BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIÊP VÀ PTNT

VIÊN CHĂN NUÔI

Nguyễn Khánh Vân

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIÊU QUẢ ĐÔNG

LẠNH TẾ BÀO TRỨNG TRÂU ĐẦM LẦY (Bubalus bubalis)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIÊP

HÀ NỘI- 2015

ii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIÊP VÀ PTNT

VIÊN CHĂN NUÔI

Nguyễn Khánh Vân

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIÊU QUẢ ĐÔNG

LẠNH TẾ BÀO TRỨNG TRÂU ĐẦM LẦY (Bubalus bubalis)

Chuyên ngành: Chăn nuôi

Mã số: 62. 62. 01. 05

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIÊP

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1. PGS. TS Nguyễn Lai Thành

2. TS Đào Đức Thà

HÀ NỘI – 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả

nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng

để bảo vệ ở bất kỳ học vị nào.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được

cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Tác giả luận án

Nguyễn Khánh Vân

i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban lãnh đạo Viện Chăn nuôi;

Phòng Đào tạo và thông tin – Viện Chăn nuôi, Ban Giám đốc Phòng TNTĐ –

Viện Chăn nuôi cùng toàn thể cán bộ Phòng TNTĐ – Viện Chăn nuôi nơi tôi

công tác đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành nhiệm vụ, được học

tập và hoàn thành công trình nghiên cứu của mình.

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ Bộ môn Sinh học Tế bào, Khoa

Sinh học, trường ĐH KHTN, ĐHQG Hà Nội đã hỗ trợ tôi trong việc phân tích

hình ảnh hiển vi.

Để hoàn thành được bản luận án này tôi đã nhận được sự hướng dẫn khoa

học của PGS. TS Nguyễn Lai Thành và TS. Đào Đức Thà. Tôi xin gửi tới các

thầy hướng dẫn lòng biết ơn sâu sắc về sự tận tình giúp đỡ, động viên dìu dắt tôi

trong suốt quá trình thực hiện luận án.

Luận án này khó có thể hoàn thành nếu không nhận được sự hỗ trợ của

GS. TS Vũ Chí Cương; TS. Hồ Lam Sơn; TS. Trần Xuân Hoàn; TS. Phạm Doãn

Lân; TS. Lưu Quang Minh; Th.S Vũ Thị Thu Hương và các bạn đồng nghiệp.

Tôi luôn trân trọng sự giúp đỡ quý báu đó.

Tôi xin cảm ơn gia đình và người thân đã động viên, tạo điều kiện cho tôi

trong suốt quá trình công tác cũng như hoàn thành bản luận án này.

Hà Nội,tháng 7 năm 2015

Tác giả luận án

Nguyễn Khánh Vân

ii

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU x

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH MINH HỌA xii

MỞ ĐẦU ……………………………………………………………… 1

1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU……………….. 1

2. MỤC TIEU CỦA ĐỀ TÀI…………………………………………… 3

3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI…………… 4

A. Ý nghĩa khoa học…………………………………………………… 4

B. Ý nghĩa thực tế……………………………………………………… 4

4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN……………………… 4

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC…….. 5

1.1. TẾ BÀO TRỨNG TRÂU………………………………………….. 5

1.1.1. Cấu tạo tế bào trứng trâu ………………………………………… 5

1.1.2. Thu và phân loại chất lượng tế bào trứng trâu…………………… 7

1.1.2.1. Thu và đánh giá số lượng tế bào trứng trâu/buồng trứng ……… 8

1.1.2.2. Đánh giá và phân loại chất lượng trứng trâu…………………… 9

1.2. MÔI TRƯỜNG NUÔI THÀNH THỤC IN VITRO TẾ BÀO

TRỨNG TRÂU…………………………………………………………10

1.3. QUÁ TRÌNH THÀNH THỤC NHÂN CỦA TẾ BÀO TRỨNG

TRÂU…………………………………………………………………..11

1.4. CHẤT BẢO VỆ LẠNH SỬ DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH ĐÔNG 12

iii

LẠNH – GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO TRỨNG ……………………………

1.4.1. Các dạng chất bảo vệ lạnh……………………………………… 12

1.4.2. Cơ chế hoạt động của các chất bảo vệ lạnh……………………… 13

1.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất bảo vệ lạnh đến tế bào trứng……… 19

1.4.4. Ảnh hưởng của thời gian và cách thức tiếp xúc với chất bảo vệ

lạnh đến tế bào trứng……………………………………………………20

1.4.5. Quá trình giải đông và pha loãng……………………………… 21

1.5. PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH SỬ DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH

BẢO QUẢN LẠNH TẾ BÀO TRỨNG ……………………………… 22

1.5.1. Bảo quản lạnh tế bào trứng……………………………………… 22

1.5.2. Sử khử nước (Dehydration) trong quá trình đông lạnh tế bào trứng

trâu đầm lầy………………………………………………………………25

1.5.3. Quá trình cần bằng……………………………………………… 26

1.5.4. Tốc độ đông lạnh……………………………………………… 26

1.5.5. Phương pháp đông lạnh………………………………………… 28

1.5.5.1. Đông lạnh chậm (Slow-freezing)……………………….. 28

1.5.5.2. Thủy tinh hóa (Vitrification)…………………………………… 32

a. Thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống…………………………… 34

b. Đông lạnh cực nhanh (ultra rapid freezing)………………………… 35

1.6. ẢNH HƯỞNG CỦA GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN ĐẾN HIỆU QUẢ

BẢO QUẢN LẠNH TẾ BÀO TRỨNG………………………………39

1.6.1. Bảo quản lạnh tế bào trứng ở giai đoạn túi mầm (GV) hoặc giai

đoạn chưa thành thục……………………………………………………40

1.6.2. Bảo quản lạnh tế bào trứng ở giai đoạn thành thục nhân (MII)…… 41

1.7. MỘT SỐ DẠNG TỔN THƯƠNG LẠNH CỦA TẾ BÀO TRỨNG

TRONG QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN LẠNH…………………………….43

1.8. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG TẾ BÀO TRỨNG SAU BẢO QUẢN 44

iv

LẠNH……………………………………………………………………

1.8.1. Đánh giá chất lượng trứng dựa vào quan sát hình thái và nhuộm tế

bào………………………………………………………………...……44

1.8.2. Đánh giá chất lượng dựa vào khả năng phát triển tiếp theo của tế

bào trứng………………………………………………………………46

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU……………………………………………………………………..48

2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu................................................. 48

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu........................................................................... 48

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất.............................................................. 48

2.1.2.1. Thiết bị........................................................................................... 48

2.1.2.2. Hóa chất, dụng cụ......................................................................... 48

2.2. Nội dung nghiên cứu.......................................................................... 49

2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................... 49

2.3.1. Phương pháp thu buồng trứng trâu................................................... 49

2.3.2. Phương pháp thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng lò mổ................ 49

2.3.3. Phân loại tế bào trứng....................................................................... 50

2.3.4. Phương pháp nhuộm nhân xác định giai đoạn phát triển của nhân

tế bào trứng trâu.........................................................................................50

2.3.5. Phương pháp nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu................... 50

2.3.6. Phương pháp đánh giá tế bào trứng trâu thành thục sau nuôi in

vitro............................................................................................................50

2.3.7. Phương pháp tạo phôi trâu in vitro................................................. 51

2.3.7.1. Hoạt hóa tinh trùng....................................................................... 51

2.3.7.2. Thụ tinh in vitro tế bào trứng trâu................................................ 51

2.3.7.3. Nuôi phôi in vitro......................................................................... 51

2.3.8. Phương pháp đông lạnh tế bào trứng................................................ 52

v

2.3.8.1. Phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng trong cọng rạ truyền

thống...........................................................................................................52

2.3.8.2. Phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng trong cọng rạ hở........... 52

2.3.8.3. Phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng bằng vi giọt................. 52

2.3.9. Phương pháp giải đông tế bào trứng sau bảo quản lạnh ................. 52

2.3.10. Phương pháp đánh giá hình thái trứng trâu sau đông lạnh-giải

đông...........................................................................................................53

2.4. Thiết kế thí nghiệm…………………………………………… 53

2.5. Phân tích số liệu và xử lý thống kê……………………………… 56

2.6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu...................................................... 56

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................... 57

3.1. Kết quả thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng ở lò mổ........................ 57

3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến hiệu quả tạo phôi in

vitro của tế bào trứng trâu..........................................................................59

3.2.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi đến sự thành thục in vitro tế bào

trứng trâu ..................................................................................................61

3.2.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến khả năng tạo phôi

in vitro của tế bào trứng trâu………………………………………63

3.3. Trạng thái của nhân tế bào trứng trâu đầm lầy tại các thời gian nuôi

in vitro khác nhau……………………………………………………66

3.4. Ảnh hưởng của chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào

trứng trâu...................................................................................................70

3.4.1. Ảnh hưởng của dạng chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh

trứng trâu………………………………………………….......................71

vi

3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh

tế bào trứng trâu.........................................................................................74

3.4.3. Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh đến hiệu

quả đông lạnh tế bào trứng trâu.................................................................78

3.4.4. Ảnh hưởng của sucrose trong quá trình giải đông đến hiệu quả

đông lạnh tế bào trứng trâu.........................................................................80

3.5. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế

bào trứng trâu ...........................................................................................85

3.5.1. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến số lượng tế bào trứng

trâu thu được sau đông lạnh –giải đông.....................................................88

3.5.2. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến chất lượng tế bào

trứng trâu thu được sau đông lạnh – giải đông..........................................91

3.5.3. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến khả năng phát triển in

vitro tiếp theo của tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông.................94

3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro tế bào trứng đến hiệu quả

đông lạnh tế bào trứng trâu ......................................................................101

3.6.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro tế bào trứng đến chất lượng

tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông...............................................103

3.6.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro tế bào trứng đến khả năng

thành thục in vitro của tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông..........105

3.6.3. Khả năng phát triển in vitro tiếp theo của tế bào trứng trâu (được

thủy tinh hóa tại một số thời điểm nuôi khác nhau) sau đông lạnh - giải

đông............................................................................................................

107

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ............................................... 114

4.1. Kết luận............................................................................................ 114

4.2. Đề nghị............................................................................................... 114

vii

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN.......................... 116

TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 117

Tài liệu tham khảo tiếng Việt.................................................................... 117

Tài liệu tham khảo tiếng Anh.................................................................... 117

PHỤ LỤC.................................................................................................. 144

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BES: Buffalo oestrus serum (Huyết thanh trâu động dục)

BSA: Bovine serum albumin (Albumin huyết thanh bò)

buFF: Buffalo follicular fluid (Dịch nang trứng trâu)

CR1aa: Charles Rosenkran,s 1 amino acid

viii

CR2aa: Charles Rosenkran,s 2 amino acid

DMSO: Dimethyl sulfoxide

DPBS: Dulbecol phosphate buffered saline (Đệm phosphat)

ĐL – GĐ: đông lạnh – giải đông

eCG: Equine chorionic gonadotrophin (Huyết thanh ngựa chửa)

EG: Ethylene glycol

EGF: Epidermal growth factor (Yếu tố tăng trưởng biểu bì)

EMG: Electron microscopy grids (Kính hiển vi lưới điện tử)

FCS: Fetal calf serum (Huyết thanh thai bò)

FF: Follicular fluid (Dịch nang trứng)

FSH: Follicle stimulating hormone (Hormon kích thích nang trứng)

Gly: Glycerol

GMP: glass micropipette (Mao quản thủy tinh)

GV: Germinal vesicle (Túi mầm)

GVBD: Germinal vesicle breakdown (Phá vỡ túi mầm)

ICSI: Intracytoplasmic sperm injection (Vi tiêm tinh trùng)

IGF-I: Insulin-like growth factor I (Yếu tố điều hòa sinh trưởng giống như

Insulin I)

IGF-II: Insulin-like growth factor II (Yếu tố điều hòa sinh trưởng giống như

Insulin II)

IVC: in vitro culture (Nuôi in vitro)

IVM: in vitro maturation (Thành thục in vitro)

IVF: in vitro fertilization (Thụ tinh in vitro)

ZP: Zona pellucida (màng sáng)

LH: Luteinizing hormone (Hormon kích thích thể vàng)

M: mol/l

ix

MEM: Minimum Essential Medium

MII: Metaphase II (Thành thục nhân)

mSOFaa: Synthetic oviduct fluid medium amino acid (Môi trường dịch ống dẫn

trứng tổng hợp)

NST: nhiễm sắc thể

OPS: Open pull straw (Cọng rạ hở)

pES: Pre – equilibrated solution (Dung dịch trước cân bằng)

PBS: Phosphate buffered saline

PI: Prodium iode

PROH: 1,2 propanediol

RPMI-1640: Roswell Park Memorial Institute 1640

SBS: Superovulated buffalo serum

SCNT: Somatic cell nuclear transfer (Cấy chuyển nhân tế bào soma)

SS: Steer serum (Huyết thanh bê đực)

TCM 199: Tisue culture medium 199

TGF-β: Transforming growth factor β

VS: Vitrification solution (Dung dịch thủy tinh hóa)

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng Tên bảng Trang

1 Tổng đàn trâu qua các năm ở Việt Nam 143

2 Chất lượng tế bào trứng trâu thu từ buồng trứng lò mổ………… 57

x

3Tỷ lệ thành thục của tế bào trứng trâu sau khi nuôi in vitro trong

một số môi trường nuôi khác nhau………………………………62

4Khả năng tạo phôi in vitro của tế bào trứng trâu sau khi nuôi in

vitro trong một số môi trường nuôi thành thục khác nhau……..64

5Nhân tế bào trứng trâu ở các mốc thời gian nuôi in vitro khác

nhau..............................................................................................67

6

Khả năng sống và sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu

đầm lầy sau đông lạnh – giải đông trong các dạng chất bảo vệ

lạnh khác nhau................................................................................

72

7Sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông

lạnh – giải đông ở các nồng độ EG khác nhau………………......75

8

Sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông

lạnh – giải đông ở các thời gian tiếp xúc khác nhau (tiếp xúc 2

bước)............................................................................................

79

9Sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu chưa thành thục khi

giải đông trong dung dịch có hoặc không có Sucrose…………...81

10 Số lượng tế bào trứng trâu thu được sau đông lạnh- giải đông… 89

11 Chất lượng tế bào trứng trâu thu được sau đông lạnh-giải đông .. 91

12Khả năng phát triển in vitro tiếp theo của tế bào trứng trâu đầm

lầy sau đông lạnh-giải đông.........................................................95

13Tế bào trứng trâu đầm lầy có hình thái bình thường sau đông

lạnh – giải đông ở các thời gian nuôi in vitro khác nhau...............104

14

Khả năng thành thục in vitro sau đông lạnh-giải đông của tế bào

trứng trâu được thủy tinh hóa tại một số thời điểm nuôi khác

nhau................................................................................................

106

xi

15

Khả năng phát triển in vitro tiếp theo sau đông lạnh-giải đông

của tế bào trứng trâu được thủy tinh hóa tại một số thời điểm

nuôi khác nhau...............................................................................

109

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH MINH HỌA

Hìn

h

Tên hình Tran

g1 Tế bào trứng trâu ngay sau khi thu từ buồng trứng lò mổ (độ 58

xii

phóng đại 10 lần)

……………………………………………………………..

2 Tế bào trứng trâu có nhân ở giai đoạn túi mầm (GV)

………………….

68

3 Tế bào trứng trâu có nhân ở giai đoạn kỳ giữa

I………………………

68

4 Tế bào trứng trâu có nhân ở giai đoạn kỳ cuối

I………………………

69

5 Tế bào trứng trâu có nhân ở giai đoạn thành thục (Metaphase II)

…….

69

6 Tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục bị mất lớp tế bào

cumulus, tổn thương tế bào chất sau đông lạnh – giải đông (độ

phóng đại 10 lần)

……………………………………………………………………..

77

7 Tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục bị vỡ màng sáng sau

giải đông (độ phóng đại 10 lần)

……………………………………………

82

8 Tế bào trứng trâu đầm lầy có hình thái bình thường sau đông lạnh

– giải đông sau nuôi in vitro 24 giờ (độ phóng đại 40 lần)

……………..

83

9 Tế bào trứng trâu đầm lầy bị tan rã lớp tế bào nang bao xung

quanh sau đông lạnh – giải đông (độ phóng đại 10 lần)

………………...........

85

10 Tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục có hình thái không

bình thường sau đông lạnh – giải đông (độ phóng đại 10

lần).......................

92

xiii

11 Tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục có hình thái bình

thường sau đông lạnh – giải đông (độ phóng đại 10

lần)...................................

93

12 Tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục có hình thái bình

thường sau đông lạnh – giải đông bằng phương pháp cọng rạ hở

sau nuôi in vitro 24 giờ (độ phóng đại 5

lần)............................................................

96

13 Phôi trâu 2 tế bào ở ngày thứ 2 sau thụ tinh từ tế bào trứng trâu

đầm lầy chưa thành thục có hình thái bình thường sau đông lạnh –

giải

đông..................................................................................................

.......

97

14 Phôi nang trâu tạo ra từ tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục

có hình thái bình thường sau đông lạnh – giải

đông....................................

98

15 Phôi dâu trâu tạo ra từ tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông lạnh –

giải đông ở thời gian nuôi in vitro 24 giờ ( độ phóng đại 40

lần)..................

110

16 Phôi nang trâu giãn nở tạo ra từ tế bào trứng trâu đầm lầy sau

đông lạnh – giải đông ở thời gian nuôi in vitro 24 giờ (độ phóng

đại 40 lần).

111

xiv

xv

MỞ ĐẦU

1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

Trâu là một loài động vật có vai trò kinh tế quan trọng ở một số nước châu

Á và Địa Trung Hải, trong đó châu Á chiếm 95% sản phẩm từ trâu trên thế giới.

Chúng là nguồn cung cấp thịt, sữa, sức kéo trong sản xuất nông nghiệp. Một vài

tổ chức trên thế giới đã nhấn mạnh tiềm năng của con trâu trong nền kinh tế

nông nghiệp của một số quốc gia đang phát triển ở Châu Á do trâu có hiệu quả

hơn so với các gia súc khác trong môi trường nuôi khắc nghiệt. Tuy nhiên con

trâu vẫn thực sự chưa được chú ý để khai thác tốt tiềm năng này. Trâu cung cấp

nguồn sức kéo quan trọng đối với nông nghiệp và nông thôn đặc biệt là ở vùng

sâu, đồi núi, ruộng bậc thang nơi khó triển khai thiết bị cơ giới. Chúng có thể cày

kéo ở tất cả địa hình như: ruộng nước, ruộng bậc thang, kéo gỗ trong rừng hoặc

dưới suối. Bên cạnh việc cung cấp sức kéo, trâu còn là nguồn cung cấp thịt và

sữa hoặc là nguồn thức ăn dự trữ cho những lúc khó khăn, nguy cấp; tuy nhiên

do khẩu vị của người tiêu dùng chưa quen với sản phẩm này nên sữa trâu chưa

trở thành hàng hóa chính. Do đó hiện nay so với một số ngành chăn nuôi khác

như bò, lợn, gà thì chăn nuôi trâu vẫn chưa được quan tâm phát triển đúng mức.

Theo số liệu thống kê của Tổng Cục Thống kê và Cục Chăn nuôi Việt

Nam, số lượng trâu trên cả nước ta đang có xu hướng giảm dần (Bảng 1 – Phụ

lục), chính vì thế cần phải cải thiện khả năng sinh sản của đàn trâu để tránh hiện

tượng suy giảm đàn trâu, ảnh hưởng tới nguồn gen quý. Tuy nhiên, chi phí giống

cao và các vấn đề về sinh sản như biểu hiện động dục không rõ ràng, tỷ lệ động

dục thầm lặng cao (Esposito và cs., 1992; Zicarelli và cs., 1997), khoảng cách

giữa các lứa đẻ dài, sự thành thục về tính muộn, ít các nang trứng non, số tế bào

trứng tốt/buồng trứng thấp, quá trình sinh sản bị ảnh hưởng bởi mùa vụ (Le Van

Ty và cs., 1994) và tỷ lệ thụ thai thấp đã hạn chế sự phát triển của đàn trâu. Sự

1

thành công của chăn nuôi trâu phụ thuộc vào việc cải thiện di truyền mà điều này

có thể đạt được bằng cách ứng dụng công nghệ sinh học sinh sản. Mặc dù công

nghệ sinh học sinh sản đã được nghiên cứu và áp dụng ở loài động vật đặc biệt

này nhưng hầu hết chúng không đạt hiệu quả như đối với bò, một loài động vật

có rất nhiều nét tương đồng. Tế bào trứng trâu thu từ buồng trứng trâu ở lò mổ là

nguồn nguyên liệu chính được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới sử dụng cho

các thí nghiệm nghiên cứu về công nghệ sinh học sinh sản trên trâu như: cấy

chuyển nhân tế bào soma (SCNT), thụ tinh in vitro (IVF) và vi tiêm tinh trùng

(ICSI) (Parnpai và cs., 2014). Nhưng nguồn mẫu tế bào trứng trâu này khá ít và

không ổn định, số lượng tế bào trứng tốt thu được trên một buồng trứng trâu

thường ít hơn khi so sánh với một số loài vật nuôi khác (bò, lợn). Chính vì vậy

việc tạo ra một nguồn nguyên liệu trứng trâu có chất lượng tốt và chủ động là

một giải pháp mà các nhà khoa học trên thế giới đang nghiên cứu và quan tâm.

Bảo quản lạnh là bước đột phá quan trọng trong khoa học bởi vì đó là một

trong các phương pháp khá hiệu quả được sử dụng để bảo tồn sự đa dạng di

truyền động vật, trong đó có cả những loài động vật có nguy cơ tuyệt chủng.

Việc bảo quản lạnh thành công tế bào trứng trâu có ý nghĩa rất quan trọng, nó

góp phần gìn giữ nguồn gen những giống trâu quý, đồng thời đó là nguồn

nguyên liệu giúp các nhà khoa học có thể sử dụng cho các thí nghiệm nghiên cứu

về sinh sản hay về phôi sinh học của mình. Trên thế giới vấn đề bảo quản lạnh tế

bào trứng được nghiên cứu ở trên một số loài động vật từ khá lâu và đã tạo ra

được con non từ tế bào trứng sau đông lạnh-giải đông (Fuku và cs., 1992, Otoi

và cs., 1993). Mặc dù hiện nay quy trình đông lạnh phôi và tinh trùng đã trở nên

phổ biến, nhưng quy trình đông lạnh tế bào trứng vẫn còn gặp nhiều khó khăn.

Vẫn có một số sai sót xảy ra trong quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng làm giảm

hiệu quả của quá trình này (Leibo, 2008). Quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng

2

trâu đến nay vẫn là vấn đề còn bỏ ngỏ do hiệu quả chưa đạt được như mong

muốn. Vấn đề chính đối với bảo quản lạnh tế bào trứng trâu là tỷ lệ sống và khả

năng phát triển tiếp theo của tế bào trứng trâu sau đông lạnh-giải đông không

cao. Nguyên nhân là do tế bào trứng trâu có hàm lượng lipid nội bào cao, độ

nhạy cảm với những tổn thương lạnh lớn (Boni và cs., 1992). Sự thành công của

quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng trâu có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố

như: chất bảo vệ lạnh, phương pháp đông lạnh, giai đoạn thành thục của tế bào

trứng, chất lượng tế bào trứng.

Tại Việt Nam trước đây có rất ít các nghiên cứu cơ bản về con trâu; có thể

do sữa trâu chưa phải là thực phẩm hàng hóa chính; chủ yếu chỉ sử dụng trâu làm

sức kéo trong sản xuất nông nghiệp. Tuy nhiên gần đây trâu được coi là đối

tượng chăn nuôi tạo thực phẩm và cho sức kéo nên các nhà khoa học cũng đã

quan tâm đến vấn đề ứng dụng công nghệ sinh học trong việc nâng cao khả năng

sinh sản và đặc điểm sinh lý sinh sản của trâu nhằm bảo tồn những giống trâu

quý. Luận án này được thực hiện trong điều kiện bảo quản lạnh tế bào trứng là

một lĩnh vực nghiên cứu còn rất mới và ít được quan tâm ở Việt Nam, đặc biệt là

đông lạnh tế bào trứng trâu thì chưa có báo cáo nào.

2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

- Đánh giá ảnh hưởng của một số chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả bảo quản lạnh tế

bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis).

- Đánh giá ảnh hưởng của một số phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông

lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis).

- Đánh giá ảnh hưởng của giai đoạn nuôi thành thục in vitro đến hiệu quả đông

lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis).

3

3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

A. Ý nghĩa khoa học

- Lựa chọn được chất bảo vệ lạnh, phương pháp đông lạnh hiệu quả đối với quá

trình bảo quản lạnh tế bào trứng trâu.

- Xác định được giai đoạn nuôi thành thục in vitro mang lại hiệu quả cao cho

quá trình đông lạnh tế bào trứng.

- Bước đầu tạo được phôi trâu in vitro từ tế bào trứng trâu sau đông lạnh-giải

đông và tinh trùng đông lạnh.

- Đưa ra được phương pháp bảo quản lạnh thành công tế bào trứng trâu đầm lầy

(Bubalus bubalis) tại Việt Nam.

B. Ý nghĩa thực tế

- Sự thành công trong việc bảo quản lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus

bubalis) đã mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học lạnh đối với

việc bảo tồn các loài động vật nuôi có giá trị kinh tế cao, các loại động vật nuôi

quý hiếm tại Việt Nam dưới dạng tế bào trứng đông lạnh.

- Nguồn tế bào trứng trâu đông lạnh là nguồn nguyên liệu sử dụng cho các

nghiên cứu khác về trâu như: tạo phôi trâu in vitro; tạo phôi trâu nhân bản bằng

cấy chuyển gen, cấy chuyển nhân.

4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

- Lần đầu tiên tại Việt Nam đưa ra phương pháp đông lạnh thành công tế bào

trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis).

- Lần đầu tiên tại Việt Nam tạo được phôi trâu in vitro từ tế bào trứng trâu

(Bubalus bubalis) sau đông lạnh-giải đông.

- Các kết quả nghiên cứu của luận án này có thể ứng dụng cho các phòng thí

nghiệm về Công nghệ sinh sản trên toàn quốc.

4

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN TÀI LIÊU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC

Mục tiêu của luận án là đánh giá được ảnh hưởng của một số yếu tố đến

hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy, từ đó đưa ra được một phương

pháp bảo quản lạnh thành công tế bào trứng trâu đầm lầy trong điều kiện tại Việt

Nam. Để đạt được điều này cần phải có những hiểu biết nhất định về cấu tạo tế

bào trứng trâu, quá trình thành thục nhân tế bào trứng trâu, các yếu tố ảnh hưởng

đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu (chất bảo vệ lạnh, phương pháp đông

lạnh, giai đoạn phát triển của tế bào trứng trâu), quá trình nuôi thành thục tế bào

trứng trâu và tạo phôi trâu in vitro. Trong phần tổng quan tài liệu và cơ sở khoa

học sẽ nói rõ hơn về những vấn đề nêu trên.

1.1. TẾ BÀO TRỨNG TRÂU

1.1.1. Cấu tạo tế bào trứng trâu

Cấu tạo trứng trâu bao gồm: vành phóng xạ, màng sáng (Zona pellucida),

màng sinh chất, nguyên sinh chất, nhân tế bào trứng trâu. Vành phóng xạ có

nhiều lớp tế bào nang (cumulus), phân bố xung quanh tế bào trứng theo hình

phóng xạ. Màng sáng: có cấu tạo từ các phân tử glycoprotein. Trong màng sáng

có nhiều tia được sinh ra từ các vi lông nhung của lớp tế bào nang (tế bào

cumulus), đây chính là những cầu nối để đảm bảo chức năng nuôi dưỡng và điều

hòa cho tế bào trứng. Các chất chứa trong tế bào nang có thể chuyển qua các vi

lông nhung này đi vào trong tế bào trứng. Khi nang trứng chín, tế bào trứng

thành thục thì cầu liên kết này bị cắt bỏ. Bên trong màng sáng là tế bào trứng.

Giữa màng sáng và màng tế bào trứng có khoảng trống gọi là xoang tiền thụ tinh.

Khoảng trống này có độ dày 1,1-1,4μm, pH khoảng 3-5, chứa dịch có nồng độ

ion cao. Cũng giống như đại đa số các loài động vật có vú khác, trước khi trứng

chín và rụng thì các tế bào trứng trong các nang trứng đều dừng ở giai đoạn tiền

5

kỳ của giảm phân I với bộ nhiễm sắc thể (NST) ở dạng lượng bội kép. Giảm

phân I chỉ xảy ra ngay trước thời điểm trứng rụng, khi các cầu nối tế bào chất

của các nang bào với tế bào trứng bị cắt bỏ. Tế bào trứng khi rụng có nhân ở

trạng thái đơn bội kép và dừng ở trung kỳ giảm phân II, đồng thời với quá trình

này thể cực I cũng được tạo ra. Nhân chứa bộ NST đơn bội chỉ được tạo ra khi tế

bào trứng được thụ tinh và hoàn tất quá trình giảm phân. Ở trâu sông (river

buffalo) và trâu đầm lầy (swamp buffalo); có bộ NST với số lượng tương ứng là

50 NST và 48 NST.

Giữa trứng trâu thành thục và chưa thành thục có một số đặc điểm cấu trúc

khác nhau. Đặc trưng của các tế bào trứng trâu chưa thành thục chất lượng tốt là

sự có mặt của nhiều tế bào nang không giãn nở (Barakat và cs., 2012). Các tế

bào trứng trâu chưa thành thục có ty thể tập trung chủ yếu ở vị trí ngoại vi của tế

bào trứng, một số ít ở vị trí trung tâm (El- Sayed và cs., 2012). Chúng có dạng

mũ trùm đầu hoặc hình bầu dục, không có ty thể dạng đa hình (Barakat và cs.,

2012). Ty thể của các tế bào trứng trâu chưa thành thục chất lượng kém chủ yếu

là dạng hình tròn, rất ít ty thể có dạng mũ trùm đầu. Các giọt lipid trong tế bào

trứng trâu chưa thành thục loại tốt được phân bố ở vị trí gần ty thể, với kích

thước nhỏ; trong khi đó tế bào trứng trâu chưa thành thục chất lượng kém lại có

một số lượng lớn các giọt lipid to (El- Sayed và cs., 2012, Barakat và cs., 2012).

Lưới nội chất được gắn với cả ty thể và phân bố trên tế bào chất. Tế bào trứng

trâu chưa thành thục có một số lượng lớn các túi (vesicles) nằm ở phần ngoại vi

xa nhất của tế bào trứng và các vi lông nhung tại vị trí trên màng sinh chất thông

qua vi lông nhung của tế bào nang xuyên qua màng sáng (Barakat và cs., 2012).

Không có sự khác biệt lớn về hình thái giữa trứng thành thục in vivo và in

vitro. Tuy nhiên, trứng thành thục in vivo hình thành một nhóm đồng nhất về

hình thái trong khi đó tế bào trứng thành thục in vitro hình thành nên nhóm

6

không đồng nhất. Trứng trâu đã thành thục chất lượng tốt có nhiều tế bào nang

giãn nở, tế bào trứng có các thể hạt vỏ tạo thành cụm phân tán vào các vị trí

riêng lẻ và được tìm thấy ở ngoại vi ngay dưới tế bào chất sát màng noãn hoàng

(Barakat và cs., 2012). Giữa màng sáng và màng noãn hoàng xuất hiện một

khoảng không gian dễ dàng phân biệt như lớp bông từ màng sáng. Đặc trưng của

trứng trâu thành thục là sự xuất hiện của thể cực thứ nhất, các túi và ty thể ở vị

trí lệch với vị trí của thể cực (Barakat và cs., 2012). Trứng trâu thành thục chất

lượng kém thường có ít các túi, vi lông nhung và giọt lipid, không có thể hạt vỏ,

bộ máy Golgi phân bố trong tế bào chất của tế bào trứng, thể cực hình thành bất

thường với sự vắng mặt của ty thể hoặc các túi (Barakat và cs., 2012).

Đối với trứng trâu chưa thành thục, quá trình trao đổi chất xảy ra mạnh với

các biến đổi trong noãn như: xuất hiện các chuỗi ty thể, các lưới nội bào trơn và

các không bào chứa mỡ. Tế bào trứng liên kết với các tế bào nang bằng các cầu

nối xuyên qua màng sáng, các bào quan chuyển hóa tập trung ở ngoại vi gần kề

với các cầu nối này, chứng minh có sự trao đổi chất. Khi tế bào trứng thành thục,

các liên kết này sẽ bị cắt bỏ và chỉ còn lại rất ít, bộ máy Golgi giảm cả về số

lượng lẫn kích thước, các hạt noãn hoàng phân tán bên trong noãn liên kết với

lưới nội bào trơn và ty thể. Đồng thời với các biến đổi này, các thể hạt vỏ do bộ

máy Golgi tạo ra cũng phân bố ra vùng ngoại vi cận kề với màng tế bào, đây

được coi như là một tiêu chí để đánh giá sự thành thục của trứng. Các hạt bào

chất đặc trưng cho sự gia tăng hàm lượng lipid được quan sát thấy cả ở tế bào

trứng thành thục cũng như trong phôi dâu, phôi nang (Barakat và cs., 2012).

1.1.2. Thu và phân loại chất lượng tế bào trứng trâu

Nguồn gốc của tế bào trứng đóng một vai trò quan trọng trong bất kỳ

nghiên cứu nào về tế bào trứng. Hơn nữa, có một tỷ lệ không nhỏ trứng trâu có

7

chất lượng kém trong mỗi buồng trứng. Một bước quan trọng trong kỹ thuật bảo

quản lạnh tế bào trứng là việc thu và phân loại chất lượng trứng để đông lạnh.

1.1.2.1. Thu và đánh giá số lượng tế bào trứng trâu/buồng trứng

Trứng trâu được thu từ buồng trứng ở lò mổ bằng kỹ thuật chọc hút dịch

nang trứng, giải phẫu nang trứng hay từ gia súc sống bằng kỹ thuật nội soi và

siêu âm. Việc áp dụng kỹ thuật nào để thu tế bào trứng phụ thuộc vào kinh

nghiệm và trang thiết bị của mỗi phòng thí nghiệm. Trứng trâu trước khi thụ tinh

được hiểu là một tổ hợp gồm chính tế bào trứng và tế bào nuôi. Vấn đề đầu tiên

các nhà nghiên cứu phải đối mặt trong các nghiên cứu về trâu là số lượng trứng

ít, trứng kém chất lượng chiếm tỷ lệ cao. Kích thước và trọng lượng buồng trứng

trâu (tương ứng là 2,5cm và 3,9g) là nhỏ hơn so với bò (tương ứng là 3,7cm và

8,5g). Việc thu được một số lượng lớn tế bào trứng có khả năng phát triển tốt là

một yêu cầu cho quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng trâu. Số nang trứng trung

bình trên một buồng trứng ở trâu thường thấp. Theo Abdoon và Kandil (2001)

thì ở trâu Ai Cập trung bình có 5,6 nang/buồng trứng. Số trứng trâu thu được như

vậy so với bò và một số gia súc khác là rất thấp (8-12 trứng chất lượng tốt/buồng

trứng ở bò). Mặt khác, tỷ lệ trứng thu được thường khá thấp ở các buồng trứng

đang có thể vàng (Nandi và cs., 2000). Điều này là hợp lý bởi phát triển nang bị

hạn chế khi các mô thể vàng chiếm một phần lớn buồng trứng và hormone

progesterone do thể vàng tiết ra sẽ ức chế tuyến yên sản xuất FSH và LH nên các

nang trứng mới không thể phát triển. Do đó khi phần lớn các nang độc tôn nằm

trên buồng trứng có thể vàng thì các nang khác khó có thể chọc hút bằng kim.

Việc thu được một số lượng lớn trứng tốt dùng cho các thí nghiệm nghiên

cứu vẫn là ưu tiên hàng đầu của các nhà nghiên cứu. Số lượng trứng tốt thu được

trung bình ở trâu Ấn Độ là 0,43 tế bào trứng/buồng trứng (Totey và cs., 1992) và

1,98 tế bào trứng/buồng trứng ở trâu Ai Cập (Abdoon và Kandil, 2001); đây thực

8

sự là một số lượng ít hơn nhiều so với các gia súc khác. Để tăng số lượng trứng

thu được từ buồng trứng trâu ở lò mổ có nhiều phương pháp cải tiến như: cắt lát

buồng trứng. Phương pháp này làm gia tăng gấp đôi số lượng tế bào trứng thu

được: 8,4 so với 4,3, số trứng có chất lượng tốt đạt 3,9 so với 2,9 (Das và cs.,

1996; Kumar và cs., 1997; Datta và Goswami, 1998). Tuy nhiên nhược điểm của

phương pháp này là làm gia tăng trứng có chất lượng thấp (Abdoon và Kandil,

2001). Nguyên nhân là kỹ thuật cắt lát tận dụng được cả những nang chìm vào

bên trong lớp vỏ buồng trứng. Do đó phương pháp này thường được áp dụng cho

các thí nghiệm với nguồn trứng thu từ buồng trứng lò mổ. Sharma và Taneja

(2000) nhận thấy rằng khi thu tế bào trứng bằng phương pháp chọc hút và thu

riêng từng tế bào trứng cho mỗi lần chọc hút sẽ có số lượng trứng cao hơn là thu

nhiều nang cùng một lần hoặc cắt lát (tương ứng: 0,88 tế bào trứng/buồng trứng

so với 0,26 trứng/buồng trứng và 0,68 trứng/buồng) (Sharma và Taneja, 2000).

1.1.2.2. Đánh giá và phân loại chất lượng trứng trâu

Tế bào trứng với sự đồng nhất của noãn bào chất được bao quanh bởi

nhiều lớp tế bào nang chặt chẽ có khả năng phát triển tốt hơn so với tế bào trứng

có ít hoặc không có tế bào nang (Suzuki và cs., 1992; Nandi và cs., 1998;

Abdoon và cs., 2001). Theo Goodhand và cs. (2000), trứng được phân thành 4

loại theo quan sát hình thái:

- Loại A: trứng có trên 4 lớp tế bào nang bao xung quanh tế bào trứng, liên kết

chặt chẽ, không giãn nở, nguyên sinh chất đồng nhất.

- Loại B: trứng có từ 2 lớp tế bào nang trở lên bao xung quanh tế bào trứng, liên

kết chặt chẽ, không giãn nở, nguyên sinh chất đồng nhất.

- Loại C: trứng bị mất một phần lớp tế bào nang bao xung quanh tế bào trứng,

nguyên sinh chất co lại không đồng đều.

9

- Loại D: trứng hoàn toàn không có lớp tế bào nang bao xung quanh và nguyên

sinh chất không đồng đều.

Chỉ sử dụng trứng loại A, B cho các thí nghiệm trong nghiên cứu này.

1.2. MÔI TRƯỜNG NUÔI THÀNH THỤC IN VITRO TẾ BÀO TRỨNG

Môi trường nuôi thành thục in vitro có vai trò quan trọng và quyết định

cho sự thành công của quy trình thụ tinh in vitro. Môi trường được sử dụng rộng

rãi hiện nay trong nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu là TCM 199 và

Ham’s F-10. Vì môi trường nuôi thành thục được thiết kế để tế bào trứng có thể

hoàn thiện quá trình thành thục của mình giống như trong cơ thể mẹ nên thường

được bổ sung thêm huyết thanh, hormone và một số yếu tố kích thích sinh

trưởng khác. Huyết thanh có vai trò cung cấp protein, các yếu tố chống oxy hóa

và phát triển; không ảnh hưởng đến màng zona pellucida của tế bào trứng. Nồng

độ bổ sung dao động từ 10% - 20%.

Để nâng cao hiệu quả nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu các nhà

nghiên cứu còn sử dụng kết hợp huyết thanh với hormone. Mặc dù tế bào trứng

có thể thành thục mà không cần bổ sung hormone vào môi trường nuôi thành

thục, nhưng việc có thêm gonadotropins và estradiol làm tăng tỷ lệ thành thục và

thụ tinh. Trong môi trường Ham’s F-10 khi bổ sung luteinizing hormone (LH)

cải thiện đáng kể tỷ lệ thành thục, còn việc thêm follicle stimulating hormone

(FSH) và estradiol làm tăng tỷ lệ tạo phôi nang. Ngược lại trong TCM-199, LH

không nâng cao tỷ lệ thành thục nhưng việc bổ sung FSH và oestradiol lại làm

tăng tỷ lệ này. Theo Abdoon và cs. (2001) việc bổ sung FSH và huyết thanh

ngựa chửa (eCG) vào môi trường nuôi thành thục có thể đạt tỷ lệ thành thục cao.

Neglia và cs. (2001) cho rằng khi sử dụng kết hợp FCS, LH và estradiol trong

môi trường nuôi thành thục làm tăng tỷ lệ trứng trâu và bò thành thục in vitro.

10

Ngoài việc bổ sung hormone và huyết thanh vào trong môi trường nuôi

thành thục, một số nhà nghiên cứu còn nhận thấy rằng việc bổ sung yếu tố kích

thích sinh trưởng ở một liều lượng nhất định làm tăng hiệu quả của quá trình

nuôi thành thục in vitro. Một số yếu tố kích thích sinh trưởng như IGF-I; IGF-II,

TGF-β cũng có thể được bổ sung vào môi trường nuôi thành thục. Theo Pawashe

và cs., 1998 việc bổ sung IGF-I cùng với FSH thúc đẩy sự giảm phân, quá trình

steroid và tổng hợp protein. Hơn nữa, việc bổ sung vào môi trường nuôi thành

thục với nhân tố kích thích giống như insulin (IGF-II) làm tăng đáng kể tỷ lệ

thành thục và phân chia so với những môi trường đối chứng khác (Chauhan và

cs., 1998b). Ngoài ra, Chauhan và cs. (1999) báo cáo rằng việc bổ sung vào môi

trường IVM với yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF) làm tăng đáng kể tỷ lệ thành

thục và phân chia so với đối chứng.

Trong dịch nang trứng có chứa một số yếu tố kích thích sinh trưởng như

IGF-I; IGF-II, TGF-β. Abdoon và cs. (2001) nhận thấy rằng việc thêm 10% dịch

nang trứng (FF) hoặc dịch nang trứng trâu (buFF) thu từ những nang lớn vào môi

trường nuôi thành thục với sự có mặt của eCG làm tăng đáng kể tỷ lệ cumulus

giãn nở, phân chia và phát triển của phôi. Tuy nhiên khi nồng độ buFF cao (20-

60%) hoặc buFF thu từ những nang nhỏ làm giảm tỷ lệ thành thục và phân chia.

Trong khi đó, Chauhan và cs. (1997b) cho rằng buFF có thể thay thế huyết thanh

ở nồng độ cao hơn (20-40%).

1.3. QUÁ TRÌNH THÀNH THỤC NHÂN CỦA TẾ BÀO TRỨNG

Quá trình thành thục nhân tế bào trứng trâu trước khi chín và rụng gồm

các giai đoạn phát triển chính: Kỳ đầu I, tiền kỳ giữa I, kỳ giữa I, kỳ sau I, kỳ

cuối I và thành thục nhân. Kỳ đầu I là giai đoạn tế bào trứng có nhân ở trạng thái

túi mầm (GV), nhân to tròn có thể ở giữa hoặc lệch hoặc sát ngoại vi tùy thuộc

vào giai đoạn phát triển sớm hay muộn. Nhiễm sắc thể của tế bào ở giai đoạn này

11

sẽ biến đổi từ dạng sợi mảnh thành dạng co ngắn với hình dạng đặc trưng. Do sự

bắt cặp NST đồng dạng nên phần lớn thời gian của tiền kỳ I, chúng tồn tại ở

trạng thái tứ trị. Giai đoạn kì trước I bắt đầu khi màng nhân vỡ và dần biến mất,

NST co ngắn gần như tối đa và tâm động của mỗi NST sẽ đính với một sợi của

thoi phân bào. Kì giữa I: các NST của cặp tương đồng xếp thành hàng trên mặt

phẳng xích đạo thoi phân bào. Trong kì sau I: NST trong cặp tương đồng bắt đầu

tách ra, hai NST của mỗi cặp tiếp hợp chuyển động về 2 cực đối nhau. Kì cuối I

xảy ra khi một bộ NST được tách ra trong thể cực I (giai đoạn này diễn ra rất

nhanh), sau đó sẽ hình thành eo thắt tách rời thể cực I ra khỏi tế bào trứng. Tế

bào trứng chứa bộ NST đơn bội ở trạng thái kép dừng ở kỳ giữa giảm phân II sẽ

trở thành tế bào trứng thành thục. Như vậy sản phẩm của phân bào giảm nhiễm I

là tế bào trứng thứ cấp (noãn bào II) và thể cực thứ nhất nằm ở xoang quanh

noãn phía bên trong màng sáng. Với sự phân chia này, số NST trong tế bào trứng

thay đổi từ trạng thái lưỡng bội (2n) xuống đơn bội (n). Tế bào trứng thứ cấp giữ

lại gần như toàn bộ nguyên sinh chất và một nửa vật chất nhân (NST) của noãn

bào I. Một nửa vật chất nhân khác được đẩy ra ngoài tạo thành thể cực thứ nhất.

Tế bào trứng sẽ được giải phóng khỏi sự ức chế phân bào, tiếp tục các giai đoạn

của phân bào giảm phân II ngay sau khi được thụ tinh. Kết quả của hoạt động

giảm phân này là tạo ra thể cực thứ 2 và bộ nhân nguyên đơn bội của trứng để

khi kết hợp với nhân tinh trùng sẽ tạo thành nhân lưỡng bội của hợp tử.

1.4. CHẤT BẢO VÊ LẠNH SỬ DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH ĐÔNG

LẠNH-GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO TRỨNG

1.4.1. Các dạng chất bảo vệ lạnh

Sự thành công của quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng dựa trên hai yếu tố

chính là chất bảo vệ lạnh và tốc độ đông lạnh-giải đông. Bởi vì nước là không

nhầy, nó chỉ có thể được thủy tinh hóa bằng đông lạnh cực nhanh với một lượng

12

thể tích nhỏ hoặc sử dụng nồng độ chất bảo vệ lạnh cao. Các chất bảo vệ lạnh là

những thành phần cần thiết có mặt trong dung dịch đông lạnh, dung dịch giải

đông để ngăn chặn việc hình thành các tinh thể đá giúp tế bào trứng tránh khỏi

sự tổn thương do quá trình đông lạnh-giải đông gây ra. Theo Gautam và cs.

(2011) thì có ba dạng chất bảo vệ lạnh: Các chất bảo vệ lạnh thấm màng có khối

lượng phân tử thấp (Dimethyl sulfoxide; 1, 2 propanediol; Ethylene glycol;

Glycerol); các chất bảo vệ lạnh không thấm màng có khối lượng phân tử thấp

(đường, protein); và cuối cùng là các chất bảo vệ lạnh không thấm màng có khối

lượng phân tử lớn như polyvinylpyrrolidone và polyvinylalcohol.

Các chất bảo vệ lạnh thấm màng là những phân tử nhỏ có khả năng thấm

vào tế bào thông qua màng tế bào, hoạt động bên trong tế bào. Trái ngược với

các chất bảo vệ lạnh thấm màng, các chất bảo vệ lạnh không thấm màng không

có khả năng thấm vào bên trong tế bào và hoạt động ở ngoại bào. Khi tồn tại ở

trong dung dịch với một nồng độ nhất định chúng sẽ tạo sự chênh lệch nồng độ

chất tan giữa trong và ngoài tế bào vì vậy nước bên trong tế bào bị rút ra ngoài

làm giảm lượng nước nội bào. Do đó, khi chúng được sử dụng kết hợp với chất

bảo vệ lạnh thấm màng sẽ làm tăng nồng độ chất bảo vệ lạnh thấm màng trong

nội bào. Điều này giúp cho chất bảo vệ lạnh thấm màng hoàn thành tốt vai trò

bảo vệ tế bào trứng trong quá trình đông lạnh bằng cách ngăn chặn được sự hình

thành tinh thể đá nội bào. Dung dịch bảo vệ lạnh thường được pha trong môi

trường đệm (TCM-199; DPBS) với pH trong khoảng 7,2-7,4.

1.4.2. Ảnh hưởng của dạng chất bảo vệ lạnh đến tế bào trứng

Mặc dù cơ chế hoạt động bảo vệ lạnh của các chất bảo vệ lạnh đến nay

vẫn chưa được hiểu hết, nhưng chúng có vai trò khác nhau trong quá trình bảo

quản lạnh tế bào. Việc bổ sung các chất này trong quá trình đông lạnh tế bào là

cần thiết giúp cho tế bào khỏi bị shock lạnh. Theo Mahmoud và El-Sokaray

13

(2013), các chất bảo vệ lạnh thấm màng có một số hoạt động hóa học trong quá

trình bảo quản lạnh tế bào trứng như sau:

- Làm giảm điểm đông lạnh, giúp trứng không bị tổn thương lạnh

- Tương tác với sự thay đổi của màng tế bào xảy ra trong suốt quá trình bảo quản

lạnh (từ trạng thái tương đối lỏng sang trạng thái rắn)

- Ngăn tế bào trứng tiếp xúc với nồng độ cao các chất tan ở cả nội, ngoại bào

bằng cách liên kết với các chất điện giải.

Sự có mặt của chất bảo vệ lạnh thấm màng có khối lượng phân tử thấp là

hoàn toàn cần thiết. Chúng có khả năng thấm màng, đóng vai trò chính và hoạt

động trong nội bào như một chất bảo vệ thông qua việc hình thành liên kết

hydrogen với phân tử nước và ngăn chặn sự hình thành tinh thể đá nội bào

(Pedro và cs., 2005; Edashige và Kasai, 2007). Khi ở trong nước với nồng độ

thấp, chúng làm giảm nhiệt độ đông lạnh của hỗn hợp. Ngược lại khi ở nồng độ

cao chúng sẽ ngăn chặn sự hình thành các tinh thể đá, tạo nên một trạng thái rắn

được gọi là thủy tinh mà trong đó nước được hóa rắn nhưng không giãn nở. Theo

cách này, các chất bảo vệ lạnh thấm màng là an toàn và đảm bảo cho sự thành

công của quá trình bảo quản lạnh. Dựa vào áp suất thẩm thấu, chúng thay thế

nước trong tế bào trước khi trứng được đông lạnh và làm giảm thể tích tế bào, do

đó sẽ giảm thiểu sự hình thành tinh thể đá trong tế bào trứng.

Chất bảo vệ lạnh thấm màng có vai trò bảo vệ tế bào khỏi những ảnh

hưởng tiêu cực của dung dịch đông lạnh bằng cách tồn tại trong dung dịch và

pha loãng một cách hiệu quả các chất điện giải còn lại (John và cs., 2006). Hiệu

quả này được Friedler và cs. (1988) mô tả theo các quy tắc giai đoạn, mà trong

đó có hệ thống hai bước, chẳng hạn như nước ở dạng lỏng và đá ở áp suất nhất

định, tổng nồng độ chất tan ở giai đoạn lỏng là không đổi ở một nhiệt độ nhất

định.

14

Glycerol (Gly) là chất bảo vệ lạnh có tính độc nhẹ, có tác dụng như một

chất chống đông, có khả năng thấm màng cao, hòa tan trong nước và cồn. Trong

quá trình cân bằng Gly xâm nhập vào bên trong tế bào thay thế các phân tử nước

thấm xuất ra ngoài tế bào làm cho tế bào không bị giảm dung tích. Tuy nhiên

nhược điểm của Gly là thường gây ra một vài ảnh hưởng bất lợi cho tính thẩm

thấu của tế bào trứng trong quá trình đông lạnh, điều này ảnh hưởng đến hiệu

quả của quá trình đông lạnh.

Ethylene glycol (EG) có khối lượng phân tử thấp hơn Gly, tính thấm màng

cao, hòa tan trong nước và cồn, có tác dụng tương tự như Gly, có thể dùng thay

thế cho Gly trong bảo quản lạnh tế bào trứng. Khi vào bên trong tế bào, các phân

tử EG nằm xen kẽ với các phân tử nước nên làm cho nước bị đóng băng ở dạng

nhỏ, loại trừ được sự giãn nở của tinh thể nước có kích thước lớn, ngăn cản được

sự phá vỡ màng tế bào. Nhờ đó, EG giữ được sự ổn định về nồng độ các chất hòa

tan, không làm thay đổi áp suất thẩm thấu và hạn chế sự phá hủy protein của tế

bào trong quá trình bảo quản lạnh. Ưu điểm của việc dùng EG trong bảo quản

lạnh tế bào trứng là khi giải đông không cần rút chất này ra khỏi tế bào trứng

theo các bước rút dần mà chúng có thể tự thẩm xuất ra ngoài. Tuy nhiên bên

cạnh ưu điểm của mình thì EG cũng có nhược điểm là có thể làm tổn hại đến

nhiễm sắc thể.

Dimethyl sulfoxide (DMSO) là chất bảo vệ lạnh có khối lượng phân tử

thấp hơn Gly, được dùng lần đầu tiên trong bảo quản lạnh phôi bò vào năm 1973

(Wilmul và Rowson, 1973). Tuy nhiên chúng được sử dụng ít hơn Gly vì chúng

có độc tính cao hơn đặc biệt là với hệ thống khung xương tế bào, khả năng thẩm

thấu kém hơn so với Gly. Ngoài ra, DMSO còn ảnh hưởng đến các vi ống, sợi

thoi vô sắc làm mất sự tập trung của thoi vô sắc và nhiễm sắc thể trong quá trình

15

giảm phân. Theo Vincent và Johnson (1992) nồng độ DMSO tỷ lệ thuận với

những tổn thương vi sợi đối với tế bào trứng chuột.

Ngoài ra còn có một chất bảo vệ lạnh thường được sử dụng trong bảo quản

lạnh tế bào trứng là 1, 2 - propanediol (PROH). Khi PROH được trộn lẫn với

nước chúng sẽ hình thành liên kết hydrogen với phân tử nước, rất khó để nước

tạo thành tinh thể đá giữa các phân tử PROH. Tuy nhiên, khi sử dụng PROH ở

nồng độ cao sẽ có ảnh hưởng nhất định đến tế bào do độc tố của PROH; mặc dù

tế bào có thể được tiếp xúc với dung dịch đông lạnh trong thời gian rất ngắn

(giống như kỹ thuật thủy tinh hóa) hoặc ở nhiệt độ rất thấp, mà tại thời điểm đó

tỷ lệ trao đổi chất của tế bào là rất thấp (giống như quá trình đông lạnh chậm).

Hoạt động của chất bảo vệ lạnh không thấm màng là ở ngoại bào và dựa

trên sự khử nước của các tế bào trứng trước khi đông lạnh. Chúng hoạt động

bằng cách rút nước tự do bên trong tế bào, do đó khử nước nội bào (Pereira và

Marques, 2008). Chất bảo vệ lạnh không thấm màng khi ở ngoại bào sẽ tạo nên

một môi trường có áp suất thẩm thấu cao thu hút nước tự do ở bên ngoài, điều

chỉnh sự thấm màng của các chất bảo vệ lạnh có tính thấm màng. Eroglu và cs.

(2000) đã báo cáo về việc sử dụng trehalose như là chất bảo vệ lạnh không thấm

màng nhằm ngăn chặn sự hình thành tinh thể đá trong quá trình đông lạnh.

Chất bảo vệ lạnh không thấm màng có thể bảo vệ toàn vẹn cấu trúc và

chức năng của màng tế bào trong quá trình đông lạnh-giải đông. Chất bảo vệ

lạnh không thấm màng hiện nay thường sử dụng là đường (sucrose, galactose) và

protein (bovine serum albumin, hyaluronic, huyết thanh thai bê). Trong môi

trường đông lạnh chúng có thể có ảnh hưởng đến đặc tính của dung dịch đông

lạnh-giải đông và hỗ trợ cho sự ổn định cấu trúc màng tế bào. Disacharide hoạt

động giống như đệm thẩm thấu để giảm shock thẩm thấu và độc tố của chất bảo

vệ lạnh bằng cách làm giảm nồng độ để nâng cao hiệu quả bảo quản lạnh tế bào.

16

Chúng phát huy lợi thế của mình bằng cách tăng nồng độ các chất hòa tan để tạo

ra một áp suất thẩm thấu qua màng tế bào. Quá trình giải đông là một phần đảm

bảo cho sự thành công của quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng và chất bảo vệ

lạnh không thấm màng cũng đóng một vai trò quan trọng trong quá trình này.

Một vài chất bảo vệ lạnh không thấm màng bảo vệ tế bào trong quá trình giải

đông bằng cách ổn định màng tế bào. Trong suốt quá trình giải đông tế bào trứng

đông lạnh, nước được tạo ra do sự tan chảy của đá một cách nhanh chóng, vì vậy

sẽ dẫn đến hiện tượng giảm áp suất thẩm thấu ngoại bào. Shock thẩm thấu có thể

xảy ra nếu chất bảo vệ lạnh trong nội bào không thể khuếch tán ra ngoài một

cách nhanh chóng đủ để ngăn chặn sự tràn vào của nước tự do và làm cho tế bào

trứng phồng lên, hoặc gẫy vỡ. Sự có mặt của các chất bảo vệ lạnh không thấm

màng trong dung dịch giải đông sẽ nâng cao được hiệu quả của quá trình bảo

quản lạnh tế bào trứng.

Các chất bảo vệ lạnh có khối lượng phân tử cao bảo vệ các tế bào trứng

trong quá trình đông lạnh-giải đông bằng cách thay đổi sự hình thành tinh thể đá

thành hình dạng và kích thước không có hại cho tế bào trứng. Hơn nữa chúng

cũng được cho là có vai trò ổn định các protein trong tế bào trứng (Gautam và

cs., 2011). Những hợp chất cao phân tử có khối lượng phân tử lớn, không thấm

màng hoặc những đại phân tử thường được sử dụng để làm giảm bớt khối lượng

chất bảo vệ lạnh nội bào, và làm giảm độc tố của dung dịch đông lạnh. Ngoài ra

các hợp chất cao phân tử còn bảo vệ màng sáng không bị đứt gãy (Jennifer và

Muhammad, 2011).

Tuy nhiên ngoài vai trò quan trọng là chất bảo vệ tế bào trứng trong quá

trình đông lạnh-giải đông thì bản thân các chất bảo vệ lạnh cũng có những ảnh

hưởng bất lợi nhất định đến tế bào trứng trong quá trình bảo quản lạnh (Fahy và

cs., 1999). Những tổn thương do chất bảo vệ lạnh gây ra là không giới hạn mà có

17

thể xảy ra trong suốt quá trình đông lạnh-giải đông. Các chất bảo vệ lạnh thấm

màng được sử dụng trong quá trình bảo quản lạnh thường có hệ số thấm màng

thấp hơn so với nước. Chính vì vậy tế bào trứng sẽ phải trải qua sự chênh lệch áp

suất thẩm thấu trong quá trình bảo quản lạnh (thêm chất bảo vệ lạnh, loại bỏ chất

bảo vệ lạnh ra khỏi tế bào). Trước khi đông lạnh, tế bào trứng có thể bị tổn

thương do ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu khi tiếp xúc với dung dịch có chứa

chất bảo vệ lạnh.

Có nhiều tác giả đã nghiên cứu việc sử dụng chất bảo vệ lạnh như thế nào

để làm giảm bớt những ảnh hưởng bất lợi của chúng đối với tế bào trứng. Trong

quá trình đông lạnh, các chất bảo vệ lạnh thấm màng có thể được sử dụng riêng

lẻ hoặc kết hợp với nhau. Tuy nhiên có nhiều tranh cãi về vấn đề này, Wani và

cs. (2004b); Yadav và cs. (2008) đã báo cáo rằng không tìm thấy hiệu quả của

việc kết hợp các chất bảo vệ lạnh lên sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu

sau đông lạnh-giải đông. Ngược lại Critser và cs. (1997), Vajta và cs. (1998b),

Paynter và cs. (1999), Mahmoud và cs. (2010b) lại cho rằng khi kết hợp các chất

bảo vệ lạnh với nhau sẽ có hiệu quả đến sự thành thục in vitro của tế bào trứng

bò; tế bào trứng trâu chưa thành thục.

Ngoài việc kết hợp các chất bảo vệ lạnh thấm màng trong quá trình đông

lạnh, các nhà khoa học cũng nghiên cứu kết hợp giữa chất bảo vệ lạnh thấm

màng và không thấm màng với nhau trong quá trình đông lạnh – giải đông.

Trong quá trình đông lạnh, khi chất bảo vệ lạnh không thấm màng được kết hợp

với chất bảo vệ lạnh thấm màng sẽ làm tăng nồng độ chất bảo vệ lạnh trong nội

bào, nhờ đó giúp cho quá trình rút nước nội bào xảy ra dễ dàng hơn, ngăn chặn

được sự hình thành tinh thể đá nội bào. Chất bảo vệ lạnh không có tính thấm

màng ở bên ngoài tế bào sẽ tạo nên một môi trường có áp suất thẩm thấu cao thu

hút nước tự do ở bên ngoài và điều chỉnh sự thấm màng của các chất bảo quản

18

lạnh có tính thẩm thấu. Việc bổ sung đường vào dung dịch thủy tinh hóa có thể

làm tăng độ nhớt của dung dịch, do đó khi các tế bào được để trong dung dịch

này trước khi thủy tinh hóa giúp loại bỏ được nước từ các tế bào nhiều hơn và

làm giảm bớt độc tố của các chất bảo vệ lạnh đối với tế bào (Orief và cs., 2005).

Trong quá trình giải đông shock thẩm thấu xảy ra do sự khuếch tán của chất bảo

vệ lạnh ra ngoài môi trường. Do đó, để hạn chế hiện tượng này quy trình giải

đông thường sử dụng các chất bảo vệ lạnh không thấm màng có nồng độ cao như

đường (sucrose) chất bảo vệ lạnh không thấm màng khác. Việc kết hợp hai dạng

chất bảo vệ lạnh thấm màng và không thấm màng với nhau sẽ giúp tế bào trứng

tránh được sự tổn thương trong quá trình giải đông. Karima và cs. (2010) cho

rằng việc kết hợp giữa chất bảo vệ lạnh thấm màng và không thấm màng có thể

giảm bớt ảnh hưởng bất lợi của chất bảo vệ lạnh đến tế bào trứng trâu.

1.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất bảo vệ lạnh đến tế bào trứng

Bảo quản lạnh tế bào trứng động vật có vú đã đạt được nhiều sự thành

công khi sử dụng kỹ thuật thủy tinh hóa thay cho phương pháp đông lạnh chậm

trong những năm gần đây (Chian và cs., 2004; Vajta và Nagy, 2006). Kết quả

một số nghiên cứu đông lạnh tế bào trứng trâu trước đây cho thấy thủy tinh hóa

là phương pháp bảo quản lạnh tế bào trứng trâu hiệu quả hơn so với đông lạnh

chậm, đặc biệt là với trứng trâu chưa thành thục Gautam và cs., 2008a; Gautam

và cs., 2008b). Mặt khác nồng độ chất bảo vệ lạnh cũng là một trong những yếu

tố mang lại sự thành công cho quá trình này. Theo các nghiên cứu đã được công

bố thì giới hạn về việc sử dụng nồng độ các chất bảo vệ lạnh trong quá trình bảo

quản lạnh tế bào trứng khá rõ ràng, nồng độ tối đa có thể chấp nhận của chất bảo

vệ lạnh thấm màng là 10M, nếu quá nồng độ này sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả bảo

quản lạnh trứng trâu (Yadav và cs., 2008; Dhali và cs.,2000a; Wani và cs.,

2004a). Việc tăng nồng độ các chất bảo vệ lạnh quá giới hạn cho phép sẽ làm

19

giảm khả năng sống của trứng trâu sau khi chúng tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh

(Karima và cs., 2010). Tuy nhiên vẫn chưa có sự thống nhất trong việc lựa chọn

một nồng độ chất bảo vệ lạnh tối ưu cho quá trình đông lạnh tế bào trứng. Theo

Yadav và cs. (2008) thì ở nồng độ 8M tế bào trứng có khả năng sống sau đông

lạnh-giải đông tốt nhất; trong khi đó Wani và cs. (2004a) thì lại cho rằng tỷ lệ

thành thục in vitro cao nhất của tế bào trứng trâu sau đông lạnh-giải đông được

quan sát thấy khi tế bào trứng được thủy tinh hóa ở nồng độ 7M đối với tất cả

các chất bảo vệ lạnh mà họ nghiên cứu.

1.4.4. Ảnh hưởng của thời gian và cách thức tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh

đến tế bào trứng

Thời gian tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh trong quá trình đông lạnh-giải

đông là một yếu tố có ảnh hưởng không nhỏ tới hiệu quả của quá trình này. Theo

Kasi (1996), một trong những yếu tố quan trọng đảm bảo cho sự thành công của

quá trình thủy tinh hóa là phải lựa chọn được thời gian tiếp xúc tốt nhất với chất

bảo vệ lạnh qua đó ngăn chặn được sự hình thành tinh thể đá và tránh cho tế bào

trứng không bị những tổn thương lạnh trong quá trình này. Martin và cs. (2005);

Karima và cs. (2010) đều cho rằng thời gian tiếp xúc của tế bào trứng với chất

bảo vệ lạnh chỉ có giới hạn nhất định, nếu quá giới hạn này tế bào trứng sẽ bị

chết sau khi tiếp xúc.

Trước khi đông lạnh, tế bào sẽ được tiếp xúc với dung dịch có chứa chất

bảo vệ lạnh ở một nồng độ nhất định. Mỗi quy trình đông lạnh sẽ có một hình

thức, cách thức tiếp xúc khác nhau. Việc tiếp xúc sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả bảo

quản lạnh tế bào, nếu tế bào bị tiếp xúc đột ngột với chất bảo vệ lạnh ở một nồng

độ nào đó có thể gây shock thẩm thấu và thậm chí là gây chết tế bào. Có thể hạn

chế những ảnh hưởng bất lợi này bằng cách: cho tế bào tiếp xúc với nồng độ cao

chất bảo vệ lạnh trong thời gian rất ngắn thông qua việc cho chúng tiếp xúc với

20

dung dịch trước cân bằng có chứa nồng độ chất bảo vệ lạnh thấp hơn, hình thức

tiếp xúc này gọi là tiếp xúc nhiều bước (Wood và cs., 1993; Papis và cs., 2000).

Hiện nay trên thế giới thường sử dụng cách thức tiếp xúc nhiều bước trong quá

trình bảo quản lạnh tế bào trứng. Nồng độ chất bảo vệ lạnh tăng dần theo các

bước tiếp xúc cho đến nồng độ thích hợp cuối cùng đối với mẫu được bảo quản

lạnh. Khi tế bào trứng được tiếp xúc nhiều bước với chất bảo vệ lạnh sẽ cho hiệu

quả bảo quản lạnh tốt hơn là tiếp xúc 1 bước. Nguyên nhân là do trong quá trình

tiếp xúc nhiều bước, các tế bào trứng sẽ được tiếp xúc với một dung dịch có

nồng độ thấp trước khi chuyển sang dung dịch có nồng độ cao hơn, nhờ đó

chúng sẽ tránh bị shock thẩm thấu đột ngột khi tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh ở

nồng độ cao.

1.4.5. Quá trình giải đông và pha loãng

Việc giải đông tế bào trứng sau bảo quản lạnh được thực hiện ở nhiệt độ

phòng hoặc trong bể ấm 37°C. Sau giải đông, các chất bảo vệ lạnh được loại bỏ

khỏi tế bào, quá trình này được gọi là quá trình pha loãng. Đây cũng là giai đoạn

rất quan trọng để ngăn chặn độc tố của các chất bảo vệ lạnh, tế bào trứng có thể

tự sửa chữa những tổn thương và hồi phục. Hiện nay quá trình pha loãng thường

gồm nhiều bước và nồng độ của các chất bảo vệ lạnh được giảm dần qua từng

bước. Vai trò của chất bảo vệ lạnh không thấm màng trong quá trình pha loãng là

làm cho chất bảo vệ lạnh thấm màng nhanh chóng được loại bỏ khỏi tế bào chất.

Trong quá trình giải đông tốc độ giải đông có một vai trò vô cùng quan

trọng. Đó cũng là một yếu tố quan trọng để bảo quản lạnh thành công tế bào

trứng của động vật có vú. Tốc độ giải đông tối ưu phụ thuộc vào loại tế bào và

tốc độ đông lạnh trước đó. Các nghiên cứu ban đầu cho thấy tốc độ giải đông

nhanh làm tăng tỷ lệ sống sau đông lạnh-giải đông của tế bào bởi vì tế bào ít có

thời gian để tái kết tinh, thời gian tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh ít hơn. Tuy nhiên

21

theo Whittingham và cs. (1972) thì vẫn có những trường hợp ngoại lệ cho quy

tắc nêu trên. Họ đã chỉ ra rằng phôi được bảo quản lạnh bằng phương pháp đông

lạnh chậm nếu giải đông từ từ sẽ cho tỷ lệ sống sau đông lanh-giải đông cao hơn,

tỷ lệ này phụ thuộc vào tốc độ giải đông. Ngoài ra các tác giả này cũng kết luận

rằng tỷ lệ sống của tế bào sau đông lạnh-giải đông bị giảm khi sử dụng tốc độ

giải đông nhanh là còn do hiệu ứng thẩm thấu. Phương pháp phổ biến nhất giải

đông tế bào trứng sau khi được thủy tinh hóa là phương pháp giải đông trực tiếp

và nhanh chóng. Thông thường các tế bào trứng sẽ được giải đông ở 20o – 37oC.

Sau khi giải đông, tế bào trứng phải được bù nước và chất bảo vệ lạnh sử dụng

cho quá trình bảo quản lạnh phải được loại bỏ hết ra khỏi tế bào trứng. Tuy nhiên

hiện nay vẫn chưa có một quy trình giải đông chuẩn nào cho quá trình bảo quản

lạnh tế bào trứng.

1.5. PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH SỬ DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH

BẢO QUẢN LẠNH TẾ BÀO TRỨNG

1.5.1. Bảo quản lạnh tế bào trứng

Quá trình bảo quản lạnh tế bào hoặc mô là cho chúng tiếp xúc với nhiệt độ

giảm dần đến -1960C, nhiệt độ của nitơ lỏng. Ở nhiệt độ thấp, nước tồn tại ở

trạng thái rắn, các hoạt động sinh học sẽ ngừng lại và chức năng của tế bào sẽ

được lưu giữ hàng thế kỷ. Do tế bào trứng có khả năng thấm màng thấp đối với

các chất bảo vệ lạnh thấm màng nên bảo quản lạnh tế bào trứng là khó hơn so

với bảo quản lạnh tinh trùng hoặc phôi. Tế bào trứng ở động vật có vú có thể tích

lớn hơn 3-4 lần so với tinh trùng, hàm lượng lipid trong tế bào chất cao, do đó

làm giảm đáng kể tỷ lệ thể tích bề mặt được tiếp xúc và làm cho chúng trở nên

nhạy cảm với những tổn thương lạnh và dễ bị hình thành tinh thể đá nội bào

trong quá trình đông lạnh (Toner và cs., 1990; Ruffing và cs., 1993; Arav và cs.,

1996; Zeron và cs., 1999).

22

Tế bào trứng được bao xung quanh bởi màng sáng, nó đóng vai trò như

hàng rào bảo vệ ngăn cản chuyển động của nước, sự thẩm thấu và thẩm xuất của

chất bảo vệ lạnh đối với tế bào trứng (Joseph Saragusty và Amir Arav, 2011).

Sau giải đông màng sáng bị hóa rắn làm cho tinh trùng khó xâm nhập trong quá

trình thụ tinh (Mavrides và Morroll, 2005). Điểm khác nhau chính để làm nên sự

thành công của quá trình bảo quản lạnh giữa tế bào trứng và phôi là màng tế bào

chất, sự có mặt của các tế bào hạt vỏ, sự hình thành thoi vô sắc ở giai đoạn thành

thục nhân (MII) của quá trình giảm phân. Quá trình đông lạnh sử dụng hợp chất

khử nước, điểm đông lạnh thấp, đông lạnh chậm và thủy tinh hóa nội bào giúp

cho tế bào trứng tránh khỏi những tổn thương lạnh. Hiện nay chưa có một

phương pháp chung chắc chắn nào được thiết lập để bảo quản lạnh tế bào trứng

của một số loài, mặc dù đã có một vài quy trình đông lạnh tạo ra được con non từ

trứng sau đông lạnh-giải đông như ở bò, cừu, ngựa.

Tế bào trứng có khả năng sống ở 37oC và không có hoạt động sinh học

nào diễn ra tại -196oC; thời điểm nguy hiểm nhất xảy ra trong quá trình bảo quản

lạnh là giai đoạn chuyển đổi nhiệt độ từ nhiệt độ lạnh xuống -196oC và giai đoạn

giải đông tiếp theo đến 37oC. Tế bào trứng có những cấu tạo đặc biệt và rất nhạy

cảm với nhiệt độ hiệu quả của quá trình đông lạnh tế bào trứng thường bị ảnh

hưởng bởi điều này. Mazur (1977) đã mô tả những hiện tượng vật lý chính xảy ra

trong quá trình đông lạnh tế bào. Theo tác giả này, khi nhiệt độ hạ xuống -5°C;

tế bào và môi trường xung quanh nó vẫn chưa đóng băng bởi vì nhiệt độ lạnh

chưa tạo đá (supercooling), và sự giảm điểm đông do sự có mặt của chất bảo vệ

lạnh. Tinh thể nước sẽ hình thành bên ngoài nhiệt độ -5°C đến -15°C (do ngẫu

nhiên hay do tạo mầm đá-seeding), nhưng lúc này các chất bên trong tế bào vẫn

chưa đông lạnh và nhiệt độ lạnh chưa tạo đá do có sự ngăn cản lan việc lan rộng

của tinh thể nước vào trong tế bào chất. Theo định nghĩa, nước ở nhiệt độ lạnh

23

chưa tạo đá bên trong tế bào có nồng độ hóa học cao hơn so với nước trong dung

dịch được đông lạnh một phần bên ngoài tế bào. Để đáp ứng lại sự chênh lệch

này nước sẽ đi ra ngoài tế bào và đông lạnh bên ngoài tế bào. Khi nước chuyển

từ dạng dung dịch sang dạng đá, các chất hòa tan trong dung dịch sẽ không bị

hóa rắn, đây là lý do điểm đông lạnh của những dung dịch có chứa chất hòa tan

bị giảm xuống. Khi nhiệt độ giảm xuống và hình thành thể rắn, nồng độ các chất

hoàn tan và điện giải trong dung dịch đông lạnh có thể tăng lên (Lovelock,

1954). Nồng độ này có thể gây độc cho protein tế bào, ảnh hưởng đến hiệu quả

bảo quản lạnh tế bào; vì vậy việc loại trừ những ảnh hưởng của dung dịch là một

trong những mục tiêu quan trọng đảm bảo cho sự thành công của quá trình bảo

quản lạnh (John và cs., 2006).

Trong suốt quá trình giải đông, tinh thể đá sẽ tan ra và giải phóng nước,

kết quả làm giảm áp suất thẩm thấu của dung dịch xung quanh. Khi quá trình

giải đông diễn ra chậm, nước có thể hóa rắn trở lại và gây nguy hiểm cho tế bào.

Khi quá trình giải đông diễn ra nhanh, áp suất thẩm thấu ngoại bào bị giảm đột

ngột do sự tan chảy nhanh chóng của tinh thể đá ngoại bào có thể dẫn đến sự

thay đổi nhanh chóng của nước ra và vào bên trong tế bào, dẫn đến hiện tượng tế

bào bị phồng lên và tổn thương (Mazur. 1980). Hiện tượng này được gọi là

shock thẩm thấu và việc loại trừ nó cũng là mục tiêu để đảm bảo cho sự thành

công của quá trình bảo quản lạnh (John và cs., 2006).

1.5.2. Sự khử nước (dehydration) trong quá trình đông lạnh tế bào trứng

Việc khử nước của tế bào trứng xảy ra trong quá trình đông lạnh là điều

cần thiết để đảm bảo khả năng sống của tế bào trứng sau đông lạnh-giải đông.

Do tế bào trứng có tỷ lệ thể tích bề mặt thấp nên chúng sẽ rất khó thực hiện sự

khử nước trong quá trình đông lạnh – giải đông. Yếu tố đầu tiên đem lại sự thành

công cho quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng chính là việc tế bào trứng khử

24

nước thành công trong quá trình này. Mỗi loại tế bào có khả năng thấm màng cơ

bản và đặc trưng riêng (Leibo, 1980). Theo Oda và cs. (1992); Agca và cs.

(2000) thì stress thẩm thấu là một trong những nguyên nhân gây bất lợi cho khả

năng phát triển của tế bào trứng.

Mặc dù đã có sự quan tâm nghiên cứu đến tính thấm của nước qua màng

tế bào trứng và phôi nhưng hầu hết mới chỉ thực hiện ở trên chuột (Leibo, 1980;

Toner và cs., 1991; Oda và cs., 1992; Pedro và cs., 1997). Khả năng thẩm thấu

qua màng tế bào cũng đã được kiểm tra trên một số tế bào trứng của động vật

nuôi như dê (Le Gal và cs., 1994); bò (Ruffing và cs., 1993; Agca và cs., 2000)

và cả ở trên người (Trad và cs., 1998). Trong quá trình đông lạnh tế bào trứng sẽ

được cho vào môi trường có chứa chất bảo vệ lạnh với một nồng độ nhất định.

Các tế bào trứng được tiếp xúc 1 bước hoặc nhiều bước với chất bảo vệ lạnh tùy

thuộc vào quy trình đông lạnh. Dung dịch đông lạnh có thể sử dụng chất bảo vệ

lạnh thấm màng và không thấm màng để tạo nên sự thay đổi trong nước đẳng

trương giữa nội và ngoại bào dẫn tới hiện tượng nước thoát ra khỏi tế bào. Quá

trình này được gọi là sự khử nước tế bào, đây cũng là một bước cần thiết và quan

trọng trong cân bằng đông lạnh. Thủy tinh hóa là một phương pháp đông lạnh

không cân bằng trong đó sử dụng nồng độ chất bảo vệ lạnh cao; chính vì thế cần

phải có những nghiên cứu để giảm thiểu tác động của stress thẩm thấu đến tế bào

trứng, qua đó nâng cao được hiệu quả của quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng.

1.5.3. Quá trình cân bằng

Trong các quy trình đông lạnh nồng độ chất bảo vệ lạnh thường từ 1M đến

8M, với mục đích làm tăng nồng độ bên ngoài tế bào. Để làm giảm những yếu tố

ảnh hưởng bất lợi cho khả năng thẩm thấu của tế bào trứng trong quá trình đông

lạnh, việc cho tế bào trứng tiếp xúc từng bước với chất bảo vệ lạnh là cần thiết.

Các quá trình cân bằng một bước hoặc nhiều bước ở nhiệt độ phòng được sử

25

dụng hiện nay dựa trên sự tính toán về dạng và nồng độ cuối cùng của chất bảo

vệ lạnh. Thêm vào đó, thời gian tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh cũng là một nhân

tố quan trọng khác đối với việc điều chỉnh sự xâm nhập của chất bảo vệ lạnh vào

trong tế bào chất. Đối với Glycerol, tối thiểu là 20 phút để hoàn thành quá trình

xâm nhập vào bên trong tế bào trứng thông qua màng sáng và màng tế bào chất.

EG và PROH đòi hỏi thời gian thẩm thấu thông qua màng tế bào ít hơn Glycerol,

và thời gian cân bằng không cần thiết phải lâu hơn 10 phút. Việc sử dụng kết hợp

chất bảo vệ lạnh thấm màng và không thấm màng cũng làm tăng hiệu quả của

quá trình đông lạnh, vì chất bảo vệ lạnh không thấm màng có tác dụng ngăn chặn

sự xâm nhập thừa của một vài chất bảo vệ lạnh thấm màng.

1.5.4. Tốc độ đông lạnh

Tốc độ đông lạnh là một trong những yếu tố quan trọng đảm bảo cho sự

thành công của quá trình bảo quản lạnh. Theo Le Gal và Massip. (1999) tốc độ

đông lạnh nhanh là chìa khóa mở ra sự thành công của quá trình đông lạnh tế bào

trứng theo phương pháp thủy tinh hóa. Tốc độ đông lạnh nhanh làm giảm thời

gian tiếp xúc của tế bào trứng với nhiệt độ đồng thời giảm độc tố của chất đông

lạnh, nhờ đó sẽ giảm bớt các tổn thương của tế bào trứng trong quá trình thủy

tinh hóa. Tốc độ đông lạnh phụ thuộc vào vật chứa mẫu, khối lượng, độ dẫn

nhiệt và thành phần dung dịch… (Yavin và Arav., 2007). Theo Arav và cs.

(2002); Yavin và Arav (2007) nếu thể tích chứa mẫu đông lạnh nhỏ sẽ làm tăng

khả năng sống sau đông lạnh-giải đông của mẫu đông lạnh. Bởi vì khi thể tích

chứa mẫu đông lạnh nhỏ sẽ cho phép khả năng truyền nhiệt tốt hơn, và tốc độ

đông lạnh tăng lên. Ví dụ khi sử dụng một dụng cụ chứa mẫu là cọng rạ hở, có

thể làm cho tốc độ đông lạnh đạt được đến 20000oC/phút.

Việc tăng tốc độ đông lạnh-giải đông trong quá trình bảo quản lạnh sẽ

giúp cho tế bào tránh được những tổn thương lạnh, làm giảm nồng độ chất bảo

26

quản lạnh, nhờ đó các tế bào sẽ vượt qua vùng nhiệt độ giới hạn (-5 đến -15oC)

một cách nhanh chóng, nước đi ra ngoài tế bào và đông lạnh ở bên ngoài. Điều

này ngăn chặn tổn thương lạnh đối với các giọt lipid nội bào, lipid có trong màng

tế bào và bộ khung xương tế bào. Mức độ mất nước của tế bào phụ thuộc vào tốc

độ đông lạnh (hạ nhiệt nhanh hay chậm), tốc độ này phải trên tốc độ giới hạn.

Đối với mỗi loại tế bào có một tốc độ giới hạn cho phép khác nhau. Cùng với

mức độ mất nước là khả năng tạo băng đá nội bào cũng tăng lên gây tổn thương

cho tế bào do đông lạnh hoặc giải đông. Nếu tốc độ đông lạnh ở dưới giới hạn

cho phép thì sự sống của tế bào gắn liền với sự biến đổi các tính chất của dung

dịch, đồng thời nồng độ chất hòa tan cũng tăng lên ở bên ngoài tế bào.

Các hiện tượng vật lý xảy ra bên trong tế bào trứng trong quá trình đông

lạnh-giải đông phụ thuộc vào tốc độ làm lạnh. Nếu nhiệt độ giảm chậm, tế bào

có khả năng mất nước nhanh do ngoại thẩm thấu làm tăng nồng độ các chất nội

bào đủ để loại bỏ nhiệt độ lạnh chưa tạo đá và duy trì tiềm năng các chất hóa học

nội bào cân bằng với tiềm năng các chất hóa học ngoại bào. Điều này dẫn tới

việc là tế bào bị mất nước và không đông lạnh bên trong tế bào. Nhưng nếu tế

bào được đông lạnh quá nhanh thì nó không có khả năng mất nước nhanh để duy

trì cân bằng, nhiệt độ lạnh chưa tạo đá tăng lên và xảy ra hiện tượng đông lạnh

nội bào. Như vậy sự hiện diện của tinh thể đá nội bào và những hiệu ứng của

dung dịch là hai yếu tố chủ yếu thay đổi theo tốc độ đông lạnh để quyết định đến

khả năng sống của tế bào trứng sau bảo quản lạnh-giải đông.

1.5.5. Phương pháp đông lạnh

Từ khi có báo cáo đầu tiên về bảo quản lạnh thành công phôi chuột ở giai

đoạn 8 tế bào (Whittingham và cs., 1972), nhiều nghiên cứu tiếp theo được thực

hiện để kiểm tra các yếu tố có liên quan đến khả năng sống sau đông lạnh - giải

đông của phôi và tế bào trứng động vật có vú để xem xét hiệu quả và khả năng

27

phát triển tiếp theo của chúng. Hiện nay trên thế giới đang tồn tại song song hai

phương pháp bảo quản lạnh là đông lạnh chậm (slow-freezing), thủy tinh hóa

(vitrification). Thủy tinh hóa bao gồm thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống

và đông lạnh cực nhanh (ultra rapid freezing) tùy thuộc vào tốc độ đông lạnh,

các chất bảo vệ lạnh, vật chứa mẫu đông lạnh. Điều khác biệt cơ bản giữa hai

phương pháp này là nồng độ chất bảo vệ lạnh, tốc độ đông lạnh, vật chứa mẫu.

Hầu hết các tế bào trứng được bảo quản lạnh theo một trong hai quy trình: (1)

cân bằng đông lạnh, thường được gọi là đông lạnh chậm và (2) không cân bằng

đông lạnh, thường gọi là đông lạnh nhanh hoặc đông lạnh cực nhanh.

1.5.5.1. Đông lạnh chậm (slow-freezing)

Đây là phương pháp áp dụng thành công đầu tiên cho việc bảo quản lạnh

tế bào trứng/phôi của động vật có vú. Cơ chế của đông lạnh chậm là tạo tinh thể

đá ngoại bào và ngăn chặn sự hình thành tinh thể đá nội bào. Các chất bảo vệ

lạnh thấm màng có thể đi vào bên trong tế bào trứng và khử nước của tế bào

trứng (Liang, 2010). Nguyên tắc của phương pháp này là tạo ra sự kết tinh nước

trong nội bào một cách chậm và có kiểm soát. Nước được đi ra hay đi vào tế bào

nhờ vào độ nhớt hoặc sự hóa rắn mà không có sự hình thành tinh thể đá nội bào.

Đông lạnh chậm kiểm soát tốc độ đông lạnh ở mức 0,3 -0,5oC/phút, vì vậy nước

nội bào có thể đủ thời gian đi ra khỏi tế bào trứng. Đông lạnh chậm là đòi hỏi tốc

độ đông lạnh chậm và dài trước khi mẫu được chuyển vào nitơ lỏng. Đó là

phương pháp cân bằng truyền thống khi sử dụng các chất bảo vệ lạnh thấm

màng. Phương pháp này gồm có việc sử dụng chất bảo vệ lạnh ở nồng độ thấp

(1-2M) với quá trình khử nước diễn ra từ từ để đáp ứng dần với nồng độ của các

phần đông lạnh ngoại bào trong suốt quá trình hình thành tinh thể đá nội bào

đồng thời duy trì sự cân bằng giữa các nhân tố làm ảnh hưởng đến sự tổn thương

tế bào.

28

Phương pháp đông lạnh chậm gồm các bước sau:

- Tế bào trứng được tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh với nồng độ thích hợp ở nhiệt

độ phòng tới khi đạt được sự cân bằng giữa dung dịch chất bảo vệ lạnh và tế bào

trứng. Tế bào trứng sau đó được nạp vào cọng rạ.

- Cọng rạ được cho vào máy đông lạnh và được làm lạnh ở nhiệt độ -5 đến -7oC,

tại đây chúng được giữ vài phút để cân bằng. Sau khi cân bằng dung dịch sẽ

được tạo mầm đá để bắt đầu quá trình đông lạnh nội bào với tốc độ đông lạnh

khoảng 0,3-0,5oC/phút, để đảm bảo nhiệt độ đồng đều trong mẫu cho tới khi đạt

đến -65oC. Lúc này nồng độ chất bảo vệ lạnh trong nội bào đủ cho nước nội bào

hóa rắn mà không hình thành tinh thể đá nội bào. Khi đó cọng rạ chứa mẫu được

nhúng ngập vào trong nitơ lỏng để bảo quản cho tới khi sử dụng.

Trong phương pháp đông lạnh chậm, tinh thể nước đá được tạo ra ở nhiệt

độ 6oC bằng cách tạo mầm đá, sự hình thành tinh thể đá nhỏ này sẽ cho phép

hình thành tiếp các tinh thể đá khác. Mầm đá thường được thực hiện bằng cách

dùng một dụng cụ rất lạnh (chẳng hạn như cái kẹp) chạm vào bên ngoài của vật

chứa mẫu để tạo ra một tinh thể đá nhỏ hình thành bên ngoài vùng chứa mẫu bảo

quản lạnh. Kết quả của sự hình thành đá là giải phóng ra năng lượng thường

được gọi là phản ứng tổng hợp nhiệt. Do đó, dung dịch thường được giữ ở nhiệt

độ này trong một thời gian, khoảng 10-30 phút để cân bằng. Sự phát triển các

tinh thể đá sẽ làm tách các chất hòa tan khỏi nước, do đó dần tăng nồng độ của

chúng trong dung dịch còn lại. Chính vì thế, mầm đá phải được thực hiện ở vị trí

xa tế bào trứng để các tinh thể đá phát triển dần dần về phía tế bào trứng. Sau khi

cân bằng, nhiệt độ giảm xuống -32oC. Trong suốt thời gian này, các tinh thể đá

dần dần lan truyền trong môi trường ngoại bào, nồng độ chất bảo vệ lạnh tiếp tục

tăng, đặc biệt là ở không gian nội bào, trong khi đó sự khử nước vẫn diễn ra nhờ

vào các chất bảo vệ lạnh không thấm màng. Tốc độ đông lạnh chậm (0,33oC/

29

phút) giúp tế bào trứng bổ sung từ từ các chất bảo vệ lạnh thấm màng trong khi

vẫn duy trì sự cân bằng với không gian ngoại bào. Tốc độ trao đổi chất của tế

bào trứng tại thời điểm này là chậm.

Trong quá trình giải đông, sự thay đổi nhanh chóng của nhiệt độ phù hợp

để ngăn chặn sự hình thành lại tinh thể đá của nước và những tổn thương do tinh

thể đá gây ra. Đây là bước cần phải thực hiện để tránh shock thẩm thấu từ các

chất bảo vệ lạnh thấm màng, mà tại đó nồng độ của chúng trong nội bào là rất

cao. Vì vậy, việc thêm chất bảo vệ lạnh không thấm màng đã được sử dụng. Khi

các chất bảo vệ lạnh thấm màng khuếch tán ra khỏi tế bào trứng, nồng độ các

chất bảo vệ lạnh không thấm màng dần dần được giảm xuống, cho đến khi tế bào

trứng được chuyển vào môi trường dùng cho các thí nghiệm nghiên cứu tiếp

theo.

Đối với phương pháp đông lạnh chậm thì tốc độ đông lạnh được kiểm

soát, nó cho phép sự trao đổi giữa dung dịch nội bào và ngoại bào mà không có

ảnh hưởng thẩm thấu nghiêm trọng và làm biến dạng tế bào. Trong suốt quá trình

kiểm soát tốc độ đông lạnh, nước bị thay đổi giữa dung dịch nội và ngoại bào mà

không chịu ảnh hưởng của tính thấm màng. Trong quá trình này, việc tạo đá nội

bào và tốc độ đông lạnh chậm sẽ đảm bảo rằng đông lạnh chỉ xảy ra ở bên ngoài

tế bào, kết quả là nhờ áp suất thẩm thấu nước chuyển từ trong ra ngoài tế bào và

sự khử nước xảy ra từ từ cho đến khi chúng đạt đến nhiệt độ mà tại đó nội bào

được đông lạnh (Mazur, 1963). Do đó đông lạnh chậm làm giảm các yếu tố gây

tổn thương đến tế bào như: sự hình thành tinh thể đá, rạn nứt và tổn thương do

độc tố và áp suất thẩm thấu.

Mặc dù nồng độ chất bảo vệ lạnh có thể gây độc cao ở các giai đoạn cuối

cùng của quá trình đông lạnh, nhưng do nó diễn ra ở nhiệt độ thấp nên đã hạn

chế ảnh hưởng của độc tố đến mức thấp nhất. Chính vì vậy sự đông đặc tinh thể

30

đá nội bào giảm xuống tới một mức độ chấp nhận được hoặc được loại bỏ hoàn

toàn. Đông lạnh chậm đem lại một kết quả chấp nhận được đối với tế bào trứng

của một số loài mà không bị ảnh hưởng mạnh bởi tổn thương lạnh, thí dụ như là

mèo, người, chuột. Tuy nhiên tế bào trứng trâu, bò và lợn chịu ảnh hưởng tổn

thương lạnh mạnh hơn và kết quả bảo quản kém hơn khi được đông lạnh bằng

phương pháp đông lạnh chậm. Quy trình đông lạnh chậm có thể có hại cho

những tế bào trứng có độ nhạy cảm cao với những tổn thương lạnh vì các tế bào

trứng sẽ phải tiếp xúc lâu ở nhiệt độ dễ gây tổn thương cho chúng (Liang, 2010).

Có thể giảm thiểu được vấn đề này bằng cách sử dụng nhiệt độ cân bằng cao kết

hợp với tốc độ đông lạnh nhanh để nâng cao hiệu quả bảo quản lạnh những tế

bào trứng có độ nhạy cảm cao với những tổn thương lạnh (Martino và cs., 1996;

Isachenko, 1997; Le Gal và Massip, 1999; Vajta và cs., 1998b).

1.5.5.2. Thủy tinh hóa (Vitrification)

Thủy tinh hóa là một quy trình vật lý mà theo đó dung dịch chuyển sang

dạng ổn định như thủy tinh bằng cách làm lạnh nhanh chóng nhưng không có sự

hình thành tinh thể đá (Fahy và cs., 1984; Vajta và cs., 2009). Phương pháp đông

lạnh thủy tinh hóa là cách tiếp cận tối ưu vì có thể tránh được tổn thương lạnh và

sự hình thành tinh thể đá. Thời gian từ lúc khử nước nội bào đến lúc kết thúc quá

trình đông lạnh xảy ra rất nhanh. Sự thành công của quá trình thủy tinh hóa phụ

thuộc vào hai yếu tố: nồng độ cao của chất bảo vệ lạnh để ức chế sự hình thành

tinh thể đá và tốc độ đông lạnh-giải đông (có thể lên đến 20000oC/phút) để

nhanh chóng đi qua vùng nhiệt độ nguy hiểm, tránh cho tế bào khỏi những tổn

thương lạnh. Do các chất bảo vệ lạnh thường có độc tính nhất định đối với tế bào

nên thời gian tiếp xúc đối với tế bào trứng/phôi phải càng ngắn càng tốt.

Hiện nay quy trình phổ biến cho thủy tinh hóa tế bào trứng/phôi thường

được bắt đầu bằng việc cho chúng cân bằng trong dung dịch có chứa nồng độ

31

chất bảo vệ lạnh thấp hơn (được gọi là dung dịch trước cân bằng, pES) trước khi

chuyển chúng vào dung dịch cuối cùng (gọi là dung dịch thủy tinh hóa, VS) có

chứa nồng độ cao chất bảo vệ lạnh thấm màng và không thấm màng chẳng hạn

như đường hoặc một đại phân tử. Dung dịch pES chứa từ 25 đến 50% (thường là

50%) nồng độ chất bảo vệ lạnh thấm màng cuối cùng và có thể được thêm để

tăng nồng độ, ví dụ 25% và sau đó là 50% nồng độ chất bảo vệ lạnh thấm màng.

Thời gian trước cân bằng thường được giới hạn 1-3 phút, tuy nhiên có thể

sử dụng thời gian trước cân bằng dài (5-15 phút) với nồng độ chất bảo vệ lạnh

thấp trong dung dịch pES (Dinneys và cs., 2000; Gupta và cs., 2007; Kuwayama

và cs., 2005). Ngược lại thời gian trong dung dịch VS được giới hạn 25-45 giây.

Do nồng độ các chất bảo vệ lạnh trong dung dịch VS là khá cao cho nên chúng

sẽ gây độc cho tế bào trứng, vì vậy thời gian tế bào ở trong dung dịch này cần

phải được giảm xuống. Việc tăng thời gian trong dung dịch VS sẽ làm tăng độc

tố của chất bảo vệ lạnh nhưng điều này có thể giúp bảo vệ tế bào trứng/phôi tốt

hơn. Phôi nang lợn ở trong dung dịch thủy tinh hóa 25s cho tỷ lệ sống sau thủy

tinh hóa cao (Vajta và cs., 2009), nhưng sự thụ thai từ phôi sau đông lạnh-giải

đông chỉ đạt được khi phôi ở trong dung dịch thủy tinh hóa 60 giây.

Khi tế bào trứng được tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh nồng độ cao thì ngay

lập tức xảy ra một vài hiện tượng thẩm thấu. Sau đó, tế bào trứng nhanh chóng

khử nước và nước nội bào được thay thế bằng chất bảo quản lạnh thấm màng.

Các tế bào trứng lúc này sẽ không thể hình thành tinh thể đá ở nhiệt độ dưới 0°C.

Vì vậy tế bào trứng được bảo quản lạnh mà không bị hình thành tinh thể đá trong

nội bào và tránh được những tổn thương. Tuy nhiên, việc sử dụng các chất bảo

vệ lạnh với nồng độ cao có thể làm cho tế bào trứng bị ảnh hưởng bởi độc tố của

các chất bảo quản lạnh. Để ngăn chặn điều này, hiện nay các nhà nghiên cứu

thường sử dụng phương pháp cân bằng nhiều bước với sự có mặt của chất bảo vệ

32

lạnh không thấm màng. Ưu điểm nữa của thủy tinh hóa là thời gian đông lạnh

nhanh, không cần các thiết bị đắt tiền, đơn giản và đặc biệt quan trọng là tỷ lệ

sống của tế bào trứng sau đông lạnh-giải đông cao. Với các ưu điểm trên thì thủy

tinh hóa đang dần trở thành một phương pháp đông lạnh thay thế có tính cạnh

tranh với phương pháp đông lạnh chậm truyền thống.

Mặc dù vậy thủy tinh hóa vẫn có một số ảnh hưởng bất lợi đến tế bào

trứng trong quá trình đông lạnh như: làm tăng nguy cơ của hầu hết các dạng tổn

thương ngoại trừ tổn thương do sự hình thành tinh thể đá. Để giải quyết được

vấn đề này trong quá trình thủy tinh hóa cần phải thiết lập hệ thống vật chứa mẫu

với tốc độ đông lạnh – giải đông an toàn nhất và đáng tin cậy, tránh được sự đứt

gãy màng sáng hoặc các bào quan khác, loại bỏ hoặc giảm thiểu các tác động

độc hại và stress thẩm thấu của nồng độ cao các chất bảo vệ lạnh. Sự co rút tế

bào gây ra bởi các chất bảo vệ lạnh không thấm màng và sự thẩm thấu không

đầy đủ các chất bảo vệ lạnh có khả năng thấm màng có thể là nguyên nhân gây

ra những tổn thương nội bào (Liang, 2010).

a. Thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống

Thủy tinh hóa tế bào trứng và phôi bằng cọng rạ truyền thống đều sử dụng

cọng rạ 0,25ml chứa mẫu. Bằng cách này tốc độ đông lạnh đạt khá cao và có thể

trên 2500oC/phút. Tuy nhiên khi sử dụng cọng rạ 0,25ml để chứa mẫu thì lượng

thể tích dung dịch chứa mẫu vẫn khá lớn (25-200μl). Theo đó về mặt lý thuyết

tốc độ đông lạnh-giải đông có thể đạt được là khá hạn chế. Lợi ích chính của bảo

quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống là không

gây tổn thương cho tế bào trứng trong quá trình đông lạnh. Tính chất vật lý thể

hiện rõ nhất của quá trình này là sự đông đặc của dung dịch ở dạng tinh thể ở

nhiệt độ thấp, mà không có sự hình thành tinh thể đá nội bào. Đông lạnh theo

phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống hiện nay đang được sử

33

dụng khá phổ biến. Phương pháp này thường sử dụng các chất bảo vệ lạnh có

nồng độ cao do tính nhầy của chúng làm cho nước bị đông đặc mà không có sự

giãn nở để loại trừ sự hình thành tinh thể đá nội bào. Quá trình thủy tinh hóa

trong cọng rạ truyền thống đã đạt được một số thành công ở chuột (Edashige và

cs., 2003), người (Katayama và cs., 2003), bò (Luna và cs., 2001; Albarracin và

cs., 2005a, b), lợn (Huang và Holtz., 2002), ngựa (Hurt và cs., 2000), trâu (Dhali

và cs., 2000a,b; Hufana-Duran và cs., 2004; Hammam và El- Shahat, 2005).

Tuy nhiên bên cạnh những ưu điểm thì nhược điểm của quá trình thủy tinh

hóa trong cọng rạ truyền thống là các chất bảo vệ lạnh được sử dụng với nồng độ

cao, điều này dễ làm cho tế bào trứng bị những ảnh hưởng bất lợi do độc tố của

chất bảo vệ lạnh gây ra. Thêm vào đó, lượng thể tích dung dịch chứa mẫu vẫn

khá lớn cũng gây ảnh hưởng đến tốc độ đông lạnh. Để giảm ảnh hưởng bất lợi

của các chất bảo vệ lạnh lên trứng thì trước khi đưa tế bào trứng vào dung dịch

thủy tinh hóa có đủ nồng độ cần thiết phải đưa tế bào trứng vào một dung dịch

khác có nồng độ thấp hơn, thường là bằng ½ nồng độ cuối cùng (Hammam và

El- Shahat, 2005; Sharma và Purohit., 2008). Ngoài ra trong quá trình giải đông,

để loại bỏ các chất bảo vệ lạnh thấm màng, dung dịch giải đông thường được kết

hợp với chất bảo vệ lạnh không thấm màng, nhờ đó có thể làm giảm bớt những

ảnh hưởng bất lợi của chất bảo vệ lạnh đến khả năng phát triển tiếp theo của tế

bào trứng (Karima và cs., 2010). Mặc dù có kết quả tốt hơn so với đông lạnh

chậm nhưng tỷ lệ tế bào sống sau đông lạnh-giải đông của thủy tinh hóa trong

cọng rạ truyền thống vẫn kém hơn so với phương pháp đông lạnh cực nhanh.

b. Đông lạnh cực nhanh (ultra rapid freezing)

Những tế bào nhạy cảm với quá trình đông lạnh vẫn bị tổn thương khi sử

dụng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống. Nguyên nhân là do

tốc độ đông lạnh, giải đông trong phương pháp thủy tinh hóa cọng rạ truyền

34

thống vẫn chưa đạt tới mức cực nhanh. Có một cách hiệu quả để đạt tới tốc độ

đông lạnh và giải đông cực nhanh bằng cách giảm thiểu lượng dung dịch và vật

chứa mẫu. Để tăng tỷ lệ sống và thể tích chứa mẫu, một số nhà nghiên cứu đưa

ra phương pháp đông lạnh cực nhanh để phân biệt với thủy tinh hóa trong cọng

rạ truyền thống (Purohit và cs., 2012). Thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống

và đông lạnh cực nhanh đều sử dụng chất bảo vệ lạnh ở nồng độ cao, thời gian tế

bào tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh ngắn. Điểm khác biệt lớn nhất giữa hai phương

pháp này chính là vật chứa mẫu và thể tích dung dịch chứa mẫu đông lạnh. Một

vài kỹ thuật được phát triển để làm giảm thể tích chứa mẫu với sự bùng nổ của

các phương pháp xuất hiện trong một vài thập kỷ gần đây. Những kỹ thuật này

thường được chia thành hai loại: kỹ thuật bề mặt và kỹ thuật ống. Hiện nay trên

thế giới nhiều phòng thí nghiệm đã sử dụng rộng rãi một số cách thức đông lạnh

cực nhanh như là: cọng rạ hở (Sharma và Purohit, 2008), cryotop (Hamawaki và

cs., 1999; Kuwayama và Kato, 2000), cryoloop (Gasparrini và cs., 2007), pipette

tip (Sun và cs., 2008), Cryopette (Portmann và cs., 2010), Rapid-I (Larman và

Gardner, 2010), lưới kính hiển vi điện tử (Steponkus và cs., 1990; Martino và

cs., 1996), vi giọt (Landa và Tepla, 1990; Yavin và Arav, 2001; Liang và cs.,

2012).... Trong đó mỗi nhóm kỹ thuật đều có những ưu điểm riêng của mình.

Trong phương pháp thủy tinh hóa bề mặt, thể tích của giọt (0,1µl) được

kiểm soát, tốc độ đông lạnh có thể khá cao bởi vì đây là hệ thống hở, và đạt được

tốc độ giải đông nhanh bằng cách tiếp xúc trực tiếp với dung dịch giải đông. Hệ

thống ống có lợi thế là đạt được tốc độ đông lạnh cao trong hệ thống khép kín,

do đó chúng an toàn và xử lý dễ dàng hơn. Hệ thống ống làm giảm thể tích đông

lạnh, tăng tốc độ đông lạnh do đó làm giảm nồng độ chất bảo vệ lạnh để giảm

thiểu những nguy hiểm tác động do độc tố của chất bảo vệ lạnh và áp suất thẩm

thấu (Yavin và cs., 2009). Việc kết hợp ba yếu tố này đưa ra phương trình chung

35

cho xác suất của thủy tinh hóa (Joseph và Amir, 2011): Xác suất thủy tinh hóa =

(Tốc độ đông lạnh x Độ nhớt)/Thể tích

Bên cạnh việc giảm thiểu lượng thể tích dung dịch VS chứa tế bào trứng,

các nhà nghiên cứu đã thiết lập một mối liên hệ trực tiếp (không có lớp nhiệt

cách điện) giữa dung dịch VS và nitơ lỏng với mục đích tăng tốc độ đông lạnh.

Phương pháp đông lạnh này được gọi là thủy tinh hóa vi giọt. Vi giọt là dụng cụ

được sử dụng đơn giản nhất, sớm nhất, giọt dung dịch có chứa mẫu được cho

ngập trực tiếp vào trong nitơ lỏng và sau đó sẽ được chuyển vào các ống chịu

lạnh (Papis và cs., 2000). Hiện nay tại Việt Nam mới chỉ có duy nhất Nguyễn

Thị Thương Huyền và cs. (2014) báo cáo về việc bảo quản lạnh trứng bò ở giai

đoạn túi mầm bằng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt. Tuy nhiên có một số vấn

đề xảy ra với phương pháp này là thể tích dung dịch chứa mẫu vẫn khá lớn, khi

giọt dung dịch VS có chứa mẫu được thả thẳng vào nitơ lỏng sẽ không chìm

ngay lập tức mà nổi lên trên bề mặt nitơ lỏng một vài giây sau đó mới chìm do

hiện tượng bay hơi của nitơ xung quanh giọt dung dịch.

Cọng rạ hở là dạng vật chứa mẫu sử dụng cho quá trình đông lạnh cải tiến

từ cọng rạ truyền thống 0,25ml. Cọng rạ hở được dựa trên ý tưởng rất đơn giản

với một kỹ thuật cũng đơn giản đó là giảm thiểu đường kính vật chứa mẫu bằng

cách kéo dài cọng rạ truyền thống sau khi được làm mềm bằng nhiệt cho đến khi

đường kính bên trong và độ dày của thành cọng rạ giảm tương ứng đến 0,8mm

và 0,07mm. Sau đó, cọng rạ được cắt tại điểm hẹp nhất bằng một lưỡi dao sắc.

Trứng được nạp vào cọng rạ hở bằng lực mao dẫn trong giọt dung dịch có chứa

trứng và hút với độ dài cột hút khoảng 2-3cm (thể tích dung dịch tương ứng là1-

1,5µl). Tiếp theo các cọng rạ hở có chứa mẫu này sẽ được nhúng ngập trực tiếp

vào trong nitơ lỏng. Nhược điểm của phương pháp thủy tinh hóa bằng cọng rạ hở

là cọng rạ dễ bị nổi khi cho vào trong nitơ lỏng. Để giải quyết vấn đề này thì cho

36

các cọng rạ hở vào một ống chịu lạnh to hơn và bảo quản trong nitơ lỏng. Bằng

cách giảm đường kính và độ dày thành cọng rạ, cọng rạ hở không chỉ cho phép

tăng tốc độ đông lạnh mà với bức tường cọng rạ trở nên trong suốt có thể dễ

dàng theo dõi sự thủy tinh hóa bằng mắt thường. Quá trình nạp cũng như trục

xuất tế bào trứng ra khỏi cọng rạ hở có thể được theo dõi trên kính hiển vi. Mặc

dù rất khó để đo chính xác tốc độ đông lạnh-giải đông bằng phương pháp này,

nhưng ước tính cột dung dịch trong cọng rạ hở được đông lạnh với tốc độ

22500oC/phút (từ -25 đến -175oC) trong khi đó tốc độ này ở cọng rạ truyền thống

là 2500oC/phút.

Mao quản thủy tinh (GMP) là dụng cụ chứa mẫu thủy tinh hóa gần giống

như cọng rạ hở (Kong và cs., 2000). Sự khác nhau giữa cọng rạ hở và GMP là

GMP sử dụng kính mao mạch dễ bị phá vỡ, nặng hơn cọng rạ hở. Thể tích dung

dịch thủy tinh hóa chứa mẫu của GMP nhỏ hơn cọng rạ hở, tốc độ đông lạnh

nhanh hơn cọng rạ hở.

Kính hiển vi lưới điện tử (EMG) cũng được sử dụng thành công như vật

chứa tế bào trứng trong suốt quá trình đông lạnh và giải đông. Với phương pháp

này, tế bào trứng được để trên một lưới hiển vi điện tử và sau đó bảo quản trong

nitơ lỏng bằng đông lạnh nhanh. Martino và cs. (1996) đã sử dụng phương pháp

này để bảo quản tế bào trứng bò, 60% tế bào trứng có hình thái bình thường sau

giải đông, tỷ lệ phân chia sau IVF đạt 29-32% và tỷ lệ phôi nang 10-15%.

Cryotop là một phương pháp tiếp cận mới để giảm thiểu lượng dung dịch

thủy tinh hóa, các tế bào trứng được nạp vào cryotop với một lượng thể tích rất

nhỏ (0,1 μl) (Kuwayama và cs., 2005). Thiết bị này đã được sử dụng thành công

để bảo quản lạnh tế bào trứng và phôi người (Katayama và cs., 2003; Lucena và

cs., 2006; Antinori và cs., 2007). Tại Việt Nam, Nguyễn Văn Hạnh và cs. (2013)

lần đầu tiên báo cáo về việc bảo quản lạnh thành công tế bào trứng lợn ở giai

37

đoạn túi mầm bằng phương pháp Cryotop. Tế bào trứng lợn rất nhạy cảm với các

kỹ thuật đông lạnh do chúng có hàm lượng lipid nội bào cao (Somfai và cs.,

2012). Theo Nguyễn Văn Hạnh và cs (2013), tỷ lệ tế bào trứng lợn sống và thành

thục in vitro trở lại sau đông lạnh – giải đông với phương pháp Cryotop tương

ứng là 100% và 56%.

1.6. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN ĐẾN HIÊU

QUẢ BẢO QUẢN LẠNH TẾ BÀO TRỨNG

Trứng động vật có vú sử dụng trong nghiên cứu nói chung và trong bảo

quản lạnh nói riêng chủ yếu thu từ buồng trứng ở lò mổ (Parnpai và cs., 2014).

Vì vậy mà tế bào trứng có thể có nhân ở nhiều giai đoạn phát triển khác nhau kéo

dài từ giai đoạn túi mầm (GV) (Magnusson và cs., 2008); giai đoạn phá vỡ túi

mầm (GVBD- bao gồm: metaphase I, anaphase I, telophase I) (Barnes và cs.,

1997) cho đến hết giai đoạn thành thục nhân tế bào trứng (metaphase II - MII) để

chuẩn bị cho rụng trứng (Men và cs., 2002). Hiện nay, các nghiên cứu bảo quản

lạnh tế bào trứng được thực hiện với trứng ở hai giai đoạn phát triển là: giai đoạn

thành thục (MII) và giai đoạn túi mầm (GV) (Liang, 2010). Tuy nhiên vẫn còn

nhiều tranh cãi xung quanh việc bảo quản lạnh tế bào trứng ở giai đoạn phát triển

nào là thích hợp nhất.

Có báo cáo cho rằng 9-16% tế bào trứng chịu những tổn thương lạnh trong

quá trình bảo quản lạnh mà không liên quan đến các thời điểm nuôi thành thục

khác nhau (Fuku và cs., 1995; Le Gal, 1996). Hurt và cs. (2000); Le Gal và

Massip (1999) nhận thấy giai đoạn phát triển của tế bào không ảnh hưởng đến

khả năng sống sau đông lạnh-giải đông của tế bào trứng. Ngược lại, trong quá

trình tìm hiểu và đánh giá những điều kiện tốt nhất để duy trì khả năng sống của

trứng sau đông lạnh-giải đông, một số nhà nghiên cứu nhận thấy ảnh hưởng rõ

rệt của các giai đoạn phát triển tế bào trứng trong quá trình thành thục nhân đến

38

khả năng sống của tế bào trứng sau đông lạnh-giải đông do sự nhạy cảm khác

nhau của chúng đối với những tổn thương lạnh (Men và cs., 2002; Sharma và

Loganathasamy 2007; Magnusson và cs., 2008; Lane và cs., 1999).

1.6.1. Bảo quản lạnh trứng ở giai đoạn túi mầm hoặc giai đoạn chưa thành

thục

Tế bào trứng ở giai đoạn túi mầm (GV) được đặc trưng bởi sự mở rộng

nhiễm sắc thể (NST), nhân tròn và có kích thước lớn, chưa hình thành thoi phân

bào, thể hạt vỏ chưa sẵn sàng giải phóng, mối liên kết với các tế bào nang bên

ngoài vẫn được duy trì, các tế bào nang vẫn liên kết với nhau rất chặt chẽ phí

ngoài màng sáng. Khi đông lạnh tế bào trứng ở giai đoạn GV, thoi phân bào của

chúng sẽ không bị ảnh hưởng trực tiếp bởi các vấn đề liên quan giống như ở giai

đoạn thành thục MII (Liang, 2010). Tuy nhiên các tế bào trứng chưa thành thục

dễ bị tổn thương lạnh, khả năng sống và phát triển tiếp theo sau đông lạnh-giải

đông thường rất kém so với tế bào trứng không bảo quản lạnh (Liang, 2010) do

chúng có độ nhạy cảm cao đối với các dạng stress và có khả năng thấm màng

thấp hơn so với tế bào trứng ở giai đoạn MII.

Việc bảo quản lạnh thành công tế bào trứng ở giai đoạn GV hoặc chưa

thành thục phụ thuộc nhiều vào khả năng lưu giữ tính nguyên vẹn về mặt cấu

trúc và chức năng của toàn bộ tế bào trứng và lớp tế bào nang bao xung quanh tế

bào trứng. Các cầu nối giữa tế bào trứng và tế bào nang có vai trò quan trọng

trong quá trình hoàn thiện sự thành thục của tế bào trứng chưa thành thục. Các tế

bào trứng ở giai đoạn GV nếu không có tế bào nang, sẽ kém phát triển hơn so

với các tế bào trứng có tế bào nang chặt chẽ. Nguyên nhân là do chúng không có

sự phối hợp giữa nhân và sự thành thục tế bào chất. Lớp tế bào nang, đóng vai

trò liên kết nội bào giữa tế bào trứng và tế bào nang, có ảnh hưởng đến việc hoàn

thiện quá trình thành thục của tế bào trứng (Lim và cs., 1992; Fuku và cs., 1995;

39

Le Gal, 1996). Vắng mặt các tế bào nang có thể gây ra những thiếu sót trong quá

trình tổng hợp protein, ảnh hưởng đến sự tham gia điều chỉnh chu kỳ tế bào và

giảm phân ở mức độ phân tử (Liang, 2010). Sharma và Loganathasamy (2007)

cho rằng tế bào trứng chưa thành thục có khả năng sống và phát triển sau đông

lạnh-giải đông kém hơn so với tế bào trứng thành thục là do sự tổn thương của

lớp tế bào nang trong quá trình đông lạnh, đặc biệt là cầu nối rất mỏng manh của

tế bào nang với tế bào trứng. Sự thành công của quá trình bảo quản lạnh phụ

thuộc vào khả năng bảo quản toàn vẹn cấu trúc chức năng tế bào nang – tế bào

trứng. Tuy nhiên các tế bào nang lại có thể là một trở ngại cho việc thẩm thấu

các chất bảo vệ lạnh của tế bào trứng trong quá trình đông lạnh (Liang, 2010).

Ở một khía cạnh khác, Hong và cs. (1999), Agca và cs. (2000) cho rằng bộ

khung xương tế bào của tế bào trứng chưa thành thục có độ linh hoạt hơn nên dễ

bị tổn thương lạnh hơn so với tế bào trứng thành thục. Các tác giả này cũng cho

rằng nguyên nhân của hiệu quả thấp trong bảo quản lạnh trứng chưa thành thục

có thể là do khả năng thấm màng thấp. Edashige và cs. (2003) cũng cho rằng bảo

quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng chuột ở giai đoạn chưa

thành thục có thể cải thiện được khả năng sống của tế bào trứng sau đông lạnh –

giải đông. Nhân tế bào trứng chưa thành thục sẽ không bị ảnh hưởng bởi quá

trình bảo quản lạnh, trong khi đó đối với tế bào trứng đã thành thục thì NST dễ

bị đứt gãy sau đông lạnh – giải đông. Trái ngược với quan điểm nêu trên, Barnes

và cs. (1997) đã bảo quản lạnh tế bào trứng ở giai đoạn phá vỡ túi mầm và cho

rằng trứng sau đông lạnh-giải đông có tỷ lệ phân chia và phát triển đến giai đoạn

phôi nang cao hơn so với tế bào trứng đông lạnh ở giai đoạn túi mầm hoặc MII.

Họ cho rằng việc lựa chọn được giai đoạn phát triển của tế bào trứng ở giai đoạn

phá vỡ túi mầm có thể giải quyết được một số vấn đề bất lợi có liên quan đến

quá trình đông lạnh tế bào trứng ở giai đoạn túi mầm hoặc MII.

40

1.6.2. Bảo quản lạnh tế bào trứng ở giai đoạn thành thục nhân (MII)

Tế bào trứng ở giai đoạn thành thục nhân MII đã mất đi liên kết với các tế

bào nang một cách tự nhiên, hơn nữa các nang bào cũng dãn cách xa nhau. Vì

vậy mà khả năng thấm màng của trứng ở giai đoạn này cao hơn trứng ở giai đoạn

GV hoặc chưa thành thục. Liang (2010); Mahmoud và cs. (2010a) cho rằng tế

bào trứng ở giai đoạn thành thục nhân MII là phù hợp nhất để sử dụng cho bảo

quản lạnh do chúng có tính ổn định màng tốt hơn trong quá trình đông lạnh. El-

shahat và Hammam (2005); Sharma và Loganathasamy (2007) cũng nhận thấy

khả năng sửa chữa những tổn thương lạnh của tế bào trứng trâu thành thục là cao

hơn so với tế bào trứng trâu chưa thành thục.

Nhưng có một số vấn đề nảy sinh khi bảo quản lạnh tế bào trứng ở giai

đoạn thành thục nhân MII. Đó là khi cho chúng tiếp xúc với nhiệt độ dưới mức

nhiệt độ sinh lý sẽ gây ra những tổn thương cho một số cấu trúc của chúng như

cấu trúc của thoi vô sắc (Mandelbaum và cs., 2004), làm sai lệch bộ NST

(Sathananthan và cs., 1988), tăng hiện tượng bội thể và giảm khả năng thụ tinh

(Wood và cs., 1992). Những tổn thương của tế bào trứng chỉ xảy ra do tiếp xúc

với dung dịch thủy tinh hóa trước khi đông lạnh (Fuku và cs., 1995). Nhiều báo

cáo đã chứng minh rằng quá trình bảo quản lạnh (Aigner và cs., 1992); các chất

bảo vệ lạnh (Vincent và cs., 1989; Aigner và cs., 1992) hoặc quá trình đông lạnh

(Aman và Parks, 1994) có thể gây ra sự khử polymer và làm hỏng cấu trúc các vi

ống của thoi phân bào. Việc này sẽ dẫn đến sự phân tán NST khỏi tấm trung kỳ

và phát sinh thể dị bội (Liang, 2010). Ngoài ra, bảo quản lạnh tế bào trứng ở giai

đoạn thành thục nhân MII có thể gây nên hiện tượng hóa rắn màng sáng, nhưng

vấn đề này có thể khắc phục được bằng kỹ thuật vi tiêm tinh trùng vào tế bào

chất của trứng (ICSI). Liang và cs. (2011) đã sử dụng phương pháp bảo quản

lạnh bằng thủy tinh hóa vi giọt tế bào trứng trâu ở giai đoạn thành thục nhân MII

41

bằng phương pháp vi giọt, sau đó sử dụng kỹ thuật ICSI để thụ tinh tế bào trứng

sau đông lạnh – giải đông. Kết quả cho tỷ lệ thụ tinh đạt 43%; tỷ lệ tạo phôi nang

đạt 15%. Sự khác nhau giữa các quan điểm về giai đoạn phát triển tế bào trứng

sử dụng cho quá trình bảo quản lạnh khiến cho việc lựa chọn một giai đoạn phát

triển tối ưu của tế bào trứng không hề đơn giản cho những nhà nghiên cứu về

sinh sản và phôi sinh học động vật có vú.

1.7. MỘT SỐ DẠNG TỔN THƯƠNG LẠNH CỦA TẾ BÀO TRỨNG

TRONG QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN LẠNH

Đông lạnh tế bào trứng chưa thành thục, thành thục in vitro hoặc tế bào

trứng đã rụng thường làm tổn thương hình thái và cấu trúc của chúng. Trong quá

trình bảo quản lạnh tế bào trứng trải qua hai quá trình dễ bị tổn thương là giai

đoạn tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh và giai đoạn đông lạnh-giải đông. Cơ chế

chính gây ra những tổn thương lạnh là sự hình thành và tan của tinh thể đá nội

bào. Tinh thể đá nội bào hình thành khi sự cân bằng giữa hai môi trường nội bào

và ngoại bào của tế bào trứng bị phá vỡ trong quá trình khử nước trong quá trình

đông lạnh (Parks và Ruffing, 1992; Muldrew và cs., 2004). Các nhà nghiên cứu

đã chỉ ra những tổn thương khác nhau đối với tế bào trứng trong quá trình bảo

quản lạnh. Những dạng tổn thương này bao gồm: tổn thương màng tế bào (vỡ

màng, thủng màng, thay đổi tính chất của màng) (Shaw và cs., 2000; Mazur và

Schneider, 1986).; màng sáng bị phá hủy (Neeta và Mital, 2009); hỏng sợi thoi

vô sắc và tách NST gây ra dạng dị bội (Neeta và Mital, 2009); mất hoặc tăng số

lượng NST (Shaw và cs., 2000); hỏng hoặc thay đổi trật tự ADN (Gasparrini và

cs., 2009; 2006); tổn thương bộ khung xương tế bào (mất vi ống hoặc vi sợi

actin) (Gautam và cs., 2011; Ciotti và cs., 2009; Aman và Parks, 1994); protein,

enzyme bị mất nước hoặc mất chức năng quan trọng; cấu trúc tế bào trứng có thể

bị thay đổi do sự thay đổi của các tế bào hạt vỏ, màng sáng (Shaw và cs., 2000).

42

Theo Ciotti và cs. (2009) mặc dù bản thân tế bào trứng cũng có khả năng tự sữa

chữa một phần hoặc hoàn toàn sau quá trình đông lạnh-giải đông. Tuy nhiên đối

với tế bào trứng trâu thì không có khả năng sửa chữa những tổn thương lạnh trên

bộ khung xương tế bào (Aman và Parks., 1994).

1.8. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG TRỨNG SAU ĐÔNG LẠNH – GIẢI

ĐÔNG

Một yếu tố quan trọng trong việc nuôi trứng và thụ tinh in vitro đó là sử

dụng đúng những tế bào trứng có khả năng thụ tinh. Như vậy, việc xác định

được đúng tế bào trứng sống hay chết là rất cần thiết, nếu có thể, những tế bào

trứng chết cần phải được loại bỏ trước khi đưa vào quá trình nuôi và thụ tinh. Có

một vài phương pháp khác nhau được sử dụng để kiểm tra khả năng sống và mức

độ tổn thương lạnh của tế bào trứng sau bảo quản lạnh. Có hai xu hướng chính

để đánh giá đó là: dựa vào các chỉ số thông qua quan sát hình thái và nhuộm tế

bào (sự giãn nở của tế bào nang bao xung quanh tế bào trứng hay sự xuất hiện

thể cực; nhiễm sắc thể; tế bào chất; màng sáng) hoặc dựa vào khả năng phát triển

tiếp theo (thành thục, thụ tinh, phát triển của phôi).

1.8.1. Đánh giá chất lượng trứng dựa vào quan sát hình thái và nhuộm tế

bào

Tiêu chuẩn chung điển hình thường sử dụng để đánh giá khả năng sống

của tế bào trứng sau đông lạnh - giải đông là sự có hoặc không có hiện tượng

thoái hóa hoặc phân bố tế bào chất hoặc sự đứt gãy màng sáng. Sự tổn thương

màng được đánh giá bằng cách thăm dò các chỉ tiêu biểu thị tính nguyên vẹn của

màng sinh chất. Nhiều nghiên cứu hiện nay đã kiểm tra được sự nguyên vẹn của

sợi thoi vô sắc. Thêm vào đó, tế bào trứng của động vật có vú cũng có thể được

kiểm tra thông qua những phương pháp như là kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh

quang, sự phát triển sinh học tiếp theo hoặc phân tích phân tử. Về đặc điểm cấu

43

trúc và chức năng, tế bào chết có những yếu tố khác biệt rất rõ ràng so với tế bào

sống, đó là tính toàn vẹn của các cấu trúc bên trong tế bào, của nhân tế bào và

màng tế bào. Những đặc điểm này có thể xác định được khi quan sát dưới kính

hiển vi quang học đối pha. Ngoài ra có thể quan sát hình thái tế bào trứng dưới

kính hiển vi soi nổi hoặc nhuộm tế bào để đánh giá kỹ hơn các tổn thương của

chúng sau đông lạnh-giải đông (Nguyễn Văn Hạnh và cs., 2013).

Về mặt hình thái thì tế bào trứng có khả năng sống sau đông lạnh-giải

đông là tế bào trứng có hình cầu cân đối, không méo mó, lớp tế bào nang vẫn

còn liên kết chặt chẽ với tế bào trứng, màng tế bào chất không bị tổn thương

(không bị phồng lên hoặc xẹp xuống); tế bào chất không bị mất hoặc thoái hóa;

màng sáng không bị đứt gãy. Tuy nhiên, những tế bào vừa mới chết hoặc đang

trong quá trình chết thì lại khó phát hiện vì chúng chưa có những đặc điểm điển

hình để dễ dàng phân biệt dưới kính hiển vi thông thường. Mặt khác, tế bào

trứng có màng sáng dày vững chắc bảo vệ cho nên nó có thể tồn tại một thời gian

dài mà không bị phá hủy. Vì vậy, các nhà nghiên cứu đã phát triển những

phương pháp nhuộm tế bào hoặc các phương pháp gián tiếp để xác định những tế

bào trứng không còn khả năng phát triển tùy theo mục đích. Với một số loại tế

bào, có thể sử dụng chất nhuộm màu xanh methylen đưa vào môi trường nuôi

cấy tế bào. Do tính bán thấm của màng tế bào, tế bào sống sẽ không cho chất

màu này đi qua do đó tế bào không bắt màu trong khi tế bào chết thì ngược lại.

Tuy nhiên, với tế bào trứng đang trong quá trình chết hoặc mới chết thì phương

pháp nhuộm này hầu như không xác định được. Muốn phát hiện được tế bào

trứng không phát triển, có thể sử dụng các thuốc nhuộm nhân. Dựa vào cấu trúc

của nhân ta có thể đánh giá được trạng thái hoạt động và giai đoạn phát triển của

trứng. Tế bào trứng đang trong quá trình chết thì nhân thường bị biến dạng hoặc

phân mảnh thậm trí không còn cấu trúc của nhân. Với tế bào trứng đang trong

44

quá trình thành thục, phương pháp nhuộm nhân cũng xác định được chúng đang

ở giai đoạn nào của quá trình này, do đó có thể xác định được tỷ lệ sống – chết

của các tế bào trứng trước hoặc sau bảo quản lạnh, đồng thời có thể xác định

được giai đoạn phát triển và thành thục của tế bào trứng trong nuôi cấy in vitro.

Bên cạnh đó, các nhà nghiên cứu thường đánh giá hiệu quả của quá trình bảo

quản lạnh tế bào trứng bằng cách kết hợp giữa quan sát hình thái với khả năng

phát triển in vitro tiếp theo của tế bào trứng sau đông lạnh-giải đông. Nhờ đó sẽ

loại trừ được tế bào trứng vừa mới chết hoặc đang trong trong quá trình chết mà

chúng ta không phát hiện được khi quan sát bằng hình thái.

1.8.2. Đánh giá chất lượng dựa vào khả năng phát triển tiếp theo của trứng

Hiệu quả của quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng được đánh giá dựa trên

sự thành thục in vitro trở lại, sự thụ tinh, phân chia và khả năng phát triển đến

phôi dâu, phôi nang của tế bào trứng sau đông lạnh – giải đông.

Tiêu chí đánh giá khả năng thành thục in vitro trở lại được áp dụng cho tế

bào trứng đông lạnh ở giai đoạn chưa thành thục. Trứng chưa thành thục sau

đông lạnh – giải đông sẽ được nuôi thành thục in vitrio để hoàn thành quá trình

thành thục nhân của mình. Sau nuôi, có thể sử dụng phương pháp nhuộm nhân

hoặc quan sát hình thái để đánh giá tế bào trứng thành thục. Trứng hoàn thành

quá trình thành thục khi nhân ở giai đoạn Metaphase II và xuất hiện thể cực thứ

nhất. Khả năng thụ tinh, phân chia, phát triển đến phôi dâu, phôi nang cũng là

tiêu chí được sử dụng để đánh giá hiệu quả của quá trình bảo quản lạnh tế bào

trứng, áp dụng cho tế bào trứng được đông lạnh ở giai đoạn thành thục hoặc

chưa thành thục. Đối với tế bào trứng được đông lạnh ở giai đoạn chưa thành

thục, sau nuôi thành thục trở lại sẽ sử dụng phương pháp quan sát hình thái để

lựa chọn những tế bào trứng có khả năng thành thục (tế bào trứng có các lớp tế

45

bào nang bao xung quanh giãn nở, khối tế bào chất đồng đều) sử dụng cho quá

trình thụ tinh và tạo phôi tiếp theo.

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của quá trình thụ tinh như:

môi trường thụ tinh (Abdoon và cs., 2001; Totey và cs., 1993, Suzuki và cs.,

1992; Kandil và cs., 1999); chất lượng tinh trùng (Totey và cs., 1992; Madan và

cs., 1994; Mustafa và cs., 1998; Kandil và cs., 1996; Totey và cs., 1993; Abbas

1998); việc loại bỏ lớp tế bào nang bao xung quanh tế bào trứng trong quá trình

thụ tinh (Kandil và cs., 1999, Nandi và cs., 1998). Môi trường nuôi phôi sau thụ

tinh cũng đóng vai trò quan trọng trong việc tạo phôi in vitro từ tế bào trứng nói

chung và tế bào trứng trâu đông lạnh nói riêng. Sự kết hợp những kỹ thuật nuôi

thành thục in vitro, thụ tinh và nuôi in vitro của tế bào trứng đã được sử dụng

thành công đối với việc tạo phôi trâu in vitro và nghé con (Madan và cs., 1996;

Chauhan và cs., 1997a). Tuy nhiên do điều kiện nuôi cấy phức tạp và số lượng

phôi nang thấp, chỉ đạt 8-10% tổng số tế bào trứng sau IVM; đã làm cho kỹ thuật

này trở nên khó áp dụng (Palta và Chauhan, 1998). Theo Abdoon và cs. (2001);

Kumar và cs. (2007) hiện nay môi trường nuôi phôi trâu in vitro sau thụ tinh

gồm có: CR1aa; CR2aa; mSOFaa. Để nâng cao được tỷ lệ tạo phôi dâu, phôi

nang có thể bổ sung thêm huyết thanh (Wang và cs., 1997) hoặc tế bào ống dẫn

trứng (Kumar và cs., 2007).

46

CHƯƠNG II

VẬT LIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu

Tế bào trứng trâu trong nghiên cứu này được thu từ buồng trứng trâu với

nang trứng phân bố đều, trong và sáng màu, có nguồn gốc ở các lò mổ ở Đông

Anh – Hà Nội, Vĩnh Tường – Vĩnh Phúc; Lim- Bắc Ninh. Trâu cho buồng trứng

là trâu không bị bệnh tật và có đặc điểm của trâu đầm lầy (Bubalus bubalis).

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

2.1.2.1. Thiết bị

Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu này bao gồm: kính hiển vi soi nổi

Leica MZ6, kính hiển vi soi nổi Olympus SD 30, kính hiển vi vi thao tác

Axiovert 40 CFL, kính hiển vi huỳnh quang Carl Zeiss Axioplan S10, tủ nuôi tế

bào động vật Heracell 150, bàn ổn nhiệt HT 50, máy khử ion Sartorius.

2.1.2.2. Hóa chất, dụng cụ

Hóa chất (xuất xứ Sigma): TCM 199, Ham,s F10, FCS, Phosphate buffer

saline, Ethylene glycol, DMSO, Glycerol, PROH, sucrose, FSH, Penicillin,

Streptomycin, Paraformaldehit, Propidium Iodide, RNAse, Bovine serum

albumin, NaCl, KCl, CaCl2.2H2O, NaH2PO4.2 H2O, MgCl2.6H2O, NaHCO3,

KH2PO4, Heparine, Sodium pyruvate, Sodium caffein Benzoate, dầu khoáng.

Dụng cụ vật tư tiêu hao: cọng rạ 0,25ml; cọng rạ hở, đĩa petri (Ф 90mm,

Ф 35mm), pipette pasteur, xylanh 5ml, kim 18G, màng lọc 0,2μm; 0,45μm).

2.2. Nội dung nghiên cứu

1. Nghiên cứu số lượng, chất lượng tế bào trứng trâu thu từ buồng trứng ở lò mổ.

2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến hiệu quả tạo phôi

in vitro từ tế bào trứng trâu.

47

3. Nghiên cứu giai đoạn phát triển của nhân tế bào trứng trâu tại các thời gian

nuôi thành thục in vitro khác nhau.

4. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào

trứng trâu.

5. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế

bào trứng trâu.

6. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro đến hiệu quả đông lạnh tế

bào trứng trâu.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp thu buồng trứng trâu

Buồng trứng trâu thu từ lò mổ, được để trong dung dịch bảo quản buồng

trứng (PBS + 100iu Penicillin/ml + 0,1mg Streptomycin/ml), nhiệt độ 30 – 32oC,

đưa về phòng thí nghiệm trong vòng 2-3 giờ. Rửa buồng trứng trâu trong dung

dịch bảo quản buồng trứng vài lần ở nhiệt độ 30 – 32oC trước khi sử dụng.

2.3.2. Phương pháp thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng lò mổ

Thu trứng trâu từ những nang có đường kính 3-8mm trên buồng trứng

bằng phương pháp chọc hút. Sử dụng xylanh 5ml với kim tiêm 18G, hút 0,5ml

dung dịch thu trứng (PBS + huyết thanh thai bò (3%, v/v) + 100iu Penicillin/ml

+ 0,1mg Streptomycin/ml) vào trong xylanh trước khi chọc hút các nang trứng

trên buồng trứng để pha loãng dịch nang trứng có chứa trứng hút được. Sau đó

chuyển dịch nang trứng trong xylanh vào các đĩa Petri Ф 90mm, để lắng 5-10

phút trên bàn ổn nhiệt 37oC trước khi soi tìm trứng dưới kính hiển vi soi nổi.

2.3.3. Phân loại tế bào trứng

Các tế bào trứng sau khi soi tìm dưới kính hiển vi soi nổi sẽ được tiến

hành đánh giá phân loại trên kính hiển vi soi nổi theo phân loại của Goodhand và

cs. (2000). Hình thái tế bào trứng được mô tả ở mục 1.1.3.2.

48

2.3.4. Phương pháp nhuộm nhân xác định giai đoạn phát triển của nhân

trứng trâu

Loại bỏ lớp tế bào nang của trứng, cố định bằng Paraformaldehit 4% ở

nhiệt độ phòng; rửa lại bằng PBS, ủ với RNAse nồng độ 10ug/ml trong 20 phút ở

37oC hoặc nhiệt độ phòng, rửa lại bằng PBS và nhuộm với PI trong 15-20 phút

tại nhiệt độ phòng, trong tối). Rửa lượng PI dư thừa bằng PBS. Quan sát xác

định giai đoạn phát triển nhân tế bào trứng dưới kính hiển vi huỳnh quang.

2.3.5. Phương pháp nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu

Thực hiện theo mô tả của Chauhan và cs. (1998a). Trứng trâu được rửa 2-

3 lần trong môi trường nuôi thành thục in vitro trước khi chuyển vào giọt môi

trường nuôi (20 tế bào trứng/giọt; 100μl/giọt). Phủ kín các giọt nuôi bằng dầu

khoáng và nuôi 24 giờ ở điều kiện 38,5oC; 5% CO2, độ ẩm không khí bão hòa.

2.3.6. Phương pháp đánh giá tế bào trứng trâu thành thục sau nuôi in vitro

Sử dụng phương pháp quan sát hình thái và nhuộm nhân tế bào (mô tả ở

mục 3.4.4) để đánh giá tế bào trứng thành thục sau nuôi in vitro. Với phương

pháp quan sát hình thái, tế bào trứng được kiểm tra hình thái dưới kính hiển vi

soi nổi. Trứng có khả năng thành thục là trứng với các lớp tế bào nang bao xung

quanh giãn nở, khối tế bào chất đồng đều chặt chẽ. Trứng thành thục in vitro là

trứng có nhân ở giai đoạn Metaphase II và xuất hiện thể cực thứ nhất.

2.3.7. Phương pháp tạo phôi trâu in vitro

2.3.7.1. Hoạt hóa tinh trùng

Thực hiện theo mô tả của Chauhan và cs. (1998a) với dung dịch gốc BO

(Brackett và Oliphant, 1975). Cọng rạ tinh trâu 0,25ml được lấy ra khỏi bình nitơ

lỏng, để trong không khí 5 giây, sau đó để vào bể ổn nhiệt 37oC trong 20-25

giây. Rửa tinh trùng trâu đã giải đông trong dung dịch rửa tinh trùng (BO +

49

Heparine + Caffeine), pha loãng bằng dung dịch pha loãng tinh trùng (BO +

BSA) để mật độ tinh trùng đạt 2 x 106 tế bào/ml.

2.3.7.2. Thụ tinh in vitro tế bào trứng trâu

Tế bào trứng đã thành thục được rửa 2-3 lần trong dung dịch thụ tinh (BO

+ BSA + Sodium pyruvate + Caffeine sodium benzoate) trước khi chuyển vào

giọt thụ tinh có tinh trùng đã được hoạt hóa (20 tế bào trứng/giọt) và được đồng

nuôi cấy 18 giờ ở điều kiện 38,5oC; 5% CO2; độ ẩm không khí bão hòa.

2.3.7.3. Nuôi phôi in vitro

Sau 18 giờ đồng nuôi cấy, loại bỏ lớp tế bào nang bao xung quanh trứng

trâu sau thụ tinh in vitro với pipet pasteur thủy tinh vô trùng trong môi trường

nuôi phôi (mCR1aa + huyết thanh thai bò + 100iu Penicillin/ml + 0,1mg

Streptomycin/ml). Tiếp theo rửa các tế bào trứng này 2-3 lần trong môi trường

nuôi phôi in vitro và chuyển vào giọt nuôi chứa môi trường nuôi phôi in vitro.

Phủ kín các giọt nuôi bằng dầu khoáng và nuôi ở điều kiện 38,5oC; 5% CO2; độ

ẩm không khí bão hòa. Kiểm tra tỷ lệ phân chia (thụ tinh) ở ngày thứ 2 sau thụ

tinh; tỷ lệ phôi dâu và phôi nang ở ngày thứ 8-9 sau thụ tinh.

2.3.8. Phương pháp đông lạnh tế bào trứng

2.3.8.1. Phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng trong cọng rạ truyền thống

Để trứng trâu trong dung dịch trước cân bằng (pES): TCM 199 + 50%

dung dịch đông lạnh (v/v) một thời gian trước khi chuyển sang dung dịch đông

lạnh (VS): TCM 199 + chất bảo vệ lạnh + BSA + Sucrose. Tiếp theo nạp 5-6

trứng vào cọng rạ 0,25ml, hàn kín đầu và để trên hơi nitơ lỏng. Sau 2 phút các

cọng rạ này sẽ được nhúng ngập trực tiếp vào trong nitơ lỏng để bảo quản lâu

dài.

2.3.8.2. Phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng trong cọng rạ hở

50

Trứng trâu được để trong dung dịch pES một thời gian; sau đó chuyển

sang môi trường VS, và nạp vào cọng rạ hở bằng lực mao dẫn. Các cọng rạ này

sẽ được nhúng ngập trực tiếp vào trong nitơ lỏng mà không cần hàn kín. Để

không bị nổi trong nitơ lỏng, các cọng rạ hở thường được cho vào trong cọng rạ

0,5ml không hàn kín.

2.3.8.3. Phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng bằng vi giọt

Trứng trâu được để trong dung dịch pES một thời gian; sau đó chuyển

sang môi trường VS; sau đó tế bào trứng được hút bằng pipet pasteur (3-5 tế bào

trứng/giọt) và thả trực tiếp vào trong nitơ lỏng. Các giọt dung dịch đông đặc có

chứa mẫu sẽ được chuyển vào trong ống chịu lạnh và bảo quản trong nitơ lỏng.

2.3.9. Phương pháp giải đông tế bào trứng sau bảo quản lạnh

Tế bào trứng được giải đông ở 37oC, sau đó chuyển sang môi trường giải

đông. Tiếp theo các tế bào trứng sẽ được rửa 2-3 lần trong môi trường nuôi thành

thục để loại bỏ hoàn toàn chất bảo vệ lạnh cũng như môi trường giải đông.

2.3.10. Phương pháp đánh giá hình thái trứng trâu sau đông lạnh-giải đông

Kiểm tra hình thái trứng trâu thu được sau đông lạnh - giải đông dưới kính

hiển vi soi nổi. Trứng có hình thái bình thường: có hình cầu cân đối, không méo

mó, lớp tế bào nang liên kết chặt chẽ với tế bào trứng, màng tế bào chất không bị

tổn thương (không bị phồng lên hoặc xẹp xuống); tế bào chất không bị mất hoặc

thoái hóa; màng sáng không bị đứt gãy. Trứng có hình thái không bình thường:

có hình dạng méo mó, lớp tế bào nang bao xung quanh bị tan rã, màng tế bào

chất và màng sáng bị tổn thương, tế bào chất bị thoái hóa.

2.4. Thiết kế thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu số lượng và chất lượng trứng trâu thu từ buồng trứng

lò mổ (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 1)

51

Thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng lò mổ bằng phương pháp chọc hút.

Đánh giá số lượng, chất lượng tế bào trứng trâu ngay sau khi thu. Phân loại chất

lượng tế bào trứng dựa vào quan sát hình thái.

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến hiệu

quả tạo phôi in vitro của trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 2)

Tế bào trứng trâu sau phân loại được nuôi thành thục in vitro trong 6 môi

trường: TCM 199 + 10% FCS + kháng sinh, TCM 199 + 5μg/ml FSH+ kháng

sinh, TCM 199 + 10% FCS + 5μg/ml FSH+ kháng sinh, Ham’s F-10 + 10%

FCS+ kháng sinh, Ham’s F-10 + 5μg/ml FSH+ kháng sinh, Ham’s F-10 + 10%

FCS + 5μg/ml FSH+ kháng sinh. Sau nuôi thành thục, các tế bào trứng được thụ

tinh in vitro và tạo phôi in vitro.

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu giai đoạn phát triển của nhân tế bào trứng trâu tại

các thời gian nuôi in vitro khác nhau (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 3 và 6)

Xác định giai đoạn phát triển chủ yếu của nhân tế bào trứng trâu tại các

thời gian nuôi in vitro khác nhau (0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ) bằng

phương pháp nhuộm nhân, kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang.

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của dạng chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả

đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 4)

Đông lạnh tế bào trứng trâu bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ

truyền thống, tiếp xúc 2 bước (thời gian tiếp xúc ở bước 1: 1 phút, bước 2: 30

giây). Dung dịch trước cân bằng: TCM 199 + 50% (v/v) dung dịch đông lạnh.

Dung dịch đông lạnh: TCM 199 + 0,4% BSA + 0,5M sucrose + dạng chất bảo vệ

lạnh (riêng lẻ hoặc kết hợp) ở nồng độ 6M. Dung dịch giải đông là: TCM 199.

Tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông được nuôi thành thục in vitro trong

môi trường đã lựa chọn ở thí nghiệm 2.

52

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả

đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 4)

Từ kết quả của thí nghiệm 4, lựa chọn dạng chất bảo vệ lạnh thích hợp sử

dụng cho thí nghiệm 5. Tế bào trứng trâu được đông lạnh bằng phương pháp

thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, tiếp xúc 2 bước (thời gian tiếp xúc ở

bước 1: 1 phút, bước 2: 30 giây). Dung dịch trước cân bằng: TCM 199 + 50%

(v/v) dung dịch đông lạnh. Dung dịch đông lạnh: TCM 199 + 0,4% BSA + 0,5M

sucrose + dạng chất bảo vệ lạnh đã lựa chọn ở thí nghiệm 4 với các nồng độ 2M,

4M, 6M và 8M. Dung dịch giải đông là TCM 199. Tế bào trứng trâu sau đông

lạnh – giải đông được nuôi thành thục in vitro trong môi trường đã lựa chọn ở thí

nghiệm 2.

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh

đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 4)

Từ kết quả của thí nghiệm 5, dạng chất bảo vệ lạnh với nồng độ thích hợp

sẽ được sử dụng cho thí nghiệm 6. Dung dịch trước cân bằng: TCM 199 + 50%

(v/v) dung dịch đông lạnh. Dung dịch đông lạnh: TCM 199 + 0,4% BSA + 0,5M

sucrose + dạng chất bảo vệ lạnh với nồng độ đã lựa chọn ở thí nghiệm 5. Dung

dịch giải đông là: TCM 199. Đông lạnh tế bào trứng trâu bằng phương pháp thủy

tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, tiếp xúc 2 bước. Thời gian tiếp xúc ở bước 2

bằng ½ bước 1. Thời gian tiếp xúc ở bước 2 trong thí nghiệm này là 30 giây, 1

phút, 2 phút, 3 phút.

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc thêm sucrose trong quá trình giải

đông đến hiệu quả đông lạnh trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 4)

Từ kết quả của thí nghiệm 6, dạng chất bảo vệ lạnh ở nồng độ, thời gian

tiếp xúc thích hợp sẽ được sử dụng cho thí nghiệm 7. Đông lạnh trứng trâu bằng

phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, tiếp xúc 2 bước. Dung

53

dịch trước cân bằng: TCM 199 + 50% (v/v) dung dịch đông lạnh. Dung dịch

đông lạnh: TCM 199 + 0,4% BSA + 0,5M sucrose + dạng chất bảo vệ lạnh với

nồng độ đã được lựa chọn ở thí nghiệm 5. Dung dịch giải đông gồm hai dạng:

dạng I là TCM 199; dạng II là hai dung dịch V1 (TCM 199 + 0,5M sucrose) và

V2 (TCM 199 + 0,25M sucrose). Đối với dung dịch giải đông dạng I, trứng sau

giải đông được để 5 phút trong dung dịch giải đông. Còn đối với dạng II: trứng

sau giải đông được chuyển lần lượt vào dung dịch V1 và V2 mỗi lần 5 phút.

Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả

đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 5)

Đông lạnh tế bào trứng trâu bằng 3 phương pháp: thủy tinh hóa trong cọng

rạ truyền thống, thủy tinh hóa trong cọng rạ hở, thủy tinh hóa vi giọt. Sử dụng

dạng chất bảo vệ lạnh ở nồng độ, thời gian và cách thức tiếp xúc và dung dịch

giải đông thích hợp đã lựa chọn được từ các thí nghiệm 4, 5, 6 và 7. Tế bào trứng

trâu sau đông lạnh – giải đông được nuôi thành thục in vitro trở lại, thụ tinh và

tạo phôi in vitro.

Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro đến hiệu quả

đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 6)

Các tế bào trứng trâu sẽ được đông lạnh ở các thời điểm nuôi in vitro khác

nhau (0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ). Sử dụng phương pháp đông lạnh với

dạng chất bảo vệ lạnh ở nồng độ, thời gian và cách thức tiếp xúc và dung dịch

giải đông thích hợp đã lựa chọn được từ các thí nghiệm 4, 5, 6, 7 và 8.

Sơ đồ thiết kế các thí nghiệm được thể hiện ở phần phụ lục

2.5. Phân tích số liệu và xử lý thống kê

Số liệu của tất cả các nội dung nghiên cứu trong luận án này được xử lý

thống kê bằng phần mềm Microsoft Excell 2007, sự khác nhau có ý nghĩa được

kiểm tra bằng χ2 sử dụng hàm CHITEST, sự sai khác có ý nghĩa với P< 0,05.

54

2.6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm của luận án được tiến hành từ năm 2010 đến năm 2013 tại:

- Phòng TNTĐ Công nghệ tế bào động vật – Viện Chăn nuôi.

- Bộ môn Sinh học Tế bào, Khoa Sinh học – Trường ĐHKHTN, ĐHQG Hà Nội.

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng ở lò mổ

Tế bào trứng trâu trước khi đông lạnh được hiểu là tổ hợp tế bào trứng và

tế bào nang trứng. Tất cả các thao tác từ lúc thu tế bào trứng cho đến lúc đông

lạnh, giải đông đều liên quan đến tổ hợp này. Theo Mehmood và cs. (2011a),

mặc dù phương pháp cắt lát cho tỷ lệ thu tế bào trứng cao hơn nhưng tỷ lệ tế bào

trứng tốt và thành thục lại thấp hơn rất nhiều so với phương pháp chọc hút.

Chính vì thế trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp chọc hút để

thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng lò mổ.

Một hạn chế trong việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh sản trên trâu

là tỷ lệ thu tế bào trứng chưa thành thục từ các buồng trứng thấp. Trong nghiên

cứu này số tế bào trứng trâu thu được trung bình là 4,9 tế bào trứng/buồng trứng;

trong đó số tế bào trứng trâu có chất lượng tốt thu được trung bình là 2 tế bào

trứng/buồng trứng (Bảng 2).

Bảng 2: Số lượng và chất lượng tế bào trứng trâu thu từ buồng trứng lò mổ

55

Số

buồng

trứng

Số tế

bào

trứng

thu

được

Số tế bào trứng

thu được/buồng

trứng

(Mean ± SE)

Số tế bào

trứng

loại A, B

Số tế bào trứng

loại A, B/buồng

trứng

(Mean ± SE)

Số tế bào

trứng

loại C, D

Số tế bào trứng

loại C, D/buồng

trứng

(Mean ± SE)

565 2770 4,9 ± 0,36 1130 2 ± 0,2 1640 2,9 ± 0,33

Kết quả thu tế bào trứng trâu trên một buồng trứng trong nghiên cứu của

chúng tôi là thấp hơn so với bò (4,9 tế bào trứng/buồng trứng so với 8-12 tế bào

trứng/buồng trứng).

Hình 1: Tế bào trứng trâu ngay sau khi thu từ buồng trứng lò mổ (độ

phóng đại 10 lần)

Kết quả thu tế bào trứng trâu có chất lượng tốt (Hình 1) từ buồng trứng lò

mổ của chúng tôi đạt 2 tế bào trứng/ buồng trứng là phù hợp với Das và cs.

(1996). Các tác giả này cho rằng tỷ lệ tế bào trứng trâu tốt nếu thu từ những nang

có đường kính 2-8 mm trên buồng trứng trâu sẽ dao động từ 0,7 – 2,4 tế bào

trứng trâu tốt/buồng trứng. Kết quả đánh giá chất lượng tế bào trứng trâu thu từ

buồng trứng lò mổ trong nghiên cứu này là cao hơn so với Totey và cs. (1992)

(0,7 tế bào trứng tốt/buồng trứng); Das và cs. (1996) (0,9 tế bào trứng tốt/buồng

trứng); Samad và cs. (1998) (1,76 tế bào trứng tốt/buồng trứng); nhưng thấp hơn

so với Gasparrini và cs. (2000) (2,4 tế bào trứng tốt/buồng trứng).

56

Số lượng tế bào trứng trâu tốt thu được trên một buồng trứng là thấp khi

được so sánh với gia súc khác như bò (10 000 đến 19 000 so với 150 000)

(Danell, 1987). Có một số nguyên nhân để lý giải cho điều này. Nguyên nhân

thứ nhất là do bản thân buồng trứng trâu có số lượng nang trứng nguyên thủy ít.

Ngoài ra, tỷ lệ nang trứng nhỏ và kém chất lượng trên buồng trứng trâu cũng

chiếm một tỷ lệ lớn (82 - 92%) (Palta và Chauhan, 1998), do đó tỷ lệ nang thoái

hóa ở buồng trứng trâu cũng cao (70,6 - 82%). Thêm vào đó trâu được giết mổ

thường là trâu đã già có dự trữ nang cạn kiệt nên tỷ lệ thu tế bào trứng trâu tốt từ

buồng trứng lò mổ thấp. Sự khác nhau về kết quả thu tế bào trứng trâu từ buồng

trứng lò mổ trong mỗi nghiên cứu liên quan đến sự khác nhau về mặt địa lý, chất

lượng trâu ở lò mổ, mùa thu buồng trứng, số lượng buồng trứng, kích thước và

giai đoạn của chu kỳ buồng trứng và kỹ thuật thao tác của kỹ thuật viên.

3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến hiệu quả tạo phôi in

vitro của tế bào trứng trâu

Hiện nay, kỹ thuật tạo phôi in vitro đã tạo ra một nguồn phôi dồi dào, có

chất lượng sử dụng cho cấy truyền phôi (Nandi và cs., 2002). Quy trình tạo phôi

in vitro được thực hiện theo các bước sau: nuôi thành thục in vitro tế bào trứng,

thụ tinh in vitro tế bào trứng và nuôi in vitro tế bào trứng đã phân chia sau thụ

tinh đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang.

Mặc dù đã tạo ra được nghé từ cấy truyền phôi trâu in vitro nhưng hiệu

quả của quá trình tạo phôi trâu in vitro vẫn thấp hơn khi được so sánh với bò

(Chauhan và cs., 1997a). Quá trình nuôi thành thục tế bào trứng rất quan trọng,

có ảnh hưởng tới sự thành công của quy trình tạo phôi in vitro. Có nhiều yếu tố

ảnh hưởng đến sự thành thục in vitro của tế bào trứng như: môi trường nuôi

thành thục, chất lượng tế bào trứng, các chất bổ sung... (Gabr và cs., 2015). Để

nâng cao hiệu quả quá trình tạo phôi trâu in vitro, các yếu tố kích thích tăng

57

trưởng như FSH, LH thường được bổ sung vào môi trường nuôi thành thục với

mục đích tăng tỷ lệ tế bào trứng thành thục in vitro (Saeki và cs., 1991). Theo

Abdoon và cs. (2001) việc bổ sung FSH và eCG vào môi trường nuôi thành thục

có thể nâng cao tỷ lệ tế bào trứng thành thục.

Hiện nay có nhiều dạng môi trường được sử dụng trong nuôi thành thục

in vitro tế bào trứng như: TCM 199, Ham’s F-10; Ham’s F-12, DMEM. Tuy

nhiên những môi trường này chỉ là những môi trường cơ bản dùng cho nuôi tế

bào, không có khả năng hỗ trợ cao cho sự thành thục của tế bào trứng. Chính vì

thế khi sử dụng những môi trường này trong nuôi thành thục in vitro tế bào trứng

thường được bổ sung thêm huyết thanh và hormone (Kumar và Anand, 2012).

Có nhiều dạng huyết thanh bổ sung vào môi trường nuôi thành thục in

vitro tế bào trứng như: huyết thanh trâu động dục (BOS); huyết thanh thai bò

(FCS); huyết thanh trâu gây siêu bài noãn (SBS); huyết thanh bê đực (SS).

Chauhan và cs., 1998a đã nghiên cứu hiệu quả của việc sử dụng FCS, SBS, BOS

và SS đối với tế bào trứng trâu. Việc nghiên cứu so sánh hiệu quả giữa các loại

huyết thanh này là khó do có sự sai khác giữa các nhóm thí nghiệm. Theo các tác

giả này, mức độ giãn nở của tế bào nang và thành thục của nhân là không khác

nhau giữa các nhóm. Tỷ lệ phân chia với FCS là thấp hơn so với BOS, SBS, SS.

Trong khi đó tỷ lệ phôi phân chia phát triển đến phôi nang với SBS lại cao hơn

so với BOS, FCS và SS. Tuy nhiên, đa số các phòng thí nghiệm thường sử dụng

FCS là dạng huyết thanh phổ biến bổ sung vào môi trường nuôi tế bào.

Đã có một số nghiên cứu được thực hiện nhằm so sánh các dạng môi

trường và các chất bổ sung vào môi trường nuôi thành thục in vitro tế bào trứng

trâu (Chauhan và cs., 1997b; Gasparrini và cs., 2006; Gabr và cs., 2015). Trong

nghiên cứu này, với mục đích nâng cao hiệu quả tạo phôi trâu in vitro từ tế bào

trứng trâu sau đông lạnh – giải đông, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đánh giá

58

ảnh hưởng của một số dạng môi trường nuôi thành thục đến sự thành thục và

hiệu quả tạo phôi trâu in vitro.

Môi trường được sử dụng rộng rãi hiện nay trong nuôi thành thục in vitro

tế bào trứng trâu là TCM 199 và Ham’s F-10 (Kumar và Anand, 2012; Hammam

và cs., 2010). Chính vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng hai môi

trường nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu là TCM 199 hoặc Ham’s F-10

có bổ sung thêm kháng sinh (100iu Penicillin/ml + 0,1mg Streptomycin/ml),

huyết thanh thai bò (FCS), hormone kích thích nang trứng (FSH). Hiệu quả của

các dạng môi trường nuôi được đánh giá dựa vào tỷ lệ thành thục và tạo phôi in

vitro của tế bào trứng trâu sau nuôi. Sử dụng phương pháp nhuộm nhân tế bào

như đã mô tả ở mục 2.4.4 để đánh giá sự thành thục của tế bào trứng. Tế bào

trứng thành thục là tế bào trứng có nhân ở giai đoạn Metaphase II, xuất hiện thể

cực thứ nhất.

3.2.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi đến sự thành thục in vitro tế bào trứng

trâu

Kết quả thể hiện ở bảng 3 cho thấy không có sự khác nhau (P>0,05) khi so

sánh tỷ lệ thành thục giữa TCM 199 và Ham’s F-10 khi bổ sung riêng lẻ FCS và

FSH. Kết quả này tương tự như báo cáo của Hegab và cs. (2009). Hegab và cs.

(2009) cũng không nhận thấy sự khác nhau giữa TCM 199 và Ham’s F-10 khi

cùng bổ sung FCS.

Tuy nhiên trong nghiên cứu của chúng tôi, khi bổ sung kết hợp cả FSH và

FCS vào môi trường Ham’s F-10 và TCM 199 thì môi trường Ham’s F-10 cho tỷ

lệ thành thục cao hơn so với TCM 199 (tương ứng là 74,64% và 63,28%;

P<0,05). Thậm chí theo kết quả ở bảng 3, khi nuôi tế bào trứng trâu trong môi

trường Ham’s F-10 có bổ sung kết hợp FCS và FSH cho tỷ lệ tế bào trứng trâu

thành thục sau nuôi cao nhất (74,64%; P<0,05).

59

Bảng 3: Tỷ lệ thành thục của tế bào trứng trâu sau khi nuôi in vitro trong

một số môi trường nuôi khác nhau

Môi trường nuôi thành thục

Số tế bào

trứng nuôi

thành thục

Tế bào trứng thành thục

Số tế bào

trứng% (M ± SE)

TCM 199 + FCS 203 102 50,24c ± 1,38

TCM 199 + FSH 200 103 51,5c ± 1,47

TCM 199 + FCS + FSH 207 131 63,28b ± 1,72

Ham F10 + FCS 213 108 50,7c ± 1,39

Ham,s F10 + FSH 209 112 53,6c ± 1,28

Ham,s F10 + FCS + FSH 209 156 74,64a ± 1,76

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái khác nhau là sai khác có ý

nghĩa (P<0,05)

Kết quả này cho thấy FSH có tác động tích cực đến sự thành thục in vitro

của tế bào trứng trâu. Quá trình thành thục của tế bào trứng chịu tác động mạnh

60

mẽ của lớp tế bào nang bao xung quanh, bởi vì các tế bào nang chính là cầu nối

trao đổi giữa tế bào trứng và môi trường nuôi trong quá trình nuôi thành thục in

vitro. Sự có mặt của FSH trong môi trường nuôi thành thục sẽ làm tăng quá trình

giãn nở của lớp tế bào nang, kích thích quá trình thành thục nhân của tế bào

trứng (Totey và cs., 1992, 1993; Palta và Chauhan, 1998), qua đó sẽ làm tăng tỷ

lệ tế bào trứng thành thục sau nuôi in vitro.

Kết quả của nghiên cứu này cho thấy Ham’s F-10 nâng cao được hiệu quả

nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu hơn TCM 199. Điều này là phù hợp với

báo cáo của Hammam và cs. (1997); Totey và cs. (1992); Abdoon và cs. (2001).

Abdoon và cs. (2001) nhận thấy tế bào trứng trâu được nuôi thành thục in vitro

trong Ham’s F-10, sau thụ tinh có tỷ lệ phân chia và phát triển tốt hơn khi nuôi

thành thục in vitro trong TCM 199; MEM hoặc RPMI-1640. Hammam và cs.

(1997) cũng nhận thấy rằng Ham’s F-10 là môi trường nuôi thành thục tế bào

trứng trâu có hiệu quả hơn so với TCM 199. Kết quả này cũng được Totey và cs.

(1992) khẳng định; các tác giả này cho rằng khi nuôi thành thục in vitro tế bào

trứng trâu trong môi trường Ham’s F-10 có bổ sung FCS và hormone cho hiệu

quả cao hơn nuôi trong môi trường TCM 199 có bổ sung FCS và hormone.

3.2.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến khả năng tạo phôi in

vitro của tế bào trứng trâu

Kết quả của nghiên cứu này cho thấy việc bổ sung riêng lẻ FSH vào môi

trường TCM 199 và Ham’s F-10 cho tỷ lệ phân chia; tạo phôi dâu, phôi nang cao

hơn so với việc bổ sung riêng lẻ FCS vào hai môi trường này (Bảng 4).

Bảng 4: Khả năng tạo phôi in vitro của tế bào trứng trâu sau khi nuôi in

vitro trong một số môi trường nuôi thành thục khác nhau

61

Môi trường nuôi

thành thục

Số tế bào trứng

thụ tinh

Tế bào trứng

phân chia

Phôi dâu, phôi nang

Số tế

bào

trứng

% (M ± SE)

Số phôi

dâu, phôi

nang

% (M ± SE)

TCM 199 + FCS 123 51 41,46c ± 1,36 10 8,13c ± 1,55

TCM 199 + FSH 129 67 51,94c ± 1,47 11 8,53c ± 1,75

TCM 199 + FCS + FSH 160 104 65b ± 0,9 30 18,75b ± 0,93

Ham’s F10 + FCS 127 65 51,18c ± 1,34 11 8,66c ± 1,19

Ham’s F10 + FSH 138 94 68,12b ± 1,12 25 18,12b ± 1,41

Ham’s F10 + FCS + FSH 184 144 78,26a ± 1,79 54 29,35a ± 1,25

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái khác nhau là sai khác có ý

nghĩa (P<0,05)

Kết quả trên là phù hợp với báo cáo của Totey và cs. (1992; 1993); Palta

và Chauhan (1998). Các tác giả này đã chỉ ra rằng FSH là yếu tố cần thiết cho sự

giãn nở của tế bào nang và sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu bởi vì

62

FSH có ảnh hưởng đến sự giãn nở của tế bào nang bao xung quanh tế bào trứng,

do đó nó có ảnh hưởng đến quá trình thụ tinh, tạo phôi in vitro.

Ali và Sirard (2002) cũng khẳng định rằng việc bổ sung FSH và E2 trong

suốt quá trình nuôi thành thục in vitro tế bào sẽ làm tăng số lượng phôi dâu, phôi

nang in vitro.

Hiệu quả của việc tạo phôi trâu in vitro được nâng cao khi bổ sung kết hợp

cả FSH và FCS vào môi trường Ham’s F-10 và TCM 199. Tỷ lệ phân chia

(tương ứng 78,26% và 65%); tạo phôi dâu, phôi nang (tương ứng 29,35%và

18,75%) trong môi trường nuôi có bổ sung kết hợp FSH và FCS cao hơn so với

việc bổ sung riêng lẻ FSH, FCS (P<0,05; Bảng 4). Kết quả này là phù hợp với

báo cáo của Chauhan và cs. (1997b); Chohan và Hunter (2003); Totey và cs.

(1992). Các tác giả này cũng nhận thấy việc bổ sung riêng lẻ hormone hoặc

huyết thanh vào môi trường TCM 199 sẽ không cải thiện được tỷ lệ thụ tinh

(phân chia) in vitro.

Neglia và cs. (2001) cũng cho rằng việc sử dụng kết hợp FCS, LH và

estradiol trong môi trường nuôi thành thục sẽ làm tăng tỷ lệ tế bào trứng trâu và

bò thành thục in vitro. Trong môi trường Ham’s F-10 khi bổ sung luteinizing

hormone (LH) sẽ cải thiện đáng kể tỷ lệ thành thục, còn việc thêm follicle

stimulating hormone (FSH) và estradiol làm tăng tỷ lệ tạo phôi nang. Ngược lại

trong TCM-199, LH không nâng cao tỷ lệ thành thục nhưng việc bổ sung FSH

và oestradiol lại làm tăng tỷ lệ này.

Kết quả thể hiện ở bảng 4 cho thấy tỷ lệ phân chia; tạo phôi dâu, phôi

nang của tế bào trứng trâu được thành thục trong môi trường Ham’s F-10 + FCS

+ FSH là cao hơn so với các môi trường còn lại (tương ứng là 78,26%; 29,35%;

P<0,05). Kết quả của chúng tôi cho thấy việc sử dụng môi trường Ham’s F-10

trong quá trình nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu mang lại hiệu quả tạo

63

phôi trâu in vitro cao hơn so với môi trường TCM 199 ở cùng điều kiện. Kết quả

này là phù hợp với báo cáo của Abdoon và cs. (2001). Theo Abdoon và cs.

(2001) tế bào trứng thành thục trong Ham’s F-10 sau thụ tinh có tỷ lệ phân chia

và phát triển tốt hơn thành thục trong TCM - 199; MEM hoặc RPMI-1640.

Kết quả của mục 3.2.1 và 3.2.2 đã chỉ ra rằng tế bào trứng trâu được nuôi

thành thục in vitro trong môi trường Ham’s F-10 có bổ sung kết hợp FCS và

FSH cho tỷ lệ thành thục, phân chia và tạo phôi hiệu quả hơn các môi trường còn

lại. Với kết quả đó chúng tôi sử dụng môi trường nuôi thành thục in vitro Ham’s

F-10 có bổ sung kết hợp FCS và FSH cho các thí nghiệm nuôi thành thục in vitro

tế bào trứng trâu trong luận án này.

3.3. Trạng thái của nhân tế bào trứng trâu đầm lầy tại các thời gian nuôi in

vitro khác nhau

Kết quả của nghiên cứu này được thể hiện ở bảng 5. Nguồn gốc chủ yếu

của tế bào trứng sử dụng cho thủy tinh hóa là từ buồng trứng lò mổ. Kết quả

nghiên cứu của luận án này cho thấy khi nhuộm nhân các tế bào trứng trâu loại

A, B ngay sau khi thu từ buồng trứng lò mổ (tương ứng với thời gian nuôi in

vitro 0 giờ) để kiểm tra, tất cả các tế bào trứng đều có nhân ở giai đoạn túi mầm

(GV) (100%). Điều này là phù hợp với nhận định của Parnpai và cs. (2014), theo

họ tế bào trứng được thu từ những nang trứng đều có nhân ở giai đoạn túi mầm

(GV).

Theo kết quả thu được trong nghiên cứu này thì tại thời điểm nuôi thành

thục 12 giờ và 18 giờ, nhân tế bào trứng trâu chủ yếu tồn tại tương ứng ở kỳ giữa

I (95,43%; Hình 3) và kỳ cuối I (64,57%; Hình 4). Đến thời điểm nuôi thành

thục 24 giờ: 74,88% tế bào trứng có nhân đạt tới trạng thái thành thục và thể cực

thứ nhất đã hình thành xong (Hình 5). Tỷ lệ này là cao hơn so với Barakat và cs.

(2012), các tác giả này báo cáo rằng chỉ có 45,7% tế bào trứng có nhân thành

64

thục ở thời điểm nuôi thành thục 24 giờ. Sự khác nhau này có thể là do môi

trường nuôi thành thục, chất lượng tế bào trứng của mỗi nghiên cứu.

Bảng 5: Trạng thái nhân tế bào trứng trâu ở các thời điểm nuôi khác nhau

Thời

gian

nuôi

in

vitro

Số tế

bào

trứng

nuôi in

vitro

Số tế bào trứng trâu ở các giai đoạn phát triển nhân tại các thời điểm nuôi khác nhau

(%; M ± S E)

Túi mầm

Tiền

kỳ

giữa I

Kỳ giữa I Kỳ sau I Kỳ cuối I Thành thụcThoái

hóa

0 giờ 221221

100 ± 0

6 giờ 218216

1 199,08 ± 0,79

12 giờ 219 1 5209

1 395,43 ± 1,13

18 giờ 223 1 6 11

59 144

2

26,46 ± 1,12 64,57 ± 1,41

24 giờ 219 1 6 9

18 17 164

48,22 ± 0,48 7,76 ± 0,55 74,88 ± 1,4

Sau 6 giờ nuôi thành thục in vitro tỷ lệ tế bào trứng có nhân ở giai đoạn

GV vẫn rất cao (99,08%; Hình 2). Theo Barakat và cs. (2012) sau 8 giờ nuôi

thành thục in vitro vẫn còn 52,7% tế bào trứng có nhân ở giai đoạn GV. Điều

65

này cho thấy đối với tế bào trứng trâu thời gian tồn tại của nhân ở giai đoạn túi

mầm là khá dài.

Nhân

Hình 2: Tế bào trứng trâu có nhân ở giai đoạn túi mầm (GV)

Nhân

Hình 3: Tế bào trứng trâu có nhân ở giai đoạn kỳ giữa I

66

Nhân

Thể cực thứ nhất đang hình thành

Hình 4: Tế bào trứng trâu có nhân ở giai đoạn kỳ cuối I

Nhân Thể cực

Hình 5: Tế bào trứng trâu có nhân ở giai đoạn thành thục (Metaphase II)

67

Kết quả ở bảng 5 cho thấy tại mỗi thời điểm nuôi thành thục in vitro khác

nhau, nhân tế bào trứng trâu tồn tại ở các trạng thái khác nhau, và đó có thể là

nguyên nhân khiến tế bào trứng sẽ có mức độ chịu đựng những tổn thương lạnh

khác nhau ở mỗi giai đoạn nuôi thành thục in vitro.

3.4. Ảnh hưởng của chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng

trâu

Các chất bảo vệ lạnh là những thành phần cần thiết có mặt trong dung dịch

đông lạnh – giải đông để bảo vệ tế bào khỏi những tổn thương do quá trình đông

lạnh –giải đông gây ra. Tuy nhiên bên cạnh đó bản thân các chất bảo vệ lạnh

cũng là một trong những nguyên nhân gây ra các tổn thương cho tế bào trứng

(Fahy và cs., 1999). Những tổn thương do chất bảo vệ lạnh gây ra là không giới

hạn mà có thể xảy ra trong suốt quá trình đông lạnh-giải đông. Những chất bảo

vệ lạnh thấm màng được sử dụng trong quá trình đông lạnh thường có hệ số

thấm màng thấp hơn so với nước. Chính vì vậy tế bào trứng sẽ phải trải qua sự

chênh lệch áp suất thẩm thấu trong quá trình đông lạnh (thêm chất bảo vệ lạnh

vào tế bào trứng) và giải đông (loại bỏ chất bảo vệ lạnh ra khỏi tế bào trứng), do

đó tế bào trứng dễ bị tổn thương bởi sự thay đổi thể tích.

Dung dịch đông lạnh sử dụng chất bảo vệ lạnh thấm màng, không thấm

màng để tạo nên sự thay đổi trong nước đẳng trương giữa nội và ngoại bào dẫn

tới hiện tượng nước thoát ra khỏi tế bào. Quá trình này được gọi là sự khử nước

của tế bào. Tế bào trứng có thể bị tổn thương do ảnh hưởng của áp suất thẩm

thấu khi tiếp xúc với dung dịch đông lạnh. Chất bảo vệ lạnh thấm màng thường

ảnh hưởng bất lợi lên sợi thoi vô sắc (Johnson và Pickering., 1987), sự thành

thục (Karima và cs., 2010), khả năng phát triển tiếp theo (Rho và cs., 2002; Roja

và cs., 2004) và nhiễm sắc thể của tế bào trứng (Bouquet và cs., 1993; Bos-

Mikich và Whittingham, 1995).

68

Việc làm giảm bớt những ảnh hưởng bất lợi đến tế bào trứng trâu khi

chúng được tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm:

dạng chất bảo vệ lạnh, nồng độ chất bảo vệ lạnh, cách thức và thời gian tiếp xúc.

3.4.1. Ảnh hưởng của dạng chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh trứng

trâu

Trong luận án này, khi nghiên cứu về ảnh hưởng của dạng chất bảo vệ

lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy, chúng tôi đông lạnh tế

bào trứng trâu trong một số dung dịch thủy tinh hóa sử dụng riêng lẻ dạng chất

bảo vệ lạnh hoặc kết hợp.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy EG là chất bảo vệ lạnh có ảnh

hưởng tốt hơn so với DMSO, PROH, Gly kể cả khi sử dụng riêng lẻ hoặc kết

hợp trong quá trình đông lạnh – giải đông đối với tế bào trứng trâu đầm lầy chưa

thành thục. Tỷ lệ tế bào trứng trâu có hình dạng bình thường thu được sau đông

lạnh – giải đông, tỷ lệ thành thục in vitro trở lại của các tế bào trứng này cao nhất

là ở nhóm EG (70,04%; 19,07%; P <0,05) và thấp nhất là ở nhóm EG + Gly

(44,81%; 4,63; P<0,05) (Bảng 6).

Kết quả này cũng tương tự như một số báo cáo khác về hiệu quả của EG

đối với quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng: chuột (Miyake và cs., 1993), bò

(Delval và cs., 1996; Martino và cs., 1996; Saha và cs., 1996; Dinnyes và cs.,

2000) và trâu (Dhali và cs., 2000a; 2000b; Wani và cs., 2004b; Sharma và

Purohit, 2008). Sharma và cs. (2010) nhận thấy EG là chất bảo vệ lạnh có hiệu

quả hơn Propylene glycol trong bảo quản lạnh tế bào trứng trâu đối với cả hai

phương pháp đông lạnh bằng cọng rạ truyền thống và cọng rạ hở. Theo các tác

giả này, khi sử dụng EG trong bảo quản lạnh tế bào trứng trâu cho tỷ lệ tạo phôi

dâu, phôi nang của tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông cao hơn khi được

so sánh với Propylene glycol.

69

Bảng 6: Khả năng sống và sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu đầm

lầy sau đông lạnh – giải đông trong các dạng chất bảo vệ lạnh khác nhau

Chất bảo vệ

lạnh

Số tế bào

trứng

đông

lạnh

Tế bào trứng trâu có hình thái

bình thường sau đông lạnh –

giải đông

Tế bào trứng thành thục

Số tế bào

trứng% (M ± SE)

Số tế bào

trứng% (M ± SE)

EG 247 173 70,04a ± 0,46 33 19,07a ± 1,05

DMSO 244 134 54,91bcd ± 0,49 11 8,21b ± 0,59

PROH 238 143 60,08b ± 0,44 12 8,4b ± 0,54

Gly 240 117 48,75ce ± 0,35 8 6,84b ± 1,14

EG + DMSO 240 138 57,5bc ± 0,71 13 9,86b ± 0,82

EG + PROH 239 143 59,83bd ± 0,46 12 8,4b ± 0,57

EG + Gly 241 108 44,81ef ± 0,45 5 4,63b ± 1,39

DMSO + PROH 245 121 49,39cf ± 1,01 9 7,44b ± 0,89

DMSO + Gly 247 142 57,49bcd ± 0,57 14 9,42b ± 0,69

PROH + Gly 246 127 51,63bcdf ± 0,61 12 9,45b ± 0,69

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không có chữ cái giống nhau là sai khác

có ý nghĩa (P<0,05)

70

Kasai, 2002 cũng cho rằng EG là một chất bảo vệ lạnh thấm màng thường

được sử dụng rộng rãi trong quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng và phôi, vì nó

có ít ảnh hưởng bất lợi cho tế bào trứng và phôi trong quá trình này. Theo Shaw

và cs. (1997), Cha và cs. (2000) EG là chất bảo vệ lạnh hiệu quả vì nó có khả

năng thấm màng nhanh hơn Glycerol, DMSO và ít độc tố hơn các chất bảo vệ

lạnh khác. EG có khả năng thấm màng tốt hơn so với Gly, DMSO và PROH

(Dhali và cs., 2000b) bởi vì nó là chất bảo vệ lạnh có khối lượng phân tử thấp

hơn, do đó EG nhanh chóng bị loại bỏ khỏi tế bào trứng trong quá trình giải đông

(Dhali và cs., 2000a).

Thêm vào đó, EG còn được cho là ít có ảnh hưởng bất lợi hơn Glycerol và

PROH đối với phôi chuột (Kasai và cs., 1990). Mahmoudzadeh và cs. (1993) đã

nhận thấy rằng khi sử dụng EG trong quá trình đông lạnh phôi bò thì khả năng

sống của phôi bò sau đông lạnh – giải đông là cao hơn so với việc sử dụng

DMSO, PROH (riêng lẻ hoặc kết hợp).

Bảng 6 cho thấy tỷ lệ thành thục in vitro của các nhóm kết hợp dao động

từ 4,63% - 9,86%; cao nhất là ở nhóm EG + DMSO và thấp nhất ở nhóm EG +

Gly, tuy nhiên sự khác nhau này là không có ý nghĩa (P<0,05). Theo Karima và

cs. (2010) tỷ lệ thành thục in vitro cao nhất của tế bào trứng trâu chưa thành thục

sau tiếp xúc cao nhất cũng ở nhóm EG + DMSO, nhưng thấp nhất là ở nhóm

DMSO + Gly.

Mahmoud và cs. (2010b) cũng chỉ ra rằng sự kết hợp EG + DMSO cho tỷ

lệ thành thục cao nhất của tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông khi được

thủy tinh hóa bằng cọng rạ truyền thống hoặc cọng rạ hở ở giai đoạn túi mầm

(GV). Hỗn hợp EG + DMSO được sử dụng rộng rãi cho bảo quản lạnh tế bào

trứng (Muenthaisong và cs., 2007; Morato và cs., 2008). Những tiến bộ gần đây

71

trong phương pháp bảo quản lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy chỉ ra rằng hỗn hợp

EG + DMSO được sử dụng phổ biến cho loài này (Liang và cs., 2013).

Mặc dù Vajta và cs. (1998b), Chian và cs. (2004) cho rằng khi sử dụng

dung dịch đông lạnh là hỗn hợp chất bảo vệ lạnh thấm màng có ưu điểm hơn

dung dịch chỉ có một chất bảo vệ lạnh thấm màng. Tuy nhiên theo kết quả

nghiên cứu của chúng tôi, sự kết hợp các chất bảo vệ lạnh thấm màng không cải

thiện được tỷ lệ thành thục nhân của tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông

khi được so sánh với việc sử dụng riêng lẻ EG ở cùng một nồng độ. Cùng quan

điểm với chúng tôi, Yadav và cs. (2008); Wani và cs. (2004b) cũng nhận thấy sự

kết hợp giữa DMSO với EG hoặc PROH, EG với Gly không có hiệu quả đối với

sự thành thục nhân của tế bào trứng trâu chưa thành thục sau đông lạnh – giải

đông. Sự khác nhau giữa các kết quả nghiên cứu có thể là do yếu tố loài, điều

kiện của từng phòng thí nghiệm.

3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào

trứng trâu

Dựa vào kết quả của mục 3.4.1, trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng

chất bảo vệ lạnh là Ethylene glycol để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ chất bảo

vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy Bubalus bubalis. Kết

quả thể hiện ở bảng 7.

Nồng độ chất bảo vệ lạnh sử dụng là một trong những yếu tố ảnh hưởng

đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng. Trong nghiên cứu này, tỷ lệ tế bào trứng

trâu có hình thái bình thường thu được sau đông lạnh – giải đông cao nhất là ở

nhóm EG 6M (70,04%; P<0,05); thấp nhất là ở nhóm EG 8M (39, 84%; P<0,05).

Tỷ lệ tế bào trứng trâu thành thục in vitro trở lại sau đông lạnh – giải đông cao

nhất là ở nhóm EG 6M (19,07%; P<0,05) và thấp nhất là ở nhóm EG 2M

(5,98%; P<0,05).

72

Bảng 7: Sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông lạnh

– giải đông ở các nồng độ EG khác nhau

Chất bảo

vệ lạnh

Số tế bào

trứng

đông

lạnh

Tế bào trứng có hình thái

bình thường sau đông lạnh-

giải đông

Tế bào trứng

thành thục

Số tế

bào

trứng

% (M ± SE)

Số tế

bào

trứng

% (M ± SE)

EG 2M 244 117 47,95c ± 0,29 7 5,98b ± 0,67

EG 4M 241 145 60,17b ± 0,37 12 8,28b ± 0,95

EG 6M 247 173 70,04a ± 0,46 33 19,07a ± 1,05

EG 8M 246 98 39,84c ± 0,31 6 6,12b ± 0,26

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái khác nhau là sai khác có ý

nghĩa (P<0,05)

Kết quả trên cho thấy nếu nồng độ chất bảo vệ lạnh không thích hợp, cho

dù là sử dụng phương pháp thủy tinh hóa thì hiệu quả đông lạnh vẫn kém. Theo

Rubinsky và cs. (1991), trong phương pháp thủy tinh hóa nếu sử dụng nồng độ

73

chất bảo vệ lạnh thấp thì tế bào bị vỡ màng là điều tất yếu; còn nếu nồng độ chất

bảo vệ lạnh quá cao thì tế bào sẽ bị chết. Mặc dù trong nghiên cứu của chúng tôi

có sự khác nhau về tỷ lệ thành thục in vitro giữa các nhóm EG 2M, EG 4M, EG

8M (tương ứng: 5,98%; 8, 28% và 6,12%) nhưng sự khác nhau là không có ý

nghĩa (P>0,05).

Kết quả ở bảng 7 cho thấy nồng độ chất bảo vệ lạnh sử dụng trong quá

trình đông lạnh cho hiệu quả cao nhất là 6M, các nồng độ còn lại đều cho tỷ lệ

thấp hơn. Kết quả này là khác so với một số báo cáo. Theo Yadav và cs. (2008)

thì tại nồng độ EG 8M, tỷ lệ tế bào trứng trâu có khả năng sống (có hình thái

bình thường) thành thục in vitro trở lại sau đông lạnh-giải đông là cao nhất.

Trong khi đó theo Wani và cs. (2004b) thì tỷ lệ thành thục in vitro cao nhất của

tế bào trứng trâu chưa thành thục đạt được khi tế bào trứng trâu được thủy tinh

hóa ở nồng độ 7M của tất cả các chất bảo vệ lạnh. Bombatkar. (2008) cũng cho

rằng ở nồng độ EG 7M cho tỷ lệ tế bào trứng có hình thái bình thường thu được

sau đông lạnh – giải đông cao hơn khi được so sánh với EG 5M và EG 6M

(tương ứng 75% so với 47,7% và 30,51%). Sự khác nhau này có thể là do

phương pháp đông lạnh sử dụng, điều kiện thí nghiệm của từng báo cáo.

Mặc dù việc đưa ra kết luận về nồng độ chất bảo vệ lạnh tối ưu sử dụng

trong quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng trâu là khác nhau tùy thuộc từng

nghiên cứu, nhưng các nghiên cứu đều cho rằng có sự giới hạn về nồng độ các

chất bảo vệ lạnh khi sử dụng chúng trong quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng

trâu. Theo kết quả đạt được trong nghiên cứu này nhận thấy có sự giới hạn về

nồng độ chất bảo vệ lạnh được sử dụng, không nên sử dụng quá nồng độ 8M.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với Mahmoud và El-Sokary (2013),

các tác giả này cũng nhận định rằng nồng độ chất bảo vệ lạnh tối đa sử dụng

trong bảo quản lạnh tế bào trứng trâu là 8M. Tuy nhiên theo Yadav và cs. (2008)

74

thì giới hạn cuối cùng của nồng độ chất bảo vệ lạnh sử dụng trong quá trình đông

lạnh là 10M, nếu quá nồng độ này tỷ lệ tế bào trứng có hình thái bình thường sau

đông lạnh – giải đông giảm.

Hình 6: Tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục bị mất lớp tế bào nang,

tổn thương tế bào chất sau đông lạnh – giải đông (độ phóng đại 10 lần)

Kết quả thể hiện ở bảng 7 cho thấy, tại nồng độ 8M tỷ lệ tế bào trứng có

hình thái bình thường và thành thục in vitro trở lại sau đông lạnh – giải đông

giảm đáng kể, vì vậy không nên sử dụng nồng độ cao hơn nồng độ này trong bảo

quản lạnh tế bào trứng trâu. Nồng độ chất bảo vệ lạnh cao sẽ ảnh hưởng bất lợi

đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng.

Nguyên nhân lý giải cho điều này là do chất bảo vệ lạnh ngoài vai trò tích

cực bảo vệ tế bào trong quá trình đông lạnh thì nó còn có những độc tố có thể

gây ảnh hưởng đến tế bào. Khi nồng độ chất bảo vệ lạnh cao sẽ làm tăng áp suất

thẩm thấu và độc tố của chất bảo vệ lạnh, do đó sẽ gây tổn thương đến tế bào

trứng (Hình 6) khi chúng được tiếp xúc (Rall và cs., 1987). Việc tăng nồng độ

các chất bảo vệ lạnh quá ngưỡng cho phép trong quá trình đông lạnh sẽ làm giảm

khả năng sống của tế bào trứng trâu sau khi chúng tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh

(Karima và cs., 2010). Đó cũng có thể là một trong những nguyên nhân gây ra

một số ảnh hưởng bất lợi cho tế bào trứng trong quá trình bảo quản lạnh.

3.4.3. Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả

đông lạnh tế bào trứng trâu

Dựa vào kết quả của mục 3.4.2, trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng

chất bảo vệ lạnh là EG ở nồng độ 6M để đánh giá ảnh hưởng của thời gian tiếp

75

xúc với chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy

Bubalus bubalis (Bảng 8). Tỷ lệ tế bào trứng thành thục in vitro trở lại được tính

dựa trên số tế bào trứng thành thục/số tế bào trứng có hình thái bình thường sau

đông lạnh – giải đông.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ tế bào trứng có khả năng

sống và thành thục in vitro trở lại bị ảnh hưởng bởi các mức thời gian tiếp xúc

khác nhau. Điều này cũng phù hợp với báo cáo của Karima và cs. (2010). Theo

kết quả của nghiên cứu này thì tỷ lệ tế bào trứng thành thục in vitro trở lại sau

đông lạnh – giải đông cao nhất ở nhóm tiếp xúc 1 phút (30,62%; P<0,05), thấp

nhất là ở nhóm 3 phút (10,11%; P<0,05).

Sự khác nhau về tỷ lệ thành thục giữa hai nhóm tiếp xúc 30 giây và tiếp

xúc 2 phút là không có ý nghĩa (tương ứng: 19,07% và 20,31%; P>0,05). Tỷ lệ tế

bào trứng thành thục in vitro trở lại giảm dần và khác nhau có ý nghĩa theo thời

gian tiếp xúc từ mức thời gian 1 phút (P<0,05).

Karima và cs. (2010) cho rằng thời gian tiếp xúc của tế bào trứng với chất

bảo vệ lạnh chỉ có một giới hạn nhất định, nếu vượt quá giới hạn này tế bào

trứng sẽ chết sau khi tiếp xúc. Các tác giả này khi kiểm tra hình thái của tế bào

trứng sau tiếp xúc nhận thấy tỷ lệ sống của tế bào trứng trâu chưa thành thục là

không khác nhau giữa các thời gian tiếp xúc 30 giây, 1 phút và 5 phút đối với các

chất bảo vệ lạnh DMSO, EG và Glycerol. Tuy nhiên tỷ lệ thành thục in vitro trở

lại sau tiếp xúc ở nhóm 5 phút là thấp hơn so với 1 phút và 30 giây.

Bảng 8: Sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông lạnh

– giải đông ở các thời gian tiếp xúc khác nhau (tiếp xúc 2 bước)

76

Thời gian tiếp xúc ở

bước cuối cùng

Số tế bào trứng có

hình thái bình

thường sau đông

lạnh-giải đông

Tế bào trứng thành thục

Số tế bào

trứng% (M ± SE)

30 giây 173 33 19,07bc ± 1,05

1 phút 209 64 30,62ab ± 0,45

2 phút 128 26 20,31bc ± 0,39

3 phút 89 9 10,11c ± 1,26

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái khác nhau là sai khác có ý

nghĩa (P<0,05)

Trong quá trình đông lạnh tế bào trứng, thời gian tế bào trứng tiếp xúc với

chất bảo vệ lạnh là yếu tố rất quan trọng đảm bảo cho sự thành công của quá

trình này. Khi thời gian tiếp xúc quá dài sẽ làm cho tế bào trứng chịu nhiều ảnh

hưởng bất lợi từ độc tố của chất bảo vệ lạnh dẫn đến những tổn thương không

thể hồi phục. Nhưng nếu thời gian tiếp xúc quá ngắn, tế bào trứng không loại bỏ

được hết nước nội bào thì sẽ dẫn đến sự hình thành tinh thể đá trong quá trình

77

đông lạnh, do đó sẽ làm tổn thương tế bào trứng và làm giảm hiệu quả của quá

trình đông lạnh-giải đông.

Theo Kasi (1996) để đảm bảo cho sự thành công của quá trình thủy tinh

hóa thì phải đảm bảo được thời gian tế bào trứng tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh là

tối ưu, qua đó sẽ làm giảm những tổn thương lạnh và ngăn chặn sự hình thành

tinh thể đá. Martins và cs. (2005) cũng cho rằng đối với tế bào trứng bò mặc dù

cách thức tiếp xúc là 2 bước nhưng nếu ở bước 1 tế bào trứng tiếp xúc lâu với

chất bảo vệ lạnh trong môi trường trước cân bằng với nồng độ cao sẽ gây bất lợi

cho sự thành thục in vitro trở lại của tế bào trứng bò chưa thành thục sau đông

lạnh-giải đông.

3.4.4. Ảnh hưởng của sucrose trong quá trình giải đông đến hiệu quả đông

lạnh tế bào trứng trâu

Từ kết quả của mục 3.4.1; 3.4.2 và 3.4.3; thí nghiệm này được tiến hành

nhằm đánh giá ảnh hưởng của việc thêm sucrose trong quá trình giải đông đến

hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy Bubalus bubalis dựa trên cơ sở sử

dụng chất bảo vệ lạnh thấm màng EG ở nồng độ 6M, tiếp xúc 2 bước với thời

gian tiếp xúc ở bước cuối cùng là 1 phút. Tỷ lệ tế bào trứng thành thục in vitro

trở lại được tính dựa trên số tế bào trứng thành thục/số tế bào trứng có hình thái

bình thường sau đông lạnh – giải đông. Kết quả thể hiện ở bảng 9.

Sự thành công của quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng trâu không chỉ phụ

thuộc vào quá trình đông lạnh mà còn phụ thuộc vào quá trình giải đông.

Bảng 9: Sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu chưa thành thục khi

giải đông trong dung dịch có hoặc không có Sucrose

78

Giải đông

Số tế bào

trứng không

đông lạnh

nuôi thành

thục

Số tế bào trứng

có hình thái bình

thường sau đông

lạnh-giải đông

Tế bào trứng thành thục

Số tế bào

trứng% (M ± SE)

Không sucrose 209 64 30,62c ± 0,45

Có sucrose 192 78 40,63b ± 0,44

Đối chứng

(Tế bào trứng không

đông lạnh)

209 156 74,64a ± 1,76

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái khác nhau là sai khác có ý

nghĩa (P<0,05)

Kết quả nghiên cứu thể hiện ở bảng 9 cho thấy việc sử dụng sucrose như

là chất bảo vệ lạnh không thấm màng trong quá trình giải đông có hiệu quả hơn

khi không sử dụng sucrose. Tỷ lệ tế bào trứng trâu chưa thành thục có khả năng

sống và thành thục in vitro trở lại sau đông lạnh giải đông của nhóm có sucrose

là cao hơn nhóm không sucrose (tương ứng: 40,63% và 30,62%; P<0,05; Hình

8). Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Karima và cs. (2010); theo họ

thì tỷ lệ thành thục in vitro của tế bào trứng trâu chưa thành thục ở nhóm thêm

đường Galactose là cao hơn so với nhóm không thêm Galactose.

79

Hình 7: Tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục bị vỡ màng sáng sau

giải đông (độ phóng đại 40 lần)

Sucrose là chất bảo vệ lạnh không thấm màng thường được sử dụng trong

quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng hoặc phôi. Trong môi trường đông lạnh

hoặc giải đông chúng hỗ trợ cho sự ổn định cấu trúc màng tế bào. Trong quá

trình thủy tinh hóa, succrose có bản chất là đại phân tử nên chúng có thể tạo nên

gradien nồng độ thông qua màng tế bào; nhờ đó giúp cho quá trình khử nước nội

bào của tế bào xảy ra hoàn thiện hơn. Thêm vào đó sucrose hoạt động giống như

đệm thẩm thấu để giảm shock thẩm thấu và những ảnh hưởng bất lợi của chất

bảo vệ lạnh đến tế bào trứng trong quá trình giải đông, qua đó giúp cho quá trình

đông lạnh – giải đông đạt được sự thành công.

Theo Kuleshova và cs. (2001) thì nồng độ các chất bảo vệ lạnh thẩm thấu

qua màng tế bào có thể thấp nhưng vẫn đảm bảo được hàm lượng các chất bảo

vệ lạnh trong dung dịch thủy tinh hóa vì chúng được thay thế bởi các chất bảo vệ

lạnh không thấm màng. Toth và cs. (1994) cũng báo cáo rằng tỷ lệ thành thục

của tế bào trứng người chưa thành thục sau đông lạnh – giải đông được cải thiện

với sự có mặt của đường trong dung dịch đông lạnh.

Quá trình giải đông là một phần đảm bảo cho sự thành công của quy trình

thủy tinh hóa, trong đó chất bảo vệ lạnh không thấm màng đóng vai trò rất quan

trọng trong quá trình giải đông. Trong suốt quá trình giải đông, nước được tạo ra

bởi sự tan chảy của đá một cách nhanh chóng dẫn đến sự giảm áp suất thẩm thấu

nội bào. Shock thẩm thấu có thể xảy ra nếu chất bảo vệ lạnh trong nội bào không

thể khuếch tán ra ngoài một cách nhanh chóng đủ để ngăn chặn sự tràn vào của

80

nước tự do, dẫn đến sự gẫy vỡ tế bào (Hình 7). Sự có mặt của các chất bảo vệ

lạnh không thấm màng trong dung dịch giải đông sẽ nâng cao được hiệu quả của

quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng và phôi.

Thêm vào đó việc cho tế bào trứng trâu sau giải đông vào dung dịch có

nồng độ sucrose ban đầu cao, tiếp theo là chuyển sang dung dịch có chứa nồng

độ sucrose thấp hơn là cần thiết. Bằng cách này các tế bào trứng được chuyển

trực tiếp từ dung dịch có chứa các chất bảo vệ lạnh vào dung dịch sucrose đẳng

trương với các chất bảo vệ lạnh. Nhờ vào tính không thấm màng của mình,

sucrose hỗ trợ quá trình loại bỏ hoàn toàn chất bảo vệ lạnh thấm màng ra khỏi tế

bào trứng, đồng thời giúp cho tế bào trứng không bị tổn thương về mặt cấu trúc

(co rút hoặc sưng phồng) trong quá trình giải đông.

Hình 8: Tế bào trứng trâu đầm lầy có hình thái bình thường sau đông lạnh

– giải đông sau nuôi in vitro 24 giờ (độ phóng đại 40 lần)

Hình 9: Tế bào trứng trâu đầm lầy bị tan rã lớp tế bào nang bao xung

quanh sau đông lạnh – giải đông (độ phóng đại 10 lần)

Mặc dù có sự cải thiện về tỷ lệ thành thục khi sử dụng chất bảo vệ lạnh

không thấm màng trong quá trình giải đông nhưng kết quả vẫn thấp hơn so với

đối chứng (tương ứng 40,63% so với 74,64%; P<0,05). Nguyên nhân có thể là

do trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng tế bào trứng chưa thành thục, sự

thành thục trở lại của tế bào trứng sau đông lạnh giải đông bị ảnh hưởng bởi quá

trình đông lạnh – giải đông. Quá trình này gây ra những tác động bất lợi cho sự

thành thục nhân và tế bào chất, đặc biệt là các tế bào nang bao xung quanh tế bào

trứng (Trounson, 1992). Các tế bào nang bao xung quanh tế bào trứng chưa

thành thục có vai trò quan trọng trong việc cung cấp các dưỡng chất phục vụ cho

81

quá trình trao đổi chất và thành thục nhân của tế bào trứng (Down và cs., 1988;

Pawshe và Totey., 1993). Nếu các tế bào nang bị tan rã sau đông lạnh - giải đông

thì tế bào trứng sẽ không thể hoàn thành được quá trình thành thục nhân và tế

bào chất của mình (Hình 9).

Kết quả được nêu ra ở mục 3.4.1; 3.4.2; 3.4.3; 3.4.4 của nghiên cứu này

cho thấy chất bảo vệ lạnh thấm màng Ethylene glycol có hiệu quả tốt hơn

DMSO, PROH và Gly trong quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy.

Việc sử dụng riêng lẻ Ethylene glycol ở nồng độ 6M và cách thức tiếp xúc 2

bước, thời gian tiếp xúc ở bước cuối cùng là 1 phút, kết hợp cùng với sucorose

trong quá trình giải đông sẽ mang lại hiệu quả bảo quản lạnh tốt cho tế bào trứng

trâu đầm lầy trong nghiên cứu này.

3.5. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào

trứng trâu

Có nhiều nguyên nhân làm giảm sự thành công của quá trình bảo quản

lạnh tế bào trứng như: sự hình thành tinh thể đá, các dạng tổn thương lạnh và độc

tính của các chất bảo vệ lạnh (Liebermann và cs., 2002). Yếu tố sinh lý chính

gây nên sự đứt gãy tế bào trong suốt quá trình đông lạnh – giải đông bao gồm: sự

hình thành tinh thể đá (Mazur và cs., 2005) và tổn thương do áp suất thẩm thấu

(Pedro và cs., 1997). Tuy nhiên những yếu tố này có thể được giảm thiểu bằng

những kỹ thuật bảo quản lạnh như phương pháp đông lạnh.

Theo Smorag và Gajda (1994); Vajta và Kuwayama (2006) trong suốt quá

trình thủy tinh hóa, sự hình thành tinh thể đá có thể được ngăn chặn nhờ vào tốc

độ đông lạnh-giải đông, nồng độ cao của chất bảo vệ lạnh trong dung dịch thủy

tinh hóa. Phương pháp thủy tinh hóa sử dụng tốc độ đông lạnh-giải đông nhanh

do đó không chỉ ngăn chặn sự hình thành tinh thể đá mà nó còn giúp cho tế bào

trứng có thể vượt qua vùng nhiệt độ nguy hiểm một cách nhanh chóng (15oC đến

82

– 5oC), nước sẽ đi ra ngoài tế bào và đông lạnh ở bên ngoài. Điều này giúp màng

tế bào và bộ khung xương tế bào không phải chịu những tổn thương lạnh.

Dụng cụ chứa mẫu trong các phương pháp thủy tinh hóa thường sử dụng

cọng rạ truyền thống 0,25ml. Vì cọng rạ truyền thống là tương đối nhỏ (đường

kính bên ngoài 2,0mm; chiều dài 13cm), nên khi nó được nhúng ngập trực tiếp

trong nitơ lỏng và giải đông thì tốc độ đông lạnh-giải đông đạt > 2500oC/phút

(Kuleshova và Shaw, 2000). Tốc độ đông lạnh-giải đông này là nhanh so với

phương pháp đông lạnh chậm truyền thống. Tuy nhiên đối với những tế bào nhạy

cảm với quá trình đông lạnh như tế bào trứng thì vẫn bị một số tổn thương nhất

định. Để giải quyết vấn đề này, các nhà nghiên cứu đã tìm cách tăng tốc độ đông

lạnh-giải đông thông qua việc giảm thiểu lượng dung dịch và vật chứa mẫu.

Phương pháp bảo quản lạnh này được một số nhà nghiên cứu đưa ra và gọi là

đông lạnh cực nhanh (Purohit và cs., 2012).

Đông lạnh cực nhanh và thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống đều sử

dụng chất bảo vệ lạnh ở nồng độ cao và thời gian tế bào trứng tiếp xúc với chất

bảo vệ lạnh ngắn. Điểm khác biệt lớn nhất giữa hai phương pháp này chính là vật

chứa mẫu và thể tích dung dịch chứa mẫu đông lạnh. Hiện nay có một số cách

thức đông lạnh cực nhanh được sử dụng như là: cọng rạ hở (Sharma và Purohit,

2008); cryotop (Kuwayama và cs., 2005; Nguyễn Văn Hạnh và cs., 2013), vi giọt

(Landa và Tepla, 1990; Liang và cs., 2012).... Mỗi nhóm kỹ thuật đều có những

ưu điểm riêng của mình. Thiết kế của thiết bị chứa mẫu và dung dịch bảo quản

lạnh ảnh hưởng đến tốc độ đông lạnh-giải đông.

Trong phương pháp cọng rạ hở, do lượng thể tích dung dịch thủy tinh hóa

có chứa mẫu được giảm thiểu (1-1,5μl), thêm vào đó độ dày của thành cọng rạ

khá mỏng nên nó làm tăng đáng kể tốc độ đông lạnh-giải đông. Tốc độ đông

lạnh-giải đông của phương pháp cọng rạ hở vào khoảng 22500oC/phút trong khi

83

ở phương pháp thủy tinh hóa cọng rạ truyền thống tốc độ này là 2500oC/phút.

Tốc độ giải đông nhanh cũng rất quan trọng để ngăn chặn những tổn thương tại

thời điểm giải đông (Isachenko và cs., 2005a; Isachenko và cs., 2005b; Seki và

Mazur, 2008). Ngoài ra do cấu tạo của vật chứa mẫu trong phương pháp đông

lạnh bằng cọng rạ hở mà quá trình thủy tinh hóa cũng như quá trình nạp và trục

xuất tế bào trứng ra khỏi cọng rạ hở có thể dễ dàng được quan sát bằng mắt

thường hoặc dưới kính hiển vi.

Bên cạnh việc giảm thiểu lượng thể tích dung dịch thủy tinh hóa xung

quanh tế bào trứng, các nhà nghiên cứu đã thiết lập một mối liên hệ trực tiếp

(không có lớp nhiệt cách điện) giữa dung dịch thủy tinh hóa và nitơ lỏng với mục

đích tăng tốc độ đông lạnh. Phương pháp đông lạnh này được gọi là thủy tinh

hóa vi giọt. Phương pháp vi giọt cũng làm tăng đáng kể tốc độ đông lạnh-giải

đông do tế bào trứng được tiếp xúc trực tiếp với nitơ lỏng và thể tích tối thiểu

của dung dịch thủy tinh hóa có chứa mẫu được giảm thiểu (5-20μl).

Phương pháp cọng rạ hở, thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, vi giọt

đều sử dụng nồng độ chất bảo vệ lạnh cao cùng với thiết bị bảo quản lạnh khác

nhau. Tuy nhiên do ở phương pháp đông lạnh bằng cọng rạ hở và vi giọt sử dụng

dụng cụ chứa dung dịch thủy tinh hóa có mẫu là hở, lại tiếp xúc trực tiếp với

dung dịch nitơ lỏng nên dễ dẫn đến sự nhiễm khuẩn trở lại ở quá trình nuôi tiếp

theo sau đông lạnh-giải đông (Tedder và cs., 1995; Fountain và cs., 1997).

Ngược lại mặc dù tốc độ đông lạnh-giải đông là không cao bằng phương pháp

cọng rạ hở và vi giọt nhưng thiết bị chứa mẫu của phương pháp thủy tinh hóa

trong cọng rạ truyền thống là kín nên hạn chế được sự nhiễm khuẩn sau đó. Để

giải quyết được vấn đề này, có thể lọc bỏ nitơ lỏng bằng màng lọc vô trùng

nhưng điều này làm cho quá trình đông lạnh trở nên phức tạp và khó thực hiện

(Vajta và cs., 1998a; Lane và cs., 1999).

84

Để đánh giá được ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả

đông lạnh tế bào trứng trâu, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng ba phương

pháp đông lạnh đang được sử dụng rộng rãi trong bảo quản lạnh tế bào trứng là:

thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, thủy tinh hóa bằng vi giọt và thủy tinh

hóa bằng cọng rạ hở. Hiệu quả của ba phương pháp đông lạnh: thủy tinh hóa

bằng cọng rạ truyền thống, thủy tinh hóa trong cọng rạ hở và thủy tinh hóa vi

giọt được đánh giá dựa trên số lượng, chất lượng và khả năng phát triển in vitro

tiếp theo của tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông.

3.5.1. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến số lượng tế bào trứng trâu

thu được sau đông lạnh –giải đông

Tỷ lệ tế bào trứng thu được sau đông lạnh-giải đông trong nghiên cứu của

chúng tôi ở mỗi nhóm thí nghiệm dao động từ 84,66% đến 93,75% (Bảng 10).

Kết quả này cũng phù hợp với Nowshari và cs. (1994); Men và cs. (2002);

Atabay và cs. (2004). Theo các tác giả này thì tỷ lệ tế bào trứng thu được sau

đông lạnh-giải đông ở các loài khác nhau là từ 80% - 100%.

Việc mất tế bào trứng trong quá trình đông lạnh-giải đông cũng có một vài

báo cáo đưa ra (Dhali và cs., 2000a; Luna và cs., 2001; Isachenko và cs., 2005b;

Nguyễn Thị Thương Huyền và cs., 2012; 2014; Liang 2010). Có nhiều nguyên

nhân như: tế bào trứng bị dính vào cọng rạ vì bề mặt cọng rạ rạn hoặc ghồ ghề

(hiện tượng này thường xảy ra trong quá trình giải đông) hoặc tế bào trứng bị tan

rã trong quá trình đông lạnh.

Tỷ lệ tế bào trứng trâu thu được sau đông lạnh-giải đông ở nhóm cọng rạ

truyền thống là thấp nhất so với nhóm cọng rạ hở và vi giọt (tương ứng 84,66%;

so với 93,75% và 90,32%; P<0,05); sự khác nhau giữa nhóm cọng rạ hở và vi

giọt là không có ý nghĩa (P>0,05). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với

85

báo cáo của Hammam và El-Shahat (2005), Misha và cs. (2012), Nguyễn Thị

Thương Huyền và cs. (2014).

Bảng 10: Số lượng tế bào trứng trâu thu được sau đông lạnh- giải đông

Phương phápSố tế bào trứng

đông lạnh

Tế bào trứng thu được sau đông lạnh-

giải đông

Số tế bào trứng % (M ± SE)

Cọng rạ truyền thống 378 320 84,66b ± 2,84

Cọng rạ hở 368 345 93,75a ± 1,44

Vi giọt 372 336 90,32a ± 2,32

Ghi chú: Các giá trị có chữ cái khác nhau trong cùng một cột là sai khác có ý

nghĩa (P<0,05)

Trong quá trình đông lạnh – giải đông cọng rạ truyền thống dễ bị nổ, vỡ

hoặc rạn nứt do sự thay đổi áp suất khi chúng được nhúng ngập trong nitơ lỏng

hoặc bể ấm (giải đông). Nguyên nhân có thể là do thành cọng rạ dày nên cọng rạ

dễ bị vỡ và mất mẫu trong quá trình đông lạnh – giải đông. Sự thay đổi áp suất

trong cọng rạ khi được nhúng ngập trong nitơ lỏng trong quá trình đông lạnh

hoặc khi đưa vào bể ấm 37oC trong quá trình giải đông có thể làm cho cọng rạ bị

nứt hoặc vỡ. Để hạn chế được điều này, trong phương pháp thủy tinh hóa bằng

cọng rạ truyền thống cọng rạ trước khi được nhúng ngập thẳng vào trong nitơ

lỏng sẽ được để trên hơi nitơ lỏng ; hoặc trong quá trình giải đông trước khi

chuyển cọng rạ vào bể ấm 37oC cọng rạ sẽ được để trong không khí 5-10 giây.

86

Tuy nhiên do sự thay đổi nhiệt độ của hơi nitơ lỏng và không khí xung quanh mà

vẫn xảy ra hiện tượng nổ, vỡ hoặc rạn nứt cọng rạ trong quá trình giải đông.

Kết quả ở bảng 10 cho thấy tỷ lệ thu hồi tế bào trứng sau đông lạnh – giải

đông ở nhóm cọng rạ hở là cao hơn so với nhóm cọng rạ truyền thống và vi giọt.

Kết quả này là phù hợp với báo cáo của Sharma và cs. (2010). Theo các tác giả

này, tỷ lệ thu hồi tế bào trứng sau đông lạnh - giải đông ở phương pháp đông

lạnh bằng cọng rạ hở là cao hơn cọng rạ truyền thống trong cả hai trường hợp sử

dụng chất bảo vệ lạnh Ethylene glycol hoặc Propylene glycol. Tuy nhiên tỷ lệ tế

bào trứng thu hồi sau đông lạnh – giải đông của các tác giả này (98,04%) là cao

hơn so với kết quả nghiên cứu của chúng tôi (93,75%).

Sự khác nhau giữa kết quả nghiên cứu có thể là do Sharma và cs. (2010)

sử dụng tế bào trứng trâu thành thục, còn trong nghiên cứu này, tôi sử dụng tế

bào trứng trâu chưa thành thục để đông lạnh. Mặc dù vậy, tỷ lệ thu tế bào trứng

trâu sau đông lạnh – giải đông của chúng tôi trong phương pháp thủy tinh hóa

bằng cọng rạ hở (93,75%) là cao hơn so với Hammam và El-Shahat (2005)

(70,0%), Misha và cs. (2012) (81,35%) khi cùng sử dụng cọng rạ hở làm vật

chứa mẫu. Sự khác nhau này có thể là do việc sử dụng các chất bảo vệ lạnh khác

nhau trong quá trình đông lạnh. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng

Ethylene glycol là chất bảo vệ lạnh, trong khi đó Hammam và El-Shahat (2005)

sử dụng Glycerol, Misha và cs. (2012) sử dụng hỗn hợp Ethylene glycol và

DMSO là chất bảo vệ lạnh trong quá trình đông lạnh.

3.5.2. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến chất lượng tế bào trứng

trâu thu được sau đông lạnh – giải đông

Kết quả đánh giá ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến chất lượng tế

bào trứng trâu thu được sau đông lạnh – giải đông được thể hiện ở bảng 11.

Bảng 11: Chất lượng tế bào trứng trâu thu được sau đông lạnh-giải đông

87

Phương pháp

Số tbt thu

được sau

ĐL - GĐ

Tế bào trứng có hình

thái bình thường thu

được sau ĐL - GĐ

Tế bào trứng có hình

thái không bình thường

thu được sau ĐL - GĐ

Số tế bào

trứng% (M ± SE)

Số tế bào

trứng% (M ± SE)

Cọng rạ truyền thống 320 265 82,81b ± 2,48 55 17,19a ± 2,48

Cọng rạ hở 345 315 91,3a ± 1,73 30 8,7b ± 1,73

Vi giọt 336 302 89,88a ± 2,73 34 10,12b ± 2,73

Ghi chú: Các giá trị có chữ cái khác nhau trong cùng một cột là sai khác có ý

nghĩa (P<0,05). Tế bào trứng: tbt. Đông lạnh-giải đông: ĐL-GĐ

Kết quả ở bảng 11 cho thấy, tỷ lệ tế bào trứng có hình thái bình thường thu

được sau đông lạnh-giải đông dao động từ 82,81% đến 91,3% tùy thuộc vào

phương pháp đông lạnh.

Kết quả trong nghiên cứu này là phù hợp với một số báo cáo về đông lạnh

tế bào trứng. Theo Dhali và cs. (2000a) tỷ lệ tế bào trứng trâu chưa thành thục có

hình thái bình thường sau đông lạnh - giải đông dao động giữa 88% - 98%. Còn

theo Hong và cs. (1999) thì tỷ lệ tế bào trứng người chưa thành thục có hình thái

bình thường sau đông lạnh-giải đông là 84%.

88

Hình 10: Tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục có hình thái không

bình thường sau đông lạnh – giải đông (độ phóng đại 10 lần)

Tỷ lệ tế bào trứng thu được có hình thái bình thường (Hình 11) ở nhóm

cọng rạ hở và vi giọt đều cao hơn (P<0,05) so với cọng rạ truyền thống cho thấy

phương pháp thủy tinh hóa sử dụng cọng rạ hở và vi giọt có hiệu quả hơn so với

phương pháp sử dụng cọng rạ truyền thống. Mặc dù cả ba phương pháp này đều

sử dụng một loại môi trường pES, VS với cùng một nồng độ chất bảo vệ lạnh

nhưng chất lượng tế bào trứng thu được sau đông lạnh – giải đông ở nhóm cọng

rạ truyền thống vẫn kém hơn nhóm cọng rạ hở và vi giọt. Nguyên nhân của sự

khác biệt này có thể là do trong phương pháp thủy tinh hóa bằng cọng rạ hở và vi

giọt, vật chứa mẫu có cấu tạo ưu thế hơn nên đã làm tăng tốc độ đông lạnh-giải

đông, nhờ đó tế bào trứng vượt qua được vùng nhiệt độ nguy hiểm, giảm thiểu

những tác động nguy hiểm do độc tố của chất bảo vệ lạnh và áp suất thẩm thấu

gây ra (Yavin và Arav, 2001).

Hình 11: Tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục có hình thái bình

thường sau đông lạnh – giải đông (độ phóng đại 10 lần)

Theo Dinnyes và cs. (2000) cọng rạ truyền thống có thành cọng rạ dày vì

vậy nó tạo ra lớp cách nhiệt giữa môi trường chứa tế bào trứng và nitơ lỏng nên

làm giảm tốc độ đông lạnh, quá trình thủy tinh hóa có thể không hoàn toàn nên

ảnh hưởng đến chất lượng của tế bào trứng sau đông lạnh – giải đông.

Trong phương pháp cọng rạ hở đường kính bên trong và độ dày của thành

cọng rạ hở được giảm đi đáng kể so với cọng rạ truyền thống (tương ứng từ

89

1,7mm xuống 0,8mm và từ 0,15mm xuống 0,07mm). Còn trong phương pháp vi

giọt, vật chứa mẫu là dạng vi giọt chỉ gồm dung dịch VS và tế bào trứng; giữa

dung dịch chứa mẫu và nitơ lỏng không có lớp cách nhiệt do chúng được tiếp

xúc trực tiếp; do đó tốc độ đông lạnh-giải đông ở hai phương pháp này được gia

tăng đáng kể so với phương pháp thủy tinh hóa bằng cọng rạ truyền thống.

3.5.3. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến khả năng phát triển in

vitro tiếp theo của tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông

Tế bào trứng trâu có hình thái bình thường sau đông lạnh-giải đông (Hình

11) được đánh giá khả năng sống và phát triển tiếp theo thông qua quá trình nuôi

thành thục in vitro, khả năng tạo phôi sau khi được tiến hành thụ tinh trong ống

nghiệm (Bảng 12). Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ sử dụng những tế bào

trứng trâu sau đông lạnh – giải đông đủ tiêu chuẩn thụ tinh (có khả năng thành

thục) để đánh giá khả năng tạo phôi in vitro tiếp theo. Tế bào trứng đủ tiêu chuẩn

thụ tinh là tế bào trứng sau nuôi thành thục in vitro có lớp tế bào nang giãn nở,

khối tế bào chất đồng đều.

Kết quả ở bảng 12 cho thấy tỷ lệ tế bào trứng đủ tiêu chuẩn thụ tinh

(30,94%), phân chia (18,29%) và tạo phôi dâu, phôi nang (2,44%) của tế bào

trứng trâu chưa thành thục sau đông lạnh-giải đông (Hình 12, hình 13, hình 14) ở

nhóm thủy tinh hóa bằng cọng rạ truyền thống vẫn thấp hơn so với hai nhóm

thủy tinh hóa bằng cọng rạ hở và thủy tinh hóa bằng vi giọt (P<0,05). Mặc dù sự

sai khác về tỷ lệ tế bào trứng trâu phân chia giữa nhóm thủy tinh hóa bằng cọng

rạ hở và thủy tinh hóa bằng vi giọt trong nghiên cứu của chúng tôi là không có ý

nghĩa (tương ứng là 37,98% và 30,83%; P>0,05); nhưng sự sai khác về tỷ lệ tạo

phôi dâu, phôi nang giữa hai nhóm này là có ý nghĩa (tương ứng là 10,08% so

với 3,31%; P<0,05).

90

Bảng 12: Khả năng phát triển in vitro tiếp theo của tế bào trứng trâu sau đông lạnh-giải đông

Phương pháp

Số tế bào trứng

có hình thái bình

thường sau ĐL –

GĐ và tế bào

trứng không

đông lạnh được

nuôi in vitro

Tế bào trứng đủ tiêu chuẩn

dùng cho thụ tinh

Tế bào trứng phân chia Phôi dâu, phôi nang

Số tế bào

trứng% (M ± SE)

Số tế bào

trứng% (M ± SE)

Số phôi dâu,

phôi nang% (M ± SE)

Cọng rạ truyền

thống265 82 30,94c ± 2,68 15 18,29c ± 3,26 2 2,44c ± 4,6

Cọng rạ hở 315 129 40,95b ± 1,33 49 37,98b ± 2,52 12 10,08b ± 3,9

Vi giọt 302 120 39,73b ± 1,7 37 30,83b ± 2,06 4 3,31c ± 3,56

Đối chứng

(Tế bào trứng

không đông lạnh)

351 263 74,93a ± 1,54 205 77,95a ± 2,24 78 29,66a ± 1,66

Ghi chú: Các giá trị có chữ cái khác nhau trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa (P<0,05)

95

Hình 12: Tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục có hình thái bình

thường sau đông lạnh – giải đông bằng phương pháp cọng rạ hở sau nuôi in

vitro 24 giờ (độ phóng đại 5 lần)

Kết quả của nghiên cứu này cũng phù hợp với báo cáo của Sharma và cs.

(2010). Các tác giả này cũng cho rằng khi sử dụng cọng rạ hở là vật chứa mẫu

trong quá trình đông lạnh kết hợp với chất bảo vệ lạnh là Ethylene glycol cho tỷ

lệ tế bào trứng có hình thái bình thường sau đông lạnh – giải đông phát triển đến

giai đoạn phôi nang là cao hơn so với cọng rạ truyền thống. Tương tự như vậy,

khi nghiên cứu bảo quản lạnh tế bào trứng bò, Vajta và cs. (1998b) cũng nhận

thấy rằng khả năng phát triển của tế bào trứng bò sau đông lạnh – giải đông có

thể được cải thiện khi sử dụng cọng rạ hở so với cọng rạ truyền thống.

Trong nghiên cứu này tỷ lệ tế bào trứng đủ tiêu chuẩn thụ tinh, phân chia

cũng như tỷ lệ tạo phôi dâu, nang của tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông

ở nhóm thủy tinh hóa bằng cọng rạ hở là cao hơn so với hai nhóm còn lại.

Nguyên nhân có thể là do ở trong phương pháp cọng rạ hở lượng thể tích được

giảm thiểu đáng kể (1-2μl so với 15-20μl đối với vi giọt và 150μl đối với cọng rạ

truyền thống). Việc giảm thể tích dung dịch thủy tinh hóa chứa mẫu đông lạnh

làm tăng tốc độ đông lạnh-giải đông; nhờ đó làm giảm đi những ảnh hưởng bất

lợi cho tế bào trứng.

96

Hình 13: Phôi trâu 2 tế bào ở ngày thứ 2 sau thụ tinh từ tế bào trứng trâu

đầm lầy chưa thành thục có hình thái bình thường sau đông lạnh – giải

đông (độ phóng đại 40 lần)

Đầu của cọng rạ hở được thiết kế với đường kính nhỏ và thành của cọng rạ

hở mỏng, do đó tế bào trứng được giữ trong cọng rạ hở với lượng thể tích rất nhỏ

(1-2µl), nhờ vậy tốc độ đông lạnh-giải đông nhanh hơn so với cọng rạ truyền

thống (20 000oC/phút so với 2500oC/phút) (Rall và Fahy, 1985; Vajta và cs.,

1998a). Tốc độ đông lạnh – giải đông nhanh giúp cho tế bào trứng vượt qua

được vùng nhiệt độ nguy hiểm từ 15oC đến -15oC (Martino và cs., 1996). Thêm

vào đó, tế bào trứng trong dung dịch thủy tinh hóa được giải đông nhanh giúp

cho chất bảo vệ lạnh được pha loãng và loại bỏ nhanh hơn. Điều này làm giảm

thời gian tế bào trứng phải tiếp xúc với nhiệt độ và nồng độ chất bảo vệ lạnh

không thích hợp (Sharma và Purohit, 2008).

Hình 14: Phôi nang trâu in vitro tạo ra từ tế bào trứng trâu đầm lầy chưa

thành thục có hình thái bình thường sau đông lạnh – giải đông (độ phóng

đại 40 lần)

Trong phương pháp thủy tinh hóa bằng cọng rạ truyền thống, cọng rạ sẽ

được giải đông trong nước ấm và sau đó được cắt đầu. Việc làm này khiến tế bào

trứng mất nhiều thời gian hơn để vượt qua các điều kiện có ảnh hưởng bất lợi

đến khả năng sống và phát triển tiếp theo của chúng sau đông lạnh - giải đông

(Sharma và Purohit, 2008).

Subramaniam và cs. (1990) đã báo cáo rằng việc để cọng rạ trong không

khí trước khi cho vào bể ấm là rất quan trọng trong việc ngăn chặn sự phá vỡ

97

màng sáng trong quá trình giải đông. Nhưng Yunus và Ayhan. (2005) lại cho

rằng mặc dù cọng rạ được để trong không khí 5 giây, tế bào trứng vẫn bị đứt gãy

màng sáng. Nguyên nhân có thể là do sự thủy tinh hóa trở lại trong quá trình giải

đông với tốc độ đông lạnh – giải đông trong cọng rạ truyền thống 0,25ml. Chính

vì thế phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống đối với tế bào trứng

trâu không mang lại kết quả như mong đợi, hơn thế nữa còn làm cho tế bào trứng

bị một số tổn thương lạnh.

Phương pháp thủy tinh hóa bằng vi giọt cũng làm tăng tốc độ đông lạnh –

giải đông bằng cách giảm bớt lượng thể tích dung dịch thủy tinh hóa chứa mẫu

(15-20μl) và loại bỏ lớp cách nhiệt. Đây là phương pháp thủy tinh hóa đơn giản

nhất bởi vì các giọt dung dịch thủy tinh hóa chứa tế bào trứng được cho trực tiếp

vào nitơ lỏng. Liang và cs. (2011) đã báo cáo về tỷ lệ sống và tạo phôi nang của

tế bào trứng trâu thành thục sau đông lạnh – giải đông tương ứng là hơn 90% và

15% khi được thủy tinh hóa bằng phương pháp vi giọt. Trong nghiên cứu này

mặc dù tỷ lệ thành thục in vitro trở lại và tỷ lệ phân chia của tế bào trứng trâu sau

thủy tinh hóa bằng vi giọt và cọng rạ hở là không khác nhau nhưng tỷ lệ tạo phôi

dâu, nang của nhóm cọng rạ hở (10,08%) là cao hơn so với vi giọt (3,31%).

Mặc dù có ưu thế hơn so với phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ

truyền thống nhưng khả năng phân chia, tạo phôi của tế bào trứng trâu chưa

thành thục sau đông lạnh-giải đông ở phương pháp vi giọt vẫn kém hơn so với

phương pháp cọng rạ hở. Nguyên nhân có thể là do lượng thể tích dung dịch

chứa mẫu trong phương pháp thủy tinh hóa vi giọt vẫn lớn hơn so với cọng rạ hở

(15-20µl so với 1-2µl). Thêm vào đó khi giọt dung dịch VS có chứa tế bào trứng

được thả thẳng vào trong nitơ lỏng sẽ hình thành xung quanh nó một lớp áo

khoác hơi. Giải thích cho hiện tượng này khá đơn giản: điểm sôi của nitơ lỏng là

-196oC, chính vì thế bất kỳ một vật gì ấm hơn nó và liên kết với nó sẽ gây ra hiện

98

tượng sôi và bốc hơi mạnh trên bề mặt của nó, do đó sẽ hình thành xung quanh

vi giọt một lớp áo khoác hơi bao xung quanh nó. Dạng áo khoác hơi này không

chỉ có chức năng như một lớp cách nhiệt mà còn làm chậm quá trình chìm xuống

nitơ lỏng của giọt dung dịch VS này, do đó nó cũng làm giảm tốc độ đông lạnh

và ảnh hưởng đến hiệu quả đông lạnh.

Theo kết quả thể hiện ở bảng 12, mặc dù phương pháp thủy tinh hóa bằng

cọng rạ hở cho hiệu quả cao hơn so với phương pháp cọng rạ truyền thống và vi

giọt nhưng tỷ lệ tế bào trứng đủ tiêu chuẩn thụ tinh, phân chia, tạo phôi của

nhóm cọng rạ hở vẫn thấp hơn so với đối chứng (tương ứng là 74,93%; 77,95%;

29,66%; P<0,05). Nguyên nhân có thể là do tế bào trứng mà chúng tôi sử dụng

trong nghiên cứu này là các tế bào trứng ở giai đoạn chưa thành thục.

Tỷ lệ thụ tinh, phát triển của phôi từ các tế bào trứng chưa thành thục sau

đông lạnh – giải đông thấp là do nhiều nguyên nhân. Bản thân tế bào trứng có

cấu trúc phân tử phức tạp, có một số cấu trúc rất nhạy cảm vởi nhiệt độ thấp, áp

suất thẩm thấu như là trục chính của thoi vô sắc trong quá trình giảm phân (Fuku

và cs., 1995). Các nghiên cứu trước đây cho thấy, tế bào trứng chưa thành thục

khi tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh hoặc trải qua quá trình đông lạnh sẽ làm tăng số

lượng tế bào trứng có thoi vô sắc, nhiễm sắc thể và sự phân bố của vi sợi không

bình thường khi được nuôi thành thục in vitro sau đông lạnh – giải đông. Những

bất thường về mặt tế bào học có thể ảnh hưởng không tốt đến sự phát triển của

phôi sau khi thụ tinh (Kim và cs., 2007).

Dựa trên kết quả của mục 3.5.1; 3.5.2; 3.5.3 cho thấy khi đông lạnh tế bào

trứng trâu đầm lầy Bubalus bubalis bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng

rạ hở mang lại hiệu quả tốt hơn so với phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ

truyền thống và vi giọt. Thủy tinh hóa bằng cọng rạ hở là một phương pháp đông

lạnh đơn giản, hiệu quả trong quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng trâu mà không

99

ảnh hưởng tiêu cực đến tỷ lệ tạo phôi dâu, phôi nang của tế bào trứng trâu đầm

lầy sau đông lạnh – giải đông.

3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro tế bào trứng đến hiệu quả đông

lạnh tế bào trứng trâu

Hiện nay trên thế giới đã có báo cáo về việc tạo ra được con non từ tế bào

trứng thủy tinh hóa ở: chuột (Edashige và cs., 2003), người (Katayama và cs.,

2003), bò (Luna và cs., 2001; Albarracin và cs., 2005a,b), lợn (Huang và Holtz,

2002), ngựa (Hurt và cs., 2000) và trâu (Dhali và cs., 2000a, b; Hufana và cs.,

2004). Các tác giả này đã tìm hiểu và đánh giá những điều kiện tối ưu để duy trì

khả năng sống của tế bào trứng sau đông lạnh – giải đông (Vajta và Kuwayama,

2006). Các nhà nghiên cứu nhận thấy các giai đoạn phát triển khác nhau của tế

bào trứng có ảnh hưởng đến khả năng sống sau đông lạnh-giải đông đối với tế

bào trứng của động vật có vú (Miyake và cs., 1993; Men và cs., 2002; Sharma và

Loganathasamy., 2007; Magnusson và cs., 2008).

Quá trình phát triển của tế bào trứng để đạt tới giai đoạn thành thục kéo

dài từ giai đoạn túi mầm (Magnusson và cs., 2008) đến giai đoạn phá vỡ túi mầm

bao gồm: tiền kỳ giữa I (prometaphase I), kỳ giữa I (metaphase I), kỳ sau I

(anaphase I), kỳ cuối I (telophase I) (Barnes và cs., 1997) cho đến hết giai đoạn

thành thục (metaphase II) (MII) (Men và cs., 2002); có ảnh hưởng khác nhau đến

quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng. Sự nhạy cảm của tế bào trứng trong quá

trình bảo quản lạnh có liên quan đến các giai đoạn phát triển của tế bào trứng

trong quá trình này (Lane và cs., 1999). Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để

xác định giai đoạn phát triển tế bào tối ưu cho quá trình bảo quản lạnh tế bào

trứng, nhưng vẫn chưa có đáp số chung về vấn đề này.

Fuku và cs. (1995); Le Gal. (1996) cho rằng 9-16% tế bào trứng bị tổn

thương trong quá trình bảo quản lạnh không liên quan đến các thời điểm nuôi

100

thành thục khác nhau. Thậm chí theo Hurt và cs. (2000); Le Gal và Massip.

(1999) giai đoạn phát triển của tế bào trứng không ảnh hưởng đến khả năng sống

của tế bào trứng sau đông lạnh – giải đông. Tế bào trứng là dạng tế bào có cấu

trúc tương đối phức tạp, trong đó có một số thành phần tế bào có tính nhạy cảm

với nhiệt độ (Magistrini và cs., 1980), áp suất thẩm thấu (McWilliam và cs.,

1995). Quá trình đông lạnh làm ảnh hưởng đến trục chính phân bào giảm nhiễm

(Pickering và Johnson, 1987) và tế bào hạt (Vincent và Johnson, 1992). Sự khử

polyme của trục chính phân bào giảm nhiễm dẫn đến hiện tượng dị bội (Kola và

cs., 1988) và việc giải phóng các tế bào hạt dẫn đến sự tổn thương màng sáng

(Vincent và Johnson, 1992), do đó nó sẽ ảnh hưởng đến khả năng thụ tinh cũng

như phát triển tiếp theo của tế bào trứng sau đông lạnh – giải đông.

Sự khác nhau giữa các kết quả nghiên cứu về vấn đề này khiến cho việc

lựa chọn giai đoạn phát triển tế bào tối ưu cho quá trình bảo quản lạnh tế bào

trứng vẫn còn nhiều tranh cãi. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá ảnh

hưởng của thời gian nuôi in vitro đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu dựa

vào chất lượng và khả năng phát triển in vitro (khả năng thành thục trở lại, thụ

tinh, tạo phôi) của tế bào trứng sau đông lạnh – giải đông.

3.6.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro tế bào trứng đến chất lượng tế

bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông

Trong nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ tế bào trứng có hình thái bình thường

thu được sau đông lạnh-giải đông dao động từ 91,3% đến 98,31% tùy thuộc vào

giai đoạn nuôi thành thục (Bảng 13). Theo Dhali và cs. (2000a) tỷ lệ tế bào trứng

trâu chưa thành thục có hình thái bình thường sau đông lạnh-giải đông dao động

giữa 88% và 98% với nồng độ chất bảo quản lạnh, thời gian tiếp xúc khác nhau.

Bảng 13: Tế bào trứng trâu đầm lầy có hình thái bình thường sau đông lạnh

– giải đông ở các thời gian nuôi in vitro khác nhau

101

Thời gian

nuôi in vitro

Sô tế bào trứng thu

được sau đông lạnh-

giải đông

Tế bào trứng bị tổn

thương sau đông lạnh-

giải đông

Tế bào trứng có hình thái

bình thường sau đông

lạnh-giải đông

Số tế bào

trứng% (M ± SE)

Số tế bào

trứng% (M ± SE)

0 giờ 345 30 8,7a ± 1,73 315 91,3b ± 1,73

6 giờ 337 26 7,72a ± 1,24 311 92,28b ± 1,24

12 giờ 332 27 8,13a ± 1,16 305 91,87b ± 1,16

18 giờ 351 8 2,28b ± 0,23 343 97,72a ± 0,23

24 giờ 354 6 1,69b ± 0,29 348 98,31a± 0,29

Ghi chú: Các giá trị có chữ cái khác nhau trong cùng một cột là sai khác có ý

nghĩa (P<0,05)

Kết quả thể hiện ở bảng 13 là cao hơn so với báo cáo của Sharma và

Loganathasamy (2007); Mahmoud và cs. (2010a). Theo Sharma và

Loganathasamy (2007) tỷ lệ tế bào trứng có hình thái bình thường thu được sau

đông lạnh – giải đông ở các nhóm 0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ và 24 giờ dao động

102

từ 84 – 91%. Còn theo Mahmoud và cs. (2010a) tỷ lệ tế bào trứng thủy tinh hóa

ở giai đoạn nuôi 0 giờ, 6 giờ và 24 giờ có hình thái bình thường sau đông lạnh –

giải đông tương ứng đạt 81,2%; 82,4% và 85,2%.

Sự khác nhau giữa các nghiên cứu có thể là do phương pháp đông lạnh

cũng như chất bảo vệ lạnh sử dụng trong mỗi nghiên cứu. Sharma và

Loganathasamy (2007), sử dụng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền

thống với chất bảo vệ lạnh là PROH. Mahmoud và cs. (2010a) cũng sử dụng

phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống nhưng dạng chất bảo vệ

lạnh là hỗn hợp EG + DMSO. Còn trong nội dung nghiên cứu này chúng tôi sử

dụng phương pháp thủy tinh hóa bằng cọng rạ hở kết hợp với chất bảo vệ lạnh là

Ethylene glycol (EG). Mà theo kết quả nghiên cứu của chúng tôi ở mục 4.3 và

4.4 việc sử dụng phương pháp thủy tinh hóa bằng cọng rạ hở với chất bảo vệ

lạnh là EG cho hiệu quả bảo quản lạnh tế bào trứng trâu tốt hơn.

Kết quả trong nghiên cứu này cho thấy không có sự khác nhau giữa các

nhóm 0 giờ, 6 giờ, 12 giờ (tương ứng 91,3%; 92,28%, 91,87%, P>0,05) và giữa

nhóm 18giờ, 24 giờ (97,72%, 98,31%, P>0,05) về tỷ lệ tế bào trứng có hình thái

bình thường thu được sau đông lạnh – giải đông. Tỷ lệ tế bào trứng trâu có hình

thái bình thường sau đông lạnh – giải đông ở nhóm 24 giờ trong nghiên cứu này

là cao hơn so với các nhóm còn lại (P<0,05). Kết quả này tương tự các báo cáo

của Lim và cs. (1999); Arav và cs. (2000); Hochi và cs. (2000); Mahmoud và cs.

(2010a); Sharma và Loganathasamy (2007), nhưng lại ngược so với kết quả của

Martino và cs. (1996); Albarracin và cs. (2005a, b). Theo Martino và cs. (1996);

Albarracin và cs. (2005a, b) tỷ lệ tế bào trứng thành thục có hình thái bình

thường sau đông lạnh-giải đông là thấp hơn so với tế bào trứng chưa thành thục.

3.6.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro tế bào trứng đến khả năng thành

thục in vitro của tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông

103

Kết quả thể hiện ở bảng 14 cho thấy giữa các nhóm thủy tinh hóa thì nhóm

nuôi 18 giờ có tỷ lệ thành thục cao hơn so với các nhóm còn lại (P<0,05). Tỷ lệ

tế bào trứng đạt tới giai đoạn thành thục nhân (MII) của nhóm đối chứng là cao

hơn so với các nhóm thủy tinh hóa (P<0,05), tuy nhiên giữa nhóm 18 giờ

(69,97%) và đối chứng (74,93%) là không khác nhau (P>0,05).

Nguyên nhân có thể là do ở giai đoạn nuôi 18 giờ tế bào trứng có nhân chủ

yếu ở giai đoạn kỳ cuối I và giai đoạn này diễn ra rất nhanh để tế bào trứng hoàn

thành xong quá trình thành thục nhân của mình. Vì vậy tế bào trứng ở nhóm 18h

sau đông lạnh – giải đông có khả năng hoàn thiện quá trình thành thục nhân tốt

hơn so với các nhóm khác.

Sharma và Loganathasamy (2007); Mahmoud và cs. (2010a), cũng cho

rằng tỷ lệ tế bào trứng thành thục phụ thuộc vào thời gian chúng được nuôi trong

môi trường nuôi cho tới khi được thủy tinh hóa. Tế bào trứng có thời gian nuôi

thành thục in vitro ít trước khi thủy tinh hóa có tỷ lệ thành thục in vitro trở lại

sau đông lạnh – giải đông thấp là do nhiều nguyên nhân.

Quá trình thủy tinh hóa tế bào trứng chưa thành thục sẽ làm mất đi sự

nguyên vẹn của cấu trúc tế bào nang, tạo ra nhiều những lỗ thủng tế bào chất hơn

là tế bào trứng đã thành thục (Fuku và cs., 1995). Thêm vào đó quá trình thủy

tinh hóa có thể làm tổn thương tế bào chất và ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp

protein (Le Gal, 1996), qua đó làm giảm khả năng thành thục trở lại của tế bào

trứng chưa thành thục sau đông lạnh-giải đông.

Bảng 14. Khả năng thành thục in vitro sau đông lạnh-giải đông của tế bào

trứng trâu được thủy tinh hóa tại một số thời điểm nuôi khác nhau

104

Thời gian nuôi in

vitro

Số tế bào trứng

có hình thái

bình thường sau

đông lạnh-giải

đông

Tế bào trứng thành thục Tế bào trứng không

thành thục

Số tế bào

trứng% (M ± SE)

Số tế bào

trứng% (M ± SE)

0h 315 129 40,95c ± 1,33 186 59,05 ± 1,33

6h 311 127 40,84c ± 0,9 184 59,16 ± 0,9

12h 305 166 54,43b ± 0,71 139 45,57 ± 0,71

18h 343 240 69,97a ± 1,27 103 30,03 ± 1,27

Đối chứng

(Tế bào trứng

không đông lạnh)

351 263 74,93a ± 1,54 88 25,07 ± 1,54

Ghi chú: Các giá trị có chữ cái khác nhau trong cùng một cột là sai khác có ý

nghĩa (P<0,05)

Các tế bào nang có vai trò liên kết nội bào giữa tế bào trứng và môi trường

nuôi, ảnh hưởng đến sự thành thục của tế bào trứng (Lim và cs., 1992; Fuku và

cs., 1995, Le Gal, 1996). Thêm vào đó cầu nối giữa tế bào trứng và tế bào nang

105

có vai trò quan trọng trong quá trình thành thục vì nó cung cấp cơ chất dinh

dưỡng có tầm quan trọng trong suốt quá trình thụ tinh in vitro. Một số các cơ

chất của quá trình trao đổi chất là cần thiết cho sự thành thục của tế bào trứng,

giống như choline, uridine, inositol và có thể vào tế bào trứng thông qua sự kết

nối nội bào hoặc có thể truyền trực tiếp thông qua các điểm nối phức hợp (Chian

và cs., 1994).

Hơn 85% quá trình trao đổi chất được thông qua tế bào nang và đưa vào tế

bào trứng thông qua sự kết nối nội bào. Trong quá trình đông lạnh – giải đông

các tế bào trứng chưa thành thục, các tế bào nang dễ bị tổn thương và phân rã,

điều này sẽ làm ảnh hưởng đến sự thành thục trở lại của tế bào trứng chưa thành

thục sau đông lạnh – giải đông.

3.6.3. Khả năng phát triển in vitro tiếp theo của tế bào trứng trâu (được thủy

tinh hóa tại một số thời điểm nuôi khác nhau) sau đông lạnh - giải đông

Tế bào trứng được bảo quản lạnh thành công tức là tế bào trứng có khả

năng phát triển sau đông lạnh – giải đông như tế bào trứng không đông lạnh.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ tế bào trứng phân chia của nhóm 24 giờ là

cao hơn so với các nhóm còn lại (64,67%; P<0,05). Mặc dù nhóm 18 giờ có tỷ

lệ thành thục không khác nhau so với đối chứng (P>0,05) nhưng tỷ lệ tế bào

trứng phân chia của nhóm 18 giờ vẫn thấp hơn so với nhóm 24 giờ (53,73% so

với 64,67%; P<0,05). Điều đó cho thấy hiệu quả bảo quản lạnh tế bào trứng ở

giai đoạn chưa thành thục thấp hơn so với tế bào trứng ở giai đoạn thành thục.

Nguyên nhân có thể là do tế bào trứng chưa thành thục bị nhiều tổn thương lạnh

hơn trong quá trình đông lạnh – giải đông.

Bảng 15. Khả năng phát triển in vitro tiếp theo sau đông lạnh-giải đông của

tế bào trứng trâu được thủy tinh hóa tại một số thời điểm nuôi khác nhau

106

Thời gian nuôi in vitro

Số tế bào

trứng

được thụ

tinh

Tế bào trứng phân chia Phôi dâu, phôi nang

Số tế bào

trứng% (M ± SE)

Số phôi

dâu, phôi

nang

% (M ± SE)

0h 336 127 37,8d ± 0,76 13 10,24c ± 1,57

6h 327 126 38,53d ± 0,47 12 9,52c ± 0,98

12h 329 132 40,12d ± 0,65 15 11,36c ± 1,68

18h 335 180 53,73c ± 0,62 24 11,67c ± 0,97

24h 334 216 64,67b ± 0,92 42 19,44b ± 1,14

Đối chứng

(Tế bào trứng không

đông lạnh)

263 205 77,95a ± 2,24 78 29,66a ± 1,66

Ghi chú: Các giá trị có chữ cái khác nhau trong cùng một cột là sai khác có ý

nghĩa (P<0,05)

Thêm vào đó bộ khung xương tế bào của tế bào trứng thành thục có độ

linh hoạt hơn so với tế bào trứng chưa thành thục, nên chúng ít chịu những tổn

thương lạnh (Allworth và Albertini, 1993). Ngoài ra sự khác nhau về mức độ

107

chịu đựng tổn thương lạnh của tế bào trứng ở hai giai đoạn chưa thành thục và

thành thục có thể là do khả năng thấm màng thấp và độ nhạy cảm của bộ khung

xương tế bào (Hong và cs., 1999) và sự khác nhau về tính thấm màng trong suốt

quá trình đông lạnh – giải đông (Parnpai và cs., 2014; Agca và cs., 2000).

Hình 15. Phôi dâu trâu tạo ra từ tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông lạnh –

giải đông ở thời gian nuôi in vitro 24 giờ (độ phóng đại 40 lần)

Mối liên kết giữa tế bào trứng và các tế bào nang bao xung quanh tế bào

trứng có vai trò quan trọng trong việc hoàn thiện quá trình thành thục của tế bào

trứng. Sự vắng mặt của các tế bào nang có thể gây ra những thiếu sót trong quá

trình tổng hợp protein và ảnh hưởng đến các yếu tố điều chỉnh sự thành thục tế

bào trứng ở mức độ phân tử (Liang, 2010). Chính vì vậy sự thành công của việc

bảo quản lạnh tế bào trứng chưa thành thục còn phụ thuộc vào khả năng bảo toàn

sự toàn vẹn cấu trúc và chức năng của tế bào nang.

Sự thành công của quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng thể hiện ở khả

năng phát triển tiếp theo của tế bào trứng sau đông lạnh – giải đông. Trong

nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá sự phát triển tiếp theo của các tế bào trứng

trâu đầm lầy sau đông lạnh – giải đông đến giai đoạn phôi dâu, nang. Kết quả thể

hiện ở bảng 15 cho thấy sự giảm có ý nghĩa của số lượng phôi dâu, phôi nang

trong các nhóm 0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ và 24 giờ so với đối chứng. Tế bào

trứng phát triển kém sau đông lạnh-giải đông là do chúng phải chịu những tổn

thương trong quá trình bảo quản lạnh (Men và cs., 2002).

Quá trình thủy tinh hóa khử sợi polyme của sợi thoi vô sắc và giải phóng

các tế bào hạt vỏ dẫn đến hiện tượng dị bội và tổn thương màng sáng (Kola và

108

cs., 1988; Vincent và Johson, 1992). Thêm vào đó, khi tế bào trứng chưa thành

thục được bảo quản lạnh dưới 40C sẽ gây cản trở cho sự hình thành sợi thoi vô

sắc và sự thụ tinh trong khi đó đối với tế bào trứng thành thục thì chất bảo vệ

lạnh và nhiệt độ thấp lại làm tổn thương thoi vô sắc, vi sợi actin, sự tổng hợp các

vi ống và sự phân tán nhiễm sắc thể. Sự bất thường của thoi vô sắc cản trở sự thụ

tinh và phát triển bình thường của phôi, bởi vì thoi vô sắc là một phần quan trọng

cho sự hoàn thiện quá trình giảm phân, sự hình thành thể cực thứ nhất, sự di

chuyển của tiền nhân. Khi sợi thoi vô sắc bị phá hủy sẽ dẫn đến sự phân tán

nhiễm sắc thể, ngăn cản tế bào trứng thực hiện sự thụ tinh một cách bình thường

và sự phát triển của phôi.

Kết quả thể hiện ở bảng 15 cho thấy tỷ lệ phát triển đến phôi dâu, phôi

nang của nhóm 24 giờ (19,44%, P<0,05) là cao hơn so với các nhóm còn lại. Kết

quả này cũng tương tự như báo cáo của Men và cs. (2002); El-shahat và

Hammam (2005), El-nabby. (2013), Luna và cs. (2001), Mahmoud và cs.

(2010a), Sharma và Loganathasamy (2007). Các tác giả trên cũng nhận thấy tỷ lệ

phôi nang được tạo ra từ tế bào trứng ở giai đoạn thành thục Metaphase II sau

đông lạnh – giải đông là cao hơn so với ở giai đoạn GV.

Tỷ lệ tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông phát triển đến giai đoạn

phôi dâu, phôi nang của nhóm 24 giờ tuy cao hơn so với các nhóm còn lại nhưng

vẫn thấp hơn so với đối chứng (29,66%; P<0,05). Kết quả này tương tự như báo

cáo của Men và cs. (2002); El-shahat và Hammam (2005).

Hình 16. Phôi nang trâu giãn nở tạo ra từ tế bào trứng trâu đầm lầy sau

đông lạnh – giải đông ở thời gian nuôi in vitro 24 giờ (độ phóng đại 40 lần)

109

Mặc dù tế bào trứng ở giai đoạn thành thục nhân MII có sự ổn định màng

tốt hơn tế bào trứng chưa thành thục, tuy nhiên chúng cũng bị tổn thương khi

tiếp xúc với nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sinh lý như: tổn thương cấu trúc trục

chính phân bào giảm nhiễm (Mandelbaum và cs., 2004), tăng sự sai lệch nhiễm

sắc thể (Sathananthan và cs., 1988), tăng hiện tượng bội thể và giảm khả năng

thụ tinh (Wood và cs., 1992). Thêm vào đó một số báo cáo đã chứng minh rằng

việc tế bào trứng trải qua quá trình đông lạnh (Aman và Parks, 1994), tiếp xúc

với các chất bảo vệ lạnh (Vincent và cs., 1989; Aigner và cs., 1992), hoặc trải

qua quá trình bảo quản lạnh (Aigner và cs., 1992) có thể dẫn đến sự phân tán

nhiễm sắc thể và phát triển thể dị bội do sự khử polymer và làm hỏng cấu trúc

các vi ống của trục chính. Do đó sự phát triển kém của các tế bào trứng sau đông

lạnh – giải đông là do những tổn thương trong chính bản thân tế bào trứng chứ

không phải là do thụ tinh thất bại (Men và cs., 2002).

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng tế bào trứng ở giai đoạn

GV hoặc giai đoạn phá vỡ túi mầm không phù hợp để bảo quản lạnh. Điều này là

trái ngược với kết quả nghiên cứu của Barnes và cs. (1997). Các tác giả này cho

rằng các tế bào trứng khi được bảo quản lạnh ở giai đoạn phá vỡ túi mầm có tỷ lệ

phân chia và phát triển đến phôi nang là cao hơn so với giai đoạn túi mầm hoặc

thành thục (MII). Thậm chí các tác giả này còn nhấn mạnh rằng việc lựa chọn

giai đoạn trung gian có thể vượt qua được một số vấn đề khi bảo quản lạnh tế

bào trứng ở giai đoạn GV hoặc MII.

Cũng đồng quan điểm như vậy, Somfai và cs. (2012); Egerszegi và cs.

(2013) cho rằng tế bào trứng lợn khi được thủy tinh hóa ở giai đoạn túi mầm có

khả năng hoàn thiện quá trình thụ tinh và phát triển đến dâu, phôi nang cao hơn

so với tế bào trứng lợn được thủy tinh hóa ở giai đoạn MII cùng một phương

pháp thủy tinh hóa. Theo Somfai và cs. (2012), mặc dù tế bào trứng thành thục

110

có tỷ lệ sống sau đông lạnh-giải đông cao hơn tế bào trứng chưa thành thục,

nhưng trong quá trình thủy tinh hóa các tế bào trứng ở giai đoạn MII gây ra sự

kết hợp các dạng thay đổi khác nhau trong tế bào chất làm tổn thương đáng kể

đến khả năng thụ tinh bình thường và phát triển phôi tiếp theo của tế bào trứng.

Thậm chí Mehmood và cs. (2011b) còn cho rằng tế bào trứng trâu ở giai đoạn túi

mầm (GV) được thủy tinh hóa trong DMSO hoặc PROH có tỷ lệ phân chia sau

đông lạnh – giải đông là không khác nhau so với tế bào trứng không đông lạnh;

còn tế bào trứng trâu ở giai đoạn thành thục MII có tỷ lệ phân chia thấp hơn so

với đối chứng. Sự khác nhau về các kết quả nghiên cứu có thể là do yếu tố đặc

trưng loài, dạng chất bảo vệ lạnh sử dụng, điều kiện của từng phòng thí nghiệm.

Kết quả ở mục 3.6.1, 3.6.2, 3.6.3 cho thấy, thời gian nuôi in vitro có ảnh

hưởng đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy. Tế bào trứng trâu có

thời gian nuôi in vitro 24 giờ cho tỷ lệ sống, thành thục in vitro trở lại, tỷ lệ tạo

phôi dâu, phôi nang sau đông lạnh – giải đông cao hơn so với tế bào trứng trâu

được đông lạnh ở thời gian nuôi < 24 giờ.

111

CHƯƠNG IV

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

Các kết quả của nghiên cứu này đã khẳng định:

1. Phương pháp đông lạnh tiếp xúc 2 bước với Ethylene glycol (EG) (bước 1: 2

phút trong EG 3M; bước 2: 1 phút trong EG 6M) kết hợp với giải đông trong

môi trường có chứa sucrose mang lại hiệu quả cao cho quá trình bảo quản lạnh tế

bào trứng trâu đầm lầy trong điều kiện tại Việt Nam.

2. Đông lạnh tế bào trứng trâu bằng phương pháp thủy tinh hóa cực nhanh với

cọng rạ hở (OPS) cho tỷ lệ tế bào trứng trâu sống sau đông lạnh –giải đông cao

hơn so với các phương pháp đã thử nghiệm.

3. Đông lạnh tế bào trứng trâu ở giai đoạn nuôi thành thục in vitro 24 giờ cải

thiện tỷ lệ tế bào trứng trâu có hình thái bình thường sau đông lạnh –giải đông

(98,31%); cải thiện tỷ lệ tạo phôi dâu, phôi nang sau thụ tinh và nuôi phôi in

vitro (19,44%).

4. Đã tạo được phôi dâu, phôi nang trâu in vitro từ tế bào trứng trâu đầm lầy sau

đông lạnh – giải đông. Đây là kết quả thành công đầu tiên được công bố tại Việt

Nam tính đến thời điểm này.

5. Đã xây dựng được phương pháp bảo quản lạnh thành công tế bào trứng trâu

đầm lầy tại Việt Nam. Đây cũng là phương pháp bảo quản lạnh tế bào trứng trâu

đầu tiên được công bố tại Việt Nam tính đến thời điểm này.

112

4.2. ĐỀ NGHỊ

Kết quả của nghiên cứu này là công bố đầu tiên về bảo quản lạnh tế bào

trứng trâu tại Việt Nam. Tuy nhiên để nâng cao tỷ lệ sống của tế bào trứng trâu

sau đông lạnh – giải đông, tỷ lệ tạo phôi trâu in vitro từ tế bào trứng trâu sau

đông lạnh –giải đông, nhằm mục đích bảo tồn cũng như tạo nguồn nguyên liệu

cho các nghiên cứu và sản xuất phôi trâu cần phải thực hiện thêm một số nghiên

cứu khác như: nghiên cứu cải thiện môi trường nuôi phôi in vitro, cấy truyền

phôi trâu tạo ra từ tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông, nghiên cứu tạo

phôi trâu nhân bản từ tế bào trứng đông lạnh.

Các kết quả nghiên cứu của luận án có thể được dùng làm tài liệu tham

khảo trong nghiên cứu giảng dạy tại các trường Đại học hoặc được áp dụng cho

các phòng thí nghiệm về công nghệ sinh sản.

113

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN

1. Nguyễn Khánh Vân, Vũ Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Lệ Hương, Nguyễn Thị

Hương, Quản Xuân Hữu, Đào Đức Thà, Nguyễn Lai Thành. 2014. Ảnh hưởng

của phương pháp đông lạnh đến chất lượng tế bào trứng trâu chưa thành thục sau

đông lạnh – giải đông. Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi – Viện Chăn

nuôi. Số 50: 92-100

2. Nguyễn Khánh Vân, Vũ Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Lệ Hương, Nguyễn Thị

Hương, Quản Xuân Hữu, Đào Đức Thà, Nguyễn Lai Thành. 2014. Ảnh hưởng

của thời gian nuôi cấy đến kết quả bảo quản lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy. Tạp

chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi – Viện Chăn nuôi. Số 51: 39 -47

114

TÀI LIÊU THAM KHẢO

* Tài liệu tiếng Việt

Nguyễn Thị Thương Huyền, Nguyễn Thành Trung, Nguyễn Vũ Hoàng Linh, Lê

Thành Long, Hoàng Nghĩa Sơn, Phan Kim Ngọc. 2012. Những tác động

của Taxol lên việc bảo quản lạnh tế bào trứng bò trưởng thành bằng

phương pháp thủy tinh hóa. Tạp chí sinh học, 34 (3SE): 299-305.

Nguyễn Thị Thương Huyền, Lâm Sơn Bích Trâm, Nguyễn Quốc Đạt, Hoàng

Nghĩa Sơn, Phan Kim Ngọc. 2014. Bảo quản lạnh tế bào trứng bò giai đoạn

túi mầm bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ và vi giọt. Tạp chí

Sinh học, 36 (1se): 195-202.

Nguyễn Văn Hạnh, Nguyễn Việt Linh, Bùi Xuân Nguyên. 2013. Đông lạnh

trứng lợn non bằng cryotop. Tạp chí sinh học, 35(4): 516-521.

* Tài liệu tiếng Anh

Abbas, E.H. 1998. Investigations on in vitro fertilization in buffaloes. Ph. D.

Thesis, Zagazig University.

Abdoon, A.S.S., and O.M. Kandil. 2001. Factors affecting number of surface

ovarian follicles and oocytes yield and quality in Egyptian buffaloes.

Reproduction, Nutrition and Development 41: 71-77.

Abdoon, A.S.S., O. M. Kandil, T. Otoi, T. Suzuki. 2001. Influence of oocyte

quality, culture media and gonadotropins on cleavage rate and development

115

of in vitro fertilized buffalo embryos. Animal Reproduction Science 65:

215-223.

Agca,Y., J. J.J. Liu, E.S. Rutledge, Crister and J.K. Crister. 2000. Effect of

osmotic stress on the developmental competence of germinal vesicle and

metaphase II stage bovine cumulus oocytes complexes and its relevance to

cryopreservation. Mol. Reprod Dev., 55: 212-219.

Aigner, S., J. Van der Elst, E. Siebzehnrubl, L. Wildt, N. Lang and A. Van

Steirteghem. 1992. The influence of slow and ultra-rapid freezing on the

organization of the meiotic spindle of the mouse oocyte. Hum Reprod 7:

857-864.

Albarracin, J.L., R. Morato, D. Izquierdo and T. Mogas. 2005a.Vitrification of

calf oocytes: effects of maturation stage and prematuration treatment on the

nuclear and cytoskeletal components of oocytes and their subsequent

development. Molecular Reproduction and Development, 72(2), 239–249

Albarracin, J.L., R. Morato, C. Rojas and T. Mogas. 2005b. Effects of

vitrification in open pulled straws on the cytology of in vitro matured

prepubertal and adult bovine oocytes. Theriogenology, 63(3), 890–901.

Ali, A., M.A. Sirard. 2002. Effect of the absence or presence of various protein

supplements on further development of bovine oocytes during in vitro

maturation. Biol Reprod, 66: 901-905.

Allworth, A.E. and D.F. Albertini. 1993. Meiotic maturation in cultured bovine

oocytes is accompanied by remodeling of cumulus cell cytoskeleton.

Develop. Boil., 158: 101-112.

Aman, R.R. and J.E. Parks. 1994. Effects of cooling and rewarming on the

meiotic spindle and chromosomes of in vitro-matured oocytes. Biol.

Reprod. 50: 103-110.

116

Antinori, M., E. Licata, G. Dani. 2007. Cryotop vitrification of human oocytes

results in high survival rate and healthy deliveries. Reproductive

BioMedicine Online 14: 71-79.

Atabay, E.C., Y. Takahashi, S. Katagiri, M. Nagano, A. Koga and Y. Kanai.

2004.Vitrification of bovine oocytes and its application to intergeneric

somatic cell nucleus transfer. Theriogenology, 61(1), 15–23.

Arav, A., Y. Zeron, S.B. Leslie, E. Behboodi, G.B. Anderson and J.H. Crowe.

1996. Phase transition temperature and chilling sensitivity of bovine

oocytes. Cryobiology 33. 589–599.

Arav, A., Y. Zeron and A. Ocheretny. 2000. A new device and method for

vitrification increases the cooling rates and allows successful

cryopreservation of bovine oocytes. Theriogenology, 53, 248 (Abstract)

Arav, A., S. Yavin, Y. Zeron, D. Natan, I. Dekel and H. Gacitua. 2002. New

trends in gamete’s cryopreservation. Molecular and Cellular Endocrinology

187 77–81.

Barakat, A., H, H.M. El –Ashmaoui, A. Barkawi, S. A. Kandeal and El- Nahass.

2012. Ultra-structural study of Egyptian buffalo oocytes before and after in

vitro maturation. African Journal of Biotechnology Vol. 11 (30), pp. 7592-

7602

Barnes, F.L., P. Damiani, C.R. Looney and R.T. Duby. 1997. The meiotic stage

affects subsequent development of cooled bovine oocytes. Theriogenol.,

47: 183.

Bombatkar, R. 2008. Effect of ethylene glycol concentrations on survivability

and in vitro maturation of vitrified-thawed immature buffalo (Bubalus

bubalis) oocytes. M. V. Sc. Thesis submitted to Maharashtra animal and

fishery sciences university, Nagpur.

117

Boni, R., L. Santella, B. Dale, S. Roviello, R. Di Palo, and V. Barbieri. 1992.

Maturation in vitro of oocytes buffalo investigation ultrastructural (in

Italian). Acta Medica Veterinaria 28: 153-161.

Bouquet, M., J. Selva and M. Auroux. 1993. Cryopreservation of mouse oocytes

mutagenic effects in the embryo. J. Biol. Rep., 49: 764-769.

Bos-Mikich, A., and D.G. Whittingham. 1995. Analysis of the chrosome

complement of frozen-thawed mouse oocytes after parthenogenetic

activation. J. Mol. Reprod. Dev., 42: 254-260.

Bracket, B.G., G. Oliphant. 1975. Capacitation of rabbit spermatozoa in vitro.

Biol Reprod, 12: 260-274.

Cha, K.Y., H.M. Chung, J.M. Lim, J.J. Ko, S.Y. Han, D.H. Choi and T.K. Yoon.

2000. Freezing immature oocytes. Mol Cell Endocrinol, 169: 43-47.

Chauhan, M.S., P.K. Katiyar, S.K. Singla, R.S. Manik. and M.L. Madan. 1997a.

Production of buffalo calves through in vitro fertilization. Indian Juornal of

Animal Sciences 67: 306-08.

Chauhan, M.S., P. Palta, S.K. Das, P.K. Katiyar and M.L. Madan. 1997b.

Replacement of serum and hormones additives with follicular fluid in the

IVM medium: effect on maturation, fertilization and subsequent

development of buffalo oocytes in vitro . Theriogenology 48:461-469.

Chauhan, M.S., S.K. Singla, P. Palta, R.S. Manik and M.L. Madan. 1998a. In

vitro maturation and fertilization, and subsequent development of buffalo

(Bubalus bubalis) embryos: effect of oocyte quality and type of serum.

Reprod. Fertil Dev., 110: 173-177.

Chauhan, M.S., S.K. Sigla., P. Palta, R.S. Manik and M.L. Madan. 1998b. IGF-II

stimulation of in vitro maturation, in vitro fertilization and subsequent

118

development of buffalo (Bubalus bubalis) oocytes in vitro. Vet Rec. 142:

727-728.

Chauhan, M.S,, S.K Sigla, P Palta, R.S Manik and M.L Madan. 1999. Effect of

epidermal growth factor on the cumulus expansion, meiotic maturation and

development of buffalo oocytes in vitro. Vet. Rec. 144:266-267.

Chian, R.C., K. Niwa and M.A. Sirad. 1994. Effects of cumulus cells on male

pronuclear formation and subsequent early development of bovine oocytes

in vitro. Theriogenology, 41, 1499–1508.

Chian, R., M. Kuwayama, L. Tan, J. Tan, O. Kato, and T. Nagai. 2004. High

survival rate of bovine oocytes matured in vitro following vitrification. J

Reprod Dev. 50: 685-696.

Chohan, K.R., A.G Hunter. 2003. In vitro maturation and fertilization of water

buffalo oocytes. Buffalo J 1: 91-101.

Ciotti, P.M., E. Porcu, L. Notarangelo, O. Magrini, A. Bazzocchi and S.

Venturoli. 2009. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human

oocytes compared to slow freezing. Fertility and Sterility 91 2399–2407.

Critser, J.K.., Y. Agca and K. T. Gunasena. 1997. The cryobiology of

mammalian oocytes. In: Reproductive Tissue Banking, eds. A. M. Karow

& J. K. Critser, Academic Press, San Diego, pp. 329−357.

Danell, B. 1987. Oestrus behaviour, ovarian morphology and cyclical variation

in follicular system and endocrine pattern in water buffalo heifers. PhD

Thesis, University of Uppsala, Sweden.

Das, G.K., G.C. Jain, V.S. Solanki, V.N. Tripathi. 1996. Efficacy of various

colletion methods for oocytes retrieval in buffalo. Theriogenology 46, pp :

1403-1411.

119

Datta, T.K., and S.L. Goswami. 1998. Feasibility of harvesting oocytes from

buffalo (Bubalus bubalis) ovaries by different methods. Buffalo J. 2: 277-

284.

Delval, A., F. J. Ectrors, K. Touati, J. F. Beckers and F. Ectoss. 1996.

Vitrification of bovine embryos produced in vitro: Survival, hatching and

pregnancy rates. Theriogenology, 45, 178 (Abstract).

Dhali, A., R. S. Manik, S. K. Das, S. K. Singla and P. Palta. 2000a. Vitrification

of buffalo (Bubalus bubalis) oocytes. Theriogenology, 53, 1295−1303.

Dhali, A., R. S. Manik, S. K. Das, S. K. Singla and P. Palta. 2000b. Post-

vitrification survival and in vitro maturation rate of buffalo (Bubalus

bubalis) oocytes: Effect of ethylene glycol concentration and exposure

time. Animal Reproduction Science, 63, 159−165.

Dinnyes, A., Y. Dai, S. Jiang, X. Yang. 2000. High developmental rates of

vitrified bovine oocytes following parthenogenetic activation, in vitro

fertilization, and somatic cell nuclear transfer. Biol Reprod. 63: 513-518.

Down, S.M., S.A.G. Daniel and J.J. Eppig. 1988. Induction of maturation in

cumulus cells enclosed mouse oocytes by follicle stimulating hormone and

epidermal growth factor evidence for the positive stimulus of somatic cell

origin. J. Exp. Zool., 245: 86-96.

Edashige, K., Y. Yamaji, F.W. Kleinhans and M. Kasai. 2003. Artificial

expression of Aquaporin-3 improves the survival of mouse oocytes after

cryopreservation. Biology of Reproduction, 68, 87–94

Edashige, K., and M. Kasai. 2007. The movement of water and cryoprotectants

in mammalian oocytes and embryos and its relevance to cryopreservation.

J. Mamm. Ova. Res., 24: 18 – 22.

120

Egerszegi, I., T. Somfai, M. Nakai, F. Tanihara, J. Noguchi, H. Kaneko, T.

Nagai, J. Rátky and K. Kikuchi. 2013. Comparison of cytoskeletal

integrity, fertilization and developmental competence of oocytes vitrified

before or after in vitro maturation in a porcine model. Cryobiology 67:287-

292.

El-nabby. 2013. In vitro maturation and structural changes in vitrified-warmed

buffalo oocytes. Global J of Biotechnol and Biochem, 5(4): 220-225.

El-shahat, K.H., and A.M. Hammam. 2005. Vitrification of immature and mature

buffalo oocytes in glycerol solution by simple method. 17th Annual Congr.

Egyptian Soc. Anim. Reprod. Fert.pp: 167-177.

El – Sayed, A., H. Eitedal. Elsayed, A. Dalia, S. M Ahmed, Salem, and A. H.

Barkawi. 2012. Ultra-structure study of microvilli, mitochondria and lipid

droplets of Egyptian buffaloes, oocytes with reference to quality. Egyptian

J. Anim. Prod., 49 Suppl. Issue, Nov : 29-38

Esposito, L., G. Campanile, R. Di Palo, R. Boni, C. Di Meo and L. Zicarelli.

1992. Seasonal reproductive failure in buffaloes bred in Italy. In:

Proceedings of the Twelfth International Congress of Animal

Reproduction, Hague, The Netherlands 4: 2045-2047.

Eroglu, A., M.J. Russo, R. Bieganski, A. Fowler, S. Cheley, H. Bayley. 2000.

Intracellular trehalose improves the survival of cryopreserved mammalian

cells. Nat Biotechnol. 18: 163-167.

Fahy, G.M., D.R. MacFarlane, C.A. Angell, H.T. Meryman. 1984. Vitrification

as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21: 407-26

Fahy, G.M., T.H. Lilley, H. Lindsel, M.S.T.J. Douglas, H. Meryman. 1999.

Cryoprotectant toxicity and cryoprotectant toxicity reduction: in search of

molecular mechanisms. J. Cryobiol., 27: 247-268.

121

Fountain, D.M., M. Ralston, N. Higgins, J.B. Gorlin, L. Uhl, C. Wheeler, J.H.

Antin, W.H. Churchill, R.J. Benjamin. 1997. Liquid nitrogen freezers: a

potential source of microbial contamination of hematopoietic stem cell

components. Transfusion 37, 585-591.

Friedler, S., L.C. Giudice, F.J. Lamb. 1988. Cryopreservation of embryos and

ova. Fertil Steril. 49: 743-764.

Fuku, E., A. Kojima, Y. Shioya, G.J. Marcus, B.R. Downey. 1992. In vitro

fertilization and development of frozen-thawed bovine oocytes.

Cryobiology; 29: 485-49.,

Fuku, E., L. Xia and B.R. Downey. 1995. Ultrastructural changes in bovines

oocytes cryopreserved by vitrification. Cryobiology, 32, 139–156.

Gabr, Sh. A., A.E. Abdel-Khalek and I.T. El-Ratel. 2015. Evaluation of some

factors affecting quantity, quality and in vitro maturation of buffalo

oocytes. Asian J. Anim. Vet. Adv. ISSN 1683-9919.

Gasparrini, B., G. Neglia, Caracciolodi, V. Brienza, G. Canpanile and L.

Zicarelli. 2000. Effect of cysteamine during in vitro maturation on buffalo

embryo development. Theriogenology, 54, 1537–1542.

Gasparrini, B., L. Boccia, J. Marchandise, R. Di Palo, F. George, I. Donnay, L.

Zicarelli. 2006. Enrichment of in vitro maturation medium for buffalo

(Bubalus bubalis) oocytes with thiol compounds: effects of cystine on

glutathione synthesis and embryo development. Theriogenology. 65: 275-

87.

Gasparrini, B., L. Attanasio, A. De Rosa, E. Monaco, R. Di Palo, G. Campanile.

2007. Cryopreservation of in vitro matured buffalo (Bubalus bubalis)

oocytes by minium volumes vitrification methods. Anim Reprod Sci. 98 (3-

4): 335-42.

122

Gasparrini, B., Serena Di Francesco, Marcello Rubessa, Salvatore Velotto,

Evelina Mariotti, Marina De Blasi. 2009. Structural changes of in vitro

matured buffalo and bovine oocytes following cryopreservation. Ital. J.

Anim. Sci. Vol 8 (Suppl 2): 90-92.

Gautam, S.K., V. Verma, B. Singh, P. Palta, S.K Singla, M.S Chauhan and R. S.

Manik. 2008a. Effect of slow freezing: on morphology and developmental

competence of buffalo (Bubalus bubalis) immature oocytes. Anim Reprod

Sci 105: 311-318.

Gautam, S.K., V. Verma, P. Palta, M.S. Chauhan and R. S. Manik. 2008b. Effect

of type of cryoprotectant on morphology and developmental competence of

in vitro matured buffalo (Bubalus bubalis) oocytes subjected to slow

freezing or vitrification. Reprod Fertil Dev 20: 490-496.

Gautam, S.K., B. Singh, V. Verma, R.S. Manik, M.S. Chauhan. 2011. Oocyte

freezing: basics, current status and potential applications in reproductive

biology. International Journal of Animal Biotechnology, Vol 1.1, No.1

Goodhand, K.L., M.E Staines, J.S.M Hutchinson, P.J Broadbent. 2000. In vivo

oocytes recovery and in vitro embryo production from bovine oocytes

doner treated with progestagen, oestradiol. Animal Reproduction, 63: 145-

185.

Gupta, MK., S.J. Uhm, H.T. Lee. 2007. Cryopreservation of immature and in

vitro matured porcine oocytes by solid surface vitrification.

Theriogenology. 67: 238-248.

Hamawaki, A., M. Kuwayama and S. Hamano. 1999 Minimum volume cooling

method for bovine blastocyst vitrification. Theriogenology 51: 165.

123

Hammam, A.M., M.M. Zabal and H. A. Sabara. 1997. Effect of type of media on

in vitro maturation, culture and fertilization of buffalo and cattle oocytes.

Beni-Swef Vet. Med. Res. 2: 242-259.

Hammam, A. M. M., H. K El-Shahat. 2005. Vitrification of immature and

mature buffalo oocytes in glycerol solution by a simple method. ISAH. Vol

1: 252-255.

Hammam, A.M., C.S. Whisnant, A. Elias, S.M. Zaabel, A.O. Hegab and E.M.

Abu-El Naga. 2010. Effect of media, sera and hormones on in vitro

maturation and fertilization of water buffalos (Bubalus bubalis). Journal of

Animal and Veterinary Advances 9(1); 27-31.

Hegab, A.O., A.E. Montasser, A.M. Hammam, E.M.A. Abu El-Naga, S.M.

Zaabel. 2009. Improving in vitro maturation and cleavage rates of buffalo

oocytes. Anim. Reprod, v.6, n.2: 416-421.

Hochi, S., M. Akiyama, K. Kimura and A. Hanada. 2000. Vitrification of in vitro

matured bovine oocytes in open-pulled glass capillaries of different

diameters. Theriogenology, 53, 255 (Abstract).

Hong, S.M., H.M. Chung, J.M. Lim, J.J. Ko, T.K. Yoon, B. Yee and K.Y Cha.

1999. Improved human oocytes development after vitrification: a

comparision of thawing methods. Fert. Steril. 72: 142-146.

Huang, W.T., and W. Holtz. 2002. Effects of meiotic stages, cryoprotectants,

cooling and vitrification on cryopreservation of porcine oocytes. Asian

Australasian Journal of Animal Science, 15, 485–493

Hufana-Duran, D., P.B. Pedro, H.V. Venturina, R.D. Hufana, A.L. Salazar, P.G.

Duran and L.C. Cruz. 2004. Post-warming hatching and birth of live calves

following transfer of in vitro-derived vitrified water buffalo.

Theriogenology, 61(7–8), 1429–1439

124

Hurt, A.E., F. Landim-Alvarenga, G.E. Seidel and E.L. Squires. 2000.

Vitrification of immature and mature equine and bovine oocytes in ethylene

glycol, Ficoll and sucrose solution using open-pulled straws. Theriogenol.,

54: 119-128.

Isachenko, V. 1997. Vitrification of porcine immature oocytes: new aspect.

Probl. Cryobiology 1-2: 100-110.

Isachenko, V., M. Montag, E. Isachenko, H. Van Der Ven. 2005a. Vitrification

of mouse pronuclear embryos after polar body biopsy without direct

contact with liquid nitrogen. Fertil. Steril. 84: 1011-1016.

Isachenko, V., M. Montag, E. Isachenko, V. Zaeva, I. Krivokharchenko, R.

Shafei, H. Van Der Ven. 2005b. Aseptic technology of vitrification of

human pronuclear oocytes using open-pulled straws. Hum. Reprod. 20:

492-496.

Jennifer, R.P., A. Muhammad. 2011. Cryopreservation of mammalian oocytes

for conservation of animal genetics. Veterinary Medicine International,

Article ID 146405, 11 pages.

Johnson, M.H., and S.J. Pickering. 1987. The effect of dimethylsulphoxide on

the microtubular system of the mouse oocytes. J. Develop., 100: 313 – 324.

John, K., M.D. Jain, and J. Richard, M.D. Paulson. 2006. Oocytes

cryopreservation. Fertility and Sterility® Vol.86, Suppl 3.

Joseph, S., and A. Amir. 2011 Current progress in oocyte and embryo

cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction . 141. 1-

19.

Kandil, O. M., A.S. Abdoon and R.I El-Sheshtawy. 1996. Capacitation of

buffalo and cattle spermatozoa by heparin and caffeine. Proc. 8 th Annual

125

Congress of the Egyptian Society of Animal Reproduction and Fertility,

Cairo, pp: 67-74.

Kandil, O.M., A.S.S Abdoon, T. Otoi and T. Suzuki. 1999. New technique, using

a portable CO2 incubator, for the production of in vitro fertilized buffalo

embryos. J. Reproduction and Development 45: 315-320.

Katayama, K.P., J. Stehlik, M. Kuwayana, O. Kato and E. Stehlik, 2003. High

survival rate of vitrified human oocytes results in clinical pregnancy.

Fertility and Sterility, 80, 223–224.

Kasai, M., J.H. Komi, K. Takakamo, H. Tsudera, T. Sakurai, T. Machida. 1990.

A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity

vitrification solution, without appreciable loss of viability. Journal of

Reproduction and Fertility, 89: 91-97.

Kasai, M. 2002. Advances in the cryopreservation of mammalian oocytes and

embryos: development of ultrarapid vitrification. Reprod Med Biol. 1: 1-9.

Kasi, M. 1996. Simple and efficient methods for vitrification of mammalian

embryos. J. Animal Reproduction Sci., 42: 67-75.

Karima, Gh., M. Mahmoud, M. Magda, Noshy, M.A. Youssra, M.A. Mohamed,

Amer and M.F. Nawito. 2010. Genetoxicity of Cryoprotectants on Buffalo

Oocytes. Journal of Reproduction and Infertility 1 (1): 18 -25.

Kim, D.H., H.S. Park, S.W. Kim, I.S. Hwang, B.C. Yang, G.S. Im, H.J. Chung,

H.W. Seong, S.J. Moon, B.S. Yang. 2007. Vitrification of immature bovine

oocytes by the microdrop method. J. Reprod. Dev 53(4): 843 – 851.

Kola, I., C. Kirby, J. Shaw, A. Davey and A. Trounson. 1988. Vitrification of

mouse oocytes results in aneuploid zygotes and malformed fetuses.

Teratol., 38: 467-474.

126

Kong, I. K., S. I. Lee, S. G. Cho, S. K. Cho, and C. S. Park. 2000. Comparison of

open pulled straws (OPS) vs glass micorpipette (GMP) vitrification on

mouse blastocysts. Theriogenology 53: 1817-1826.

Kuleshova, L.L., J.M. Shaw. 2000. A strategy for rapid cooling of embryos

within a double straw to eliminate the risk of contamination during

cryopreservation and storage. Hum Reprod 15: 2604-2609.

Kuleshova, L.L., J.M. Shaw and A.O. Trounson. 2001. Studies on replacing

most of the penetrating cryoprotectant by polymers for embryo

cryopreservation. J. Cryobiol 43: 21-31.

Kumar, A., V.S. Solanki, S.K. Jindal, V.N. Tripathi and G.C. Jain. 1997. Oocyte

retrieval and histological studies of follicular population in buffalo ovaries.

Anim. Reprod. Sci., 47:189-195.

Kumar, D., P. Palta, R.S. Manik, S.K. Singla and M.S. Chauhan. 2007. Effect of

culture media and serum supplementation on the development of in vitro

fertilized buffalo embryos. Indian Journal of Animal Sciences 77(8): 697-

701.

Kumar, D., and T. Anand. 2012. In vitro embryo production in buffalo: Basis

concepts. Journal of Buffalo Science, 1, 50 – 54.

Kuwayama, M., and O. Kato. 2000. All-round vitrification method for human

oocytes and embryos. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 17:

477.

Kuwayama, M., G. Vajta, O. Kato, S.P. Leibo. 2005. Highly efficient

vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reprod

Biomed Online. 11: 300-308.

Landa, V., O. Tepla. 1990. Cryopreservation of mouse 8-cell embryos in

microdrops. Folia Biol (Praha). 36: 153-158.

127

Lane, M., K.T. Forest, E.A. Lyons., B.D. Bavister. 1999. Live births following

vitrification of hamster embryos using a novel containerless technique.

Theriogenology 51, 167.

Larman, M.G., and D.K. Gardner. 2010 Vitrifying mouse oocytes and embryos

with super-cooled air. Human Reproduction 25 i265

Le Gal, F., P. Gasqui and J.P. Renard. 1994. Differential osmotic behaviour of

mammalian oocytes before and after maturation: A quantitative analysis

using goat oocytes as a model. Cryobiology 31: 154-170.

Le Gal, F. 1996. In vitro maturation and fertilization of goat oocytes frozen at

germinal vesicle stage. Theriogenology, 45, 1177–1185.

Le Gal, F., A. Massip. 1999. Cryopreservation of cattle oocytes: effects of

meiotic stage, cycloheximide treatment, and vitrification procedure.

Cryobiology 38 (4): 290-300.

Le Van Ty, Bui Xuan Nguyen, N. H. Son and M. A. Driancurt. 1994.

Superovulation and ovarian follicular population of juvenile buffaloes and

calves. Anim Reprod Sci 35: 191-199

Leibo, S.P. 1980. Water permeability and its activation energy of fertilized and

unfertilized mouse ova. J. Membrane Biol. 53: 179-188.

Leibo, S.P. 2008. Cryopreservation of oocytes and embryos: Optimization by

theoretical versus empirical analysis. J. Theriogenol., 69: 37 – 47.

Liang ,Y.Y. 2010. Effects of vitrification techniques on the survival of buffalo

oocytes and developmental potential of embryo following intracytoplasmic

sperm injection. PhD thesis submit.

Liang, Y.Y., T. Phermthai, T. Nagai, T. Somfai and R. Parnpai. 2011. In vitro

development of vitrified buffalo oocytes following parthenogenetic

128

activation and intracytoplasmic sperm injection. Theriogenology 75: 1652-

1660.

Liang, Y.Y., K Srirattana, T. Phermthai, T. Somfai, T. Nagai, R. Parnpai. 2012.

Effects of vitrification cryoprotectant treatment and cooling method on the

viability and development of buffalo oocytes after intracytoplasmic sperm

injection. Cryobiology. 65 (2): 151-6.

Liang, Y.Y., T. Somfai, T. Nagai and R. Parnpai. 2013. Vitrification of buffalo

oocytes : Current status and perspectives. Buffalo Bulletin. Vol 32 (Special

Issue 1): 196 – 203.

Liebermann, J., F. Nawroth, V. Isachenko, E. Isachenko, G. Rahimi, M.J.

Tucker. 2002. Potential importance of vitrification in reproductive

medicine. Biol. Reprod. 67: 1671-1680.

Lim, J.M., Y. Fukui and H. Ono. 1992. Developmental competence of bovine

oocytes frozen at various maturation stages followed by in vitro maturation

and fertilization. Theriogenol, 37: 351-361.

Lim, J.M., J.J. Ko, W.S. Hwang, H.M. Chung and K. Niwa. 1999. Development

of in vitro matured bovine oocytes after cryopreservation with different

cryoprotectants. Theriogenology, 51, 1303–1310.

Lovelock, J.E. 1954. The protective action of neutral solutes against haemolysis

by freezing and thawing. Biochem J. 56: 265-270.

Lucena, E., D.P. Bernal, C. Lucena. 2006. Successful ongoing pregnancies after

vitrification of oocytes. Fertility and Sterility 85: 108-111.

Luna, H.S., I. Ferrari and R. Rompf. 2001. Influence of maturation of bovine

oocytes at time of vitrification on the incidence of diploid metaphase II at

completion of maturation. Animal Reproduction Science, 68, 23–28.

129

Madan, M.L., M.S. Chauhan, S.K. Singla and R.S. Manik. 1994. Pregnancies

established from water buffalo (Bubalus Bubalis) blastocyst derived from

in vitro matured, in vitro fertilized oocytes and co-cultured with cumulus

and oviductal cells. Theriogenology 42:591-600.

Madan, M.L., S.K. Das and P. Palta. 1996. Application of reproductive

technology to buffaloes. Anim. Reprod. Sci., 42:299-306.

Magnusson, V., W.B. Feitosa, M.D. Goissis, C. Yamada, L.M. Tavares, M.E.

Ortiz, D. Assumpcao, and J.A. Visintin. 2008. Bovine oocytes vitrification:

Effect of ethylene glycol concentration and meiotic stages. Anim. Reprod.

Sci., 106: 265-273.

Magistrini, M., and D. Szollosi. 1980. Effects of cold and of isopropyl-N-

phnylcarbamate on the second meiotic spindle of mouse oocytes. Eur J.

Cell. Biol., 22: 699-707.

Mahmoud, K.M.Gh., T.H. Scholkamy, G.E. Seidel Jr, G.A. Elsisy and M.F.

Nawito. 2010a. Influence of meiotic stages on the survival and

development ability of vitrified-warmed buffalo oocytes. Global Journal of

Biotechnology & Biochemisty 5 (4): 220-225.

Mahmoud, K.M.Gh., T.H. Scholkamy, Y.F. Ahmed, G.E. Seidel and M.F.

Nawito. 2010b. Effect of different combinations of cryoprotectants on in

vitro maturation of immature buffalo (Bubalus bubalis) oocytes vitrified by

straw and open-pulled straw methods. Reprod. Dom. Anim., 45: 565-571.

Mahmoud, K.M.Gh., M.M.M. El-Sokary. 2013. Improvement of the efficacy of

buffalo oocytes vitrification. Global Veterinaria 11 (4): 420-431.

Mahmoudzadeh, A.R., A. Van Soom, I. Van Vlaenderen, A. De Kruif. 1993. A

comparative study of the effect of one – step addition of different

130

vitrification solutions on in vitro survival of vitrified bovine embryos.

Theriogenology, 39: 1291-1302.

Mandelbaum, J., O. Anastasiou, R. Levy, J. F. Guerin, V. De Larouziere and J.

M. Antoine. 2004. Effects of cryopreservation on the meiotic spindle of

human oocytes. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 113S: S17-S23.

Mazur, P. 1963 Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the

likelihood of intracellular freezing. Journal of General Physiology 47: 347–

369.

Mazur, P. 1977. The role of intracellular freezing in the death of cells cooled at

supraoptimal rates. Cryobiology 6, 315-332.

Mazur, P. 1980. Limits to life at low temperatures and at reduced water contents

and water activities. Orig Life , 10: 137-159.

Mazur, P., and U. Schneider. 1986. Osmotic responses of preimplantation mouse

and bovine embryos and their cryobiological implications. Cell Biophys. 8:

259-285.

Mazur, P.S., I.L. Seki, F.W. Pinn, Kleinhans and K. Edashige. 2005. Extra and

intracellular ice formation in mouse oocytes. Cryobiology, 51: 29-53.

Martins, R.D., E.P. Costa, J.S.C. Chagas, F.S. Ignacio, C.A.A. Torres and C. Mc.

Manus. 2005. Effects of vitrification of immature bovine oocytes on in

vitro maturation. J. Anima. Reprod. 2: 128-134.

Martino, A., N. Songsasen and S.P. Leibo. 1996. Development into blastocysts

of bovine oocytes cryopreserved by ultra-rapid cooling. Biology of

Reproduction 54 1059–1069.

Mavrides, A., and D. Morroll. 2005. Bypassing the effect of zona pellucida

changes on embryo formation following cryopreservation of bovine

131

oocytes. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive

Biology 118 66–70.

McWilliams, R.B., W.E. Gibbons and S.P. Leibo, 1995. Osmotic and

physiological responses of mouse zygotes and human oocytes to mono and

disaccharides. Hum. Reprod., 10: 1163-1171.

Mehmood, A., M. Anwar, S. M. H. Andrabi, M. Afzal, A.M.S. Naqvi. 2011a. In

vitro maturation and fertilization of buffalo oocytes: the effect of recovery

and maturation methods. Turk. J. Vet. Anim. Sci. 35(6): 381-386.

Mehmood, A., S. M. H. Andrabi and M. Anwar. 2011b. In vitro fertilization of

vitrified-warmed oocytes by frozen thawed semen of breeding buffalo

bulls. Pakistan J. Zool. Vol 43 (6): 1135-1139.

Men, H., R.L. Monson, and J.J. Rutledge, 2002. Effect of meiotic stages and

maturation protocols on bovine oocyte’s resistance to cryopreservation.

Theriogenology, 57(3), 1095–1103.

Misha, A., V. Chandra and G. Sharma. 2012. Effect of vitrification on in vitro

matured buffalo oocytes. Buffalo Bulletin, Vol 31, No 2: 81 – 83.

Miyake, T., M. Kasai, S. F. Zhu, T. Sakurai and T. Machida. 1993. Vitrification

of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an

ethylene glycol based solution by simple methods. Theriogenology, 40,

121−134.

Morato, R., T. Mogas and H.P. Maddox. 2008. Ultrastructure of bovine oocytes

exposed to taxol prior to OPS vitrification. Mol Reprod Dev 75: 1318 –

1326.

Muenthaisong, S., C. Laowtammathron, .M Ketudat-Cairns, R. Parnpai and S.

Hochi. 2007. Quality analysis of buffalo blastocysts derived from oocytes

132

vitrified before or after enucleation and reconstructed with somatic cell

nuclei. Theriogenology 67: 893 – 900.

Muldrew, K., J.P. Acker, J.A. Elliott and L.E. McGann. 2004. The water to ice

transition: Implications for living cells. In: B. J. Fuller, N. Lane and E. E.

Benson (Eds.) Life in the Frozen State. CRC Press, New York. pp. 67-108.

Mustafa, G., M. Anzar and M. Arslan. 1998. Separation of motile spermatozoa

from frozen-thawed buffalo semen: swim-up vs. filtration procedures.

Theriogenology 50:205-211.

Nandi, S., M.S. Chauhan, and P. Palta. 1998. Influence of cumulus cell and

sperm concentration on cleavage rate and subsequent embryonic

development of buffalo (Bubalis bubalis) oocytes matured and fertilized in

vitro. Theriogenology 50: 1251-1262.

Nandi, S., M.S. Chauhan, P. Palta. 2000. Effect of a corpus luteum on the

recovery and developmental potential of buffalo oocytes. Vet. Rec., 147:

580-581. 10.

Nandi, S., B.M. Ravindranatha, P.S.P. Gupta, P.V Sarma. 2002. Timing in

sequential changes in cumulus cells and first polar body extrusion during in

vitro maturation of buffalo oocytes. Theriogenology, 57: 1151-1159.

Neeta Singh, Suneeta Mital. 2009. Cryopreservation of Oocytes and Ovarian

Tisuue. JK Science. Vol 11 No1.

Neglia, G., M. Marin, R. Di Palo, M. Wilding, V. Caracciolo di Brienza, B.

Dale, B. Gasparrini, L. Zicarelli. 2001. A comparison of in vitro maturation

in buffalo (Bubalus bubalis) and bovine oocytes using confocal

microscopy Theriogenology 55:488.

Nowshari, M.A., P.L. Nayudu and J.K. Hodges. 1994. Effect of cryoprotectant

concentration, equilibration time and thawing procedure on survival and

133

development of rapid frozen-thawed mouse oocytes. Theriogenology, 42,

1193–1204.

Oda, K., W.E. Gibbons and S.P. Leibo. 1992. Osmotic shock of fertilized mouse

ova. J. Reprod. Fertil. 95: 737-747.

Orief, Y., A. Schultze-Mosgau, K. Dafopoulos, S. Al-Hasani. 2005. Vitrification,

will it replace the conventional gamete cryopreservation techniques? Mid.

East Fertil. Soc. J., 10: 171-184.

Otoi, T., S. Tachikawa, S. Kondo, T. Suzuki. 1993. Development capacity of

bovine oocytes frozen in different cryoprotectants. Theriogenology 40:

801-807.

Palta, P., and M.S. Chauhan. 1998. Laboratory production of buffalo (Bubalus

bubalis) embryos. Reproduction Fertility and development 10: 379-91.

Papis, K., M. Shimizu, and Y. Izaike. 2000. Factors affecting the survivability of

bovine oocytes vitrified in droplets. Theriogenology 15: 651-658.

Parks, J.E., and N.A. Ruffing. 1992. Factors affecting low temperature survival

of mammalian oocytes. Theriogenology 37: 59-73.

Parnpai, R., Y. Y. Liang, A. K. Paul, A. Ngernsoungnern, P. Ngernsoungnern,

M. Cairns. K. 2014. Cryopreservation of buffalo oocytes. Thai J Vet Med

Suppl. 1, 44: 119-123.

Pawshe, C.H., and S.M. Totey. 1993. Effect of cumulus cell monolayer on the in

vitro maturation of the denuded oocytes of the buffalo (Bubalus bubalis).

Theriogenology, 39: 281. (Abstract).

Pawshe, C.H., K.B. Rao and S.M. Totey. 1998. Effect of insulin-like growth

factor I and its interaction with gonadotropins on the in vitro maturation

and embryonic development, cell proliferation, and biosynthetic activity of

134

cumulus-oocyte complexes and granulosa cells in buffalo. Mol. Reprod.

Dev., 49:277-285.

Paynter, S. J., A. Cooper, B. J. Fuller and R. W. Shaw. 1999. Cryopreservation

of bovine ovarian tissue: Structural normality of follicles after thawing and

culture in vitro. Cryobiology, 38, 301−309.

Pedro, P.B., S.E. Zhu, N. Makino, T. Sakurai, K. Edashige and M. Kasai. 1997.

Effects of hypotonic stress on the survival of mouse oocytes and embryos

at various stages. Cryobiology 35: 150-158.

Pedro, P.B., S.E. Yokoyama, N.Y. Zhu, D. Oshida, Jr. M. Valdez, K. Tanaka.

Edashige and M. Kasai. 2005. Permeability of mouse oocytes and embryos

at various developmental stages to five cryoprotectants. J. Reprod. Dev.,

51: 235 – 246.

Pereira, R.M., C.C. Marques. 2008. Animal oocytes and embryo

cryopreservation. Cell and Tissue Banking, Vol 9, No 4: 267-277.

Pickering, S.J., M.H. Johnson. 1987. The influence of cooling on the

organization of the meiotic spindle of the mouse oocytes. Hum Reprod, 3:

207-216.

Portmann, M., Z.P Nagy and B. Behr. 2010. Evaluation of blastocyst survival

following vitrification/warming using two different closed carrier systems.

Human Reproduction 258 - 261.

Purohit, G.N., V. Meena and K. Solanki. 2012. Morphological Survival and

Subsequent In Vitro Maturation of Denuded and Cumulus Compact

Bubaline Oocytes Cryopreserved by Ultra Rapid Cooling. Jounal of

Buffalo Science, 1, 78-83.

Rall, W.F., G.M. Fahy. 1985. Ice free cryopreservation of mouse embryos at -

196 degrees C by vitrification. Nature, 313: 573-575.

135

Rall, W.F. 1987. Factors affecting the survival of mouse embryo

cryopreservation. J. Cryobiol. 24: 387-402.

Rho, G.J., S. Kim, J.G. Yoo, S. Balasubramanian, H.J. Lee and S.Y. Choe. 2002.

Microtubulin configuration and mitochondrial distribution after ultra-rapid

cooling of bovine oocytes. J. Mol. Reprod Dev., 63: 464-470.

Rojas, C., M.J. Palomo, Albaracin, T. Mogas. 2004. Vitrification of immature

and in vitro matured pig oocytes: Study of distribution of chromosomes,

microtubules and actin microfilaments. J. Cryobiol, 49: 211-220.

Rubinsky, B., A. Arav, G.L. Fletcher. 1991. Hypothermic protection a

fundamental property of “”antifreeze” proteins. Bioch. Bioph. Res. Comm.

180, 2: 566-571.

Ruffing, N.A., P.L. Steponkus, R.E. Pitt and J.E. Parks. 1993. Osmometric

behavior, hydraulic conductivity, and incidence of intracellular ice

formation in bovine oocytes at different developmental stages. Cryobiology

30. 562–580.

Saeki, M., M.L. Hoshi, N.L. Leibfried-Rutledge First. 1991. In vitro fertilization

and development of bovine oocytes matured in serum-free medium. Biol

reprod, 44: 256-260.

Saha, S., A. Boediono, E. Sumantri, M. Murakani, Y. Kikkawa and T. Suzuki.

1996. Vitrification of bovine in vitro matured and pronuclear oocytes with

different vitrification solutions. Theriogenology, 45, 179 (Abstract).

Samad, H.A., I.Q. Khan, N.U. Rehman and N. Ahmed. 1998. The recovery, in

vitro maturation and fertilization of, Nili-Ravi buffalo follicular oocytes.

Asian Australasian Journal of Animal Science, 11, 491–497.

Sathananthan, A. H., A. Trouson, L. Freeman and T. Brady. 1988. The effect of

cooling human oocytes. Hum. Reprod 3: 968-977.

136

Seki, S., P. Mazur. 2008. Effect of warming rate on the survival of vitrified

mouse oocytes and on the recrystallization of intracellular ice. Biol.

Reprod. 79: 727-737.

Sharma, T.G., and K. Loganathasamy. 2007. Effect of meiotic stages during in

vitro maturation on the survival of vitrified-warmed buffalo oocytes. Vet.

Res. Commun., 31: 881-893.

Sharma, T.G., K.D. Pawan, V. Chandra. 2010. Morpholigical changes, DNA

damage and developmental competence of in vitro matured, vitrified-

thawed buffalo (Bubalus bubalis) oocytes: A comparative study of two

cryoprotectants and two cryodevices. Cryobiology 60: 315 – 321.

Sharma, A., G.N. Purohit. 2008. Vitrification of immature bubaline cumulus

oocyte complexes by the open-pulled straw and conventional straw

methods and their subsequent in vitro fertilization. Veterinami Medicina,

53 (8): 427-433.

Sharma, D., and V.K. Taneja. 2000. Number and quality of buffalo oocytes

recovered relative to method of harvest, stage of estrous cycle and corpus

luteum. Indian J. Animal Sciences 70: 684-687.

Shaw, J.M., L.L. Kuleshova, D.R. Farlane and A.O. Trounson. 1997.

Vitrification properties of solutions of ethylene glycolin saline containing

PVP, ficoll or dextran. Cryobiology, 35: 219-229.

Shaw, J.M., A. Oranratncachai and A.O. Trounson. 2000. Fundamental

cryobiology of mammalian oocytes and ovarian tissue. Theriogenology

53:59-72.

Smorag, Z., B. Gajda. 1994. Cryopreservation of mammalian ova and embryos

by vitrification. Biotechnol. Adv. 12: 449-465.

137

Somfai, T., K. Kikuchi and T. Nagai. 2012. Factors affecting cryopreservation of

porcine oocytes. Juornal of Reproduction and Development 58: 17-24.

Steponkus, P.L., S.P. Myers, D.V. Lynch, L. Gardner, V. Bronshteyn, S.P.

Leibo, W.F. Rall, R.E. Pitt, T.T. Lin and R.J. MacIntyre. 1990.

Cryopreservation of Drosophila melanogaster embryos. Nature 345 170–

172.

Subramaniam, A., K.P. Devarajan and M. Mohanan. 1990. Incidence and

avoidance of zona fracture in cryopreservation bovine ova and embryos.

N.Z. Vet. J, 38: 156-157.

Sun, X., Z. Li, Y. Yi, J. Chen, G.H. Leno and J.F. Engelhardt. 2008. Efficient

term development of vitrified ferret embryos using a novel pipette chamber

technique. Biology of Reproduction 79 832–840.

Suzuki, T., S.K. Singla, J. Sujata and M.L. Madan. 1992. In vitro fertilization of

water buffalo follicular oocytes and their ability to cleave in vitro.

Theriogenology 38: 1187-1194.

Tedder, R.S., M.A. Zuckerman, A.H. Goldstone, A.E. Hawkins, A. Fielding,

E.M. Briggs, D. Irvin, S. Blair, A.M. Gorman, K.G. Patterson, D.C. Linch,

J. Heptonstall, N.S. Brink. 1995. Hepatitis – B transmission from

contaminated cryopreservation tank. Lancet 346, 137-140.

Toner, M., E.G. Cravalho and M. Karel .1990. Thermodynamics and kinetics of

intracellular ice formation during freezing of biological cells. Journal of

Applied Physics 67. 1582–1593.

Toner, M., E.G. Cravalho, M. Karel and D.R. Armant. 1991. Cryomicroscopic

analysis of intracellular ice formation during freezing of mouse oocytes

without cryoadditives. Cryobiology 28: 55-71.

138

Totey, S.M., G. Singh, M. Taneja, C.H. Pawshe and G.P. Talwar. 1992. In vitro

maturation, fertilization and development of follicular oocytes from buffalo

(Bubalus bubalis). J. Reprod. Fertil., 95: 597-607.

Totey, S.M., C.H. Pawshe and S.G. Singh. 1993. In vitro maturation and

fertilization buffalo oocytes (Bubalus bubalis): effect of media, hormones

and sera. Theriogeneolgy 39: 1153-1171.

Toth, T.L., S.G. Baka and L.L. Veeck. 1994. Fertilization and in vitro

development of cryopreserved human prophase I oocytes. J. Fertil. Steril

61: 891-894.

Trad, F.S., M. Toner and J.D. Biggers. 1998. Effects of cryoprotectants and ice-

seeding temperature on intracellular freezing and survival of human

oocytes. Hum. Reprod. 14: 1569-1577.

Trounson, A. 1992. The production of ruminant embryos of bovine oocytes in

vitro. Anim. Reprod. Sci., 28: 125-137.

Vajta, G., I.M. Lewis, M. Kuwayama, T. Greve, H. Callesen. 1998a. Sterile

application of the Open Pulled Straw (OPS) vitrification method. Cryo-

Lett. 19, 389-392.

Vajta, G., P. Holm, M. Kuwayama, P. J. Booth, H. Jacobsen, T. Greve and H.

Callesen. 1998b. Open pulled straws (OPS) vitrification: A new way to

reduce cryoinjuries of bovine oocytes and embryos. Molecular

Reproduction and Development, 51, 53−58.

Vajta, G., M. Kuwayama. 2006. Improving cryopreservation systems.

Theriogenology, 65: 236-244.

Vajta, G., and Z.P. Nagy. 2006. Are programmable freezers still needed in the

embryo laboratory. Review on vitrification Reprod. Biomed. Online 12:

779-796.

139

Vajta, G., Z.P. Nagy, A. Cobo, J. Conceicao, J. Yovich. 2009. Vitrification in

assisted reproduction: myths, mistakes, disbeliefs and confusion. Reprod

Biomed Online. 19 Suppl 3: 1-7.

Vincent, C., V. Garnier, Y. Heyman and J. Renard. 1989. Solvent effects on

cytoskeletal organization and in vivo survival after freezing of rabbit

oocytes. J Reprod Fertil 87: 809-820.

Vincent, C., M.H. Johnson. 1992. Cooling, cryoprotectants and the cytoskeleton

of the mammalian oocytes. Oxford Rev Reprod Biol 14:72-100.

Wang, S., Y. Liu, G R. Holyoak and T D. Bunch. 1997. The effect of bovine

serum albumin and fetal bovine serum on the development of pre-and post

cleavage-stage bovine embryos cultured in modified CR2 and M-199

media. Animal Reproduction Science 48: 37-45.

Wani, N.A., S. N. Maurya, A. K. Misra. 2004a. Maturation rates of vitrified-

thawed immature buffalo (Bubalus bubalis) oocytes: effect of different

types of cryoprotectants. Animal Reproduction Science. Vol 84, Iss 3, 327-

335.

Wani, N.A., S. N. Maurya, A. K. Misra, V. B. Saxena and B. D. Lakhchaura.

2004b. Effect of cryoprotectants and their concentration on in vitro

development of vitrified warmed immature oocytes in buffalo (Bubalis

bubalis). Theriogenology, 61, 831−842.

Watson, P.F., and W.V. Holt. 2001. Cryobanking the genetic resource. Taylor

and Francis, London.

Whittingham, D.G., S.P. Leibo and P. Mazur. 1972. Survival of mouse embryos

frozen to 196°C and -269°C. Science 178:411-414.

Wilmut, I., L.E.A Rowson. 1973. Experiment on the low-temperature

preservation of cow embryos. Vet Rec, 92: 686-690.

140

Wood, M.J., D. G. Whittingham and S. H. Lee. 1992. Fertilization failure of

frozen mouse oocytes is not due to premature cortinal granule release. Biol.

Reprod 46: 1187-1195.

Wood, M.J., C. Barros, C. J. Candy, J. Carroll, J. Melendez and D. G.

Whittingham. 1993. High rates of survival and fertilization of mouse and

hamster oocytes after vitrification in dimethyl sulphoxide. J. Biology of

Reproduction, 49: 489-495.

Yadav, R.C., A. Sharma, N. Garg and G.N. Purohi. 2008. Survival of vitrified

water buffalo cumulus oocytes complexes and their subsequent

development in vitro. Bulg. J. Vet. Med., 11: 55-64

Yavin, S., and A. Arav .2001. Development of immature bovine oocytes

vitrified by minimum drop size technique and a new vitrification apparatus

(VIT-MASTER). Cryobiology 43 331.

Yavin, S., and A Arav. 2007. Measurement of essential physical properties of

vitrification solutions. Theriogenology 67 81–89.

Yavin, S., A. Aroyo, Z. Roth and A Arav. 2009. Embryo cryopreservation in the

presence of low concentration of vitrification solution with sealed pulled

straws in liquid nitrogen slush. Human Reproduction 24 797–804.

Yunus, A., and B. Ayhan. 2005. Cryopreservation of immature bovine oocytes

by vitrification in straws. Ani. Repro. Sci, 92: 29-36.

Zeron, Y., M. Pearl, A. Borochov and A. Arav .1999. Kinetic and temporal

factors influence chilling injury to germinal vesicle and mature bovine

oocytes. Cryobiology 38. 35–42.

Zicarelli, L., L. Esposito, G. Campanile, R. Di Palo and D.T. Armstrong. 1997.

Effect of using vasectomized bulls in AI practice on the reproductive

efficiency of Italian buffalo cows. Anim. Reprod. Sci. 47: 171-180.

141

PHỤ LỤC

Bảng 1. Tổng đàn trâu qua các năm ở Việt Nam

Năm 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014

Số

lượng

2 996

400

2 897

700

2 886

600

2 877

000

2 712

000

2 627

800

2 559

600

2 580

000

(Theo số liệu của Tổng cục Thống kê và Cục Chăn nuôi tính đến ngày 1/4/2014)

* Sơ đồ thiết kế thí nghiệm

Tế bào trứng trâu thu từ buồng trứng lò mồ

Thí nghiệm 1

Thí nghiệm 3 Thí nghiệm 2 Thí nghiệm 4

Thí nghiệm 5

Thí nghiệm 6 Thí nghiệm 9 Thí nghiệm 8 Thí nghiệm 7

142

* Phương pháp đông lạnh - giải đông tế bào trứng trâu đầm lầy trong điều

kiện tại Việt Nam

1. Phương pháp đông lạnh

- Các loại môi trường sử dụng cho quá trình đông lạnh tế bào trứng: Dung dịch

thủy tinh hóa (VS): TCM 199 + 0,4% BSA + 0,5M Sucrose + Ethylene glycol

6M; dung dịch trước cân bằng (ES): TCM 199 + 50% VS (v/v); - Sử dụng tế bào

trứng ở giai đoạn nuôi in vitro 24 giờ sau khi thu.

- Sử dụng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ hở với cách thức tiếp xúc 2

bước. Bước 1: tế bào trứng trâu được tiếp xúc với dung dịch ES trong vòng 2

phút.

Bước 2: sau khi tiếp xúc với dung dịch ES tế bào trứng được chuyển sang dung

dịch VS và nạp vào cọng rạ hở, sau đó cọng rạ hở được nhúng ngập trực tiếp vào

trong nitơ lỏng; thời gian từ lúc chuyển vào dung dịch VS đến lúc cho vào nitơ

lỏng là 1 phút.

2. Phương pháp giải đông

- Các loại môi trường sử dụng cho quá trình giải đông tế bào trứng: dung dịch

giải đông V1: TCM 199 + 0,5M sucrose và V2: TCM 199 + 0,25M sucrose.

- Tế bào trứng sau giải đông từ cọng rạ hở sẽ được chuyển vào V1 để trong 5

phút; sau đó chuyển sang V2 để trong 5 phút.

143

144