ACUMULO DE TREALOSE EM LINHAGENS DE Saccharomyces DURANTE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

L.E. Gutierrez*

* Departamento de Química da E.S.A. "Luiz de Queiroz" da Universidade de Sao Paulo - 13.400 - Piracicaba, SP e CEBTEC/FEALQ.

RESUMO: A pesquisa foi realizada para comparar os efeitos de diversos fatores (temperatura, pH, con­centração de sacarose, 2,4-dinitrofenol e fontes de ni­trogênio) sobre a produção de trealose em Saceharomyces uvarum IZ-1904 e Saccharomyces cerevisiae (M-300-A e de panificaçao) durante a fermentação alcoólica. Com a levedura IZ-1904 houve menor produção de trealose do que M-300-A e de panificaçao. A trealose foi formada em maior quantidade (p < 0,05) a 34°C. Em pH 4,5 hou­ve maior acúmulo de trealose do que em pH 3,0 para as leveduras M-300-A e de panificaçao. A adição de 18ppm de 2,4-dinitrofenol acarretou decréscimo (p < 0,05) na quantidade de trealose formada pela levedura de panifi­caçao e sem efeito para IZ-1904. 0 aumento da concen­tração de sacarose ocasionou a maior produção de trea­lose .

Termos para indexação: trealose, Saceharomyces, fermentação alcoólica.

TREHALOSE ACCUMULATION OF STRAINS OF Saccharomyces DURING ALCOHOLIC FERMENTATION

ABSTRACT: This study was carried out to compare the effects of several factors (temperature, pH, sucrose concentration, 2,4-dinitrophenol and nitrogen sources) on trehalose production by Saccharomyces uvarum IZ-1904 and Saccharomyces cerevisiae (M-300-A and baker's yeast) during alcoholic fermentation. Trehalose production was lower with the yeast LZ-1904 than with M-300-A or baker's yeast. More trehalose was formed at 34°C than at 25°C. For M-300-A and baker's yeast trehalose accumulation was higher at pH 4.5 than at pH 3.0. Addition of 18ppm 2.4-dinitrophenol strongly decreased the amount of trehalose formed by baker's yeast, but was ineffective for IZ-1904. Increase of sucrose concentration led to a higher production of trehalose .

Index terms: Trehalose, Saccharomyces, alcoholic fermentation.

INTRODUÇÃO

As leveduras mais utilizadas para a produção de etanol pela via fermentativa no Brasil sao Saccharomy_ ces cerevisiae (levedura de panificaçao), Saccharomyces cerevisiae M-300-A e Saccharomyces uvarum IZ-1904, con tudo pouco é conhecido a respeito dos componentes de reserva dessas leveduras.

Trealose é um importante carboidrato de reserva das células vegetativas e esporos de fungos e parece es_ tar associada com períodos de reduzida taxa de cresci­mento (THEVELEIN, 1984).

É conhecida a importância da trealose para a

manutenção da viabilidade das leveduras (SUOMALAINEN & PFAFFLI, 1961) sendo demonstrado por LILLIE & PRINGLE (1980) que durante prolongado jejum, a sobrevivência da célula da levedura depende do nível de trealose.

Diversos fatores afetam o teor de trealose das leveduras. Condições anaerõbias provocaram redução na quantidade de trealose, sendo que o decréscimo foi mais acentuado quando as leveduras perderam as mitocondrias (PANEK, 1971). Entretanto, CHESTER & BYRNE (1968) re­lataram que em meio anaerõbio, quanto maior a concentra çao de glucose mais glicogênio e trealose foram arma­zenados, confirmado por PANEK (1975) para trealose. A deficiência de nitrogênio induziu ao acúmulo de trealo­se em leveduras (KUENZI & FIECHTER, 1972; LILLIE & PRINGLE, 1980) enquanto que TREVELYAN & HARRISON (1956b) relataram que a formação de carboidratos pelas levedu­ras foi também reduzida por altas concentrações de fos­fato. A adição do inibidor 2,4-dinitrofenol provocou redução no teor de trealose (BERKE & ROTHSTEIN, 1957; AM IN et alii (1984) enquanto que PANEK (1962) relatou que isoniazida e fluoreto de sódio nao afetaram a for­mação de trealose em condições aerõbias.

0 objetivo do presente trabalho foi determinar os teores de trealose nas leveduras mais utilizadas pa­ra a produção de etanol em diversas condições de tem­peratura, concentração de sacarose, pH, fontes de ni­trogênio e na presença de inibidor 2,4-dinitrofenol.

MATERIAL E MÉTODOS

Microrganismo

Foram utilizadas as leveduras Saccharomyces ce­revisiae M-300-A fornecida pelo Departamento de Genéti­ca da ESALQ/USP, Saccharomyces uvarum IZ-1904 fornecida pelo Departamento de Tecnologia Rural da ESALQ/USP e a Saccharomyces cerevisiae (levedura de panificaçao, Fleis-chmann). As leveduras foram multiplicadas anaerobiamente

na presença de ãcido oleico e ergosterol conforme des­crito anteriormente (GUTIERREZ, 1989).

Meio de fermentação

0 meio utilizado nos ensaios de fermentação a-presentou a seguinte composição por litro sacarose 80 a 160g, K 2HP0 4 l,3g, MgSO 0,9g, CaCl 2 0,16, ãcido citri-co 6g, extrato de levedura 2,5 e 5,0g. 0 pH foi acer­tado a 3,0; 4,0 e 4,5 com solução de KOH45N.

Ensaio de fermentação

80 m& dos meios contidos em frascos cônicos de 125m£, foram inoculados com suspensões das leveduras de modo a proporcionar o mesmo número de células inicial (3 a 4xl0 7 células/m£) e a quantidade expressa em maté­ria seca foi de 160mg/100mJl para a levedura de panifi­caçao, 80mg para IZ-1904 e 120mg para M-300-A. As fer­mentações foram acompanhadas por pesagens para se de­terminar o C0 2 produzido e o final da fermentação. Após 0 final da fermentação, foram feitas determinações da trealose produzida. Foram realizados diversos trata­mentos: temperatura (12 ± 1°C, 25 ± 1°C e 34 ± 1°C), concentrações de sacarose (8, 11, 14 e 16%) pH (3,0 e 4,5), fontes de nitrogênio, (420ppm de N na forma amo-niacal, 420ppm de N na forma de uréia, 0,25% e 0,50% de extrato de levedura) e com 18ppm de 2,4-dinitrofenol.

Trealose

3m£ do meio fermentado foram centrifugados du­rante 5 minutos. 0 precipitado foi lavado com 8m£ de ãgua destilada gelada, centrifugado e tratado com 2m£ de ãcido tricloroacêtico 0,5M em banho de gelo durante 1 hora para a extração de trealose. A trealose foi de­terminada com o reativo de antrona, utilizando glucose como padrão segundo TREVELYAN & HARRISON (1956a e c).

Matéria seca

8mZ do meio fermentado foram centrifugados du­rante 5 minutos, o precipitado lavado com ãgua destila­da gelada e transferido para estufa a 100-105 C durante 8 horas.

Análise estatística

Foi adotado o delineamento de parcelas subdivi­didas com 3 repetições segundo GOMES (1970).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na Tabela 1 sao apresentados os teores de trea­lose das leveduras estudadas em três temperaturas. A levedura IZ-1904 apresentou menor teor de trealose (p < 0,05) do que as demais leveduras sendo que o maior acúmulo foi observado para a levedura M-300-A. Nas três leveduras ocorreu redução (p < 0,05) quando a tempera­tura aumentou de 12 para 25°C e incremento (p < 0,05) quando passou de 25 para 34°C. Para as leveduras de panificaçao e IZ-1904 os maiores teores de trealose o-correram^na temperatura mais elevada (34°C) confirmando observações de GRBA et alii (1975). Uma possível ex­plicação para o maior acúmulo a 12 e 34°C poderia ser baseada no crescimento e biossíntese de proteínas. GU­TIERREZ (1989) relatou menor produção de material celu­lar a 12 e 34°C quando comparado a 25°C. Segundo PANEK (1962) a trealose e sintetizada quando cessa a síntese de aminoácidos. Também PARADA & ACEVEDO (1983) verifi­caram redução de RNA das células de leveduras a 35°C. Assim diminuindo o crescimento celular aumenta a sín­tese de trealose como argumento por THEVELEIN (1984).

0 efeito da concentração da sacarose sobre o acú

mulo de trealose pode ser observado na Tabela 2. Nas

leveduras de panificaçao e IZ-1904 ocorreram aumento

(p < 0,05) no acúmulo de trealose com maiores concen­

trações de sacarose. Na levedura M-300-A ocorreu re­

dução de trealose quando o meio variou de 8 para 11% de

sacarose e aumento com 11 para 16% de sacarose. As le­

veduras M-300-A e de panificaçao apresentaram os teores

mais elevados enquanto que IZ-1904 apresentou os meno­

res teores (p < 0,05) em todas as concentrações de sa­

carose utilizadas.

Segundo PANEK (1971) e GRBA et alii (1975)a^trea lose foi formada em maior quantidade em meio aerõbio, devido a presença de mitocondrias funcionais. Os va­lores citados na Tabela 2 foram obtidos em meio anaero-bio e se aproximam dos valores citados por esses auto­res. Provavelmente as concentrações de sacarose utili­zadas no presente trabalho (de 8 a 16%) possibilitaram maior disponibilidade de energia, promovendo o incremen to da formação de trealose.

0 efeito da concentração de sacarose sobre o a-cúmulo de trealose poderia também ser explicado pelo au mento da pressão osmõtica, pois segundo MACKENZIE et alii (1988) o desenvolvimento da resistência a pressão osmõtica foi acompanhada pelo acúmulo de trealose.

Na Tabela 3 sao apresentados os teores de trea­lose obtidos em fermentações em pH 3,0 e 4,5. Para as leveduras M-300-A e de panificaçao ocorreu maior teor (p < 0,05) em pH 4,5 do que em pH 3,0 enquanto que fe­nômeno inverso foi observado para IZ-1904.

Na Tabela 4 sao apresentados os teores de trea­lose sob efeito da adição de 18ppm de 2,4-dinitrofenol-(DNP), sendo que o efeito nao foi o mesmo para as três

leveduras estudadas. Nao houve efeito significativo pa ra a levedura IZ-1904, pequena redução significativa pa ra M-300-A e drástica redução para a levedura de pani­ficaçao, evidenciando uma maior sensibilidade dessa le­vedura ao inibidor DNP.

A redução do teor de trealose observada na Tabe­la 4 confirma trabalhos relatados por BERKE & ROTHSTEIN (1957) e AMIN et alii (1984). 0 inibidor DNP afeta a fosforilaçao oxidativa realizando o desacoplamento da cadeia respiratória (BRADY et alii, 1961). Entretanto, os experimentos do presente trabalho foram conduzidos em condições anaerõbias com elevada concentração de açu car, condições em que as mitocondrias estão ausentes (DUNTZE et alii, 1969). Assim uma provável explicação para a redução da trealose poderia ser dada pelo efei­to estimulante do DNP sobre ATPase conforme verificado por PULLMAN et alii (1960) reduzindo assim os níveis de ATP e UTP necessários a biossintese de trealose.

Aumentando-se a quantidade de extrato de levedu­ra de 0,25 para 0,50% ocorreu redução (p < 0,05) no teor

de trealose nas leveduras estudadas (Tabela 5), confir­mando observações de KUENZI & FIECHTER (1972) e LILLIE& PRINGLE (1980). Maior acumulo de trealose foi observa­do com uréia em comparação ao nitrogênio amoniacal.

Observando-se os resultados obtidos pode-se no­tar que as leveduras Saccharomyces cerevisiae M-300-A e a de panificaçao apresentaram teores mais elevados de trealose do que Saccharomyces uvarum IZ-1904.

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Entregue para publicação em: 27/08/90

Aprovado para publicação em: 20/12/90