0,2 65,0 63,0 53,5 6155 651 6b,o 6M: 20,2 2630
u: n:deanto2560 2k
30,5
30,1
axe
19,9
mo
Resultados Chi-caidos:
III ,5
srnnrannGamma, 5 de human
ul) r II I n I n Pmdio
1,0 77,5 76,5 76,2 76,8 76,5 77,0 76.8
0.9 76,0 76,5 75,5 75,9 75,3 76,5 75,0
0,7 75,0 73,5 79,7 73:5 72,6 7*,0 73,5
0.5 70,3 71,3 69,5 69,8 69.1 70,2 70,1
o» 69,0 68,8 67,3 67,3 67.3 67,5 67.8
o, 3 63,0 63,1. 61,1. 61,0 63.2 60,0 62,0
0.2 53.5 52,1 51,9 52.5 51,5 52,0 52,6
0,1 lol»,6 ¡8,5 53,5 um w. #334 ¡»3,8
0,0 363 37.1 36,7 36.7 39,0 37.6 37.!
.136.
MUESTRA
Cantidad 17 ¿o Tmmisión ¿ect .en 1’otencilAgregada. Curva. u/rgml I II I n I n
0,5 70,5 70,0 71,6 69.7 69,7 10,5 70.3 51,0 2550
0,3; 68,0 69,1 68,0 67,2 66,8 68,1 67,8 ¡0,0 2600
0,3 6k,2 62,0 61,8 59,1; 60,0 62,5, 61,6 29,6 2560
0,2 53,0 51,5 53,6 53,5 52.9 20,2 aóao
PotenciaPranedio ¡1/5
510 22
N360th
Mx W.34M: an , ‘
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4 Ryvümhtum. ,
.1».Ens ‘ n!
Prep. de Gundam Prep. de la. r-hieatra .de Inóculo
Cunt. Solveg ñïÍJon Tñant. 161x12 11.661: an . [Em"t'.'“pesan te a- 1-312. pcaa- te a.»- a D111: medio da Cu];
na. da gres. dust. n: da m. put. c165 dde Ensg tivopj-‘¿OOOest.p/ mg- ust.p Final yo líq.. u/nl oo lOO'u (ll) Agresml 111m1
I 26,1 18,6 1/100 I 29,8 19,3 1/350 1/26 loco. 60
II 31,0 20.6 " II 30,5 19.3 ' "
Resultados Obtenidos;
STANDARD
Cantidad_ i de hanmisn'in
W‘ 1 n z n 1 n Eau-nue1.0 77,0 76,8 76,3 77,0 77,0 77,0 76,9
5,9 77,0 m2 76.6 76.7 E‘15,”?_75,7 75,8
___o,1 72,0 75,6 7m 7a,: 7MB "fina 71m
0,5 73,1 72.9 72,1 71,0 71,0 71,0 71,8
o,¡+ 68,6 69,6 68,1 67,1 58,8 68,0 68);
0.3 66,1 65.1 65.3 63.2 93.0 63.2 “.6
0,2 “,1 56,3 5235 5‘160,1 “,6 lo” Hue “no l8,9 ha» “,20,0 36,0 36,0 35.8 37,2 37,7 363 36.5
.139.
IUIIEIA1 W013 het.” launch
‘r n 1 n 1 n han-ua um" V"Lg?0.5 71,6 71,6 71,0 71,0 10,1 71,0 71,1 1.7.6 2m
0,». mo 69,3 68,8 68,3 68,0 66,9 68,6 ¡0,3
0,3 5,7 66,1 60,8 63,1 62,5 62,0 6b,1 30,0
0,2 ,6 50,6 53,2 52.6 53.6 52,9 53,6 19,5 2530
3‘?
Totanle¡rm-dioum. I: a. W
850 ah
4.5].
EnsaE N3 6
Prep. del Standard Prep. de lo Muestra “¿el Inómno
Cant. ¿DLA- 114m1 Can-b. 5011125 il.con \ ant.de Font.“pesa- greg. Agua. pesa;- tc a» agua lu edio cultivoN3 de p/ït-OOOdust. l: da antes. dani... E16; de Enag líq.
(mg) 11/1211 cst.p,’ mamen. eut.p/ Pinal bro Agre‘.nl 1mm mm lOOu/nl (nl) (m1)
(El)
I 25,1 16,6 1/150 I 31,9 20,6 l/lto 1/26 1000 I 60
II 30,7 20,3 ' II ¡3,0 21,3! ° '
Resultados Gatenibo:
BTAHDARTanti“ í dj Transmisión
u." ‘ . ‘ '
¡7731) z n 'I n I n Praaedio
2,0 79.2 73.3 77,8 73.0 77.3 77.5 78,0
0,9 73,0 77.5 77,3 77,3 71',5 77.5 77,6
0,7 76,: 76,5 76,1 76,0 76,0 76,1 76,1
0.5 75,2 75,7 73,9 no 73,5 73,1 71m
o,“ 73,1 72,5 72,0 72,0 71.9 71.9 72,2
0,3 7o,» 70,0 67,8 68,0 68,0 68,2 68,7
0,2 63,0 63,9 61,3 00,8 60, 3 61,0 61,5
0,1 51.0 51,3 50,0 50,3 5°, 3 51.5 50,8
0,0 “,9 ha,9 ha te; ¡»3,3 me ¿2,6
cunda” i a. transmisión met.» Potencia.W Curva u¡anl I n 1 n s n0.5 73.3 w'flbs. 73.9 73,2 73,5 73.2 73.7 88,5 2530
mi 72.2 72.2 71,9 71.6 11,9 71,9 71,9 39,0 2530
0,3 69,0 69,0 68,1 68,5 68,6 68,0 68,5 29,5 2560
0,2 60,8 61,5 62,2 66,8 60,3 61,0 61,1 19,6 2550
.1“M¡“p.461IW Duplohlluutn .mznócmlotant. ¡olaaa-¡1.a Cant. 061m2 t.“ aut.“poso- Am. Agua pell- to 0- n ¡odio cultivo
i: 20 ) ¡1m dost./ I: ,20 ) m. est. 0161-:Ilo¡mg líq.n u ¡1 ent.) n {cpu tira 71m1 yo 7 .¡1 mou/¡1 EMA jmo (¡1) En;
(¡1) un.
l 35,6 m3 1/¡0 z 30,5 19,8 1/100 1/06 1000 60
n 26,0 18,5 " n 30,0 19,5 " "
¡”alt-¡00 000mm:
ITAIIAIIwa
‘ln I n I II I n Mi.1.0 73.5 75.! 73.1 7a,: 10.7 15.7 “(no
0.9 73,3 73,3 73.3 T351 73.9 73.1 73,5
0,7 72,0 71.1 72.3 72.3 71,3 79.5 “,0
0.5 70.1 70,0 70.1 70,1 70.1 70,1 70.0
0,1; 67,0 67,9 67,3 67,8 67,0 68,0 67,5
0,3 62,5 63,1 63,). 63,6 63,0 60,6 60,3
0,2 57,0 56,6 55,6 56,1; 56,6 56,6 56,»
0,1 09,8 ¡8,2 ¡7,0 07,0 ¡7,3 ¡7,0 ¡7,7
0,0 h0,5 ¡0,5 39.5 ¡0,1 “,1 ¡0,0 Mm
IUII'I'RAcantina. j de humisión net... Potencia
FÉÏM‘ z n I TT”?! Prandioemm u/w0,5 70.1 70,1 70,1 69,9 69.9 69,9 70.0 50.0 2500
o); 61,1 67,1 67,1 67,1 67,2 67,0 61,1 39,0 25M
0,3 63,2 63,0 63,0 6m ¿616/ 6k,9 63,6 30,3 asao
0,2 56,6 56,: só,» 56,: M 55,0 56,3 19,5 asno
otcncia N-‘ÍdedatosPromedioya.
2575 22
In
.¡Ïmm‘fiuAuhmamWfiifl3.
4.;
y.
.EN:‘ «Pi:¡.53
¡393 n: a
rm. m SW machine-tn Prepa).InóculoCNE.del"! ¡n . n2- .em . de Unit-.5:I'" ‘°““1fi. a; y. ¿2.? 22.“.mu fit... Si?”rbd¡Fm (annalu)
1 29,. 19.2 1/1» 1 25,9 ¡6.a un 1/26 nao so
n 32,5 21.5 ' n, 33,1 11.5 " '
¡matado- mot-manu
n 'r A I a A n n
cm S lo hgs%WM z n I II X n Pra-¡dio
1,0 79.1 73,6 73.6 79.1 79.5 79.1 79,1
0.9 78.2 78.2 78.3 78.6 78.6 78,9 76.5
6.7 76.7 76.1 75.5 76.1 76.3 76.9 76,3
0,5 “.1 “.3 7M). 73.5 “.1 73,7 73.!
03 72,0 723 71,9 71.5 71.5 72,0 71.9
0.3 no 68.3 67.3 67.0 66.5 66.5 67.5
0.2 59.5 59» 58,8 58.5 56,6 58,0 53,9
0,1 ¡3,0 ¡8,0 57,5 ¡8,3 ¡7,6 ¡»1,0 ¡7,1
0,0 33.5 30,0 NJ! 33.0 33,5 33.5 33,2
ma.
I u z s r n A
cuna-a. s m Tun-¡1.1611 ¡actúa MencíaAgregada“ cum u/nunl I II I n I II PaladinW _._——
0,5 TMS 7m 1M 7M 75,5 1m 1m l¡9,5 2m
o) 71.6 72,0 71,5 71.5 72.6 72,1 71.9 ¡00,0 260°
0,3 79,0 67.3 67,2 68.0 6m 6m 67.9 30,6 8650
0.2 58.3 59,0 58,5 57,3 59,5 59,9 56,8 19,7 2560
Ñtmcia ¡facinaPromedio 1:15.
2595 ab
4NÏhN‘
-150
¿rm ggm umgms ommzmg
Ensayo Fotonotn. Potencia Promedio¡E (alma! (un) Ets:1 2600-610-200-2600 asas 2‘
2 2560-2600-2660-2650 2615 24
3 2470-2540-2600-2630 2560 24
4 2650-2600-2560-2620 2610 22
5 2470-2610-2600-2530 2550 24
6 2520-2530-2560-2550 2340 24
7 2600-2540-2630-2540 2575 22
8 2570-2600-2650-2560 2599 24
l .LPotencia final ¡3 do dato.m AI
2580 188WBelli-ados 188 ona-yo. individuales lo. que dieron lugar
I 32 pronodiol parcial.- ano derivan de los datos correspondientesa eau cantidadao soluciónaommm” nun-du. u ameno _con. vnrinciJn ¡‘11nl antro cotos! 4.2 f. Ente valor ost! dentrodo lo ¡113160 para onto tipo do n‘todol (5 ¡1 10*).
+151
IÏPWIPARACEOI E 2:3 REEQLTAmS OBTENIIDS _CO_I[a PRESENTEIBTON
Lg; gg; DIFUSIO! _E_N_PLACAS gg _A_G_A_1_z_,_
OBJETO
Determinarei los valores de le actividad biolágioe de ln¡Inem reenltentee del ensayo de reproduoibilidad de dato- cancun;dan con lo. obtenidos con el ¡{todo de difusión en placas de agarel que se considere cone referencia por ser el de uno comúnen 1aactualidad.
RESUIEAIDS OBTENIIDS
¡{todo en Discusión Met. difusión encas de ar _
2585 2600
2615 2910
2560 2160
2610 2450
¿2550 2590
2540 2460
2575 2530
2595 2330
‘ 2850
2529
Promedio: 2580 2950
MCQSIONES
Io- resultados obtenidos con el metodoajustado son conpnrablee e los del nétode de difusión en places de agar.
-152
sïtmm PARTE: ENSAYOSma APLICACION _D_E_LA NESTATEA mu ¿.5 9311+
BBRVACIONTEMPORARIAgr; ramas _!_gamma:
a) Efcggg ggggcgzgdor cg Agc;ag¡ Tgnafic. Limon g 2135;
92.21).Determinarai ln aplicación dc una ¡clución dc Iistatina
cobro estos clincntcc ticnc algún efecto boniticc cn cu conservación.
IEEEEEEEEl
Snncrgir los alimento. lenoionndoc cn una cclnci6n dc100 pp. del antibiótico dejando en cada caso ¡nostres testigo. trg_tada: con ¡gun destilada. Unavoz cocos, dichos clinenjoc serán cc;taninndoc con hongos y colocados cn condicicncc cspccialcc dc inqgbcción, durante la cual cc dctcrninari ci czictc cn alguno dc olla!crccinientc dc g‘rnencco
EN35293 PRELIMINARES
NIC
l) ggcnaracién dc ¿a gglgciág ggggcrvadgga.
1) ¡ocur dc 25 c 50 ng (3_0,1 lg) dc antibiótico.2) Dinolvcr cn agua destilada cstéril para cbtcncr una concentra
ci6n dc 100 pnl (260 n1h1).J) Agitnr durante una hora cn ¡{quina agitadorl.b)WWW1) Rcvicnr cuidcdccancntc dos nucctrcn dc cada una dc los vlgctalcl
n ensayar. clininnndc ic- qnc proccnfinrcn ¡into-nc dc deterioro.contnninaelcncc. ctc. En 01 caso dc lc ¡vn una nuestra está ccn¡_
.153
tituída por tree unidades.2) Invarlac con agua destilada, eccurrirlae y eeoarlnc cuate-ente
con papel absorbente.3) Bunergir una nuestra de cada vegetal. durante 30 eegundoa, en
1a solución acuosa de 100 pp. de nictatina. La otra aneatra cntrirí el aienc tratamiento pero con agua deetilada (nuestra te!tigo).
4)'De1ar1aa durante 24 horas a telperatnra-aabiente para permitirel secado de ¡ae mismas.
S) Contaainarlae con esporas de un hongo del género Penicillinn.6) Colocarlaa en un naciente de 25° c. y humedad 2=70fi (condicio
nes propicia. para el desarrollo de hongos).1) Observar diarianente todas laa nuestra- ennayadany expresar loa
reenltadoe obtenidos de la siguiente lunaresSin crecimiento de ¿ernenecl oConprincipio de eontaninaciónn eContaninndol e o
la: contaminado: o + +
W161: ¡lola sumido ¡aman da 100pp.
Inem utilizada:list-min cn¡unPotencia222 ya.
W ¡nula Val.d. Aut.“yu '12?)26,0 ¿o
goodouuunp
EL]! LD. WAcnt. room giant.mant. ¡“En
. ’ . - . o Ó - - .
o “’ * - .. .
o “o * o o o- u * - - . H * - . .
c mt.
MlztMénuh “¡mamando 1mm.hasta utilizada:W un¡uva
Potenciaga ¿su ‘Caudalm ¡01.h ¡susun. han.
(a) El)25,5 255
¡estatuas-abunda.
mm mn LM WA
reith czant. Tenga ¡az-nt. haga-Í o nt. fuga clama
:‘CNOU'UÜngcu
456m common
Mo R33._/
Preparacióndo 1.aoclusión ¡num a. mo 1p.
¡hasta utilizada: Mantilla cn polvo.Pótencia 2 u
Canta: posada V01.le Gent.apta.25.“ 25k
Resultados Obtenidos.
I! MEIGA mn mag! un
¿.21 rest c mt. 1%ng e aut. num c Int. huge c mt.1 - . - . - . a . . - - - . .3 o . . . . . .u' - - . - - -
5 o - + - J... - o
6 - - o - o . .
7 - - * ° .9 0 '8 o o o o o -
1.o o - 9+ o o o o
ao - o m o o o
.157.
WM. (¡"4!5).2391125
Seguir una técnica similar s Is de los ensayos prelising_res son uns modificación en el item 2, el cual se efectuar‘ de lssiguiente torna!2) levar Isa muestras con agua dostilsds. escurrirlss. secarlss son
¡enel absorbente. Enel esao del lines oortsrle uns tsjsds y esel de ls uva remperls. Coneste ¡edificación se ooloes s las dosfrutas en peores condiciones de conservación trstsnno de tirar;cer el crecimiento del hongo.Resultados obtenidos!
Minh
Preparación de la. solución Matatina de 100 mn.
Nuestrautilizada: Innatia. en polvoPotegcia 2550 u/eg.
Cantidad pesada #01. do aguaautos-eg.{nl-1)(ng) —
32,6 326
¡esz matenidos.
e ¿aga mmm m_m_n tm
¿ÉL-1Tee c un. Team c qum c un. Test1 . - - - - . .a . . . - .. - -
3 . - . - . - lb o o o - - . .
5 o - ‘ 4 - M o o
6 o - o o - m o
7 o o o J» - m o
3 0 O H 4 o o» +
9 - - H # : 1-“ 4
1° ' - 4* ++ o - ¿H 4I
o Apuicióndootroüphhonaow
Pnepanción de la solución Mahatma de 100 wm.
Mmm Bulimia: ¡list-tin. unpolvoJotemh 2550u/Ig.
Cantidad pesada Vol. de agua dutmgrq.(me) (al)
25.5 255
Bemltadou Obtenidon.
83 MEIGA mn LIMON WA
¿51+ T1522 c mt. Teotie c mt. Teatng c mt. Tutte1 - - - - . - 2 t - o o - -
3 o - - o - . ¿
h o - - - 0 - “0
5 t o & - 4' o u
6 o a- Q o u o m
7 o o o o «o - m
l o - H» o H - m
9 o - n - w o mn 0 o +0 - H o m
es: enelcgnuhacelgn,heont-1nnc16nqnm16mnmd.o harian h om tipod. map.
-160
ti Ens o l (R3 6, 7 y 8)
En onto. no siguió 1a nio-n t‘cnica para lo. contaminantes fueron en el caso del tomate, limón y uva hongos, que pudtornnser obtenidos de alimentos ainilaree echado: a perder y luego aioIndo- y aonbradoa en cada uno de los tipos do muestran a ensayar.
L- ¡caiga ¡o oontaninó con el hongo que crac16 sobre eo
to alilento on el ensayoanterior¡
Emsa N36
dob
Preparación de la solución nstatina de 100nn.
Nuestra utilizada a Bio-hau»;en polvoJotoncia fijen/na.
Canïidad peatón“al. de agua desk. agree.__(m1)gg)
¡“,7 2*?
¡”ultima Obtenidos}
a: ¡cum mmm mx!!! mn
¿231 {esta clont. Test c ant. Testigg c ent. Teng e ent.l .. .. ... .. .. - - e - - - - - - 4. ..
3 .. - - - - - ntk - - ‘ - - - 1,;5 - - o - o - +0 4»5 - - ++ o ui- - H; ++
7 - - 4+ - + o +++ ++
3 - - ++ - + <- +++ ++
9 o - ++ - + - +++ +4
3-9 - - +1 4- L - T+ ++
4.52.
av.-—.---...Mi].napa-¿ación de 1a solución Matutino. de 100 m.
Muestra utilizada; Ninguna en polvo. Potencia 2550u/mg.
Cantidad. pesada Vol.6.e Agua Gent. seres.(lll)
29,8 258
Mundua. armados.
N3 ACFLGA MA?! mm UVAde T " F
días test Test c 'ant. Testig cLant. Tes‘gga c/snt.1 o o o o c a .- o
2 - - - - - - +
3 . . o - o - ln o
ñ o o - - o o H o
f o - o - +4 o 4» o
6 . - 9 - n - 9* ff
1 . . ‘ o 0Q a “O Of
a - - 1» o u» + “9 M»
9 - - h «r +0 + o.» n
m . o fl + H + GH n
.163
mc'm QHSIWABOS
¿ESE m: B
más: deInclusiónmmum de100pp.
hasta utiliza“ ¡num enpolvo.ktemin ya. lentidad panda
4.
Val.“ dont. lares.Ï-ï)28,0 ano
¡cantadas Winnidog.
y: ‘ mm mn mm mm¿(“En Testigo _ c cut. Testifirc aut. Tes cfm . Testigg e ut.1 - - . - - - - .2 - - - - - - o
3 0 - ' ’ " ’ ‘ ‘P
ll o - 0 4- o o H Ó
5 - - 4 _ 4+ - H +
ó o - O - ++ 0 W +6
7 - - + - H - 4-“ n
a - - 4 . ++ ‘ m n
9 - o 4 o H 6 44+ H
10 O - ++ # H’ 0 H H
-164—
¡gggl Se efectuó, edenfie. nn ensayo en el que oe niolnron Ice hcg¡oe que oontaninaron elgunno nuestra. de qnoao tronco y doembutidoe,Se determinó que coco hongos están dentro del espectro de leniotntinn por lo que 1o aplicación de la mismoen 1o conservnoión de eetoe tipoe de elinontce poeiblenonte resultará
l tanbien boneficioee.
CO S 0 ES:
Be oboervn unn evidente noción conservador. del antibiótico en tonate y lilón. Bota noción reoulte nenco etica: para contrarrestar lao ccntnninacionee de hongos en uvas, aunque en este ualimento tanbien ee puede considerar en erecto cono bonotico.
En ecelgn, calvo en nn eneeyo. no ee pudo obtener creciniento de hongce. no hebiíndoee apreciado diferencian entre ol vogetal tratado con solución antibiótico y el nc tratado.
nn general. luego del tratamiento con unn solución do 100py. do nietatinn. tonto en tomate cono on lilón. loa hongos contentnante. ee pudieron observar 4 o 5 ¿{no después de en aparición on1o- controles.
En nvn, en casi todoo 10o ensayoe. lao trntae trctndeeee nantuvioron alredodcr de 1 die nin quo los controlo. nin preseater aparición de hongoo. siendo edemáoen ollne 1o oentidnd de conninantee nenor.
Detorntnu'¡a cantidaddo“num residual quow Clun no dolo. vegetalestratados un 01antibiótico. y n uru016: n función«1 un”. aplicando01 ¡“odo do Vila-¡0161:rip;‘l W‘Oo’
1mmmm ondatipo do"¡om a mm: conun entidad
moi“ ¡o h ¡citaciónminutas do100nl. reunir 01una“dola ¡un y 1am a difunto- fiupon ¿o¡anahan ¡{cota-r.u un ono. un ¡Month ¡mas onn qu novaloru‘h uuvuu mmm 4.1mamita».run-¡unn n uuu-d 1.nun“: doh potonou“1 una n condiciona-“¡atte-s. perosu“tu n conta.“conlu mom (controla).So40W un¡1h h "tancia m1 lo ¡a saludas:do100pp y h ¡han dohuna durant. In hongo“. do40bom a 25°0.
1) Pon a 25 A50 ¡u (33.1 u.) ¡o antibiótico.2) Mulm onun «atun. ostia-11¡nn ohne m concentrao
01611do 100 m.J) min:- Cnruto m han en ¡(quan “¡adorno4) Dividirh sanción"unan. cntros tracción”. n mm. n
and para o].agregue a ha mostra. y ha los ¡"tanto- u d;Jan-(n.m en aman-don y otra a 25’ 0.. ¿mato 4ohomo
-166
b) am en e e a .
1) Revisar cuidadosamente dos nuestras de cada vegetal a ensayareliminando los que presentaren sintonne de deterioro. contaminaciones, ete. En el caso del tomate y del limón se usarán unidades pequeñas. Para 1a uva cada nuestra eetarí oonpnesta por treeunidades y para 1a acelga ee oortarín trozos de hoja de ayroxi¡adelante 5 el. de lado.
2) Lavar las nuestras con agua destilada, esourrirlas, eecarlae en;venente con papel absorbente y colocarlas en un vaso de preciyitado de 250 ¡1.- ‘
3) Agregar sobre cada una de ellas, tratando de ¡ojerlae bien, 5.0¡1 de 1a eolnoián de 100 pp! de Iistatina. En dos vasos de precipitado vacios ee agregarín 5.0 nl. de 1a niena eolaoi6n (een
_ trolee).4).Dejar todas las nuestras durante 40 horas a una temperatura de
25° c. para pernitir el secado de la solución agregada.5) Inoubar a 25° O. y 70%de humedaddurante distintos tiempos. e;
gún el ensayo e efectuar.
0)mm.¡"MWgg;ng¿ág standard stggg (ee prepararán en igual terna dos agluciano. stock)
1) Pesar 25 a 56 ng (10,1 nas.) de Nistatina standard.2) Disolver en 1a mezcla de propilenaliool-aeSanol el 50* para ob
tener una concentración de 4.000 a/hl.3) Agitar durante nedia hora en ¡{quina agitador..4) Esta solución podrí conservarse a una temperature :í 5° 0., d!
-161
rante tres días.
Solgcién standard de trabajo.l) El día que ae efectue la valoración diluir las dos_solucionas
stock s 100 u/hl, con agua destilada estéril.2) Pipetosr de cada solución standard obtenida, por triplicado en
tubos de 18 por 150 II estiriles con tape de aluminio, las airguientae cantidades: 0,0 - 0,1 - 0,2 - 0,3 - 0.4 - 0.5 - 0,70.9 o 1.0 sl.II.- Preparación ge las mgestggg.
a) gglgcigneg de 100 22m.1) Efectuar de cada una de las soluciones (conservadas a 5° C. y s
25° c.) dos diluciones de 1:2 en agua destilada estiril de tal!torna de toner aproximadamente100 a/hl.
2) Pipetear de cada solución obtenida, por triplicado. en tubos e¿_teriles de 18 por 150 ss. con tapa de aluminio. las siguientescantidades: 0.2 - 0,3 - 0,4 - y 0.5 s1.
b) Vegetales tratadosÑ!_ggntroles.l) Eluir cuantitativamente dos nuestras de cada tipo y dos contre
les son 10 s1. de agua destilada “th-11 ayudindose con uns pequens estátuls y tofando varias veses la nuestras en el Vaso ngrs arrastrar bien el antibi6tico que hubiera sn las ademas.
2) ¡gitar internitontenente con cuidado de no romper las nuestras.durantesediaun.
3) Pipetear de las soluciones obtenidas. por triplicado, en tubosestériles de 13 por 150 ss. con tapa de alusinio, las siguientescantidades: 0.2 - 0,3 o 0-4 I'C -5 Il.
.168
¡IL- o a m en da ad a .
1) ¡mula! a1“¡í al ¡odio da mayo aatirn con el cultiva 11cm.do da SanchorowoaaCaravana..
2) Fracciona- ouidandolaa condicion” da esterilidad, 9 al. de a;dio ¿a mayo inoculado an cada tubo. utilizando ¡{quina punta;aora.Ivo-WW' ’
Colocar loa tuboa an 01 baño tamatattaada a 37’ o. daranta traa torna.VO'W'
“¿rogar a cada tubo 0.! al. da 1a aoluctón da torno]. 1a 31 agitar monomanVIo-W
1) ¡por an al rotonda-(acta macho: (calibrado 100%:o un; ¡o!la variación; 1! div. laa fi da tran-Mafia ¡la cada mayo.
2) Pro-odiar laa valoraa aorrnpondiantaa a cada cantidad da acla
3)
4)
5)
0161:atandard apagada aa cada amm.Iaroar ltchoavalor” anunauto- da anos-amm annual. npal ¡uma-nao aritm‘tioo, consumado aa ordmdaa 10a por -‘aantajaa da tramiaióa y an abataaa ¡aa Cantidad“ da aolaoióala "andan!apagada y m la curvaropa-uanth porloa¡unicaemma“.Proaadtar laa notan-aa da pon-canta)“ da armani-16a uruapandiante- a cada cantidad da 1a mlnan de mans-a, apagada ancadamayo.Iaar an 1a cum 1a cantidadda atandarl “marnan” a cadavalor pro-odiohalladopara la num.
.159
6) Dotcrn1nnr en cada uno do esta: valoro. la cantidad do Nistatiln on u/nl. o mundo- por vegetal. ¡pliomdo 1a namiento "fórmula;
Lectura en gráfigg x factor dilución F
Núnnro lo ¡1. do solución do ¡nostra agregada
a- u. lliatatinn / ¡1. 6'U. Nintatinn/ nuestra.
Deaecharlos valoro- nbarranten.Prdnodiar los probablos y eliminar los que lo separen
un mi; do un lo fi del promsdio.Realizar el promediofinal con los restantes.
.17.
vmmgmnzmco mmm.mm I: ;
180.111.12.80.me.
¡{AIDAID1»-80 M0100
Fm x g 1 n r n rra-8101,0 81,0 80,6 81,6 81,7 81,8 81,3 81,3
0,9 80,6 80,9 80,6 80,5 81,0 80,3 a,6
0,7 18,9 78,5 76.5 18.5 78,5 78.8 76,5
0.5 76.9 75,9 76,8 76" ' 76.8 15,0 16.2
o» 1m 13,¡ 13» 13.0 13.0 73» 73,1.
0,3 70,0 68,1, 68,1 68,2 68,8 68,6 68,7
0.a 59.5 59,0 60,1 58,6 59,1 59,¡ 59,3
0,1 ¡9,0 ¡8,6 ¡7,6 ¡7,6 ¡8,9 ¡0,1 ¡8,3
0,0 ¡0,8 ¡2,0 ¡0,6 ¡0,1 ¡0,5 ¡0,8 ¡0,8
W: Id.Común-0mmm. enmía ¡aL-¡:2!mE j a. rra-1.1 tual 10z n I n I n u/n'
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o» 77.0 16,5 76,5 16.3 76.8 76.5 52,5 262
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Noee observeron interferencias entre lee vegetelee eneayadoey le nietatine pues los valoren reeldnnlee halladoe con»euerdnneon los de los controle-.
Lnego del secado de le ablación de 100 Pplb egresada n¡oe alimentan, en el que le potencia ee reduce aproximadnnenteun40A u “unan del mtibiánoo reeidunlse meten eenveloree eoeptahles haete los 7 días.
Logicanento todoe eetoe reeultedon dependen tento de la.oontnminaaionaa inicialee de ¡oe vegetales. eeno de 1e- del medieambiente durante el període de conservación.
.211!»
¡a PARIE. S AJUSTE UN HUB“) JIO P
a) s. dom. unnum “todo. del tipo turbidu‘trico, pan n dota-¡mafia deannual. .1 quou ¡puc-M pantanos-nato¡un h valoracióndel antibiótico residual en ¡lu-ato- mudo- con01nun.
b) El ¡»reanimaon ajustadorunn- de una: nom d oojocuoióny I‘I económicoqu. los “todo. conocidos hasta la tech.para valorar ¡ni-tatiana: Pfil‘g.
a) finalizandolos mm. a unaconcentrada ¡loantibiótoo ao 100n/nl. nom a. incubaciám 3 nom y concentraciónu 1nóonlol 6 fi. n ubuntu fluctuacione- on ha potonom obtenidas,que no excedan ¡lo 3 5 fi.
b) DI 1. oouparaofin de lo. resultado. obtenidos con lo.del. ¡{todo de 4121:3161:on placas do ¡gar no dot-mm m mor onguna del“todo ¡”puntuM 1 oso‘4:10 " e_4 mmmco
rgflwgg“ gs maga; g mmHg/253.m h aplicación do n nintatm conocamu-nao: do tipo
antuiodtioo en vegetal“, no observa:a) m evidentenociónpresentan on ton-io y 11an en
1“ que 10- hongoocontaminante- ¡parce-n 4 a S diu ¡lo-pun qm cnlos annual“.
b) un erecto bcn‘floo. aunquo do ¡901611¡nos atacan. cn
-212
ma. dondeaa rata-da 1a proliferaoián da hongo. an 1 día dinimondo. admin, 1a cantidadda loa lima.
D01aatudio da loa valor-a midualoa dal antibiótico Inloa momo. tratado. aa determinaqua:
a) 1a actividad da 1a niatatina oa nation. connin]... aceptable. hasta aproximan-nte 1 diu dnpu‘a da ¡gn-osadoa loaaiaaoa y
1) ao um." interferencia entre nos ani-onto. y al antiubico.
.213W‘ln Andoraon.Arial A. y Michcncr nnvid.l., Proaorvatlon of food. w‘
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