Cultura dinâmica de células osteoprogenitoras em arcabouços de PHB

Taíla O. Meiga1,2*, Yannis Missirlis2, Rossana M.S.M. Thiré1

*taila@metalmat.ufrj.br, bolsista de doutorado do CNPq1Laboratório de Biomateriais, PEMM-COPPE-UFRJ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil

2Mechanical Engineering & Aeronautics Department, University of Patras, Greece

ResumoO uso de biorreatores nas pesquisas de engenharia tecidual ganhou grande destaque devido a sua capacidade de simular, in vitro, as variantes presentes nos experimentos in vivo, de forma isolada e controlada. Para este trabalho foram desenvolvidos arcabouços de poli(3-hidroxibutirato) (PHB) de alta porosidade, com suas superfícies modificadas pela ligação covalente da proteína adesiva fibronectina (Fn), tornando-as biocompatíveis. Os arcabouços cultivados foram submetidos à cultura dinâmica de compressão e fluxo, aplicados de forma combinada e isolada. A cultura dinâmica mostrou ser uma etapa de grande importância no que diz respeito à proliferação celular.

Palavras-chave: engenharia tecidual, biorreator, biocompatibilidade, compressão, MG-63.

IntroduçãoO Poli(3-hidroxibutirato) – PHB é um material de grande importância em aplicações biomédicas devido a suas propriedades biodegradável, biocompatível e não-tóxico [1]. Porém, por não apresentarem grupamentos químicos funcionais para o processo de interação celular, materiais a base de PHB são submetidos a processos de modificação e superfícies, objetivando a sua bioativação. Os biorreatores são dispositivos importantes para a manutenção de culturas celulares em 3D, uma vez que promove a passagem de nutrientes, por fluxo continuo, por dentro do material. Atualmente são desenvolvidos complexos biorreatores para satisfazer as exigências de grupos celulares específicos. Este trabalho tem por objetivo avaliar o efeito combinado de fluxo e compressão em culturas de células de linhagem óssea sobre arcabouços de PHB.

Materiais e métodosOs arcabouços de PHB foram preparados pela técnica de lixiviação de partículas, utilizando clorofórmio como solvente e sacarose como agente porogênico. As modificações de superfície se deram pela hidrólise com NaOH (65ºC, 45 min) seguida pela imobilização covalente de fibronectina humana (Fn) (10 mg/mL, pH 7.2) [2]. Os arcabouços modificados foram analisados estruturalmente por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). A porosidade foi medida usando o Princípio de Arquimedes (ASTM F250-10). Para

os testes in vitro foram utilizados os arcabouços hidrolisados, com e sem Fn. Cada arcabouços foi cultivado com 8 x 104 células tipo osteoblasto (MG-63 – linhagem derivada de osteosarcoma humano). Os arcabouços cultivados foram mantidos em cultura estática por 4h quando, então, foram submetidos à cultura dinâmica em biorreator, por 15h, sob duas condições distintas: compressão mecânica e fluxo contínuos (±130 µm, ~2,5% tensão, 1 Hz, 15 mL/min) e somente fluxo contínuo (15 mL/min). Foi mantida, em paralelo, a cultura estática. Em todos os experimentos de cultivo celular (estático e dinâmico) foi utilizado o meio de cultura DMEM (Biochrom AG), com atmosfera de 5% CO2 e temperatura de 370C. Após as 19h totais os materiais foram analisados por Microscopia Confocal, utilizando os fluorocromos DAPI (marca núcleos em azul) e Faloidina (marca actina em verde).

Resultados e discussãoA porosidade medida em cada arcabouços foi de 96% ± 0,33. A imagem de MEV (Figura 1) mostra a malha de poros heterogênea de um arcabouço de PHB, após hidrólise, com algumas regiões densas entre estes. A ligação covalente da Fn não causou variação significativa da estrutura porosa.

Painel PEMM 2013 – 04 e 05 de novembro de 2013

Figura 1 – Imagem de MEV da superfície do arcabouço de PHB.

A partir das imagens de microscopia confocal (Figura 2) é possível observar uma maior densidade celular presente nos arcabouços expostos à cultura dinâmica. Estas células apresentam uma morfologia arredondada que pode estar relacionada ao efeito cisalhante resultante da passagem do fluxo, que promove o aumento da atividade osteoblástica, levando a diferenciação precoce [3,4]. Essa morfologia é, também, um indicativo do maior poder de movimentação celular [4], permitindo a sua migração para dentro da malha de poros. A ligação covalente da Fn mostrou ser uma etapa importante no processo de cultivo celular, uma vez que a densidade celular e o grau de espraiamento apresentado pelas células é maior nos arcabouços com Fn do que nos sem Fn. Ainda nos arcabouços com Fn, quando em cultura estática, é possível observar pontos de maior acúmulo de faloidina (regiões de alta intensidade luminosa do reagente). Estes são pontos de forte ancoramento do citoesqueleto celular na superfície do material [4]. Experimentos de somente fluxo continuo estão sendo conduzidos e, os resultados iniciais, mostram a mesma morfologia arredondada e uma menor densidade celular, quando comparado ao experimento com compressão. Novos testes de compressão estão sendo conduzidos, com variação do valor de tensão e uma etapa posterior de cultura estática, a fim de esclarecer o seu efeito no cultivo celular. Assim como testes histológicos, com o objetivo de avaliar a capacidade de penetração/ sobrevivência celular na região mais interna dos arcabouços.

Figura 2 – Imagens de microscopia confocal de PHB sem (a,b) e com Fn (c,d) após culturas estática (a,c) e dinâmica de compressão mecânica e fluxo constante (b,d). Tempo 19h, aumento 20x.

ConclusõesA alta porosidade apresentada pelos scaffolds tem grande importância nos processos de ancoramento e proliferação. Tendo a Fn, porém, importante papel no aumento da compatibilidade das superfícies. O teste dinâmico tem se mostrado importante no processo de proliferação, com alta densidade celular após o tempo de ensaio e possível migração celular para dentro da malha de poros.

AgradecimentosAs Agências Brasileiras CAPES, CNPq e FAPERJ pelo suporte financeiro e a PHB Industrial S/A pelo fornecimento do PHB.

Referências[1] D.B. Hazer, E. Kılıçay, B. Hazer, Mat Sci Eng C 32 (2012) 637.

[2] M. Nagai, T. Hayakawa, M. Makimura, M. Yoshinari, Biomat Appl 21 (2006) 33.

[3] Z. Schwartz, T. A. Denison, S. R. Bannister, D. L. Cochran, Y. H. Liu, C. H. Lohmann, M. Wieland, B. D. Boyan J. of Biom. Mat. Res. Part A (2007) 20.

[4] J.M.Lee, J.I.Lee,Y.J.Lim, Appl Surf Sci 256 (2010) 3086.

Painel PEMM 2013 – 04 e 05 de novembro de 2013

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