DESENVOLVIMENTO DE UM SISTEMA DE LIBERAÇÃO

CONTROLADA DE OXITETRACICLINA MICROPARTICULADA

EM MATRIZ DE ALGINATO E QUITOSANA.

Sirlene A. Kleinubing1, Danielle C. Seraphim1, Lúcia H. I. Mei1

1Depto. de Engenharia de Materias e Bioprocessos , Universidade Estadual de Campinas, Campinas(SP), Brasil

E-mail: adrianak@feq.unicamp.br

Resumo. O presente trabalho fundamenta-se no desenvolvimento de um sistema de liberação controlada no meio entérico carregado com a oxitetraciclina (OTC) encapsulada em matriz microparticulada de alginato e quitosana, protegendo o meio estomacal do fármaco. O método utilizado para preparação das micropartículas foi coacervação complexa, em um único estágio. A granulometria das micropartículas foi determinada por microscopia óptica e a análise morfológica foi realizada em microscopia eletrônica de varredura (MEV). A interação entre os biopolímeros alginato e quitosana foi determinada por Espectrômetro de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR). A determinação do perfil de liberação in vitro do fármaco foi realizada por UV-VIS, em meio de dissolução ácido e básico para simular o trato gastrointestinal. A análise morfológica das micropartículas por MEV revelou a presença do revestimento de quitosana e de fissuras na superfície. No espectro do FTIR foram verificados deslocamentos das bandas de absorção, devido à interação iônica entre os grupos carboxílicos do alginato e os grupos amina da quitosana. Nos estudos do perfil de liberação do fármaco verificou-se uma liberação inicial rápida em meio ácido, mantendo-se constante. Em meio básico a liberação foi gradual, sendo o fármaco totalmente liberada em seis horas.

Palavras-chave: Oxitetraciclina, Microencapsulação, Liberação controlada.

1. INTRODUÇÃO

Os antibióticos constituem um dos grupos de fármacos mais prescritos. São agentes químicos capazes de inibir a reprodução ou destruir microorganismos (Silva, 2010), sendo empregados no tratamento de infecções bacterianas. Uma das famílias de antibióticos mais comuns são as tetraciclinas, da qual faz parte a oxitetraciclina (OTC).

As tetraciclinas apresentam amplo espectro de ação contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (Silva, 2010). Para uso clínico são prescritas em infecções do trato respiratório, trato urogenital e para tratar infecções por bactérias relativamente raras, como Rickettsias, Clamídias, Brucelosis, Micoplasma e protozoários como Entamoeba histolytica, Giardia lamblia e Plasmodium falciparium (Chopra et al, 1992).

A OTC é um antibiótico que apresenta ação bacteriostática de amplo espectro (Maia et al., 2010). Porém, causa irritação da mucosa gástrica, náuseas e dispepsia quando administrada por via oral, o que limita o uso deste fármaco na forma de liberação convencional. Assim, uma forma farmacêutica gastrorresistente oral contendo

oxitetraciclina promoveria uma redução dos efeitos gástricos deste fármaco, visto que este seria liberado apenas no intestino devido ao revestimento pH dependente.

A microencapsulação é o processo de envolver substâncias ativas ou outros compostos em um filme polimérico, liberando o seu conteúdo de forma controlada e sob condições específicas. O transporte seletivo de um agente terapêutico no local de ação desejado pode otimizar a resposta biológica, evitar fenômenos de sub ou superdosagem, e prevenir reações indesejáveis, como a irritação gástrica provocada por determinados fármacos administrados oralmente.

Biopolímeros incluindo o alginato e a quitosana têm sido o foco de um número crescente de estudos relatando sua potencial utilização em aplicações de pesquisas na área biomédica, tais como encapsulamento de células, carreamento de fármacos e engenharia de tecidos (Lawrie, 2007), por serem de fácil degradação hidrolítica e enzimática, biocompatíveis e não tóxicos.

Um dos fatores que permitiram o desenvolvimento de biomateriais usando alginato e quitosana tem sido a sua capacidade de formar um complexo polieletrólito por ligações iônicas, pela interação entre os grupos carboxílicos do alginato e amina da quitosana formando uma matriz tridimensional conhecido como gel reticulado (Peniche, 2001).

A realização deste trabalho fundamenta-se no desenvolvimento de um sistema de liberação controlada com a oxitetraciclina (OTC) encapsulada em matriz microparticulada de alginato e quitosana, com o objetivo de proteger o meio estomacal da OTC, liberando a mesma de maneira controlada no meio entérico.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

Para o desenvolvimento do trabalho foi utilizado o fármaco cloridrato de oxitetraciclina (Sigma-Aldrich Co., EUA, ≥95% (HPLC) cristalino). Como agente encapsulante foram utilizados a quitosana (Sigma-Aldrich Co., EUA, ≥75% desacetilada) e o alginato de sódio ( Fluka Chemika, Suíça). O cloreto de cálcio (Synth, P.A., Brasil) foi utilizando como geleificante do alginato. Os solventes utilizados foram ácido acético (P.A., Brasil) e água destilada.

Micropartículas de alginato revestidas com quitosana foram utilizadas para o aprisionamento do fármaco. Preparou-se uma solução de 0,3% de quitosana e ácido acético 1%, permanecendo sob agitação por 24 horas. Em seguida, adicionou-se CaCl2

2,0% nesta solução. Após, o pH foi ajustado para 5,7 com 1M de NaOH e a solução filtrada. Uma solução de oxitetraciclina 0,010g/mL dissolvida em alginato de sódio 1,75% e NaCl 0,9% foi gotejada sobre a solução contendo a quitosana, sendo que as micropartículas formadas ficaram sob agitação na solução original por 24 horas, garantindo, assim, sua geleificação interna.

A análise granulométrica das micropartículas foi realizada em um microscópio óptica modelo DMLM da marca Leica. Foi realizada também a microscopia óptica das micropartículas na forma de gel, ou seja, antes do processo de secagem, em um microscópio óptico acoplado a sistemas de aquisição de imagem –SranPro, da marca Cole-Parmer.

A morfologia e as características superficiais foram avaliadas através do uso de microscópio eletrônico de varredura modelo SC7620, marca VG Microtech.

A Espectrôscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) do alginato (pó), da quitosana (pó), das micropartículas de alginato e quitosana e destas micropartículas carregadas com OTC foi realizada para confirmar a presença dos grupos químicos em amostras de alginato e quitosana e as mudanças destes grupos após a

formação das micropartículas e após o aprisionamento do fármaco nas micropartículas. As medidas do FTIR modelo Nicolet 6700 da Thermo Scientific, foram realizadas num comprimento de onda de 268nm.

A liberação controlada da oxitetraciclina foi determinada de acordo com o procedimento descrito por Cruz (2004). A concentração de OTC liberada das micropartículas alginato/quitosana foi medida em solução de pH 1,2 e solução de pH 7,4 que simulam o ambiente gastrointestinal, foi determinada por medida direta da absorbância à 268nm, em espectrofotômetro Varian 1G. Aproximadamente 10-20mg de micropartículas foram colocadas no meio de dissolução e deixadas em banho Maria com agitação orbital tipo Dubnoff, (da Marconi Equipamentos para Laboratório), com velocidade de rotação de 100rpm, à temperatura de 37 ± 0,5ºC. As alíquotas foram retiradas em determinados intervalos e devolvidas ao meio de liberação. As curvas de calibração utilizada foram preparadas em pH 7,4 e pH 1,2 e as leituras realizadas em triplicata.

3. RESULTADOS E DISCUSSÕES

Para determinação do diâmetro médio das micropartículas, análise granulonométrica foi realizada em cerca de 50 micropartículas secas, sendo que o valor encontrado foi de 1.048 mm.

A Figura 1 apresenta as imagens obtidas por microscopia óptica das micropartículas secas.

Figura 1: Imagens de MO (a) com aumento de 20x (b) aumento de 40X, obtidas das micropartículas secas de alginato e quitosana com OTC.

A Figura 2 apresenta as imagens das esferas de alginato e quitosana contendo OTC, na forma de gel, obtidas a partir da geleificação do alginato com cloreto de cálcio antes da secagem.

Figura 2: Imagens do MO com aumento de 10x obtidas das micropartículas de alginato e quitosana com OTC úmidas.

Para análise morfológica da superfície das micropartículas secas foi realizado o MEV. A Figura 3 apresenta as imagens obtidas da amostra de referência (branco), onde se pode observar a morfologia da micropartícula, sendo que esta se apresenta na forma esférica.

Figura 3: Imagem de MEV do branco da micropartícula de alginato e quitosana sem OTC (a)aumento de 50x (b) aumento de 250x.

A Figura 4 mostra as imagens obtidas das micropartículas de alginato e quitosana contendo OTC. Nota-se que a superfície destas micropartículas apresentam-se irregulares comparadas a amostra de referência. Isto evidencia que a OTC interfere na coacervação da microesfera, por sua geometria não esférica que atua como guia para a deposição da camada externa de quitosana.

Figura 4: Imagem de MEV da micropartícula de alginato e quitosana com OTC (a) aumento de 50x (b) aumento de 250x.

Pela Figura 5 pode-se verificar a presença de fissuras na superfície das micropartículas, sendo que estas fissuras podem ocasionar uma liberação rápida do fármaco. Estas fissuras podem ter se formado devido à rápida coacervação entre alginato e quitosana que enrijeceria de imediato as cadeias dos polímeros, não tendo tempo suficiente para as mesmas se acomodarem. Assim, cavidades que se formam servem como facilitadores de escoamento rápido do fármaco (efeito “burst”) para o ambiente externo.

Figura 5 – Imagem de MEV da presença de fissuras nas micropartículas (aumento de 250x).

A espectroscopia na região do Infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) foi empregada para confirmar a presença dos grupos funcionais em amostras de alginato e quitosana; bem como as mudanças destes grupos após a formação das micropartículas, avaliando a ocorrência de interação iônica entre os grupos funcionais do alginato e da quitosana. A Figura 6 apresenta os espectros obtidos para o biopolímero alginato (Figura 6a), quitosana (Figura 6b), alginato + quitosana (Figura 6c) e alginato +quitosana + OTC (Figura 6d). A Tabela 1 apresenta as alterações sofridas pelos picos/bandas em todas as condições estudadas.

Figura 6: Espectros obtidos para o biopolímero alginato (Fig. 6a), quitosana (Fig. 6b), alginato + quitosana (Fig. 6c) e alginato +quitosana + OTC (Fig. 6d).

O grupo carboxílico do alginato reage com a amina da quitosana, formando um complexo aniônico. Como resultado, ocorrem mudanças nas faixas de absorção dos grupos aminas, ácidos carboxílicos e ligações amida, como verificado na Tabela1.

Tabela 1: Deslocamentos das bandas obtidas para o alginato, quitosana, alginato/quitosana e alginato/quitosana/OTC.

Alginato Quitosana Alginato/quitosana Alginato/quitosana/OTC

1621 cm-1 1650 cm-1 1617 cm-1 1612 cm-1

1418 cm-1 1418 cm-1 1423 cm-1 1423 cm-1

1312 cm-1 1380 cm-1 1319 cm-1 1324 cm-1

- 1258 cm-1 1258 cm-1 1263 cm-1

1094 cm-1 - 1092 cm-1 1086 cm-1

- 1076 cm-1 - -

Assim, após a complexação, os picos do ácido carboxílicos perto 1621 e 1418 cm-1, mudam ligeiramente para 1617 cm-1 e 1423 cm-1, respectivamente. Na quitosana o pico de ligação da amida mudou de 1650 cm-1 para 1617cm-1. Essas mudanças podem ser atribuídas a interações iônicas entre a carboxila do alginato e a amina da quitosana.Gazori et al, 2009, observaram resultados semelhantes em um estudo da interação entre o alginato e a quitosana, onde encontraram mudanças na faixas de absorção dos grupos aminas, ácidos carboxílicos e ligações amida.

Os grupos ésteres observados na quitosana, identificados em 1258 cm-1, não sofreram alteração na presença do alginato. O pico 1076 cm-1, que representa aminas alifáticas (Cruz, 2004), desaparece na presença do alginato devido às ligações destes grupos com os grupos carboxílicos do biopolímero alginato.

O perfil de liberação da OTC em meio ácido, que simula a condição gástrica está ilustrado na fig. 7(a), enquanto que o perfil do meio básico que simula a condição

intestinal está ilustrado na fig. 7(b). Como se pode observar, no meio ácido houve uma liberação rápida da OTC nos primeiros 30 minutos, a qual pode ser explicada pela alta solubilidade da OTC neste meio. Como já mencionado anteriormente, a presença de fissuras nas micropartículas (vide fig. 5) pode ter agravado esta liberação inicial rápida da OTC. Assim, a solução ácida pode penetrar na matriz pelas fissuras formadas e dissolver rapidamente os cristais do fármaco, o que provoca a rápida difusão do mesmo para fora das micropartículas (MI, 1996).

(a) (b)Figura 7: Perfil de liberação da oxitetraciclina microparticulada em matriz de alginato e

quitosana (a) em meio ácido (b) em meio básico.

A Figura 8 representa o meio de dissolução ácido e o meio básico que simula a condição gastrointestinal. No pH ácido as micropartículas carreados com fármaco não intumescem, como pode ser verificado na fig. 8 (b), permanecendo intactas, o que impede a liberação total do fármaco, o que pode explicar a sua liberação constante após os trinta minutos em meio ácido.

Figura 8: Meio de dissolução (a) básico (b) ácido

Em pH básico é possível verificar uma liberação gradual da OTC, sendo que a concentração se mantém constante após cinco horas, como observado na fig. 7(b). Neste meio, as micropartículas intumescem (vide fig. 8(a)) e vão se desintegrando, permitindo assim, a liberação do fármaco à medida que ocorre a desintegração.

Quando as microesferas entram em contato com o meio básico, sua temperatura de transição vítrea (Tg) diminui a um valor abaixo da temperatura de liberação do fármaco. Com isso, sua estrutura torna-se mais flexível, ocorrendo o relaxamento das cadeias. Assim, o meio aquoso que contém as partículas se aloja nos volumes livres e se liga através dos grupos OH e COOH do alginato. Os grupos polares então são hidratados e a rede polimérica intumesce, formando um hidrogel. A água que preenche

os espaços entre as cadeias promove um ambiente favorável para a dissolução e transporte da OTC (HOFFMAN, 2002).

Mi (1996) preparou micropartículas de quitosana para encapsulação da OTC estudando o perfil de liberação desta em meio ácido e básico e observou a liberação inicial rápida no meio ácido. Cruz (2004) encapsulou a OTC em micropartículas de alginato e quitosana e também observou a liberação rápida da OTC neste meio. O fato da OTC ser solúvel em meio ácido dificulta a encapsulação deste fármaco neste meio.

5. CONCLUSÃO

Pelo fato da OTC ser agressiva ao meio gástrico, este trabalho propôs encapsular este fármaco em micropartículas de alginato coacervada com quitosana. As micropartículas obtidas apresentaram-se na forma esférica, como pode ser observado pelas técnicas de microscopia. Pelo MEV pode-se observar a presença de fissuras nestas micropartículas. Os resultados obtidos no perfil de liberação mostraram que no meio básico a liberação ocorre de maneira gradual, sendo que a total liberação do fármaco ocorreu em cinco horas. No meio ácido ocorre uma liberação inicial rápida da OTC, sendo que esta liberação rápida é indesejada, já que este meio simula o meio gástrico, onde este fármaco é agressivo.

6. REFERÊNCIAS Chopra, I.; Hawkey, P.M.; Hinton, M. Tetracyclines, molecular and clinical aspects. J. Antimicrob. Chemother. 29, 245-277, 1992.Cruz, M.C.P. Influência do Poli(Etileno Glicol)(PEG) no Processo de Microencapsulação da Oxitetraciclina no Sistema Alginato/Quitosana: Modelamento “in vitro” da Liberação Oral. 143f. Dissertação (Doutorado em Engenharia Química) – Faculdade de Engenharia Química, Universidade Estadual de Campinas, 2004.Gazori, T.;Khoshayand,M.R.; Azizi,E.; Yazdizade,P.; Nomani,A.; Haririan, I. Evaluation of Alginate/Chitosan nanoparticles as antisense delivery vector: Formulation, optimization and in vitro characterization. Carbohydrate Polymers. 77, 599–606. 2009.Hoffman, A.S. Hydrogels for Biomedical Applications, Advanced Drug Delivery Reviews, vol.43, p.3-12, july, 2002.Lawrie, G.; Keen, I.; Drew, B.; Chandler-Temple, A.; Rintoul, L.; Fredericks, P.; and Grondahl, L. Interactions between Alginate and Chitosan BiopolymersCharacterized Using FTIR and XPS. Biomacromolecules. 8, 2533-2541, 2007.Peniche, C.; Arguelles-MonalL, W. Macromol. Symp. 68, 103, 2001.Maia, E.C.P.; Silva, P.P.; Almeida, W.B.; Santos, H.F.; Marcial, B.L.; Ruggiero, R.; Gerra, W. Tetraciclinas e glicilciclinas: uma visão geral. Quim. Nova, Vol. 33, nº. 3, 700-706, 2010.Mi, F.L.; Wong, T.; SHYU, S. Sustained-release of oxytetracycline from chitosan microspheres prepared by interfacial acylation and spray hardening methods. J. Microencapsulation, vol. 14, nº5, 577-591, 1997. Silva, P. Farmacologia. 8º ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan S.A, 2010.

AGRADECIMENTOS

À FAPESP pelo apoio financeiro.

DEVELOPMENT OF A SYSTEM OF CONTROLLED RELEASE OF OXYTETRACYCLINE MICROPARTICULATE IN MATRIX OF

ALGINATE AND CHITOSAN

Sirlene Adriana Kleinubing1, Danielle Chati Seraphim1, Lúcia Helena Inocentinni Mei 1

1 Dept. Materials Engineering and Bioprocesses, State University of Campinas, Campinas (SP), BrazilE-mail: adriank@feq.unicamp.br

Abstract. This work is based on the development of a system for controlled release of oxytetracycline (OTC) through the enteric loaded with microparticulate matrix encapsulated in alginate and chitosan, protecting the stomach region of drug. The method used for preparation of microparticles was complex coacervation in a single stage. The particle size of microparticles was determined by optical microscopy and morphological analysis of scanning electron microscopy (SEM). The interaction between alginate and chitosan biopolymers was determined by Spectrometer Fourier Transform Infrared (FTIR). Determination of in vitro release profile of the drug was by UV-VIS dissolution medium acidic and basic simulating the gastrointestinal tract. Morphological analysis of the microparticles by SEM revealed the presence of the coating of chitosan and cracks on their surfaces. In the FTIR spectra, movements of the absorption bands due to ionic interaction between the carboxylic groups of the alginate and the amine groups of chitosan were recorded. Studies of drug release profile showed a rapid initial release in an acidic medium, followed by a constant rate. In the basic media, release was gradual, with complete release of the drug within six hours.

Keywords: Oxytetracycline, Microencapsulation, Controlled release.