23/11/2011
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Sistemas de cromatografia e suas aplicações na Proteômica
Prof. Alan McBride
Proteômica
Biotecnologia, CDTec, UFPel
Cromatografia - uma definição
• A cromatografia é uma técnica de separação baseada na distribuição dos componentes de uma mistura entre um fluido (fase móvel ou eluente) e um adsorvente (fase estacionária).
• A fase estacionária pode ser um sólido ou um líquido depositado num sólido inerte, empacotado numa coluna ou espalhado por uma superfície formando uma camada fina.
O origem de cromatografia
• 1903: o Italiano Mikhail Semenovich Tswettdesenvolveu a técnica para a separação de extratos de plantas:
– Carbonato de cálcio como fase estacionária e di-sulfureto de carbono como eluente
Cromatografia
• Transporte dos componentes de uma amostra por uma fase móvel através de uma fase estacionária:
Tipos de cromatografia
• Cromatografia líquida
– A fase móvel é arrastada através da coluna apenas por força da gravidade.
Cromatografia liquidoUsada para identificar pigmentos e
outros compostos desconhecidos de
plantas.
Tipos de cromatografia
• Cromatografia gasosa
– As separações podem ser obtidas por cromatografia gasosa simples (CG) e por cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR).
Cromatografia gasosaUsada para determinar a composição
química de substâncias desconhecidos,
ex composto de gasolina, ver cada peco
no gráfico abaixo.
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Tipos de cromatografia
• Cromatografia em camada delgada
– É uma técnica de adsorção líquido–sólido.
Cromatografia de
papelPode separar os compostos
de tintas, plantas (ex
clorofila), maquiagem e
outras substâncias.
Cromatografia em camadadelgada
Uso de placas de plástico ou vidro para
identificar pigmentos, químicos e outros
substâncias desconhecidos.
Os processos cromatográficos
Misturas e compostos
• Analito - substância a ser separada durante a cromatografia.
• Mistura – duas ou mais substâncias misturadas, mas não quimicamente combinado– Ar: uma mistura de gases– Nevoeiro: água suspenso em ar
• Composto – dois ou mais elementos quimicamente combinado– Sal: um composto de sódio e cloro (NaCl)– Água: um composto de hidrogênio e oxigênio (H2O)
Soluções
• Solução – uma mistura onde uma substância é dissolvida em uma outra.
• Uma solução tem duas partes:
– Soluto: é a substância dissolvida.
– Solvente: é a substância que dissolver a outra.
• Solubilidade – a capacidade de uma substância de se dissolver.
Cromatografia em Camada Delgada
• CCD é uma técnica de adsorção líquido–sólido:
– A separação é em função da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente, fixo numa superfície plana, por meio de uma fase móvel (um líquido ou misturas de líquidos).
• O fenômeno é principalmente de adsorção:
– A separação se dá pela diferença de afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionária.
– Os adsorventes comerciais mais utilizados são: sílica, alumina, celulose, terra diatomácea e poliamida.
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CCD• Utiliza-se pequena quantidade de amostra
(microgramas a miligramas). As manchas podem ser reveladas por meio de luz UV, vapores de iodo, soluções de cloreto férrico e tiocianoferrato de potássio, fluorescências, radioatividade, etc.
CCD
• Fator de retenção (Rf):
– O qual é a razão entre a distância percorrida pela substância em questão e a distância percorrida pela fase móvel.
– Os valores ideais para Rfestão entre 0,4 e 0,6.
CCD
• A CCD pode ser usada tanto na escala analítica quanto na preparativa.
• Método simples, rápido, visual e econômico.
• A CCD pode ser usada para:
– Identificar os compostos presentes em uma mistura;
– Determinar a pureza de uma substância.
Cromatografia Gasosa
• Partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel gasosa e a fase estacionária líquida. A utilização de fases estacionárias sólidas, as quais levariam à separação por adsorção, apresenta poucas aplicações.
• Técnica analítica mais utilizada:– Além de possuir um alto poder de resolução, é muito
atrativa devido à possibilidade de detecção em escala de nano a picogramas (10–9 a 10-12 g).
• A grande limitação deste método é a necessidade de que a amostra seja volátil ou estável termicamente.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)
• É baseado na partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel líquida e a fase estacionária sólida.
• A versatilidade desta técnica reside no grande número de fases estacionárias existentes, as quais possibilitam análises e separações de uma ampla gama de compostos com alta eficiência.
a) reservatório da fase móvel; b) bomba de alta pressão; c) válvula de injeção; d) coluna; e) detector e f) registrador.
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HPLC
• Perfil cromatográfico de uma análise registrada automaticamente, de padrões de aminoácidos. Fonte: Lehninger, 1990.
HPLC
• As separações em HPLC podem se dar por adsorção, partição ou ambos.
– O suporte mais utilizado é a sílica.
• As fases quimicamente ligadas, dependendo da modificação feita ao suporte, podem atuar no modo normal, reverso ou ambos.
– Na cromatografia em fase normal, a fase estacionária é mais polar que a fase móvel, e em fase reversa, a fase móvel é mais polar.
HPLC
• Separações analíticas são predominantemente realizadas em fase reversa– A fase C18 (octadecilsílica) é a mais usada.– Separações no modo reverso utilizam fases móveis
aquosas.
• Tem sido utilizada em várias áreas da ciência, no acompanhamento de sínteses, em análises de pesticidas, feromônios, no isolamento de produtos naturais e sintéticos e na produção e controle de qualidade de medicamentos, dentre tantas outras aplicações.
Cromatografia de afinidade (CA)
• Baseada na capacidade de uma proteína/componente se ligar especificamente a outra partícula.
• As colunas contêm esferas ligadas covalentemente a anticorpos específicos da proteína de interesse.
• As partículas são depois eluídas por ex. por uma solução concentrada de ligando, pH diferente do de ligação.
CA
• Superfície da espera ligada ao epóxi, aldeído ou grupos de éster aril.
• Immobilized metal ion
affinity chromatography
(IMAC)– Iminodiacético +
Ni2+/Zn2+/Co2+
CA 2004dez03no002:1_UV 2004dez03no002:1_Cond 2004dez03no002:1_Conc
2004dez03no002:1_Fractions
0
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mAu
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%B
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mAu
0 20 40 60 80 min
1 3 5 7 9 121518 Waste
IMAC purificação
SDS-PAGE das frações
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Cromatografia iônica (CI)
• É a troca de íons de mesmo sinal entre uma solução e um corpo sólido muito insolúvel.
• Corpo sólido = trocador de íons = resina útil
– polímeros portadores de carga elétrica que possuem íons ativos que permutam reversivelmente de posição com outros íons de uma solução.
CI
• Importante: o grau que um íon é absorvido preferencialmente em relação a um outro íon:– Cresce com o aumento da carga dos íons
permutantes:• (Na+ < Ca2+ < Al3+ < Th4+ )
– Cresce com a diminuição do tamanho do íon hidratado:
• (Li+ < H+ < Na+ < NH4+ < K+ < Rb+ < Cs+)
• A afinidade relativa do íon de maior carga cresce em proporção direta com a diluição.
CI
• Análise consiste de quatro etapas:
– Transporte
– Separação
– Detecção
– Análise de dados
CI
• Transporte
– A amostra líquida é transportada por um eluente líquido, com composição e concentração conhecidos.
– O sistema opera sob pressão.
• Separação
– Os diferentes íons da amostra migram completamente na coluna de separação em diferentes períodos de tempo, de acordo com as interações com os sítios ativos da coluna de separação.
CI
• Detecção– Feita por uma célula de condutividade, que
monitora e mede a condutância elétrica dos íons da amostra, produzindo um sinal baseado em uma propriedade física ou química do analito.
• Análise de dados– Software que recebe o sinal da célula de
condutividade e analisa os dados comparando os picos da amostra em um cromatograma com os produzidos por uma solução padrão.
Vantagens de CI
• Permite a determinação de espécies iônicas, orgânicas e inorgânicas;
• Sensibilidade a baixas concentrações (μg/L ou menos);
• Tempo de análise (15 minutos);
• Pequenos volumes de amostra (1 mL).
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Desvantagens de CI
• Custos alto
– Equipamento e treinamento
– Produtos químicos (eluente e regenerante)
• Mão de obra especializada
– Técnico capacitado em operar o equipamento e analisar os resultados.
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
O lisado de E. coli contém milhares de proteínas
Meio de cultura
~10 proteínas
Lipopolissacarídeos
Membrana externa
Periplasma
~100 proteínas
Citoplasma
~2000 proteínas
Membrana interna
Peptídeoglicano
Os 5 princípios de separação
Gel filtração
Recombinant Protein Purification Handbook, GE Healthcare
Interaçãohidrofóbica
Troca iônicaAfinidade Fase reversa
Gel filtração
• A técnica mais simples de cromatografia.
• As proteínas maiores não entram nos poros da matriz – saem primeiro.
• As proteínas menores demoram mais para sair da coluna.
• Dois tipos:
– Separação de grupos.
– Separação de alta resolução.
Troca iônica
• Separação baseada na carga global da superfície de cada proteína.
– Dependente do pH.
• Eluição com gradiente de NaCl.
• Pode diferenciar entre duas proteínas que diferem por só um aminoácido.
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Preparação de amostraProteínas de
fusão
• Vários tipos de caudas:
– 6× His
– GST
– MBP
Purificação por Afinidade
• Proteína de fusão com cauda de histidina (6×His)
• Cromatografia de afinidade por metal imobilizado (IMAC):– Cu2+, Zn2+, Co2+ e Ni2+ tem afinidade para 6×His
• A sefarose pode ser usada em colunas:
Purificação por Afinidade
Expressar a proteínaem larga escala
Seletor os poços que tem expressão das proteínas (vermelho)
IMAC para purificara proteína
Produto final
2004dez03no002:1_UV 2004dez03no002:1_Cond 2004dez03no002:1_Conc
2004dez03no002:1_Fractions
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mAu
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%B
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1200
mAu
0 20 40 60 80 min
1 3 5 7 9 121518 Waste
Purificação por Afinidade
1. Ressuspender o pellet em tampão de lise (Tris 20 mM, EDTA 1 mM, Imidazol 10-40 mM ) e sonicar a suspensão;
2. Centrifugar a suspensão (4°C, 16.000 rpm, 30 min) e coletar o sobrenadante;
Purificação por Afinidade
3. Equilibrar a coluna de sefarose com tampão 1 (Tris 20 mM, EDTA 1 mM, Imidazol 10-40 mM ) e aplicar o sobrenadante a coluna;
4. Lavar a coluna 1x com tampão 1;
5. Aplicar tampão 1 e tampão 2 (PBS, 500 mM Imidazol) para formar um gradiente 10-40 até 500 mM Imidazol (eluição das proteína recombinantes) e coletar as frações.
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Purificação por Afinidade
2004dez03no002:1_UV 2004dez03no002:1_Cond 2004dez03no002:1_Conc
2004dez03no002:1_Fractions
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mAu
0 20 40 60 80 min
1 3 5 7 9 121518 Waste
AKTAprime
SDS-PAGE das frações
Purificação por Afinidade
• Trocar o tampão final e remover o imidazol;
– Diálise
– Gel filtração
• Verificar a concentração de proteína recombinante:
– Ex. métodos de Bradford ou Lowry
Purificação por Afinidade• Verificar a purificação de sua proteína
recombinante:M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Fontes de informação
Handbooks, GE Healthcare