MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS CENTRO DE BIOTECNOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA AGRÍCOLA

VETORES DE EXPRESSÃO EM Mycobacterium bovis BCG UTILIZANDO COMPLEMENTAÇÃO AUXOTRÓFICA

COMO MARCADOR DE SELEÇÃO

SIBELE BORSUK

Dissertação apresentada à Universidade

Federal de Pelotas, sob a orientação do

Prof. Odir Antônio Dellagostin, como parte

das exigências do Programa de Pós-

Graduação em Biotecnologia Agrícola,

para obtenção do título de Mestre em

Ciências.

PELOTAS Rio Grande do Sul - Brasil

Dezembro de 2004

ii

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS CENTRO DE BIOTECNOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA AGRÍCOLA

VETORES DE EXPRESSÃO EM Mycobacterium bovis BCG UTILIZANDO COMPLEMENTAÇÃO AUXOTRÓFICA

COMO MARCADOR DE SELEÇÃO

SIBELE BORSUK

Dissertação apresentada à Universidade

Federal de Pelotas, sob a orientação do

Prof. Odir Antônio Dellagostin, como parte

das exigências do Programa de Pós-

Graduação em Biotecnologia Agrícola,

para obtenção do título de Mestre em

Ciências.

PELOTAS Rio Grande do Sul - Brasil

Dezembro de 2004

iii

Dados de catalogação na fonte: Ubirajara Buddin Cruz – CRB-10/901 Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel

B738v Borsuk, Sibele

Vetores de expressão em Mycobacterium bovis BCG utilizando complementação auxotrófica como marcador seletivo / Sibele Borsuk ; orientador Odir Antônio Dellagostin. – Pelotas, 2004. – 58f. : il. color – Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Agrícola. Centro de Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas, 2004.

1.Biotecnologia. 2. Mycobacterium bovis. 3.BCG. 4.Vacinas. 5.Vetores. 6.Complementação auxotrófica. I.Dellagostin, Odir Antônio. II.Título.

CDD: 615.372

iv

SIBELE BORSUK

VETORES DE EXPRESSÃO EM Mycobacterium bovis

BCG UTILIZANDO COMPLEMENTAÇÃO AUXOTRÓFICA COMO MARCADOR DE SELEÇÃO

Dissertação apresentada à Universidade

Federal de Pelotas, sob a orientação do

Prof. Odir Antônio Dellagostin, como parte

das exigências do Programa de Pós-

Graduação em Biotecnologia Agrícola,

para obtenção do título de Mestre em

Ciências.

Banca examinadora:

__________________________ Dr. Cristina W. da Cunha ___________________________ Prof. Pedro Eduardo Almeida da Silva

___________________________

Dr. Reginaldo G. Bastos ___________________________ Prof. Odir Antônio Dellagostin (Orientador)

v

AGRADECIMENTOS

À Universidade Federal de Pelotas pela oportunidade de realizar o

curso de Pós-Graduação.

Ao Professor Odir Antônio Dellagostin pela oportunidade, orientação,

confiança, apoio sem os quais não seria possível o desenvolvimento deste

trabalho.

Aos colegas do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia

Agrícola, principalmente à Fabiana, Tiago, Rutilene e Camila, pela amizade.

Aos meus amigos e colegas de laboratório de Biologia Molecular,

Fabiana, Sandra, Suselaine, André, Marcelo, Cristina, Reginaldo, Gustavo, Alan,

Fabrício, Daiane, Tessália, Francine, Valeska, Luciano e Michel, a todos pela

amizade, respeito, auxílio e ambiente agradável de trabalho.

Um agradecimento especial à Cristina, pela disposição constante em

ajudar com seus conhecimentos.

As minhas queridas amigas Simone e Ana Paula que mesmo a

distancia não deixaram de contribuir para a execução deste trabalho.

Aos meus pais, Luiz e Maria que mesmo sem compreender muito da

vida acadêmica, sempre me deram todo o apoio, obrigada!

E a todos que direta ou indiretamente contribuíram de alguma forma

para a realização deste trabalho.

vi

ÍNDICE SUMÁRIO ..............................................................................................................vii

SUMMARY............................................................................................................viii

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1

1.1 Mycobacterium bovis...................................................................................... 1

1.2 Mycobacterium bovis BCG ............................................................................. 2

1.3. Vacinas recombinantes ................................................................................. 5

1.3.1. BCG recombinante ..................................................................................... 6

1.3.1.1.Vetores ..................................................................................................... 7

1.3.1.2. Promotores micobacterianos................................................................... 8

1.3.1.3. Sistemas de apresentação de antígenos .............................................. 10

1.3.1.4. Estabilidade do BCG recombinante (rBCG) .......................................... 11

1.3.1.5. Marcadores seletivos............................................................................. 13

1.3.1.6. Marcadores alternativos de seleção ...................................................... 14

2. OBJETIVOS...................................................................................................... 17

2.1. OBJETIVO GERAL...................................................................................... 17

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................... 17

ARTIGO 1 ............................................................................................................. 18

INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 20

MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 22

RESULTADOS...................................................................................................... 31

DISCUSSÃO ......................................................................................................... 39

REFERÊNCIAS..................................................................................................... 42

CONCLUSÕES ..................................................................................................... 46

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................... 47

vii

SUMÁRIO

BORSUK, SIBELE, Universidade Federal de Pelotas, Dezembro de 2004. Vetores

de expressão em Mycobacterium bovis BCG utilizando complementação auxotrófica como marcador de seleção. Professor Orientador: Odir Antônio Dellagostin.

Um novo sistema de expressão em Mycobacterium bovis BCG utilizando

complementação auxotrófica como marcador de seleção foi desenvolvido. Para

testar esse sistema, o gene leuD foi clonado no vetor pUS977 e sua capacidade

seletiva for avaliada por transformação das cepas de M. bovis BCG ∆leuD e M.

smegmatis mc2144 auxotróficas para o aminoácido leucina. A remoção do gene de

resistência ao antibiótico canamicina foi realizada pelo sistema de recombinação

homóloga sítio–especifica Cre-lox do Bacteriófago P1 e por digestão com a

enzima de restrição HindIII e posterior religação com T4 DNA ligase. A avaliação

da estabilidade dos novos vetores foi realizada por cultivo bacteriano em meio

seletivo (sem leucina) e em meio não–seletivo por mais de 190 gerações. A

seleção por complementação de BCG auxotrófica se mostrou equivalente à

seleção por resistência a antibiótico. O gene da canamicina foi removido por

ambos os sistemas, mas a remoção por digestão com HindIII foi mais eficaz, com

95% e 85% de remoção em M. bovis BCG ∆leuD e M. smegmatis mc2144,

respectivamente. M. bovis BCG ∆leuD transformado com pUS977leuD e cultivado

em meio seletivo (sem suplementação de leucina) se manteve estável após 7

subcultivos. Quando M. smegmatis mc2144/pUS977leuD foi cultivada em meio

seletivo, 100% das unidades formadoras de colônias mantiveram o vetor mesmo

após 20 subcultivos. Os resultados obtidos demonstram que este é um sistema de

seleção eficaz e que e pode ser utilizado para a expressão de antígenos

heterólogos em BCG permitindo a manutenção da pressão seletiva in vivo sem

uso de resistência a antibiótico.

viii

SUMMARY

BORSUK, SIBELE. Universidade Federal de Pelotas, December, 2004. Mycobacterium bovis BCG expression vectors using auxotrophic complementation as selectable marker. Adviser: Odir Antônio Dellagostin.

A new Mycobacterium bovis BCG expression system was developed using

auxotrophic complementation as selectable marker. To test this system, the gene leuD was cloned into the pUS977 vector and its selective capacity was evaluated

in M. bovis BCG ∆leuD and M. smegmatis mc2144, auxotrophic for the leucine

amino acid. The kanamycin resistance gene was removed using the bacteriophage

P1 Cre-lox site-specific recombination system or digestion with HindIII and

subsequent religation with T4 DNA ligase. Evaluation of vector stability was

accomplished by bacterial growth in selective media (without leucine) and non-

selective media (with leucine) for more than 190 generations. Selection for

auxothophic complementation of BCG was shown to be equivalent to antibiotic

resistance. Removal of the kanamycin resistance gene was successful using both

methods; however digestion was more effective, with 95% and 85% loss of

kanamycin marker in M. bovis BCG ∆leuD and M. smegmatis mc2144,

respectively. Complemented M. bovis BCG ∆leuD grown in selective media

(without leucine) was shown to be stable after seven in vitro passages. When M.

smegmatis mc2144/pUS977leuD was cultured in selective media, 100% of colony

forming units maintained the vector after 20 in vitro passages. The results indicate

that this is an effective selection system, which can be used to express foreign

antigens in BCG allowing selective pressure in vivo without using antibiotic

resistance markers.

1

1. INTRODUÇÃO 1.1 Mycobacterium bovis

Mycobacterium bovis é uma bactéria que pertence a um único gênero da

família Mycobacteriacea, o gênero Mycobacterium. Este gênero contém mais de

70 espécies que estão subdivididas em dois grandes grupos: micobactérias de

crescimento lento e de crescimento rápido. Algumas espécies são de grande

importância clínica como M. tuberculosis e M. leprae, responsáveis por duas das

mais importantes doenças que atingem o homem, a tuberculose e lepra

(Gangadharam & Jenkins, 1998; Butler & Guthertz, 2001).

As micobactérias são bactérias não esporuladas ligeiramente curvos ou

retos, mas formas bacilares ou filamentosas podem aparecer. A parede celular é

composta por grande quantidade de lipídeos, cerca de 40% do total. A estrutura

da parede celular consiste de um esqueleto de peptidioglicano covalentemente

ligado a cadeias de arabinogalactano esterificados na sua extremidade com ácido

micólico, vários lipídeos e glicolipídeos podem estar associados à parede celular

(Parish & Stover, 1998).

A composição da parede celular é responsável pelo crescimento das

micobactérias como colônias hidrofóbicas em meio sólido ou como películas em

meio líquido. O alto conteúdo de lipídeos também dificulta a coloração das células

micobacterianas pelas técnicas convencionais como a coloração Gram. Elas

possuem alta resistência à descoloração com 95% de etanol e 3% de ácido

clorídrico, e por isso são chamados de bacilos álcool-ácido-resistentes. Essa

propriedade de resistência à descoloração com uso de álcool é a base da técnica

de coloração de Ziehl-Neelsen, na qual as células são coradas com carbolfucsina,

descoradas com álcool ácido e coradas novamente com azul de metilieno, as

células micobacterianas aparecem coradas de vermelho (Butler & Guthertz, 2001).

Muitas das propriedades das micobactérias como antigenicidade,

propriedades adjuvantes, atividade anti-tumor e virulência são atribuídas aos

componentes da parede celular. O complexo arabinogalactano-peptideoglicano é

2

responsável pelas propriedades anti-tumor e adjuvantes. Muitos glicolipídeos

(lipoarabinomanose) associados à parede celular são responsáveis são antígenos

dominantes para células B. O fator corda (α-α-D trealose, 6-6 dimicolato), o qual

as bactérias se arranjam em cadeias paralelas é responsável pela virulência e

também pode servir como adjuvante (McFadden, 1992).

As micobactérias possuem alto conteúdo de C (citosina) G (guanina) (50 a

70%) em seu genoma (McFadden, 1992; Cole et al., 1998) e apresentam também

grande número de elementos transponíveis como o elemento de inserção IS900 e

IS6110 ou IS986 e transposons da família Tn21(McFadden, 1992)

1.2 Mycobacterium bovis BCG

Albert Calmette e Camille Guérin, trabalhando no Instituto Pasteur de Lille,

França atenuaram uma cepa virulenta de M. bovis. Em 1908 obtiveram uma cepa

virulenta isolada por Nocardia em 1902 a partir de uma mastite bovina. A partir

daí, durante o período de 1908 a 1921 cultivaram essa cepa em meio contento

bile bovina por 231 sucessivos subcultivos, o que resultou na atenuação desta

cepa. Durante este período vários testes demonstraram que essa cepa havia

perdido a virulência, mas ainda mantinha suas propriedades imunogências. Hoje

esta cepa é chamada de Bacilo de Calmette e Guérin ou BCG e é utilizada para

prevenção das formas mais graves da tuberculose (Lugosi, 1992).

Desde 1921, várias cepas filhas derivaram da vacina BCG original, estas

foram denominadas então pelo país ou laboratório de onde foram propagadas.

Mais de 50 sub-cepas de BCG são conhecidas, mas somente seis estão

atualmente em uso como vacina: BCG Connaught, BCG Glaxo, BCG Moreau,

BCG Pasteur, BCG Tokyo, BCG Danish (Minnikin et al., 1984; Milstien & Gibson,

1989; Lagranderie et al., 1996).

Estas cepas apresentam diferenças e podem ser divididas em dois grandes

grupos com base em 3 características: secreção do antígeno MPB70; composição

da parede celular e “DNA fingerprinting”. Um grupo que inclui BCG Tokyo, secreta

MPB70 em grandes quantidades e, contém metoximicolato na parede celular e

3

possui duas cópias do elemento de inserção IS6110, as cepas originais são

derivadas do Instituto Pasteur de 1925 a 1928. O segundo grupo, o qual inclui as

cepas BCG Glaxo e BCG Pasteur, não secreta o antígeno MPB70, não contem

metoximicolato como componente de sua parede celular e possui uma única cópia

do elemento de inserção IS6110. Essas cepas são derivadas de culturas após de

1938 (Behr & Small, 1999). Subseqüentes estudos moleculares revelaram

diferenças entre BCG e M. bovis virulento (Mahairas et al., 1996) bem como

diferenças entre as várias cepas de BCG (Collins & De Lisle, 1987; Fomukong et

al., 1992).

A primeira vacinação utilizando BCG foi realizada em 1921, em Paris. Em

1928 o BCG foi recomendado pela Liga das Nações Unidas e passou a ser

amplamente utilizado contra a tuberculose. De 1929 a 1930 a segurança do BCG

foi questionada quando 72 crianças de um total de 250 morreram após receberem

a vacina em Lübeck, Alemanha. Mas subseqüentes investigações mostraram que

as mortes foram devidas a uma contaminação acidental com a cepa virulenta de M. tuberculosis e não por uma reversão da virulência do BCG. Em 1931 a

Academia de Medicina de Paris reforça as recomendações da Liga das Nações

Unidas, confirmando a segurança do BCG para uso em humanos e animais. Após

a Segunda Guerra Mundial, devido a grande epidemia da tuberculose,

intensificou-se a utilização de BCG com acompanhamento da UNICEF e OMS

(Lugosi, 1992). Atualmente o BCG é uma das vacinas mais utilizadas

mundialmente, já tendo sido administrada a mais de três bilhões de pessoas

(Bloom & Fine, 1994).

No entanto, BCG tem mostrado uma eficácia variável de 80 % a 0 %

dependendo da região. Esta baixa eficácia pode ser devida à perda de muitas

regiões do genoma de BCG durante o processo de atenuação (Cole et al., 1998).

Comparando com o genoma de M. bovis virulento, 15 a 16 regiões de M. bovis

não estão presentes em BCG (Behr & Small, 1999). Regiões regulatórias podem

ter sido perdidas em BCG. A ausência dessas proteínas regulatórias poderia

ocasionar a perda ou expressão inadequada de antígenos imunogênicos e

imunoprotetores importantes para gerar uma resposta imune adequada (Mahairas

4

et al., 1996). Além disso, com o advento da AIDS (Síndrome da Imunodeficiência

Adquirida) BCG pode ser oportunista em situações de imunidade deficiente ou

comprometida (Dye et al., 1999).

Por isso, grandes esforços têm sido feitos na tentativa de buscar um novo

candidato à vacina contra tuberculose que tenha uma melhor eficácia. Vários

estudos têm descrito o desenvolvimento de cepas atenuadas auxotróficas de BCG

ou M. tuberculosis como novos candidatos a vacina contra tuberculose (Mcadam

et al., 1995b; Guleria et al., 1996; Bange et al., 1996; Pavelka et al., 1999; Jackson

et al., 1999; Hondalus et al., 2000; Chambers et al., 2000; Smith et al., 2001;

Pavelka et al., 2003). M. tuberculosis auxotrófico para o aminoácido leucina

conferiu alguma proteção contra desafio com a cepa virulenta de M. tuberculosis

(Hondalus et al., 2000). Mutantes auxotróficos de M. tuberculosis e M. bovis BCG

com defeito na biossíntese de purinas protegeram porcos da índia vacinados

(Jackson et al., 1999). Guleria et al. (1996) sugeriram que mutantes auxotróficos

de BCG poderiam representar um candidato à vacina contra tuberculose em

populações de risco para HIV. Camundongos BALB/c imunodeficientes foram

imunizados com os mutantes auxotróficos e após desafio com a cepa virulenta de M. tuberculosis, muitos dos mutantes conferiram proteção equivalente ao BCG

convencional. Mutações definidas em genes envolvidos na biossíntese dos

aminoácidos metionina (metB), prolina (proC) e triptofano (trpD) se mostraram

avirulentos em hospedeiros imunocomprometidos, conferindo uma proteção

equivalente ou melhor que BCG (Smith et al., 2001).

Outra tentativa de melhorar a eficácia de BCG é utilizar BCG expressando

várias citocinas como a interleucina 2, IFN-γ, GM-CSF (fator estimulante de

colônias de granulócitos e macrófagos) (Murray et al., 1996; Wangoo et al., 2000).

Vacinas de subunidades baseadas em proteínas secretadas e não–secretadas,

bem como componentes lipídicos e carboidratos e vacinas de DNA também estão

sendo investigadas quanto a sua eficácia em proteger contra a tuberculose (Davis

et al., 1993; Roberts et al., 1995).

5

1.3. Vacinas recombinantes

Os recentes avanços na área da tecnologia do DNA recombinante

possibilitam a manipulação genética de microorganismos, e conseqüentemente

tornam possível a introdução de genes exógenos em cepas vacinais atenuadas, o

que é uma grande promessa para o desenvolvimento de vacinas recombinantes

multivalentes.

Existem vários tipos de vacinas recombinantes: vacinas de subunidade,

vacinas de DNA e vacinas vetorizadas atenuadas.

Entre as vacinas recombinantes vetorizadas, podemos citar os vetores virais,

os quais são apropriados quando é necessário que ocorram modificações pós-

traducionais no antígeno expresso por esse vetor, quando essas modificações são

essenciais para a expressão do epitopo na conformação adequada. O vírus da

vaccínia e adenovírus tem sido utilizados para a expressão de antígenos

heterólogos (Mackett et al., 1982). Vaccínia e Adenovírus recombinantes foram

utilizados para expressar a glicoproteína G do vírus rábico (Brochier et al., 1991;

Paolazzi et al., 1999). Vários outros antígenos virais foram expressos em

Vaccínia. As proteínas Gag, Pol, Tat, Rev, Nef e Env de SIV foram expressas em

Vaccínia, em vacinas de DNA e em “Semliki Forest vírus”, onde a combinação dos

diferentes sistemas de apresentação de antígenos se mostrou eficaz (Michelini et

al., 2004). Citocinas como as interleucinas 4 (IL4), 2(IL2) e 12 (IL12) (Ebert et al.,

2004; McCurdy et al., 2004) e antígenos bacterianos como o antígeno 85A de M.

tuberculosis também já foram expressos em vaccínia (McShane et al., 2004)

Várias cepas bacterianas estão sendo utilizadas como vetores

recombinantes, como Mycobacterium bovis BCG (Stover et al., 1991), Escherichia

coli (Formal et al., 1984), Salmonella typhi e Salmonella typhimurium (Germanier &

Furer, 1975), entre outras. No caso dos vetores bacterianos o gene heterólogo é

inserido em um vetor plasmidial contendo um marcador de seleção e introduzido

na bactéria pela técnica de transformação. Este irá se replicar de forma autônoma

ou irá se integrar no genoma bacteriano (Lugosi et al., 1989).

6

Uma variedade de antígenos já foi expressa em E. coli, apresentando uma

variabilidade de resultados quanto a sua eficácia na proteção contra desafio. Essa

variabilidade foi devida à via de imunização utilizada e sistema de apresentação

de antígeno (Cirillo et al., 1995). Um dos primeiros antígenos a ser expresso em Salmonella foi a subunidade

B da enterotoxina termo-lábil de E. coli (LT-B), para a qual foram detectadas

resposta imune secretora e sistêmica (Maskell et al., 1987). Desde então vários

antígenos virais como a proteína P25 de SIV (Steger et al., 1999), antígenos

bacterianos como a proteína Ag85B de M. bovis BCG, o antígeno V de Yersinia

pestis e ureases de Helicobacter pilori (Hess et al., 2000; Londono-Arcila et al.,

2002; Garmory et al., 2003). O gene msp1 do protozoário Plasmodium falciparum

também foi expresso em Salmonella (Qian & Pan, 2002). Recentemente foi

avaliado o impacto da imunização oral com Salmonella typhi Ty21a expressando

as ureases A e B de Helicobacter pylori em voluntários humanos. Neste os

voluntários foram pré-imunizados com Salmonella typhi Ty21a, recebendo após

três doses de Salmonella recombinante. Os resultados mostraram que resposta

imune celular para as ureases de H. pylori foi obtida em 56% da população

imunizada (Metzger et al., 2004).

O bacilo de Calmette e Guérin (BCG) tem sido utilizado para expressar uma

grande quantidade de antígenos heterólogos de bactérias, vírus, protozoários,

citocinas e toxinas (Ohara & Yamada, 2001). Este veículo de apresentação de

antígenos tem a grande vantagem de já ser administrado rotineiramente como

vacina contra a tuberculose o que pode tornar mais fácil sua validação como

vacina recombinante.

1.3.1. BCG recombinante

O BCG possui algumas características que o tornam um excelente

candidato à vacina recombinante multivalente: 1- é uma das vacinas mais

utilizadas mundialmente; 2- é recomendada pela OMS para ser administrada ao

nascimento e por via oral não sendo afetada pelos anticorpos maternos; 3 - possui

7

um potente efeito imunoestimulante e adjuvante; 4- é capaz de estimular tanto

resposta imune humoral quanto celular; 5- é uma das vacinas replicantes mais

estáveis, induzindo imunidade duradoura; 6- é segura; 7- estável a temperatura

ambiente e tem um baixo custo de produção (Bloom & Fine, 1994).

Nos últimos anos, muitos avanços tem sido feitos no que diz respeito a

manipulação genética de micobactérias. Estes incluem o estabelecimento de

protocolos de transformação em micobactérias, geração de vetores bifuncionais

(shuttle vectors) para uso em E. coli e micobactéria, desenvolvimento de vários

sistemas de expressão, incluindo diferentes promotores e sistemas de

apresentação de antígenos (Jacobs et al., 1987; Snapper et al., 1988; Husson et

al., 1990; Matsuo et al., 1990). Isso permitiu a avaliação de BCG recombinante

como veículo de apresentação de antígenos heterólogos. Vários estudos já

demonstraram a viabilidade de BCG em expressar antígenos heterólogos de

bactérias, vírus, parasitas e de toxinas com bastante êxito (O'Donnell, 1997;

Ohara & Yamada, 2001).

1.3.1.1.Vetores Os vetores de expressão em micobactérias são chamados de “shuttle

vectors”, pois permitem a manipulação em E. coli e micobactéria pelo fato de

possuírem origem de replicação para ambas as espécies (Jacobs et al., 1987).

Os sistemas de expressão desenvolvidos para micobactérias foram

baseados em fagos (Snapper et al., 1988) ou em plasmídeos (Jacobs et al., 1987).

Os plasmídeos possuem um sistema de replicação autônoma, podendo estar em

número elevado de cópias no citoplasma bacteriano (Stover et al., 1991). Estes

foram desenvolvidos utilizando o replicon (plasmídeo) micobacteriano pAL5000

isolado de M. fortuitum (Labidi et al., 1985) associado a um vetor de clonagem em

E. coli e possuindo em gene de resistência a canamicina (Snapper et al., 1988).

Assim foram construídos os vetores pMV261 (Stover et al., 1991), pRR3 (Winter et

al., 1991) e pEP3 (Radford & Hodgson, 1991).

8

A utilização de seqüências específicas de micobactérias pode levar a

integração do vetor no genoma micobacteriano. Um sistema integrativo utilizado

em micobactéria é derivado do micobacteriófago L5. O vetor possui um sítio de

integração attP e um gene da intergrase (int) que promovem a integração deste no

genoma micobacteriano ao sítio attB. No entanto, este sistema pode levar a

integração de uma única cópia ao genoma (Lee et al., 1991). Vetores integrativos

baseados no elemento de inserção IS900 promovem uma integração aleatória ao

genoma bacteriano, apresentando o potencial de estar presente em várias cópias

(Dellagostin et al., 1993).

1.3.1.2. Promotores micobacterianos

Os promotores micobacterianos são muito importantes, pois regem o nível de

expressão dos antígenos heterólogos. Os promotores que tem sido mais utilizados

são os dos genes hsp60 e hsp70, ambos pertencem a família das proteínas de

choque térmico (Aldovini & Young, 1991; Stover et al., 1991). Outros promotores

tem sido utilizados em “shuttle vectors” como o promotor pAN, isolado de M.

paratuberculosis próximo a um elemento de inserção IS900 (Murray et al., 1992),

o promotor da proteína de 19 kDa de M. tuberculosis (Stover et al., 1993) e o

promotor 18 kDa de M. leprae (Dellagostin et al., 1993; Dellagostin et al., 1995), o

promotor α (alfa) de M. kansaii (Matsuo et al., 1990), o promotor de β lactamase

de M. fortuitum pBlaF* (Timm et al., 1994) bem como o promotor GroES/EL1 de

Streptomyces albus (Winter et al., 1991).

A proteína LacZ e os antígenos gp120 de HIV-1, gag de SIV e fragmento C

da toxina tetânica foram expressos sob o controle dos promotores hsp60 e hsp70

em vetores integrativos e replicativos (Aldovini & Young, 1991; Stover et al., 1991).

Fuerst et al. (1991) expressaram os antígenos gag, pol, e env de HIV-1, bem

como a proteína β-galactosidase em níveis acima de 10% de proteína celular total

em BCG com os promotores hsp60 e hsp70, ambas as respostas imune celular de

célula T citotóxica T (CTL) e linfócitos T helper foram detectados para a β-

galactosidase .

9

Vários outros antígenos de vírus, bactérias, parasitas e até citocinas tem sido

expressas sob controle destes promotores. A subunidade B da toxina colérica foi

expressa em BCG sob controle do promotor hsp60 e imunização intranasal com

BCG recombinante desenvolveu uma forte resposta de IgA (Biet et al., 2003).

BCG expressando uma forma truncada da proteína GP5 e a proteína M de

PRRSV sob controle do promotor hsp60 diminuiu os efeitos causados por desafio

com cepa virulenta de PRRSV em porcos, sugerindo uma proteção parcial (Bastos et al., 2004).

Winter et al. (1995) expressaram a proteína nef de SIV utilizando o promotor

pAN e BCG expressando esta proteína induziu resposta de células T citotóxicas

(CTL) contra o peptídeo sintético nef em camundongos. O gene gp63 de Leishmania major foi expresso em BCG sob o controle do promotor pAN, e

fusionado na região N-terminal à β-lactamase. BCG recombinante produzindo

Gp63 como uma proteína híbrida com a β-lactamase promoveu proteção

significativa contra desafio com L. major em camundongos BALB/c imunizados

(Abdelhak et al., 1995).

Matsuo et al. (1990) introduziram um epitopo da proteína Gag p17 do vírus

HIV-1 em um sítio adjacente ao antígeno α resultando em uma expressão da

proteína secretada, mas resposta imune não foi obtida. O epitopo V3 do vírus HIV-

1 quando expresso fusionado ao antígeno α foi secretado por BCG induzindo uma

resposta protetora em camundongos (Kameoka et al., 1994).

Winter et al.(1991) expressaram o antígeno nef de HIV-1 sob o controle de

um cassete de expressão contendo o promotor groES/EL1 de S. albus,

demonstrando a viabilidade desse sistema.

O antígeno OSpA de B. burgdorferi foi expresso sob o controle do promotor

de 19 kDa (Stover et al., 1993). O epitopo VP1 140-160 do vírus da febre aftosa

foi expresso fusionado a proteína de 18 kDa (Dellagostin et al., 1993; Stover et al.,

1993). A proteína de 18 kDa de M. tuberculosis foi fusionada a epitopos de

células B e T para a nucleoproteína do vírus rábico (18-kDa::B+T) e a expressão

dirigida pelos promotores hsp60 e 18 kDa. A expressão controlada pelo promotor

10

hsp60 resultou em um aumento do titulo de anticorpos até 60 dias após

imunização (da Cruz et al., 2001).

A subunidade S1 da toxina de Pertusis (S1PT) foi expressa sob o controle do

promotor da β- lactamase pBlaF* (Nascimento et al., 2000). O fragmento C da

toxina tetânica (FC) e a toxina diftérica mutada atóxica CRM (197) reguladas pelo

promotor pBlaF* ou fusionadas a seqüência sinal foram expressas em BCG.

Imunização de camundongos com rBCG-FC ou a combinação com rBCG

expressando CRM197, induziu anticorpos anti-toxina tetânica. A combinação

induziu proteção de 75% em camundongos desafiados (Mazzantini et al., 2004). Os genes nef e gag (p26) de SIV foram expressos em BCG reguladas sob o

promotor pBlaF* em vetores integrativos e replicativos (Mederle et al., 2002).

1.3.1.3. Sistemas de apresentação de antígenos As formas de apresentação de antígenos heterólogos em BCG podem ser:

citoplasmática, secretada e ligada à membrana micobacteriana. Essas diferentes

formas de apresentação podem influenciar na resposta imune a um antígeno

heterólogo bem como na natureza da resposta imune.

O antígeno α de M. kansaii (Matsuo et al., 1990) e outras duas proteínas

altamente relacionadas, o antígeno 85A e o antígeno 85 B formam o complexo de

proteínas secretórias (Matsuo et al., 1990). Os primeiros 40 aminoácidos do

antígeno α constituem um peptídeo sinal com domínio hidrofóbico e sinais de

reconhecimento de peptidases, essas características indicam uma rota de

secreção deste antígeno (Tjalsma et al., 2000). Após a secreção do antígeno

ocorre a clivagem da seqüência sinal no aminoácido 283 (Matsuo et al., 1988).

Quando proteínas heterólogas são fusionadas a esses peptídeos, são

secretadas com sucesso (Lagranderie et al., 1993; Stover et al., 1993). O antígeno

Sm14 de Schistosoma mansoni foi expresso em BCG fusionado com a seqüência

sinal da proteína beta-lactamase de M. fortuitum, a proteína recombinante foi

localizada na parede celular bacteriana (Varaldo et al., 2004). No entanto, em

alguns casos a secreção não é tão eficiente. O antígeno OspA de Borrelia

11

burgdorferi fusionado ao antígeno α foi secretado, mas a maior parte foi localizado

no citoplasma do BCG. No entanto, essa exportação foi suficiente para promover

uma boa resposta humoral (Stover et al., 1991). A mesma situação ocorreu

quando Langermann et al. (1994) fusionaram a proteína A de superficie de

Pneumococcus (PspA) à seqüência sinal pspA.

A proteína de 19 kDa está predominantemente associada à membrana ou

parede celular (Garbe et al., 1993). Os primeiros 20 aminoácidos constituem uma

seqüência sinal lipoprotéica típica, a homologia desta seqüência com outras

lipoproteínas bacterianas indicam que uma cisteína na posição 22 é um ponto de

acetilação e, portanto uma região de ancoragem à membrana (Young & Garbe,

1991). Antígenos expressos em BCG fusionados ao antígeno de 19 kDa estão

ancorados à membrana micobacteriana. Bastos et al. (2002) compararam a

expressão das proteínas G5 e M do PRRSV citoplasmaticamente ou fusionadas a

lipoproteína de 19 kDa. Anticorpos neutralizantes foram produzidos somente

quando essas proteínas estavam fusionadas a lipoproteína de 19 kDa. Estudo

com BCG expressando o antígeno p60 de L. monocytogenes no citoplasma,

membrana (fusionado a lipoproteína de 19 kDa) e secretada (fusionado ao

antígeno α) demonstrou uma proteção de 100% com BCG expressando a proteína

ancorada a membrana, de 80% quando exportado e de 20% quando a expressão

do antígeno p60 foi citoplasmática (Grode et al., 2002).

A ausência de seqüências sinais de exportação ou de sinais de ancoragem

dos antígenos heterólogos à membrana resulta na expressão destes no

citoplasma bacteriano do BCG (Kaufmann & Hess, 1999)

1.3.1.4. Estabilidade do BCG recombinante (rBCG) A estabilidade do BCG expressando um antígeno heterólogo é influenciada

por diversos fatores. Um deles é o nível de toxicidade do antígeno heterólogo

expresso. Stover et al. (1991) foi incapaz de expressar o gene gp120 de HIV-1 em

vetor replicativo, mas conseguiu expressão quando este foi expresso em vetor

12

integrativo. Esse último sistema diminui o nível de expressão pelo fato de ter

somente uma cópia do gene sendo expresso.

Outro fator relevante é a persistência dos vetores em BCG recombinante in

vitro e in vivo. Vários estudos demonstram uma estabilidade variável de vetores

replicativos in vitro. Alto grau de estabilidade foi mostrado em BCG expressando o

antígeno α na ausência de seleção (Horwitz et al., 2000). BCG expressando a

proteína quimérica V3J1 foi estável in vitro por mais de 450 passagens (Kawahara

et al., 2002). No entanto graus variados de instabilidade também foram

reportados. A expressão da β-galactosidase dirigida pelo promotor hsp60 foi

perdida em 90% dos clones no segundo subcultivo em meio seletivo (Medeiros et

al., 2002). Deleções também são freqüentes e comprometem a estabilidade do

BCG recombinante (Chawla & Das Gupta, 1999). Vários trabalhos descreveram a

estabilidade in vivo de BCG expressando a proteína β-galactosidase. A

estabilidade variou de 100% (Stover et al., 1991), 45% (Murray et al., 1992) e de

34 a 59% (Lagranderie et al., 1993). Nem sempre uma recuperação de BCG

significa que este ainda esteja expressando o antígeno heterólogo. Nascimento et

al. (2000) não detectaram nenhum nível de expressão da proteína S1 de B.

pertusis sob controle do promotor pBlaF*, após recuperar BCG recombinante de

camundongos, no entanto as bactérias ainda resistentes a canamicina foram de

86 a 85%.

A utilização de vetores integrativos tende a resultar em uma maior

estabilidade do rBCG, provavelmente por uma redução na expressão do antígeno

heterólogo e por uma melhor retenção do DNA e menor freqüência de mutações

visto que este estará integrado ao cromossomo do BCG. Mederle et al. (2002)

compararam a estabilidade de vetores replicativos e integrativos expressando os

genes nef e gag de SIV em BCG. Após 100 dias da imunização a resistência a

canamicina foi mantida em 60% das colônias de BCG transformados com vetores

replicativos e de 85% das colônias de BCG transformados com vetores

integrativos. No entanto alta freqüência de instabilidade de vetores integrativos em

M. smegmatis e BCG também foi relatada. A perda dos vetores integrativos

ocorreu em cepas recA+ e em recA-, indicando um mecanismo independente de

13

RecA. A perda dos vetores integrativos foi prevenida quando o gene da integrase

foi carreado em um plasmídeo incapaz de se replicar em micobactéria (Springer et

al., 2001).

1.3.1.5. Marcadores seletivos

Um vetor de expressão em micobactéria deve conter necessariamente

algumas características como origem de replicação em micobactéria, um promotor

funcional em micobactéria, um sítio de múltipla clonagem para inserção do gene

que codifica para o antígeno heterólogo e um marcador de seleção, que possibilite

a seleção de transformantes e coloque uma pressão de sobrevivência para que a

bactéria mantenha o vetor.

Os marcadores seletivos mais utilizados são genes de resistência a

antibióticos. A utilização de marcadores seletivos por resistência a antibiótico em

micobactérias é limitada a poucas drogas devido à baixa permeabilidade da

membrana glicolipídica (Jalier et al., 1991). A parede celular micobacteriana

contém grande quantidade de lipídeos que formam uma camada hidrofóbica que é

responsável pela impermeabilidade a componentes hidrofílicos (Minnikin et al.,

1984). Os principais lipídeos são os ácidos micólicos que estão esterificados ao

arabinogalactano, o qual está ligado covalentemente ao peptidioglicano. Esta

camada de ácido micólico e os lipídeos externos livres são os responsáveis pela

barreira de permeabilidade da parede celular micobacteriana (Rastogi et al.,

1990).

Os marcadores de resistência a canamicina tem sido os mais utilizados em

sistemas derivados de fagos ou plasmídeos para várias espécies de micobactérias

como: M.smegmatis, M. parafortuitum, M. aurum, M. tuberculosis e M. bovis BCG

(Snapper et al., 1988; Lugosi et al., 1989; Ranes et al., 1990; Snapper et al., 1990;

Hermans et al., 1993). Resistência a higromicina, sulfonamidas, cloranfenicol e

apramicina também tem sido utilizados (Snapper et al., 1990; Radford & Hodgson,

1991; Garbe et al., 1994; Paget & Davies, 1996).

14

Pelo fato de vacinas baseadas em BCG recombinante serem vacinas vivas,

podendo permanecer no organismo por longos períodos, não seria aceitável a

administração, em modelos humanos, de uma bactéria carregando um gene de

resistência a antibiótico. Além disso, o uso desse sistema de seleção é muito útil

quando as avaliações são feitas in vitro, quando podemos manter a pressão

seletiva, mas quando a vacina recombinante é administrada in vivo a pressão

seletiva é perdida e pode comprometer a persistência do vetor contendo o

antígeno heterólogo no BCG recombinante, tendo como conseqüência direta uma

possível alteração nos níveis de expressão do antígeno heterólogo, prejudicando a

resposta imune induzida por este antígeno.

Por isso buscam-se outras formas de seleção que possam ser empregadas

em substituição ao uso de resistência a antibióticos.

1.3.1.6. Marcadores alternativos de seleção

Uma alternativa é a introdução de genes de resistência à lise por

bacteriófagos, como a proteína tipo repressora codificada pelo gene 71 de

micobacterófago L5 (Donnellywu et al., 1993).

Outra proposta é a utilização de genes de resistência a metais pesados

como o mercúrio. Os genes de resistência ao mercúrio (mer) de Pseudomonas

aeruginosa e de Serratia marcescens foram utilizados como marcadores de

seleção para transformação em M. smegmatis, M. bovis BCG e M. tuberculosis

com altos níveis de estabilidade e de resistência (Baulard et al., 1995). Esse

sistema de seleção foi utilizado para expressar a subunidade β da gonadotrofina

croniônica humana (hCGβ) (Baulard et al., 1996). O Antígeno GRA1 de

Toxoplasma gondi e GST de Shistossoma também foram expressos em BCG

recombinante utilizando estes marcadores (Kremer et al., 1998; Supply et al.,

1999). No entanto, a utilização de mercúrio poderia levar a uma concentração de

metal pesado que não seria adequada para a administração em humanos.

Outra abordagem que tem sido sugerida para a seleção de recombinantes

de BCG é a utilização de uma estratégia de dupla seleção para a recombinação

15

homóloga em um gene que não é essencial. O vetor deve conter um marcador de

resistência a antibiótico para uma seleção primária e um segundo marcador com

um efeito letal dominante para contra-seleção de clones que perderam o DNA do

vetor. O marcador para contra seleção mais utilizado é o gene sacB de Bacillus

subtilis que codifica para uma levansucrase, a expressão de sacB é letal para M.

smegmatis e M. bovis BCG na presença de 10% de sacarose (Pelicic et al., 1996).

Pavelka et al. (1999) utilizaram este marcador de contra-seleção em um vetor

suicida (pTUB657) para a troca alélica de mutações deletéricas não marcadas no

cromossomo de M. bovis BCG e M. tuberculosis H37Rv. A contra-seleção com

sacB também foi utilizada em M. avium com sucesso (Irani et al., 2004). Outros

marcadores de contra-seleção como rpsL que codifica para a proteína ribosomal

S12 e torna o hospedeiro resistente a streptomicina e o pyrF também são

utilizados (Sander et al., 1995; Knipfer et al., 1997).

A proposta mais recente para a seleção de recombinantes em BCG sem o

uso de marcadores de resistência a antibióticos é a utilização de marcadores

auxotróficos. Um sistema de seleção auxotrófico requer a necessidade do

isolamento de cepas de BCG auxotróficas bem definidas, que necessitem para o

seu crescimento da suplementação de aminoácidos essenciais não sintetizados

em mamíferos. A seleção seria realizada através de um vetor de expressão que

contenha, além do cassete de expressão com o promotor e o gene heterólogo a

ser expresso, um gene que complemente a mutação da cepa e restaure a

capacidade do BCG de crescer em meio mínimo deficiente do respectivo

aminoácido. Desse modo um BCG recombinante poderia ser selecionado em

meio de cultivo sem o aminoácido para o qual este é auxotrófico, o crescimento

dos transformantes seria dado pela complementação da mutação existente na

cepa. O sistema terá como base um vetor contendo um gene de resistência a

antibiótico. Este gene terá de ser removido, essa remoção pode ser removido por

diferentes sistemas, como por um evento de recombinação sítio-específica

utilizando por exemplo o sistema Cre-lox do Bacteriófago P1 (Sternberg et al.,

1981; Ayres et al., 1993), ou mesmo por uma digestão com enzimas de restrição.

16

Na literatura encontraram-se trabalhos que descrevem o desenvolvimento

de micobactérias mutantes auxotróficas propondo a utilização destas cepas como

novos candidatos à vacina contra tuberculose, mais segura quando administrada

em hospedeiros imunodeprimidos (Mcadam et al., 1995; Guleria et al., 1996;

Jackson et al., 1999; Parish & Stoker, 2000) e com a possibilidade de não

comprometer o diagnóstico de tuberculose através do teste de tuberculina

(Pavelka et al., 1999; Hondalus et al., 2000; Chambers et al., 2000; Smith et al.,

2001; Hondalus et al., 2004).

Bange et al. (1996) mostraram que o crescimento de M. bovis BCG

auxotrófico para leucina era restrito no interior de macrófagos. Quando este

mutante foi complementado com o gene leuD de Escherichia coli os níveis de

crescimento no interior dos macrófagos foram restabelecidos. Esses resultados

mostram que é possível restaurar uma cepa de BCG auxotrófica complementado a

mutação existente por transformação com o gene nativo.

A complementação auxotrófica pode então ser utilizada como forma

seletiva, constituindo um novo sistema de seleção que dispensa o uso de

resistência a antibiótico.

17

2. OBJETIVOS 2.1. OBJETIVO GERAL

1- Construir e avaliar vetores de expressão em M. bovis BCG utilizando leuD

como marcador seletivo.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1- Construir vetores de complementação da cepa de M. bovis BCG ∆leuD

auxotrófica.

2- Avaliar a eficiência de remoção do gene de resistência a canamicina

através do sistema Cre-lox e através da digestão com uma enzima de

restrição que apresenta sítios adjacentes ao marcador seletivo.

3- Avaliar a estabilidade estrutural e funcional dos vetores contendo a

complementação auxotrófica.

18

ARTIGO 1

Vetores de expressão em Mycobacterium bovis BCG utilizando

complementação auxotrófica como marcador de seleção

19

Vetores de expressão em Mycobacterium bovis BCG utilizando complementação auxotrófica como marcador de seleção

Borsuk, S.1 2; Cunha, C.W.1; Mendrum, T.3; McFadden, J.3; Dellagostin, O.A.1

1Centro de Biotecnologia, 2Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Agrícola, Pelotas, Brasil

3 University of Surrey, Guildford, Surrey, UK

Um novo sistema de expressão em Mycobacterium bovis BCG utilizando

complementação auxotrófica como marcador de seleção foi desenvolvido. Para

testar esse sistema, o gene leuD foi clonado no vetor pUS977 e sua capacidade

seletiva foi avaliada por transformação das cepas M. bovis BCG ∆leuD e M.

smegmatis mc2144 auxotróficas para o aminoácido leucina. A remoção do gene de

resistência ao antibiótico canamicina foi realizada pelo sistema de recombinação

homóloga sítio–específica Cre-lox do Bacteriófago P1 e por digestão com a

enzima de restrição HindIII e posterior religação com T4 DNA ligase. A avaliação

da estabilidade dos novos vetores foi realizada por cultivo bacteriano em meio

seletivo (sem leucina) e em meio não–seletivo por mais de 190 gerações. A

seleção por complementação de BCG auxotrófica se mostrou equivalente à

seleção por resistência a antibiótico. O gene da canamicina foi removido por

ambos os sistemas, mas a remoção por digestão com HindIII foi mais eficaz, com

95% e 85% de remoção em M. bovis BCG ∆leuD e M. smegmatis mc2144,

respectivamente. Quando M. smegmatis mc2144 foi cultivada em meio seletivo

(sem suplementação de leucina), 100% das UFC mantiveram o vetor até o 20°

subcultivo. M. bovis BCG ∆leuD cultivado em meio seletivo se manteve estável o

7º subcultivo. Os resultados obtidos demonstram que este é um sistema de

seleção eficaz e que e pode ser utilizado para a expressão de antígenos

heterólogos em BCG permitindo a manutenção da pressão seletiva in vivo sem

uso de resistência a antibiótico.

20

INTRODUÇÃO

Mycobacterium bovis BCG é uma das vacinas mais utilizadas

mundialmente. Confere uma boa proteção, induzindo tanto resposta imune

humoral como celular contra a tuberculose. Além de ser um potente adjuvante,

segura, estável a temperatura ambiente e ter baixo custo de produção, pode ser

administrada logo após o nascimento em dose única e por via oral (Bloom & Fine,

1994b). Essas características tornam o M. bovis BCG um forte candidato ao uso

como vacina recombinante (Stover et al., 1991), sendo capaz de expressar

antígenos recombinantes de múltiplos patógenos. Vários estudos já demonstraram

a viabilidade de BCG em expressar antígenos heterólogos de bactérias, vírus,

parasitas entre outros (O'Donnell, 1997; Ohara & Yamada, 2001). Além disso,

BCG por ser uma vacina administrada rotineiramente, é o veículo de apresentação

de antígenos recombinantes de mais fácil e possível validação.

O processo de manipulação genética requer a utilização de marcadores

seletivos que permitam o monitoramento da transferência e manutenção de

antígenos heterólogos em BCG. Os mais comumente utilizados são os genes que

conferem resistência a antibióticos. O gene de resistência a canamicina do Tn5 e

Tn903, foram os primeiros a serem utilizados. M. bovis BCG, M. aurum, M.

parafortuitum e M. tuberculosis são sensíveis a baixas concentrações de

canamicina e possuem baixa taxa de reversão espontânea (Gicquel, 1995).

Outros genes de resistência a antibiótico tais como higromicina, sulfonamida,

clorafenicol e tetraciclina, também são utilizados em micobactérias de crescimento

lento (Garbe et al., 1994; Gicquel, 1995).

Apesar dos marcadores de resistência a antibiótico serem utilizados com

sucesso, o desenvolvimento um sistema de clonagem que dispense seu uso é

fundamental para permitir a utilização do BCG recombinante como vetor de

vacina. Além disso, o marcador de seleção ideal deve possibilitar a manutenção

da pressão de seleção, mesmo após a administração da vacina, o que não ocorre

com os genes de resistência a antibióticos.

21

Os marcadores auxotróficos constituem um novo modelo de seleção até o

momento não utilizado. A seleção, nesse caso poderia ser feita complementando

a mutação existente na cepa bacteriana através da presença do gene nativo no

vetor. Este mesmo vetor pode levar o gene que codifica para um antígeno

recombinante, permitindo a obtenção de uma vacina recombinante, sem uso de

resistência a antibiótico como marcador seletivo.

A excisão de genes de resistência a antibiótico, presente em vetores de

clonagem já existentes, pode ser feita através de diversas formas. Um dos

possíveis métodos é por um sistema de recombinação sítio-específica. Vários

sistemas já foram descritos, como o sistema Par-res do RP4 (Bloom & Fine,

1994b; Kristensen et al., 1995), o sistema TnpR-res do transposon γδ (Camilli et

al., 1994), o sistema Flp-FRT de Saccharomyces cerevisiae (Sadowski, 1995), e o

sistema Cre-lox do Bacteriófago P1 (Sternberg et al., 1981; Ayres et al., 1993). A

recombinação sítio-específica mediada pelo sistema Cre-lox do Bacteriófago P1

tem sido amplamente caracterizado (Hoess et al., 1987; Van Duyne et al., 2001;

Van Duyne, 2001). A Proteína Cre (38,5 kDa) promove recombinação entre sítios

lox, que é uma região de 34 pares de bases (pb) constituída de duas regiões

inversamente repetidas de 13 pb, separadas por uma seqüência assimétrica de 8

pb (Hoess et al., 1982). Se uma seqüência é flanqueada por sítios lox, que estão

em uma mesma orientação, essa é excisada. Outro método de excisão é através

da digestão com enzimas de restrição que possuam sítios em ambas

extremidades do gene a ser removido, seguido pela ligação por DNA ligase.

Neste trabalho demonstramos a utilização do marcador auxotrófico leuD em

substituição à resistência a antibiótico, e também a eficiência de remoção do gene

de resistência por dois diferentes sistemas: digestão com a enzima de restrição

HindIII e posterior religação com T4 DNA ligase e por recombinação homóloga

através do sistema Cre-lox do Bacteriófago P1.

22

MATERIAL E MÉTODOS 1. Cepas e cultivo

As cepas bacterianas de M. bovis BCG ∆leuD (cedida por Dr. Johnjoe

McFadden – University of Surrey) e M. smegmatis mc2144 (cedida por Dra.

Luciana Leite - Instituto Butantã) auxotróficas para o aminoácido leucina foram

utilizadas. M. bovis BCG ∆leuD foi cultivado em meio 7H9 Middlebrook (Difco)

suplementado com 10 % de OADC (Oleic Acid Albumin Dextrose Complex), 0,2 %

de glicerol e 0,05 % de tween 80 ou em meio sólido 7H10 (Difco), contendo 10 %

de OADC e 0,2 % de glicerol. M. smegmatis mc2144 foi cultivado em meio 7H9

Middlebrook (Difco) suplementado com 0,2 % de glicerol e 0,05 % de tween 80 ou

em meio sólido 7H10 (Difco) contendo 0,2 % de glicerol. Quando necessário,

ambas as cepas micobacterianas foram cultivadas com suplementação de 100 µg

ml-1 do aminoácido L-leucina (Sigma), bem como com os antibióticos canamicina

(Sigma) a 25 µg.mL-1 ou higromicina B (Invitrogen) a 50 µg.mL-1.

Todas as transformações em E. coli foram feitas com a cepa TOP10

(Invitrogen). E. coli TOP10 foi cultivada em meio Luria – Bertani (LB) ou LB

contendo 1,5 % de agar, com suplementação dos antibióticos canamicina 50

µg.mL-1 ou higromicina B a 200 µg.mL-1 sempre que necessário.

2. Transformação bacteriana

Células competentes de micobactéria foram preparadas como descrito a

seguir. M. bovis BCG ∆leuD foi multiplicado em 5 mL de meio 7H9 suplementado

com 10 % de OADC, 0,2 % de glicerol, 0,05 % de tween 80 e 100 µg.mL-1 de L-

leucina até atingir a DO600 de 0,8 -1,0. Em seguida a cultura foi diluída 100 vezes

em 100 mL de meio 7H9 e crescida a 37°C por 7 dias sob agitação. M. smegmatis

mc2144 foi crescido em 5 mL de meio 7H9 contendo 0,2 % de glicerol, 0,05 % de

23

tween 80 e 100 µg ml-1 de L-leucina por 72 h, sendo a cultura diluída 100 vezes

em 100 mL de meio 7H9 e crescida a 37°C por 72 horas sob agitação. As culturas

de M. bovis BCG ∆leuD e M. smegmatis mc2144 foram incubadas em gelo por 1

h, as células foram coletadas por centrifugação a 4000 g por 10 min a 4 °C, o

pellet foi ressuspendido e lavado uma vez com 100 mL de água deionizada

gelada, seguido de mais uma lavagem com 50 mL de glicerol 10 %. Após as

lavagens o pellet foi ressuspendido em 1 mL de glicerol 10 %. Alíquotas de 100 µL

foram utilizadas para a transformação de 0,05 a 1 µg de DNA utilizando o

eletroporador Gene Pulser II (Bio-Rad) com os seguintes parâmetros: 2,5 KV, 25

µF e 800 Ώ. Após a transformação as células foram imediatamente diluídas em 1

mL de meio 7H9 e incubadas a 37 °C por 24 h para M. bovis BCG ∆leuD e por 5

horas para M. smegmatis mc2144. Após esse período o produto da transformação

foi semeado em meio de cultivo com marcador seletivo apropriado. As colônias

emergiram após três semanas a 37°C no caso de BCG, ou 3 dias no caso de M.

smegmatis.

Células competentes de E. coli foram preparadas conforme Sambrook &

Russel (Sambrook & Russel, 2001) com algumas modificações: E. coli TOP10 foi

multiplicada em 50 mL de meio LB a 37°C sob agitação até atingir a DO600 de 0,4-

0,6. Após a cultura foi incubada em gelo por 15 min. As células foram coletadas

por centrifugação a 4000 g por 10 min a 4 °C, o pellet foi lavado uma vez com 50

mL de água gelada, seguido de outra lavagem com 25 mL de glicerol 10 %. Após

as lavagens as células foram ressuspendidas em 500 µL de glicerol 10 %.

Alíquotas de 50 µL foram utilizadas para transformação utilizando o eletroporador

Gene Pulser II (Bio-Rad) com os seguintes parâmetros: 2,5 KV, 25 µF e 200 Ώ.

Após a transformação as células foram imediatamente diluídas em meio SOC (2 %

Triptona, 0,5 % extrato de levedura, 0,05 % NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20

mM glicose) e incubadas a 37 °C por um período de aproximadamente 1 h e 30

min sob agitação. Decorrido esse tempo as bactérias foram semeadas em meio de

cultivo LB agar com antibiótico apropriado. As colônias emergiram após incubação

de 16 h a 37°C.

24

3. Construção dos vetores Introdução do gene leuD

A representação esquemática da construção dos vetores encontra-se na

figura 1. O gene leuD foi utilizado como forma de seleção em substituição ao gene

de resistência a canamicina. Para isso, o gene leuD (639 pb) foi amplificado por

PCR com os primers leuDI (5´-AAT CTA GAA CAG CTA GGG GAT C-3´) e leuDII

(5´TCC TGCA GTT CTA CGC CTC A-3´) a partir do DNA de Mycobacterium bovis

BCG P3 (Isogen). A reação de PCR continha 10 ng de DNA, 150 ng de cada

primer, 200 µM de dNTPs e 1 U de Taq DNA Polymerase (Invitrogen). A ciclagem

de temperaturas foi de 5 min a 94 °C, seguido de 94 °C por 1 min, 55 °C por 1 min

e 72 °C por 1min por 30 ciclos. Depois de amplificado o gene leuD foi digerido

com as enzimas XbaI e PstI e purificado a seguir com GFXTM PCR DNA and Gel

Band Purification Kit (Amersham Biosciencies). Após, 200 ng de DNA do gene leuD digerido foram ligadas com 1 U da enzima T4 DNA ligase (Invitrogen) a 200

ng do vetor pUS977 (Medeiros et al., 2002) digerido com as enzimas XbaI e PstI e

purificado com GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham

Biosciencies). A triagem dos recombinantes foi realizada por digestão com as

enzimas XbaI e PstI e o perfil eletroforético analisado em gel de agarose 0,8 %. O

vetor resultante foi denominado de pUP400.

Com a finalidade de se avaliar a estabilidade estrutural dos vetores, quando

na remoção do gene da canamicina, o gene que confere resistência ao antibiótico

higromicina foi clonado no vetor pUP400. Para isso o gene hyg R- (996 pb) foi

obtido por digestão com a enzima KpnI a partir do vetor pGOAL19, purificado com

GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit e ligado a seguir ao vetor pUP400

digerido com a enzima KpnI e desfosforilado com a enzima CIP (Roche). A

triagem dos recombinantes foi realizada por digestão com a enzima KpnI e o perfil

eletroforético analisado em gel de agarose. O vetor contendo o gene da

higromicina foi denominado de pUP401. As clonagens foram realizadas em E. coli

TOP10 eletrocompetentes.

25

Introdução de adaptador (HindIII) e de sítios lox flanqueando o gene da

canamicina A estratégia para a remoção do gene de resistência a canamicina foi

baseada em dois diferentes sistemas: digestão com a enzima de restrição HindIII

e posterior religação, e por recombinação homóloga através do sistema Cre-lox do

Bacteriófago P1. Para remover o gene da canamicina por digestão, um adaptador

contendo sítios para enzimas de restrição dentre eles o sítio HindIII e extremidade

compatível com a enzima PacI foi sintetizado. Uma micrograma de DNA das

seqüências Adap F (5´GAT ATC AAG CTT AAG ACG CGT TAA3´) e Adap R

(5´TAA CGC GTC TTA AGC TTG ATA TCT A 3´) foram pré-hibridizadas por 1 min

a 100 °C e posteriormente resfriadas por 3 h a temperatura ambiente. Uma

concentração de 500 ng do DNA dos oligonucleotídeos pré-hibridizados foi ligada

com 5 U de T4 DNA ligase (Invitrogen) a 200 ng de DNA do vetor pUP401

previamente linearizado com a enzima PacI. O produto da ligação foi aquecido a

70 °C por 10 min, e submetido imediatamente à eletroforese em gel de agarose

1%. Após, a banda corresponde ao produto da ligação foi excisada do gel,

purificada com GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham

Biosciencies), eluída em tampão de eluição (10 mM Tris-HCl [pH 8.5]), aquecida a

80 °C por 5 min contendo tampão de hidridização 1X (10 mM Tris-HCl [pH 8.5];

100 mM NaCl; 1 mM EDTA) e resfriada a temperatura ambiente por 3 h. Cinco

microlitros foram utilizados para transformar E. coli TOP10 eletrocompetentes. A

ligação dos oligonucleotídeos ao vetor pUP401 foi confirmada por digestão com a

enzima de restrição HindIII, e por seqüenciamento automatizado de DNA

utilizando MegaBACE (Amersham Biosciences). Esse vetor foi denominado de

pUP402.

Para promover a remoção do gene da canamicina por recombinação

homóloga sítio-específica através do sistema Cre-lox do Bacteriófago P1, os

seguintes oligonucleotídeos contendo a seqüência dos sítios lox, adicionados de

sítios de restrição nas extremidades para facilitar a clonagem foram sintetizados: o

sítio lox-HindIII F (5´-TAT AAC TTC GTA TAA TGT ATG CTA TAC GA AGT TAT-

26

3´) e lox- HindIII R (5´- ATA ACT TCG TAT AGC ATA CAT TA TAC GAA GTT

ATA-3´), que foram pré-hibridizados e ligados ao sítio HindIII do vetor pUP401, e

os sítios lox-PacI F (5´-TAA ATA CTT CGT ATA ATG TAT GCT ATA CGA AGT

TAT AT-3´) e lox-PacI R (5´-ATA TAA CTT CGT ATA GCA TAC ATT ATA CGA

AGT ATT TA-3´) que foram pré-hibridizados e ligados ao sítio PacI do vetor

pUP401. Os procedimentos de pré-hibridização, ligação e hibridização foram

realizados como descrito acima. Os oligonucleotídeos lox-HindIII F e lox-HindIII R

foram primeiro ligados ao sítio HindIIII do vetor pUP401 previamente digerido com

HindIII e purificado, a confirmação da presença dos sítios lox HindIII foi realizada

por digestões com as endonucleases de restrição NheI e BglII e por

seqüenciamento de DNA. Após foram ligados os oligonucleotídeos lox-PacI F e

lox-PacI R ao sítio PacI do vetor pUP401 previamente digerido com PacI e

purificado. Digestões com as endonucleases de restrição EcoRI e SmaI e

seqüenciamento de DNA, permitiram a confirmação da presença e orientação dos

sítios lox ao vetor pUP401. O vetor contendo os sítios lox foi denominado pUP404.

4. Avaliação do leuD como marcador seletivo

O sistema de seleção por complementação auxotrófica foi testado através da

capacidade seletiva do gene leuD presente nas construções plasmidiais. As

cepas de M. bovis BCG ∆leuD e M. smegmatis mc2144 foram utilizadas para

trasnformação. A ultima foi utilizada por ser uma micobactéria de crescimento

rápido. M. bovis BCG ∆leuD e M. smegmatis mc2144 competentes foram

eletroporadas com 0,5 - 1 µg de DNA do vetor pUP401. O produto da

transformação foi semeado em meio de cultivo 7H10 e em meio de cultivo 7H10

contendo canamicina. A mensuração foi realizada por contagem dos

transformantes em ambos os meios de cultivo, observando-se a equivalência de

unidades formadoras de colônia (UFC) entre os cultivos.

27

Cre recombinase Digestão HindIII

Oligonucleotídeo com sítios lox

Oligonucleotídeo com sítio HindIII

pUP4015976 bp

Hyg R-

Kan(R)

LeuD

OriM

oriC

K p n I (2 4 3 1)

K p n I (4 0 11)

P stI (3 9 6 3 )

P stI (4 8 14 )

X b a I (3 9 9 0 )

X b a I (4 18 1)

pUP4025 9 7 6 b p

Hyg R-

Kan(R)

LeuD OriM

oriCP a cI (5 7 6 9 )

H in d III (4 8 2 2 )

H in d III (5 7 8 1)

K p n I (2 4 3 1)

K p n I (4 0 11)X b a I (3 9 9 0 )

X b a I (4 18 1)

pUS9773759 bp

Kan(R)

O riM

p AN

o riC

H in dIII (2 6 2 5)

K pn I (2 4 3 1)

PacI (3 57 2 )

P stI (2 6 17 )

X ba I (2 6 0 1)

pUP4046 0 3 6 b p

Kan(R)

LeuD

Hyg R-

OriM

LoxP

LoxP oriC

H in dIII (4 8 6 7 )

PacI (58 14 )

pUP4055082 bp

LeuD

Hyg R-

OriM

LoxP oriC

K pn I (2431)

K pn I (4011)

X ba I (3990)

X ba I (4181)

Hyg R

1586 bp

K pnI (6) K pnI (1586)leuD

635 bp

PstI Xba I

pUP4035 0 1 7 b p

Hyg R-

LeuD

O riM

oriCH in dIII (4822)

K pn I (2431)

K pn I (4011)

X ba I (3990)

X ba I (4181)

Figura 1: Representação esquemática da construção dos vetores

28

5. Remoção do gene da canamicina

A remoção do gene da canamicina por digestão foi realizada submetendo-se 1

µg de DNA do vetor pUP402 a uma reação de digestão com 1U da enzima HindIII,

e a uma posterior religação de 100 ng do produto da digestão com 1 U da enzima

T4 DNA ligase. Uma reação de recombinação sítio-específica in vitro promovida

pela enzima Cre-recombinase também removeu o gene da canamicina; a reação

continha 1 µg de DNA do vetor pUP404 e 3 U da enzima Cre-recombinase

(Biolabs). Essa reação foi incubada a 37°C por 3 horas, aquecida a 70 °C por 5

min e em seguida resfriada a temperatura ambiente por 10 min. O plasmídeo

pUS1604 foi utilizado como controle da reação de recombinação. Ambas as

reações de religação e recombinação foram utilizadas para transformar células

eletrocompetentes de M. bovis BCG ∆leuD e M. smegmatis mc2144. O produto da

transformação foi semeado meio de cultivo 7H10 e em meio 7H10 contendo

canamicina. A avaliação foi feita por contagem dos transformantes em ambos os

meios de cultivo, esperando obter-se maior numero de transformantes em meio de

cultivo 7H10.

6. Eficiência dos métodos de remoção do gene da canamicina

A avaliação de remoção do gene da canamicina por ambos os sistemas,

digestão e religação e por recombinação foi realizado da seguinte forma: 0,1 a 0,5

µg dos produtos da religação (vetor pUP402) e recombinação (pUP404) foram

utilizados para transformar células competentes de M. bovis BCG ∆leuD e M.

smegmatis mc2144. O produto da transformação foi semeado em meio de cultivo

7H10 e em meio 7H10 contendo canamicina. Cem transformantes selecionados

por complementação auxotrófica (meio de cultivo 7H10) foram escolhidos

aleatoriamente e transferidas simultaneamente para uma placa contendo meio de

cultivo 7H10 e outra contendo meio 7H10 suplementado com canamicina. No

meio 7H10 cresceram todas as colônias testadas e no meio 7H10 contendo

29

canamicina cresceram somente as colônias que não tiveram o gene da

canamicina removido. A taxa de remoção foi estimada pela diferença do número

de colônias entre os meios de cultivo 7H10 e 7H10 contendo canamicina. As UFC

do meio 7H10 foram consideradas como 100%.

7. Avaliação da estabilidade estrutural

Subcultivos

A avaliação da estabilidade estrutural dos vetores pUP403 e pUP405 foi

realizada em M. bovis BCG ∆leuD e M. smegmatis mc2144. Clones de M. bovis

BCG ∆leuD e M. smegmatis mc2144 transformados com vetores que tiveram o

gene da canamicina removido foram identificados e utilizados para os subcultivos.

Um mesmo clone foi cultivado em 2 mL de meio 7H9 na ausência do aminoácido

leucina (seletivo) e em meio 7H9 suplementado com leucina (não-seletivo). M.

bovis BCG ∆leuD foi cultivado por 7 subcultivos de 7 dias e M. smegmatis mc2144

por 20 subcultivos de 2 dias, ambos a 37 ºC sob agitação. A cada intervalo de

quatro subcultivos foram realizadas diluições seriadas de 10-1 a 10-7 em água

estéril buscando-se determinar a proporção de UFC que ainda mantinham o vetor

plasmidial quando cultivadas em meio seletivo e não-seletivo.

As diluições 10-6 e 10-7 de um mesmo subcultivo em meio seletivo foram

semeadas meio 7H10 (seletivo) e em meio 7H10 contendo leucina (não seletivo).

As diluições 10-6 e 10-7 de um subcultivo em meio não seletivo foram semeadas

meio 7H10 (seletivo) e em meio 7H10 contendo leucina (não seletivo). A

proporção de UFC entre os meios seletivo (7H10) e não seletivo (7H10 contendo

leucina) foi avaliada por contagem.

Caracterização por digestão A cada quatro subcultivos foi feita a extração de DNA total de micobactéria

buscando recuperar o DNA plasmidial. Para isso foram utilizados 1 mL da cultura

dos clones cultivados em meio seletivo e não seletivo. A extração de DNA total foi

realizada como segue: um mL da cultura foi centrifugado e o pellet ressuspendido

30

em 400 µL de tampão TE (10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA [pH 8.0]) e 400 µL de

fenol, sendo em seguida lisado em ribolyser (Hybaid) com 0,5 mL de pérolas de

vidro. As purificações foram feitas com fenol-clorofórmio (v/v) e com clorofórmio. A

precipitação do DNA foi feita com dois volumes de etanol absoluto e 0,1 volume de

3 M de Acetato de sódio pH 5,2. Dois microlitros do DNA eluído foram utilizados

para transformar E. coli Top 10 selecionando-se os transformantes com 200 µg ml-

1 de higromicina em meio LB agar, ainda presente no plasmídeo pUP403 e

pUP405. Cinco clones desta transformação foram selecionados e cultivados em

meio LB contendo higromicina. O DNA plasmidial foi extraído e purificado por lise

alcalina com kit FlexiperpTM (Amersham Biosciences) a fim de se fazer a análise

genética dos vetores plasmidiais através de digestão com as endonucleases de

restrição HindIII e EcoRI. O vetor pUP402 foi utilizado como controle. O perfil das

digestões do DNA plasmidial recuperado de E. coli e do vetor pUP402 foram

comparados e visualizados por eletroforese em gel de agarose 0,8%.

8. Análise Estatística O teste T de Studant foi utilizado para calcular as diferenças estatísticas

entre o número de transformantes presentes nos meios de cultivo 7H10 e 7H10

contendo canamicina. Resultados foram considerados significativos quando p<

0,05.

31

RESULTADOS 1. Construção dos vetores

Foram utilizadas duas estratégias para possibilitar a construção e avaliação

dos novos vetores de expressão utilizando complementação auxotrófica como

forma de seleção (Figura 1). A primeira etapa foi utilizar o gene leuD como

marcador seletivo em substituição ao gene de resistência ao antibiótico

canamicina (presente nos vetores da série pUS). O gene leuD foi eficientemente

introduzido no vetor pUS977. Duas estratégias de remoção do gene de resistência

a canamicina do vetor pUP401 foram avaliadas: digestão com a enzima de

restrição HindIII seguida de religação do vetor; e recombinação homóloga sítio-

específica baseada no sistema Cre-lox do Bacteriófago P1. A clonagem da

seqüência adaptadora contendo sítio para a enzima HindIII e dos sítios lox não foi

obtida pelos métodos tradicionais de anelamento de oligos e ligação destes ao

vetor pUS977. Resultados satisfatórios só foram obtidos quando os oligos foram

pré-hibridizados, ligados e hibridizados ao vetor pUS977. Utilizando esta

metodologia a eficiência de ligação dos oligos ao vetor foi superior a 90%. A

ligação de um adaptador contendo um segundo sítio para a enzima HindIII

resultou no vetor denominado pUP402 (figura 1). Já a ligação dos sítios lox

flanqueando o gene de resistência a canamicina resultou no vetor pUP404 (figura

1).

Na figura 2 painel A observa-se a remoção do gene da canamicina por

digestão com a enzima de restrição HindIII do vetor pUP402. Essa digestão

resultou em dois fragmentos de DNA, um com 5017 pb e outro com 959 pb

correspondente ao tamanho do gene da canamicina. Esse sistema foi eficiente e

promoveu a remoção do gene da canamicina de todas as moléculas de DNA do

vetor pUP402, comprovado pela presença de dois únicos fragmentos de DNA com

os tamanhos esperados. Na figura 2 painel B observa-se a remoção por

recombinação homóloga do vetor pUP404 (clones 1 e 2) tratado com a enzima

Cre– Recombinase. A remoção foi confirmada pela presença de um fragmento de

32

DNA com aproximadamente 950 pb, que corresponde ao tamanho do gene da

canamicina. No entanto esse sistema não promoveu a remoção do gene da

canamicina de todas as moléculas de DNA. A baixa eficiência de remoção pode

ser observada pela grande concentração de DNA circular em um fragmento de

DNA de aproximadamente 5970 pb que não teve o gene removido.

Figura 2: Estratégias de remoção do gene de resistência ao antibiótico

canamicina dos vetores pUP402 e pUP404. A. Digestão com a enzima de

restrição HindIII. 1, Ladder 100 pb (Invitrogen); 2, pUP402 digerido com HindIII; 3,

pUP401 digerido com HindIII. B. Recombinação homóloga in vitro com a enzima

Cre-Recombinase. 1, 1 kb DNA ladder (Invitrogen); 2, plasmídeo controle

pUS1604 sem tratamento com Cre–Recombinase; 3, pUS1604 tratado com Cre–

Recombinase; 4, pUP404 clone 1 sem tratamento com Cre – Recombinase; 5,

pUP404 clone 1 tratado com Cre–Recombinase; 6, pUP404 clone 2 sem

tratamento com Cre – Recombinase; 7, pUP404 clone 2 sem tratado com Cre–

Recombinase. As setas indicam o gene da canamicina.

600 pb

2072 pb 1500 pb

40000 pb

1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 31 2 3

A B

517 pb

1018 pb

1636 pb 2036 pb

33

2. Avaliação do leuD como marcador seletivo

Buscando avaliar a capacidade seletiva do gene leuD, o vetor pUP401 foi

utilizado para transformar M. bovis BCG ∆leuD e M. smegmatis mc2144. A tabela

1 contém os dados que demonstram a capacidade seletiva do gene leuD presente

nas construções plasmidiais. A seleção dos clones recombinantes foi realizada

pela capacidade das micobactérias crescerem mesmo sem a suplementação do

aminoácido leucina em meio de cultivo, característica essa conferida pela

presença do gene leuD nos vetores, que restaura a capacidade de síntese da

leucina das cepas de M. bovis BCG ∆leuD e de M. smegmatis mc2144 mutadas. A

mensuração foi feita por comparação dos transformantes em meio de cultivo na

ausência de leucina e em meio contendo 25 µg.ml-1 do antibiótico canamicina. Os

resultados mostraram que o gene leuD teve equivalência seletiva em relação à

seleção por resistência ao antibiótico canamicina. Os transformantes obtidos de

M. bovis BCG ∆leuD foram de 6 x 102 /µg de DNA com ambos os sistemas de

seleção, complementação auxotrófica (utilizando leuD presente no vetor) e

selecionando-se por resistência a antibiótico. Em M. smegmatis mc2144 os

transformantes foram de 3,6 x 103 /µg de DNA utilizando-se ambos as formas

seletivas.

Tabela 1: Capacidade seletiva do gene leuD presente no vetor pUP401 estimado

pelo número de transformantes das cepas de M. bovis BCG ∆leuD e M.

smegmatis mc2144.

Letras diferentes na mesma coluna diferem estatisticamente em pelo menos 5%

Transformantes por µg de DNA Meios seletivos M. bovis BCG ∆leuD M. smegmatis mc2144

7H10 6 x 102 a 3,6 x 103 a 7H10 kan 6,1 x 102 a 3,6 x 103 a

34

3. Remoção do gene da canamicina

Os dois sistemas de remoção do gene da canamicina, recombinação

homóloga através da enzima Cre - Recombinase ou através de digestão com a

enzima de restrição HindIII e posterior religação com T4 DNA ligase foram

eficazes quando testadas em ambas as cepas bacterianas, M. bovis BCG ∆leuD e

de M. smegmatis mc2144. O menor número de transformantes em meio 7H10

contendo 25 µg ml-1 de canamicina quando comparado ao meio de cultivo não

suplementado com antibiótico foi resultado da remoção do gene da canamicina

(Tabelas 2 e 3). A tabela 2 contém os dados que demonstram a remoção do gene

da canamicina por digestão com a enzima de restrição HindIII. Em ambas as

cepas auxotróficas o sistema foi eficaz. A tabela 3 mostra a remoção do gene da

canamicina por recombinação sítio-específica in vitro mediado pela enzima Cre-

recombinase. Esse sistema foi mais eficaz quando testado em M. bovis BCG

∆leuD. Quando os resultados obtidos foram submetidos a uma análise estatística

para provar a causalidade da remoção do gene da canamicina, observou-se uma

diferença significativa entre os diferentes cultivos quando a remoção foi realizada

por digestão com HindIII e posterior religação em ambas as cepas

micobacterianas (Tabela 2). Mas quando a remoção foi realizada pelo sistema de

recombinação sítio-específica, houve diferença significativa entre os diferentes

cultivos somente quando a remoção foi avaliada em M. bovis BCG ∆leuD (p<0,05)

(Tabela 3).

Tabela 2: Remoção do gene de resistência a canamicina do vetor pUP402 por

digestão e posterior religação estimada pelo número de transformantes quando

cultivados em diferentes meios seletivos.

Letras diferentes na mesma coluna diferem estatisticamente em pelo menos 5%

Transformantes por µg de DNA

Estratégia de remoção M. bovis BCG ∆leuD M. smegmatis mc2144 Digestão e Religação

7H10 1 x 102 a 2,5 x 103 a 7H10 Kan 1,1 x 101 b 6,6 x 101 b

35

Tabela 3: Remoção do gene de resistência a canamicina do vetor pUP404 por

recombinação sito-específica estimada pelo número de transformantes quando

cultivados em diferentes meios seletivos.

Letras diferentes na mesma coluna diferem estatisticamente em pelo menos 5%

4. Eficiência dos métodos de remoção do gene da canamicina

Para avaliar a eficiência dos sistemas de remoção do gene da canamicina

foram testadas 100 UFC oriundas da transformação dos produtos da religação e

também por recombinação de M. bovis BCG ∆leuD e de M. smegmatis mc2144.

Estas colônias foram selecionadas em meio de cultivo 7H10, ou seja, por

complementação auxotrófica. A remoção por digestão e religação teve uma

eficiência de 85% em M. smegmatis mc2144 e de 95% em M. bovis BCG ∆leuD. A

remoção por recombinação teve uma eficiência de 31% em M. smegmatis mc2144

e 43 % em M. bovis BCG ∆leuD (Tabela 4).

Tabela 4: Eficiência de remoção do gene de resistência a canamicina por

recombinação ou por digestão e posterior religação após teste de 100 UFC.

Eficiência de remoção (%)

Estratégia de remoção M. bovis BCG ∆leuD M. smegmatis mc2144

Digestão e Religação 95% 85%

Recombinação 43% 31% Os resultados obtidos são a média de três diferentes experimentos.

Transformantes por µg de DNA Estratégia de remoção M. bovis BCG ∆leuD M. smegmatis mc2144 Recombinação 7H10 7,2 x 101 a 2,6 x 102 a 7H10 Kan 101 b 1,2 x 102 a

36

5. Avaliação da estabilidade estrutural

Com a finalidade de avaliar a persistência das construções plasmidiais in

vitro utilizando o gene leuD como forma seletiva, foram realizados subcultivos em

meio seletivo e não seletivo. Quando um clone de M. bovis BCG ∆leuD

transformado com um vetor que teve o gene da canamicina removido foi cultivado

em meio não seletivo o vetor se manteve estável até o 5º subcultivo. Algum índice

de instabilidade foi observado no 7º subcultivo (em torno de 50 gerações), quando

75 % das UFC mantinham o vetor (figura 3). É possível que esse índice continue

decaindo ao longo de progressivos subcultivos.

Quando M. smegmatis mc2144 foi cultivada em meio seletivo (sem

suplementação de leucina), 100% das UFC mantiveram o vetor até o 20°

subcultivo, o que corresponde a mais de 190 gerações. No entanto quando este

clone foi cultivado em meio não seletivo (com suplementação de leucina) no

quarto subcultivo (em torno de 50 gerações) apenas 20% das UFC ainda

mantinham o vetor, essa porcentagem foi gradualmente diminuindo até chegar a

4% no 20° subcultivo (Figura 4).

O plasmídeo foi recuperado das cepas de M. bovis BCG ∆leuD e M.

smegmatis mc2144 e utilizado para transformar E. coli TOP10. O DNA dos

vetores foi purificado e submetido a digestões com as enzimas HindIII e EcoRI. As

digestões com EcoRI produziram quatro fragmentos com 1587, 1505, 1011 e 979

pb, visualizados em gel de agarose como duas bandas. As digestões com HindIII

produziram um único fragmento de 5017pb, proveniente da linearização do vetor.

Os perfis de restrição obtidos foram comparados aos dos vetores originalmente

utilizados para transformar as cepas de micobactérias. A análise de restrição

mostrou que o DNA dos vetores recuperados de M. bovis BCG ∆leuD não

apresentou nenhuma modificação tais como deleções ou duplicações, em relação

ao vetor original na 7ª passagem (figura 5). Entretanto, os perfis de restrição

obtidos quando os vetores foram recuperados de M. smegmatis mc2144,

mostraram algumas duplicações em relação ao vetor original, um exemplo pode

ser observado na figura 5 (Painel A linha 11).

37

0102030405060708090

100110

1° 3° 5° 7°subcultivos

% d

e U

FC p

orta

dora

s de

pl

asm

ideo

sm eio seletivo (sem leucina)

m eio não-seletivo (com leucina)

Figura 3: Subcultivos em meio seletivo e não seletivo de M. bovis BCG ∆leuD

transformado com vetores contendo o gene leuD.

0102030405060708090

100110

1º 4º 7º 10º 13º 16º 20ºSubcultivos

% d

e UF

C p

orta

dora

s de

pl

asm

ídeo

meio seletivo (sem leucina)meio não seletivo (com leucina)

Figura 4: Subcultivos em meio seletivo e não seletivo de M. smegmatis mc2144

transformada com vetores contendo gene leuD.

38

Figura 5: Estabilidade estrutural avaliada por análise de restrição com a enzima

de restrição EcoRI. A. 1, vetor original (pUP402); 2 a 11, vetores pUP403

recuperados de M. smegmatis mc2144 na 7ª passagem. B. 1, vetor original

(pUP402); 2 a 10, vetores pUP403 recuperados de M. bovis BCG ∆leuD na 7ª

passagem.

B A

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

39

DISCUSSÃO

Um novo sistema de seleção em BCG recombinante, que pode ser utilizado

em substituição à seleção por resistência a antibiótico, foi desenvolvido. Esse

sistema utiliza uma cepa de BCG auxotrófica para o aminoácido leucina e a

seleção é realizada por complementação da mutação existente na cepa utilizando

o gene leuD em um vetor replicativo.

Vários vetores de expressão em micobactérias já foram desenvolvidos, mas

todos utilizam como marcador seletivo um gene de resistência a antibiótico (Stover et al., 1991; Lugosi, 1992; Dellagostin et al., 1993). Resistência a mercúrio, à lise

por bacteriófagos e marcadores de contra-seleção também são utilizados

(Donnellywu et al., 1993; Baulard et al., 1995; Reyrat et al., 1998), mas nenhum

destes é tão eficiente quanto a seleção por antibiótico. Os vetores construídos

(pUP400-pUP405), os quais utilizam a complementação auxotrófica como

marcador seletivo tiveram equivalência seletiva em relação a seleção por

resistência a antibiótico, mostrando-se tão eficazes quanto aos já exististes em

termos seletivos, mas com a vantagem de eliminar o uso de antibiótico.

O uso dos marcadores de resistência a antibiótico é muito útil e apropriado

para seleção e manutenção dos vetores recombinantes in vitro, em presença de

pressão seletiva. A ausência desta seleção in vivo permite a perda do vetor,

afetando com isso a expressão do antígeno heterólogo carregado por este vetor.

Quando analisamos a estabilidade do novo sistema seletivo em M. bovis BCG

∆leuD e M. smegmatis mc2144 recombinante (pUP403 e pUP405) em meio 7H9,

os vetores se mostraram muito estáveis. Em M. smegmatis mc2144 100% das

UFC mantiveram o vetor por mais de 20 passagens, o que corresponde a mais de

190 gerações. Entretanto, na ausência de pressão seletiva, ou seja, cultivando as

bactérias em meio suplementado com L-leucina, apenas 20% das UFC ainda

portavam o vetor após 32 gerações e ao final de 190 gerações apenas 4% ainda

mantinham o vetor. Diferentemente de todos os sistemas de seleção até hoje

utilizados, o sistema aqui desenvolvido fornece uma pressão seletiva inerente, ou

40

seja, a manutenção do vetor é uma condição vital para a sobrevivência do BCG

auxotrófico, condição essa que será mantida em BCG recombinante in vivo.

Stover et al (1991) relataram que após 120 gerações de M. smegmatis não

havia nenhum vetor pMV206 ainda resistente a canamicina quando esta foi

cultivada na ausência de agente seletivo. Matsumoto et al (1996) avaliaram a

estabilidade de seis vetores replicativos pIS18, pIJK1, pIJK2, pAL1269, pSO246 e

pSOJK1. Somente o vetor pSO246 se manteve estável em BCG por mais de 50

gerações. Grandes deleções foram observadas em vetores derivados do pAL5000

através da transposição de uma seqüência de inserção, próximo ao gene da

canamicina (Chawla & Das Gupta, 1999). Mederios et al. (2002) relataram

instabilidade em vetores replicativos dirigidos pelo promotor hsp60 na ausência de

agente seletivo.

Na tentativa de promover uma maior estabilidade vetores integrativos

carregando antígenos heterólogos juntamente com genes de resistência a

antibiótico foram desenvolvidos. Lee et al. (1991) desenvolveram os vetores pMH5

e pMH94 baseados no sistema integrativo derivado do micobacteriófago L5, que

promove uma integração sítio-específica ao genoma micobacteriano, M.

smegmatis mc2155 transformada com os vetores integrativos se manteve estável

quando cultivada em meio não seletivo por mais de 30 gerações. Altos índices de

estabilidade in vivo e in vitro foram reportados no vetor integrativo pOIP4

expressando o gene gag (Mederle et al., 2002). No entanto este sistema leva à

integração de uma única cópia ao genoma bacteriano, o que acaba limitando os

níveis de expressão de antígeno heterólogo. Vetores integrativos baseados no

elemento de inserção IS900 promovem uma integração aleatória ao genoma

apresentando o potencial de estarem presentes em várias cópias amplificando o

nível de expressão dos antígenos heterólogos (Dellagostin et al., 1993). Entretanto

esta integração aleatória pode resultar em alterações no genoma micobacteriano

podendo comprometer a biologia bacteriana. A seleção por complementação

auxotrófica desenvolvida oferece a associação de dois importantes fatores: a

estabilidade de um vetor integrativo e o fato dos vetores estarem presentes em

várias cópias. Tem-se então um vetor replicativo estável. Esta estabilidade é

41

conferida pela presença do gene leuD, que restaura a capacidade da cepa

micobacteriana de síntese do aminoácido leucina, sem a complementação a cepa

é incapaz de se multiplicar. Essa condição favorece a manutenção do vetor in vitro

e in vivo. O vetor base para o desenvolvimento do sistema aqui proposto foi o

vetor replicativo pUS977, a característica do vetor se apresentar em várias cópias

fornece a possibilidade uma maior expressão de um antígeno heterólogo.

O sistema desenvolvido oferece três grandes vantagens em relação aos

sistemas de expressão em micobactérias até hoje utilizados: 1- ausência de

resistência a antibiótico como marcador seletivo; 2- estabilidade, 3- por ser um

vetor replicativo se apresenta em várias cópias no genoma amplificando a

expressão de um antígeno heterólogo presente neste vetor. Isso é importante

quando se pensa em uma vacina recombinante baseada em BCG, cuja vantagem

é conferir uma imunidade duradoura pela sua capacidade de permanecer viável

no organismo por um longo período de tempo.

42

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CONCLUSÕES

Os resultados obtidos mostram que novo sistema de seleção em M. bovis

BCG desenvolvido foi eficiente. O gene leuD foi tão eficaz quanto a seleção por

canamicina, podendo ser utilizado em substituição a este; ambos os sistemas de

remoção do gene da canamicina foram eficazes, mas a digestão com HindIII foi

mais eficiente; os vetores construídos se mantiveram estáveis por sucessivas

passagens in vitro, não apresentando grandes alterações estruturais.

A próxima etapa de avaliação deste sistema é utilizar os vetores construídos

para avaliar a expressão de um antígeno heterólogo e a imunogenicidade de M.

bovis BCG ∆leuD expressando este antígeno.

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