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INTRODUCCION
Los aceites vegetales bromados han sido ampliamente
utilizados como aditivos para alimentos y especificamente en 10
industria de refrescos como agentes ajustadores de densidad de
los aceites citricos saborizantes.
A pesar de que se ha permitido el usa de dichos compuestos
como aditivos para alimentos, existe una gran cantidad de
estudlosi-? que seAalan la toxicidad de los mismos. Como resultado
de estos reportes, el uso de los aceites bromados ha side prohibido
en algunos parses, y d6nde sf se permiten, solo es posible utilizorlos
hasta una concentraci6n maxima de 15 ppm 10. Por 1 0 que resulta
importante desarrollar un metoda cnolltlco para sucucntltlcoclon.
AI realizar un estudio blblloqrcfico sobre el tema se
encontraron reportados diversos rnetodosu-w. destacando 10
cromatografla de gases como una de las tecnlcos mas utilizadas.
Efectivamente, la cromatograffa de gases ha sido ampliamente
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utilizada para el onollsls de los aceites vegetales bromados a pesar
de que las condiciones de trabajo necesarias para el desarrollo de
dicha tecnico provocan la descomposici6n de los aceites bajo
analisis21-23• Por otra parte, utilizando esta tecnlcc se dificulta el
oncllsls de los compuestos hexabromados a menos que se utilice
una columna copllorv.
La cromatografia de Ifquidos es 10 opclon mas viable para el
cncllsls de los compuestos que ocupan nuestro lnteres en este
estudlo. yo que con esta tecnlco deben eliminarse los problemas
de la descornposlclon del producto bajo onolisls y de la
determinacion de loscompuestos hexabromados.
Lawrence, Chadha y Conocher!' utilizaron un metoda de
cromatograffa de liquldos con detecclon UV a 220 nm para la
corocterlzoclon de aceites vegetales bromados, pero no
desarrollaron una metodologia para el onollsls de los mismos en
refrescos.
En este trabajo se desarrolla un rnetodo analitico para
cuantificar aceites vegetales bromados en refrescos, utilizando 10
tecnlco de cromatografia de Ifquidos de alta resoluci6n.
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CAPITULO 1
A N T E C E D E N T E S
1.1 Naturaleza Qufmica de los Aceites Vegetales Bromados
Los aceites vegetales bromados (AV8) se obtienen
sometiendo los correspondientes aceites vegetales a una reocclon
de bromoclon. Los aceites vegetales mas utilizados para este
proposito son el aceite de moiz. el aceite de soya y el aceite de
olqodon: sin embargo. tornblen se encuentra reportado en la
literatura la bromoclon de otros aceites como por ejemplo los de:
ajonjolf, girasol, conolo. jojoba y aguacate24•
Dicha reacci6n se Ileva a cabo sobre la porclon insaturada
de 10 molecule de trlqllcerido que constituye el aceite vegetal y
que en la rncyorlo de los aceites proviene, principal mente, de los
ccldos oleico, linoleico y llnolenlco (figura 1). Por 10 tanto, sf se
somete un aceite vegetal bromado a una reocclon de
3
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4
0
I ICH 2 0 C R
0
IICH 0 C R
0
I ICH 2 0 C R
R= Cadena Derivada de Acido Groso.
Figura 1. Moleculo de Triglicerido. Los Acidos, de Donee Proviene 1 0
Porclon Insaturada de la Mayoria de los Trigliceridos, son los
siguientes:
Acido Oleico: C H3 - (C H2)7 - C H = CH - (CH2)7 - CO O H
Acido Linoleico: C H3 -(C H2)4 -CH =CH -CH 2 -CH = C H -(C H 2}7 - e OO H
Acldo llnolenlco: C H3 - (C H2 - C H = CH }J - (CH 2}7 - CO O H
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tronsesterlflcoclon con metanol se deben obtener. principalmente,
los siguientes derivados bromados: dibromoestearato de metilo
(OBEM), tetrabromoestearato de metilo (TBEM), y hexobromo-
estearato de metilo (HBEM).EI porcentaje obtenido de cada uno
de esos productos depender6, evidentemente, de la composlclon
qufmica del aceite vegetal de partida.
En la tabla I se reporta la composlcton qufrnlco de los
aceites de mafz y de soya. Se obtiene del onollsls de esa
informaci6n que 01 transesterificar el aceite bromado de mafz cabe
esperar 10 formaci6n de DBEM y TBEM;en el caso del aceite
bromado de soya, odemos de los productos anteriores, se debe
obtener el HBEM.
1.2Aptlccclon de los Aceites Vegetales Bromados
Los refrescos con sabores cftricos como los de naranja y
Iima-lim6n se encuentran entre los favoritos de los consumidores de
ese tipo de bebidas. Estos sabores eston constituidos
principalmente por los aceites esenciales obtenidos de algunas
trutos: por ejemplo, naranja, lim6n, toronja, etc. Sin embargo, 10
dispersion de estes aceites esenciales en el refresco constituye un
problema debido a la insolubilidad de los mismos en agua; eso
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obliga a incorporar agentes emulsificantes en la formulaci6n de la
bebida. As! rnisrno. considerando que la habilidad de los agentes
emulsificantes para mantener el aceite en suspensi6n es
proporcional al tornofio de partlcula, las particulas de aceite son
reducidas por otomlzoclon,
TA B LA I
C O M P O SICI6N Q U iM ICA D E A CEITES VE G ETA LES
ACIDO % EN ACEITE DE MAiz % EN ACEITE DE SO Y A
Mirfstico < 0.1 < 0.5
Palmftico 8 - 19 7 - 14
Palmitoleico < 0.5 0.5
Estecrtco 0.5 - 4 1.4 - 5.5
Oleico 19 - 50 19 - 30
Linoleico 34 - 62 44 - 62
tlnolenlco < 2.0 4 - 11
Araqufdico < 1.0 < 1.0
Eicosenoico < 0.5 < 1.0
Docosanoico < 0 . 5 < 0 . 5
Tetracosa noico < 0 . 5 -
Por otra parte, no es suficiente lograr la emuIsi6n del aceite
en el refresco, sino que odemos esta debe ser estable 0 1 menos seis
meses. Un problema para conseguir dicha estabilidad es 10 baja
densidad de los aceites esenciales. En general. los aceites cftricos
tienen una gravedad especffica en el intervalo de 0.845 a 0.890
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g/cm3 mientras que un refresco con un lOa un 12%de ozucor tiene
una gravedad especffica de 1.038 a 1.046 g/cm3• Para solucionar
este problema se utilizan los aditivos de peso, tornblen
denominados agentes ajustadores de densidad, y que son
compuestos que se ofioden a los aceites esenciales para
aumentar su gravedad especffica y ayudar a mantener una
dispersi6n estable del aceite. Unejemplo de este tipo de aditivos 10
constituyen los aceites vegetales bromados.
Losaceites vegetales bromados fueron utilizados por primera
vez, como agentes ajustadores de densidad de aceites esenciales
en bebidas en la decode de los ofios 40. Los aceites vegetales
bromados obtenidos a partir del aceite de oliva tienen una
gravedad especffica de alrededor de 1.24 g/cm3 y los obtenidos a
partir de aceites de soya, de rnofz0de algod6n. de alrededor de
1.33 g/cm3, Debido a su alta gravedad especltlco los AVB son
considerados como agentes ajustadores de densidad muy
efectivos para los aceites cftricos. Adernos proporcionan turbidez u
opacidad a los refrescos 10 cuol en algunos casos es una ventaja.
1.3 Regulacion de los Aceites Vegetales Bromados
Dependiendo de losaceites citrlcos utilizados. normalmente
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se requieren de 120 a 160 ppm del AYB para lograr una emulsion
estable del aceite saborizante en el refresco. Sin embargo, en
1966, el Cornlte de Aditivos Para Alimentos de 10 Agrupacion
"World Health Organization" expresa su preocupoclon acerca de la
posibilidad de la ocurnuloclon de bromo en los tejidos del cuerpo
cuondo los AYB fueran utilizados en productos alimenticios de
consumo humano. Desafortunadamente, diversos estudios sobre los
efectos t6xicos de los AVB en animales de loborotorloi-s han
confirmado esa sospecha.
A pesar de que no existen pruebas sobre efecfos
pctoloqlcos especfficos en el ser humano, el uso de los AVB como
aditivos para alimentos tue prohibido en la India, Inglaterra y en
otros paises europeos. En algunos paises como Estados Unidos,
Canada, Australia, Espana, Finlandio, Noruega, Israel, Kenya y
Sudofrlco su uso fue limitado a 15ppm 10 en el refresco final.
1.4 Metodos de Analisis de Aceites Vegetales Bromados
Considerando 10 estricta regulaci6n a que eston sometidos
los AVB, se camprende 10 importancia de cantor con un rnetodo
analitico para su cucntlflcoclon. AI realizar una tnvestlqoclon
bibliogr6fica sabre el tema se encontraron reportados diversos
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rnetodos de oncllsls de AVB, destacando las contribuciones del
grupo de trabajo de H.B.S.Conacher. A continuaci6n se describen
brevemente algunos de los estudios mas relevantes.
Deana L. Turner12 desarrollo un rnetodo para cuantificar AVB
en refrescos basado en la determinacion de bromo total en 10
muestra. Utilizando un procedimiento de debrornoclon en conjunto
can un electrodo especifico de ion brornuro. y trabajando a niveles
de 15 ppm del AVB, se reporta un 93% de recupercclon. una
precision de ± 1ppm y una exactitud de ± <1ppm.
Otro rnetodo. basado tornblen en la determinaci6n de
bromo total, es el que reportan M.S.Green y G. Keen13• Losautores
describen un metoda colorlmetrlco d6nde el bromo es liberado del
aceite utilizando dicromato de potasio y 6cido sulfurlco
concentrado; posteriormente, este se haee reaccionar con una
soluei6n de ocldo bcrblturlco-plrldlno en presencia de cianuro de
potasio para dar un color morado. De acuerdo a los autores los
resultados obtenidos en la determinacion de bromo en AVB
coinciden con los de otros rnetodos pero no proporcionan mas
detalles.
Losinvestigadores del Central Food Technological Research
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10
Institute of Mysore14 desarrollaron una tecnlc« r6pida para detector
bojos niveles de AVB en refrescos. La prueba involucra 10
extracci6n del AVBdel refresco y su tratamiento con polvo de zinc
para convertir el bromo orqcnlco a su forma lnorqcnlco,
Posteriormente se trata la muestra con dloxldo de plomo, para
liberar bromo, que puede ser detectado por el cambia de color de
10 fluoresceina con la que es puesto en contacto. Sequn los
autores 10 prueba puede detectar hasta 1.5 ppm de AVB en
refrescos.
H.B.S. Conacher y Arthur D. McKenzie15 comparan tres
metodos de determinaci6n de bromo en AVB: 1) tltulcclon
vodornetrlco. 2) titulaci6n potenclornetrlco y 3) tltuloclon utilizando
electrodo especffico de bromuro. Ellos concluyen que tanto la
tltulcclon potenclornetrlco como la vodornetrlco son aceptables
para una determinacion precisa de bromo en AVB. Con la tercer
tecnlco reportan resultados mas bajos y variables.
Enla revision blblloqrotlco rea lizada se encontr6 que una de
las tecnicas mas empleadas para la cucntlflcoclon de AVB era la
cromatograffa de gases. H.B.S. Conacher, R.K. Chadha y M.R.
Sohosrobudhe!s se encuentran entre los primeros en reportar el usa
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de esa tecnlco. EI procedimiento utilizado par elias involucra el
tratamiento de los aceites bromados con met6xido de sodlo.
seguido del onollsls par cromatograffa de gases de los esteres
metflicos resultantes. Empleando una columna empacada con 3%
JXRen Gas Chrom Q, de malla 110-120, Y como estondor interno
pentadecanoato de metilo logran recuperaciones en el intervalo
de 93.7 a 102.4%. Aplicando su tecnlco a varios refrescos
comerciales encontraron un contenido de AVB en el intervalo de
lOa 45 mg en 10 onzas de la bebida. Posteriormente H.B.S.
Conocher'" revlsc este rnetodo y reouzo un estudio colaborativo
sobre la determinacion por cromatograffa de gases de aceite
bromado de ajonjolf en bebidas de naranja. Los resultados del
estudio colaborativo seficlon recuperaciones de 94.6, 95.3 Y 96.0%
para refrescos conteniendo 3.1, 5.22 Y 10.66 mg/l 0 onzas de
bebida respectivamente, con los correspondientes valores de
desviaci6n est6ndar de 0.4, 0.46 Y 0.64. En base a este estudio se
desarroll6 el primer metoda oficial de 10 Asociaci6n Oficial de
QuTmicosAnalistas (AOAC).
James F. Lawrence, Rajinder K. Chadha y H.B.S.Conocher'e
modificaron el metoda previamente descrito proponiendo un
rnetodo alternativo de esterlflcoclon. Estos investigadores
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transesterificaron los AVB mediante una metan61isis ocldo.
procedimiento que involucra reactivos mas tcclles de manejar que
los del metoda oficial. Adernos de la simplificaci6n del metoda. se
obtiene un cromatograma con picas simples para el DBEM.el TBEM
y el HBEM;por el contrario. con 1 0 tecnica del met6xido de sodio el
cromatograma obtenido es complejo, mostrando mezclas de picas
para el TBEMy el HBEM.
En los trabajos basados en 10 tecnlco de cramatografio de
gases que han side descritos, se utilizaron columnas de tipo
empacadas. Rajinder K. Chadha, James F. Lawrence y H.B.S.
Conochertv probaron una columna de tipo capilar, conservando el
procedimiento de transesterificaci6n via metanolisis ccldo
desarrollado por elias mismos. Su principal logro fue la detecci6n
del HBEM,analito que con las columnas empacadas era dificil de
detectar y no se obtenfan resultados reproducibles.
Tornblen se describe en la literatura un rnetodo que utiliza
espectrometrfa de fluorescencia de rayos-X para la detecclon y
estimaci6n semicuantitativa de AVB en refrescos. EI rnetodo fue
desarrollado par H.B.S.Conacher, J.C. Meranger y J. Leroux2o con el
abjetivo de contor can uno tecnica r6pida de an6lisis que pudiera
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utilizarse de rnonero previa 0 1 onollsls por cromotograffa de gases y
asi facilitar el trabojo en el coso de tener un nurnero elevado de
muestras.
Finalmente se rnenclonoro la contribuci6n de James F.
Lawrence, Rajinder K.Chadha y H.B.S.Conocher!'. Ellosemplearon
un rnetodo de crornotoqroffo de liquldos en fase normal y en fase
reversa para la caracterizaci6n de aceites vegetales bromados. Su
principal objetivo fue 1 0 corocterlzocton de diferentes aceites
comerciales y preparados en el laboratorio. Ellos estudiaron los
aceites de oliva, cjonloli, rnoiz. olqodon y soya, y el procedimiento
que siguieron se describe brevemente a contlnuoclon.
La muestra de aceite es transesterificada mediante una
rnetcnollsls ocldo y el producto obtenido se extrae con hexane.
Despues de lIevar a sequedad la fase org6nica, el residuo se
disuelve en acetonitrilo- THFpara 10 cromatograffa en fase reversa y
en hexane para la cromatograffa en fase normal. Para 10 tecnlco
en fase reversa se utilize una columna Ultrasphere ODSde 25 cm x
4.6 mm, de 5 ) .1, Y una fase m6vil de acetonitrile-agua, 95:5. Para la
tecnlco en fase normal emplearon una columna Ultrasphere Si de
las mismasdimensiones que 10 anterior y una fase rnovll consistente
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en hexano-isopropanol, 500:1. En ambos casos se utlllzo detecci6n
UVa 220 nm. Losautores utilizaron la relaci6n de TBEMa DBEMasi
como la presencia 0ausencia del HBEMpara identificar el aceite
invalucrado, reportando que sus resultados coinciden con los
obtenidos mediante la tecnico de cromatograffa de gases. No
aplicaron esta tecnlco al onollsls de refrescos.
De los rnetodos indicados, solamente los metodos
cromotoorotlcos son capaces de diferenciar e identificar los
diferenfes compuestos bromados individualmente 1 0 cuol
representa una ventaja. Sin embargo, la cromatograffa de gases
presenta algunos inconvenientes en 1 0 que respecta a 1 0
posibilidad de descornposlclon de los compuestos bajo onolisls:
diversos autores, como Landowne y Lipsky21,Koehler et al.22 y H.B.S.
Conocherw han encontrado evidencias de dicha descomposici6n.
Par otro parfe, se dificulta la detecci6n del HBEM,a menos que se
utilice una columna capilar. Par 1 0 tanto, la cromatograffa de
Ifquidos se convierte en una posibilidad mas interesante, que sin
embargo no ha side ampliamente explotada.
Asfsurge nuestro lnteres por el tema que se desarrollo en el
presente trabajo de investigaci6n y cuyos objetivos se describen a
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continuaci6n.
1.5 Objetivos del Trabajo
1.5.1Objetivo General
Desarrollar un rnetodo onolltlco. utilizando la tecnica de
cromatograffa de Ifquidos de alta resoluclon (CLAR) para
cuantificar aceites vegetales bromados en refrescos.
1.5.2 Objetivos Especfficos
1.- Corccterlzoclon mediante una tecnlcc de cromatograffa
de Ifquidos de alta resoluci6n de los productos obtenidos en una
reacci6n de bromaci6n de un aceite vegetal. Para lograr este
objetivo, los aceites vegetales sercn fransesterificados, por 1 0 que
los productos a caracterizar seron los correspondientes esteres.
2.- Evaluaci6n de un sistema de extracci6n en fase solido
para la recupercclon de los esteres metilicos que son producto de
1 0 transesterificaci6n a 1 0 que seron sometidos los aceites vegetales
bromados.
3.- Evaluaci6n de un sistema de extracci6n en fase solido
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para la recuperoclon del aceite vegetal bromado contenido en un
refresco.
4.- Aplicar el metoda de onollsls desarrollado, a algun
refresco de la localidad.
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CAPITULO 2
M A T E R IA lE S Y M E T O D O S
2.1 Reactivos y Equipo
2.1.1 Reactivos
2.1.1.1 Solventes.
Se utilizaron eter etillco. hexane y metanal grado analftico
de Productos Qufmicos Monterrey. EI metanol fue secado con
sulfato de sodio anhidro (eTR). Para los onollsls cromotoqrotlcos
se utilizaron los siguientes solventes grado cromotoorcflco:
acetonitrilo (Mallinckrodt y fisher Scientific), THf (Merck) y agua
(Merck).
En diferentes eta pas del trabaja experimental se utlllzo un
solvente compuesto de acetonitrilo y THFen proporclon 4:1,el cucl
sera denominado "solvente A".
17
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2.1.1.2 EsteresMetflicos.
Para ser utilizados como estondores en 10 carocterizaci6n de
los aceites vegetales, y para 10 preporcclon de los
correspondientes derivados bromados necesarios para el onollsls
de los AVB, fueron adquiridos de Aldrich los siguientes reactivos:
oleoto. linoleato, linolenato, estearato y palmitato de rnetllo. Para
la preparaci6n del est6ndor interno se adquiri6 de Sigma el
heptadecenoato de metilo.
2.1.1.3 Derivados Bromados de los Esteres Metflicos.
Los esteres metilicos fueron bromados de acuerdo al
procedimiento descrito a contlnucclon.
2.1.1.3.1 Oleato de Metilo. Se disolvieron 500 mg del oleato
de metilo en 15mL de eter etilico en un matraz de reacci6n de 25
mL y 10 soluci6n se IIev6 a O °C mediante 10 inmersi6n del matroz en
un bofio de agua-hielo-sal. Manteniendo dicha temperatura. y
bajo agitaci6n rnoqnettco constante, se dosificaron 0.15 mL de
bromo durante un perfodo de 20 minutos. Terminada la dosificaci6n
se mantuvo 10 agitaci6n a O °C par 10 minutas mas.
Posteriormente 10 soluci6n se transfiri6. anadiendo 15 mL
adicionales de eter. a un embudo de separaci6n que contenfa 50
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ml de soluci6n de tiosulfato de sodio 01 10%.Seagito y despues se
permltlo 10 sepcroclon de capas para posteriormente descartar la
fase acuosa; la fase eterea por su parfe se love con dos porciones
de 10ml de agua y se seco con sulfato de sodio onhldro. EIeter se
elimin6 bajo corriente de nltroqeno a temperatura ambiente.
2.1.1.3.2 linoleafo, Linolenoto y Heptadecenoafo de
Mefilo. EIresto de los esteres metilicos fueron bromados siguiendo
el mismo procedimiento descrito, excepto que para el linoleato de
metilo se utilizaron 0.30 ml de bromo y para el linolenato de metilo
0.45 ml de dicho reactivo. En esta ultima reacci6n, 10 bromoci6n
del linolenato de rnetllo. se obtuvieron dos productos: uno soluble
en el medio de reocclon (denominado HBEMsoluble) y otro que
preclplto (denominado HBEMinsoluble).
2.1.1.4 Aceites Vegefa les y susDerivados Bromados.
los aceites vegetales de rnoiz y de soya utilizados en este
estudio fueron adquiridos en casas comerciales de la localidad. Sus
derivados bromados fueron preparados en el laboratorio siguiendo
el mismo procedimiento descrito para la bromaci6n de los esteres
metilicos pero utilizando 0.2y 0.3mLde bromo respectivamente.
Tcrnblen se utlllzc en este trabajo una muestra de un aceite
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bromado comercial de la cornpofilo Haarmann & Reimer. Se trata
de un aceite bromado de rnoiz.
2.1.1.5 Soluclon ACida de Metana!.
Se disolvieron 2 mL de ccldo sulfurlco grado reactivo
(Desarrollo de Especialidades Qufmicas) en metonol y se otero 0
100mLcon metanol.
2.1.1.6 Refrescos.
Para el desarrollo del rnetodo de tratamiento de muestra se
utiliz6 un refresco de uva de 10 marco 10-K (producto importado).
Par atra parte, el rnetodo de onollsls propuesto en este trabajo se
probe en un refresco de toronja de 10 marco Joya (producto de 10
localidad). La cornposlclon de ambos refrescos se reporta en la
tabla II.
2.1 .2 Equipa
2.1.2.1 Sistema de Extraccion en FaseS6lida.
En dos eta pas del rnetodo de onollsls desarrollado en este
estudio se utlllzo un pracedimiento de extracci6n en fase s6lida. En
ambos casos se emplearon cartuchos empacados con 500 mg de
fase C-1B (Supelclean LC-18de Supelco) de 6 mL de capacidad. EI
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sistema de extracci6n seleccionado fue el de presi6n positiva de
una linea de nltroqeno (figura 2); se utlllzo nitr6geno grado
crornotoqroflco (INFRA).
TABLA II
COMPOSICI6N DE LOS REFRESCOS EMPLEADOS
REFRESCO COMPOSICION
Refresco 1O-Ksabor uva Agua, ozucor. fructosa de jarabe de
rnoiz. ccloo cftrico, benzoato de
sodlo. sorbato de potasio, citrato de
sodio y de potoslo. sal, sabor natural.
fosfato de sodio y color caramelo.
Refresco Joya sabor toronja Agua carbonatada, czucor de cofio.
6cido cltrlco. saborizantes naturales y
artificia les. almid6n modificado.
aceite vegetal bromado y benzoate
de sodio.
2.1.2.2 Cromat6grafo de Llquidos de Alta Resoluci6n
(CLAR).
Se utllizo un crornotoproto de IIquidos modelo 5000 de
Varian equipado con un detector de arreglo de dlodos rnodelo
Polychrom 9065 (figura 3). Para el control del detector asf como
el manejo de la informacion resultante del onollsls crornotoqroflco
se utlllzo el software Star Chromatography version 4 de Varian
instalado en una computadora HPmodele Vectra VL2.
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22
-+---- Nitr6geno
.:
......_-- Cartucho de Extrocclon
7l_ j
Figura 2. Sistema de Extrocclon en Fase S6lida.
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Figura 3.Cromotooroto de Llquidos.
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24
Se emple6 una columna de fase octadecil silano enlazada
(Supelcosil LC-18 de Supelco) con las siguientes caracterfsticas: 25
em de largo, 4.6 mm de dlcrnetro interno y torncno de partfcula de
5 urn. Tomblen se utlllzo una columna de guardia de 2 em de
longitud (Supelguard LC-18).
EIvolumen de lnvecclon fue de 10 JlLY 10 velocidad de flujo
de 1mL/min. Loseluentes utilizados fueron desgasificados utilizando
helio grado cromotoqroflco. (INFRA). Todas las muestras fueron
filtradas, previamente a su lnvecclon. can filtros de jeringa de 25
mm de dlcmetro y 0.45 urn de torncfio de poro (Iso-disc P-254 de
Supelco).
2.2 Corocterlzoclon por CLAR de los Esteres Metilicos
y de susOerivados Bromados
2.2.1 Introducci6n
Para 10 caracterizaci6n por CLAR de los AVB estos seron
sometidos a una reocclon de transesterificaci6n para liberar los
correspondientes esteres. es declr. los derivados bromados del
oleato y linoleato de metilo en el coso del aceite de moiz. y
odernos el del linolenoto de metilo en el caso del aceite de soya.
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Por otra parte, se debe tomar en cuenta que si el aceite no
estuviera par completo bromado tornblen cabrfa esperar la
formaci6n de uno 0varios de los siguientes compuestos: olea to,
linoleato y linolenato de metilo. Adicionalmente, tornblen se deben
considerar los esteres provenientes de la porclon saturada del
aceite, que para los aceites estudiados son el palmitato y el
estearato de metilo.
Tomando en cuenta 10 anterior, si se pretende caracterizar
los AVB por CLAR,se debe desarrollar un metoda crornctoqrotlco
que permita 10 resoluclon de todos los onolitos indicados, incluido
el que sera utilizodo como estcndor interno, es decir, el
dibromoheptadecanoato de metilo (DBHM).
2.2.2 Desarrollo del Metodo Crornotoqroflco de Anollsls por CLAR
Se prepararon soluciones de los esteres metflicos y de sus
productos de bromaci6n en el solvente A (pp. 17).En 10 tabla III se
muestra la cornposlclon de cada una de las soluciones preparadas;
cabe seriolor que las concentraciones utilizadas se seleccionaron
de forma que 10 altura de todos los picas fuera semejante y asi
poder observarlos todos simultaneamente al analizar una mezcla
de los analitos.
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Considerando que se debfan resolver 10 compuestos, y que
uno de ellos da dos picos (el TBEMLse tuvieron serias dificultades
en el desarrollo de un rnetodo cromotooroflco eficaz; sin embargo,
finalmente se lograron resultados aceptables con dos rnetodos que
seron Ilamados en este trabajo "metoda lsocrctlco" y "rnetodo
gradiente" y que a continuaci6n se describen.
TABLAIII
COMPOSICION DE LAS SOLUCIONES ANALIZADAS
ANALITO CONCENTRACION (mg/mL)
Oleato de metilo 0.94
Linoleato de metilo 0.20
Linolenato de metilo 0.1
Estearato de metilo 10.1
Palmitato de metilo 10.4
Heptadecenoato de metilo 10.0
DBEM 1.1
TBEM 2.54
DBHM 1.2
HBEMsoluble 8.30
HBEMinsoluble 2.86
1) Metodo lsocrotlco: En este rnetodo se utiliza como
eluente acetonitrilo. La longitud de onda de detecclon optima
para los analitos insaturados es de 195 nm y para los analitos
saturados es de 210 nm; en el caso de los analitos bromados es de
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205 nm. Las soluciones indicadas en la tabla III y el solvente A,
fueron analizados siguiendo este metodo.
2) Metodo gradiente: En este rnetodo se utiliza como
eluente una mezcla de los solventes acetonitrile y agua. La
cornposlcion del eluente se modifica de acuerdo a un gradiente
por etapas, mismo que se describe a contlnuoclon,
En 10 primera etapa, 10 cual tiene una duroclon de 17
minutos, se trabaja con un 91% de acetonitrilo. Posteriormente se
cambia 10 cornposiclon del eluente a 100%acetonitrilo en dos
minutos y csi se mantiene el tiempo restonte de 1 0 corrldo
cromatogr6fica. Una vez terminado el onollsls. para preparar de
nuevo el sistema para 1 0 siguiente tnvecclon. se cambia 1 0
cornposlclon del eluente 0 91% de acetonitrilo en 5 minutos.
Las mismas soluciones que se onollzoron bojo el rnetooo
lsocrotlco. fueron onollzcdos bajo las condiciones de este rnetodo
gradiente.
2.3Eloboroclon de Curvas de Ccllbroclon
Considerando que el objetivo primordial de este estudio es
1 0 cuontttlcoclon de AVB, y que esta se reollzoro a troves de 1 0
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cucntttlccclon de sus correspondientes esteres metflicos, es
necesario contar con curvas de calibraci6n para coda uno de
ellos. Por 10 tanto se procedi6 a la eloborcclon de curvas de
collbroclon para el DBEM,TBEM,HBEMsoluble y HBEMinsoluble.
Se preporo una soluci6n stock en el solvente A de los
analitos de lnteres: su composici6n se reporta en la tabla IV.
Adernos se preporo una soluci6n, en el mismo solvente, del
estoncor interno, con una concentroclon de 12.74 mg/mL.
TABLAIV
COMPOSICI6N DELASOLUCI6N STOCKDE
ESTERESMETiLiCOS BROMADOS
ANALITO CONCENTRACI6N (mg/mL)
DBEM 0.824
TBEM 1.13
HBEMsoluble 0.16
HBEMinsoluble 0.15
A partir de 10 soluci6n stock se hicieron 4 diluciones para
preparar las soluciones empleadas en 10 elaboroci6n de la curva
de conbroclon. A coda solucion se Ie agregaron 100 J.LLde 10
soluclon de DBHM. Las composlclon de las soluclones resultantes se
reparta en la tabla V.
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Las 4 soluciones fueron analizadas par CLAR siguiendo los
dos rnetodos crornotoqroflcos desarrollados. Cada soluci6n se
invecta tres veces bajo las condiciones de cada uno de los
rnetodos,
TABLAV
COMPOSICION DE LAS SOLUCIONES UTILIZADAS PARA LA
ELABORACI6N DE LAS CURVAS DE CALIBRACION
SOL'N No. DBEM TBEM HBEMSOL HBEM INS. DBHM
(mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)
1 0.659 0.902 0.12 0.12 0.254
2 0.330 0.451 0.062 0.061 0.254
3 0.165 0.226 0.031 0.030 0.254
4 0.0824 0.113 0.016 0.015 0.254
2.4 Caracferizaci6n por CLAR de AVB
2.4.1 trcnsesterttlcoclon de los Aceites Vegetales y de sus
Derivados Bromados
Para transesferificar los aceites vegetales y sus derivados
bromados se seleccion6 el rnetodo de rnetcnotlsls ccldo
desarrollado por J. Lawrence, Rajinder K. y H.B.S.Conocher!s pero
modificado en 10 que concierne a 10 extracci6n de los esferes
metflicos 01 final de la reocclon.
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En seguida se describen los procedimientos de transesterifi-
caci6n y de extracci6n utilizados
2.4.1.1 Procedimiento de Transesterificaci6n.
La muestra a transesterificar se coloco en un matraz de
reacci6n de 100 ml y se Ie agreg6 100 I I I de la soluci6n de DBHM
(est6ndar interno). EI solvente de la muestra y de la soluci6n del
est6ndar interno se ellmlno bajo corriente de nltroqeno.
Posteriormente se agregaron 25 ml de la soluclon 6cida de
metanol y se colento a reflujo (63°C) bajo agitaci6n rnoqnetlcc
constante. EIreflujo se rncntuvo por una hora al terrnlno de 10 cual
la mezela de reacci6n se enfrf6 y se Ie onodlo 40 ml de agua.
Cabe seriolcr que para evaluar este procedimiento de
transesterificaci6n se prepare una soluclon de aceite de soya en el
solvente A, Y fue analizada, sin transesterificar, utilizando el rnetodo
lsocrotlco, EI resultado obtenido se com para con el de una muestra
del mismo aceite que sf se sornetlo a este tratamiento de trans-
esterificaci6n
2.4. 1.2 Procedimiento de Extracci6n de los EsteresMetilicos.
Se utlllzo un procedimiento de extracci6n en fase solido. EI
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cartucho se aeondicion6 con 3 ml de metanol seguidos per 5 ml
de agua a pH 3.
Despues del acondicionamiento se hizo pasar la mezcla de
reocclon por el cartucho a un flujo de 2.5 mL/min, y al finalizar
esta, se pasaren 5 mL de agua. Antes de proceder a 10 eluclon de
los analitos retenidos en el cartucho, este se seco con 1 0 ayuda del
flujo de nitrogeno.
Los esteres metflicos fueron elufdos con 10 mL de hexano,
utlllzcndose un flujo de 1 mL/min. EIhexane se seco eon sulfato de
sodio anhidro y despues de filtrarlo se eumlno bajo corriente de
nltroqeno y el residue se recupero con 3 mLde solvente A.
Para evaluar este procedimiento de extrocclon S9 preporo
una soluclon, en el solvente A, eon los derivados bromados
estondor. La cornposlclon de esa soluclon se reporta en 1 0 tabla VI.
Dicho soluclon se sornetto al proeedimiento de trcnsesterlflcoclon y
al de extrocclon previamente descrito, por triplicado. En cada
caso se utillzo una olfcuota de 1mL. La soluclon obtenida 0 1 final se
analiza por CLAR utilizando el metoda lsocrotlco. Para determinar
los porcentajes de recuperoclcn de los diferentes analitos, se
aprovecharon las curvas de collbroclon cuya elabaraci6n se
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describi6 en la secci6n 2.3. Los resultados de esta evaluaci6n se
presentan en el capftulo 3.
TABLAVI
COMPOSICI6N DE LA SOLUCI6N UTILIZADA PARA LAEVALUACr6N
DEL PROCEDIMIENTO DE EXTRACCI6N
ANALITO CONCENTRACI6N (mg/mL)
DBEM 1.04
TBEM 1.78
HBEMsoluble 0.19
HBEMinsoluble 0.16
2.4.2 Ancllsls de los Aceites Vegetales y de sus Derivados
Bromados
Finalmenfe, una vez evaluados los procedimientos de
trcnsesterttlcoclon y de extracci6n descritos, can los est6ndares, se
procedi6 a trabajar con los aceites vegetales y sus derivados
bromados.
Uno de los objetivos de esta etapa era la caracferizaci6n de
los AVB Y para ella se trcbolo can el aceite de rnolz y can el de
soya y con sus respecfivos prod uctos de bromaci6n. EI aceite
bromado de Haarmann & Reimer tam bien se sornetlo a este
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tratamiento de transesterificaci6n En cada caso se trabaj6 con 3
mg de muestra y la soluci6n obtenida, despues de la extracci6n de
los esteres rnetlllcos. fue analizada por CLAR utilizando el rnetodo
lsocrotlco 0el rnetodo gradiente, sequn fuera necesario.
Por otra parte, tornblen se evoluo la cornposlclon del aceite
de soya bromado ya que este fue utilizado para la evaluaci6n del
tratamiento de muestra. Para lograr este objetivo, se sornetio el
aceite al procedimiento de tronsesteritlcoclon descrito y 10soluclon
resultante se onollzo par CLAR utilizando el rnetodo lsocrotlco: los
analitos correspondientes fueron cuantificados. Esteprocedimiento
se hlzo por triplicado empleando en cada caso 3 mg de muestra.
2.5 Tratamiento de la Muestra
2.5.1 Introducci6n
Un punta muy importante en el desarrollo de un rnetodo de
an61isises el tratamiento de 10muestro. En este coso, los AVB que
se pretenden analizar se encuentran disperses en un refresco por 10
que es necesorio cantor con un rnetodo de extracci6n de los
mismos. EI rnetodo oficial de onollsls de los AVB utiliza una
extrocclon con eter etflico pero en este trabajo se propone un
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procedimiento de extracci6n en fase salida.
Para la evoiuoclon de dicho procedimiento de extrocclon se
preporo. en primer lugar, una muestra de cornposlclon semejante a
la de un refresco y con una cantidad conocida de AVB.
Posteriormente se prob6 en dicha muestra el rnetodo de
extracci6n propuesto: el extracto obtenido fue transesterificado y
el producto cuantificado por CLAR para poder calcular el
porcentaje de recupercclon.
A contlnuoclon se describen brevemente las diferentes
eta pas mencionadas.
2.5.2 Preparaci6n de la muestra
Para lograr tener una matriz 10 mas semejante posible a la
de los refrescos que serfan analizados con el metodo propuesto, se
decidi6 utilizar, precisamente, un refresco que no contuviera AVB.
EIrefresco elegido fue uno de sabor uva de 10 marco 10-K.
Se decidi6 preparar la muestra con 15 ppm del AVB, que es
la concentraci6n maxima permitida para dlchos compuestos en un
refresco. Se selecclono el AVB de soya para esta evoluoclon
porque es el que contiene todos los analitos bromados de lnteres,
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No fue facil la dispersion del aceite en el refresco y los
primeros intentos resultaron en porcentajes de recuperoclon muy
bajos. Sin embargo, resultaba aparente que el problema era la
deficiente dispersion del AVB y no el proeedimiento de extrocclon.
Despues de evaluar diversas maneras se encontr6 que el procedi-
miento de dispersion mas efectivo consistfa en utilizar una solucion
al 15%del solvente A en el refresco. Primero se disolvi6 el aceite
bromado en el solvente y luego se agrego el refreseo.
Procediendo de esa forma se evalu6 tcrnblen una muestra con
10%de solvente A.
2.5.3 Extraccion del AVBdel Refresco
Se utlllzo un procedimiento de extrocclon en fase salida. EI
cartucho se ocondlclono con 3 ml de metanol y 5 ml de agua.
Posteriormente se hicieron pasar 200 ml de la muestra de refresco
a trotor. rnezclodos con 100 III de la soluclon de DBHM,a un flujo
de 2.5 ml/min. Despues de poser la muestra el cartueho se tovo
con 5 mLde agua y se seco bajo el flujo de nltroqeno. EIcontenido
del cartucho fue elufdo con 10 ml de hexane (flujo de 1 mL/minj.
la soluclon obtenida se seco con sulfato de sodlo y despues de
filfrar se transfiri6 al matraz donde se efectuarfa la transesteri-
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ficaci6n.
2.5.4 Transesterificaci6n y Recuperaci6n de los Esteres Metilicos
Para lIevar a cabo 1 0 trcnsesterltlcoclon se elirnino el hexano
de la soluci6n obtenido de la extracci6n previamente descrita. EI
residuo se sornetlo al procedimiento de transesterificaci6n descrito
en1 0seoclon 2.4.1.1 a partir del punto d6nde se ogrega
1 0soluclon
6cida de metanal. AI terrnlno de 10 reocclon de transesterificaci6n
los esteres metflicos obtenidos se recuperaron siguiendo el
procedimiento de extrocclon descrita en la secclon 2.4.1.2.
2.5.5 Anolisls por CLAR
Finalmente, 10 soluclon obtenida se analiza por CLAR
utilizando el metoda lsocrotlco.
Cabe senolor que tanto la muestra preparada con 10%de
solvente como la que se hizo con 15%fueron sometidas a todo este
tratamiento de muestra por duplicado.
2.6 Anctlsls de un Refresco
EI refresco seleccionado para ser analizado fue uno de
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sabor toronja de 10 marco Joya cuya etiqueta de composlclon
indicaba la presencia de aceite vegetal bromado.
EIrefresco se sornetio 01 tratamiento de muestra descrito en
la secci6n 2.5 agregandole un 15%del solvente A. La muestra fue
analizada por triplicado. En cada caso el onollsls par CLAR se
reollzo por los dos rnetodos desarrollados.
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CAPITULO 3
RES U LTA DO S Y D IS CU S IO N
3. 1 Caracterizoci6n per CLAR de los Esteres Metflicos
y de sus Derivados Bromados
3.1.1Anollsls Crornotoqroflco por el Metodo lsocrctico
3.1.1.1 Anollsls de los Esteres Metflicos.
En las figuras 4-8 (Apendlce A, pp. 70-74) se pueden observar
los cromatogramas obtenidos al analizar los esteres rnetlllcos bajo
las condiciones del rnetodo lsocrotlco. Por otro parte, en las figuras
9-13 [Apendlce B, pp. 91-95) 5e reportan los rnisrnoscromatogramas
pero en forma tridimensional para que se puedan apreciar los
diferentes picos a pesar de tener diferentes rncxlrnos de absorci6n.
Cabe seAalar que el pico de tiempo de retenci6n (tR) 3.2 minutos
que aparece en todos los cromatogramas corresponde al solvente
de las muestras como se confirm6 01 inyector este bajo las mismas
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condiciones (el cromatograma correspondiente se encuentra en 1 0
figura 14,Apendlce A, pp. 75).
Con este trabajo quedaron establecidos los tiempos de
retenci6n de los analitos no bromados, as! como susespectros UV,
informacion que es necesaria para el onotlsls de sus derivados
bromados.
Observamos que el tiempo de retenclon se incrementa a
medida que disminuye el grado de insaturaci6n. En 1 0 que
concierne a 1 0 resoluclon de estos componentes, los resultados
obtenidos muestran que los unlcos picos que se traslaparfan son los
correspondientes 01 oleato y palmitato de metilo. No se hizo ningun
intento de resolverlos ya que dichos analitos,
no senan
cuantificados.
3.1.1.2 Anollsls de los EsteresMetflicos Bromados.
En 10 literatura se reportc= que al llevor a cabo la reooclon
de bromaci6n de aceites vegetales se forman slmultoneomente
productos de adici6n y de deshidrobromaci6n y par ella en este
trabajo era interesante determinar el nurnero de derivados
bromados formados 0 1 bromar los esteres metilicos. Par supuesto
que esto queda sujeto a que dichos derivados sean detectables
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mediante el oncllsls cromotoqrcflco utilizado. En las figuras 15-18
(Apendlce A, pp. 76-79) se presentan los cromatogramas,
obtenidos bajo las condiciones del metoda isocrotlco. para coda
producto bramado. Parotro parte, en las figuras 19-22 (Aperidlce B.
pp. 96-99) se reportan los mismos cromatogramas pero en forma
tridimensional para que se aprecien los diferentes picas a pesar de
tener diferentes m6ximos de absorci6n.
A continuaci6n se describen los resultados obtenidos para
coda uno de los productos de bromaci6n.
3.1.1.2.1 Oleato de Metilo Bromado. AI comparar las figuras
4 y 15 (Apenclce A. pp. 70 Y 76) observamos los diferentes tiempos
de retenclon obtenidos, en un caso para el oleato de metilo, y en
otro para su producto bromado y en la figura 23 (Aperidlce C. pp.
102) se aprecia la diferencia en susespectros UV;con ambos datos
se confirma que 10 bromoclon se neve a cabo. Por otra parte, la
ausencia de un pico a 11.3 minutos en el cromatograma del oleato
de metilo bromodo nos indica que 1 0 brornoclon fue completo.
En 10 que concierne al nurnero de productos obtenidos al
bromar el oleoto de metilo observamos en el cromatograma
correspondiente un pica principal de tiempo de retenclon de 9.7
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minutos; ese pica debe corresponder al dibromoestearato de
metilo que es el producto principal esperado en la reacci6n
efectuada. Se observa oderncs un pico de muy poco intensidad
con un tiempo de retenci6n de 8 minutos y un espectro UV
diferente 0 1 del pico principal como se puede apreciar en 1 0 figura
24 (Apendlce C, pp. 103). No se determin6 a que compuesto
corresponde, sin embargo, es poco probable que pertenezca a un
derivado bromado sin dobles enlaces C-C ya que como se vera
mas adelante dichos compuestos tienen espectros muy similares
entre elias.
Cabe agregar que se determine pureza de pica en cada
coso, y en base a los Indices de correlaci6n encontrados (tabla
VII), se determine que coda uno corresponde a un solo
componente.
TABLA VII
PUREZADE PICO EN El CROMATOGRAMA
DEL OlEATO DE METIlO BROMADO
PICO MEJOR CORRElACI6N PEOR CORRELACION
B.Omin 0.999492 0.9940629.7 min 0.999997 0.999985
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3.1.1.2.2 Linoleato de Metilo Bromado. Enel cromatograma
correspondiente a este producto (figura 16. Apenclce AI pp. 77)
observamos dos picas principales; a pesar de que el tiempo de
retenci6n del segundo es similar al del linoleato de metilo (figura 5,
Apendlce A, pp. 71) podemos afirmar que 10bromaci6n si se llevo
o cabo considerando las diferencias entre los respectivas espectros
UV (figura 25, Apendlce C, pp. 104).
Por ofra parte se confirma que la brornoclon es completo al
determinar la pureza del pico de tiempo de retenci6n de 7.9
minutos. Tomblen se analiza la pureza del pico de tiempo de
retenci6n de 7.5 minutos. En ambos casas se concluye que
corresponden a un solo componente, como 10 seAalan los fndices
de correlaci6n reportados en la tabla VIII.
TABLA VIII
PUREZA DE PICO EN EL CROMATOGRAMA
DEL LlNOLENATO DE METllO BROMADO
PICO MEJOR CORRELACI6N PEOR CORRELACI6N
7.5min 0.999996 0.999975
7.9min 0.999983 0.999878
En 1 0 que respecta al nurnero de productos obtenidos yo se
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ha sefiolcdo la obtenci6n de dos componentes principales, los
cuales pueden correponder ados is6meros del tetrabromo-
estearato de metilo, como se reporta en la llterofurcu. Sin
embargo no se confirm6 la identidad de dichos compuestos por
algun otro metoda.
Adernos de los dos picos principales indicados, se presentan
en el cromatograma una serie de picos, de muy baja intensidad, a
5.6, 6.0, 6.4 y 10.7 minutos que no parecen corresponder a
derivados bromados sin insaturaciones C-C analizando sus
espectros UV (figura 26, Apendlce C, pp. 105).
3.1.1.2.3 Linolenato de Metilo Bromado. Como ya se habra
mencionado en el capftulo anterior, al bromar el linolenato de
metilo se obtienen dos productos can diferente solubilidad en el
medio de reacci6n (denominados H B E M soluble y H B E M insoluble).
Ambos fueron analizados par separado.
AI comparar los cromatogramas del linolenato de metilo y
de susderivados bromados (figuras 6, 17Y 18,Apendlce A, pp.72J8
Y 79), se observa una gran similitud entre susrespectivos tiempos de
retenci6n. Sinembargo, 0 1 igual que en los casos anteriores, son las
diferencias entre el espectro UV del material de partida y los
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espectros UV de los derivados (figura 27, Apendlce C. pp. 106) 10
que nos permite afirmar que sf se Ilevo a cabo la reocclon de
bromaci6n.
Para verificar que 10 bromaci6n fue completa se determino
pureza de pico del unlco pica del HBEM insoluble y del pico
principal del HBEMsoluble; considerando los fndices de correlaci6n
encontrados (tabla IX ) se concluye que ambos picos corresponden
a un solo componente y por 10 tanto que la bromaci6n fue
completa.
TABLAIX
PU REZA DE PICO EN LOS CRO M A TOG RA M A S
DEL HBEM SOLU BLE Y DEL HBEM IN SO LU BLE
MEJORCORRELACI6N,
Pice PEORCORRELACION
HBEMins., 6.2 min 0.999993 0.999828
HBEM sol.. 6.4 min 0.999966 0.999918
Como puede observarse en el cromatograma del HBEM
insoluble. dicho producto solo consta de un componente. En
cambia, en el caso del HBEMsoluble se obtiene un pico principal y
tres de menor intensidad. Tanto el pica principal como los picos de
tiempos de retenci6n de 6.2 y 7.0 minutos presentan espectros UV
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45
muy similares entre elias (figura 28, Apendlce C, pp. 107) Y con
respecto a los de los derivados bromados de los otros esteres: ello
hace suponer que se trata de tres productos bromados sin
insaturaciones C-C, al igual que el HBEM insoluble. EI pico de
tiempo de retenci6n de 8.0 minutos presenta un espectro UV
diferente.
En base a 10 anterior se tendrfan 4 productos principales
derivados de la bromaci6n del linolenato de metilo. Lawrence,
Chadha y Conucher!'. solo reportan la obtenclon de dos lsorneros.
de diferente solubilidad, coincidiendo con este trabajo en que el
is6mero mas insoluble eluye primero en el sistema crornotoqrotlco.
3.1.1.3 Anollsls del Est6ndar Interno.
En las figuras 29 y 30 (Apendlce A, pp. 80 Y 81) se reportan
los cromatogramas obtenidos, bajo las condiciones del rnetodo
lsocrctlco. para el heptadecenoato de metilo y para su derivado
bromado (DBHM) respectivamente. AI comparar los tiempos de
retenci6n de ambos productos y susrespectivos espectros UV (figu-
ra 31, Apendlce C, pp. 108) se confirm a que la brornoclon se llevo
a cabo. Por otra parte 10 ausencia del pico de tiempo de
retenci6n de 9.2 minutos en el cromatograma del producto
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bromado indica que 10 brorncclon fue completa.
En la figura 32 (Apendlce B, pp.100) se reporta el croma-
tograma del DBHM de forma tridimensional y ahf se puede
comprobar que solo se obtiene un pico. Adernos. el onollsls de
pureza de pico del mismo nos indica que se trata de un solo
componente (mejor correlaci6n = 0.999968, peor correlcclcn =
0.998945).
3.1 .1.4 Ancllsls de Mezcla de Analitos.
En la tabla X se resumen los tiempos de retenclon y los
factores de capacidad que se obtuvieron, bajo las condiciones del
metodo lsocrotlco, para todos los analitos estudiados. Cabe hacer
10 ocloroclon que en el caso del TBEM se consideraron los dos picos
principales y en el caso del HBEM soluble solo se consider6 el pica
principal.
Por otra parte, para el c61culo del factor de capacidad se
consider6 un tiempo muerto (to) de 3.2 minutos; este tiempo
corresponde al obtenido para el solvente de 10 muestra y fue
corroborado mediante 10 lnvecclon de una soluci6n de uracil,
siendo este compuesto un trazador recomendado en la literatura
sabre el terno>.
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TABLAX
TIEMPOSDERETENCIONY FACTORESDECAPACIDAD DELOS
ANALITOSBAJO ESTUDIO(METODO ISOCRATICO)
ANALITO TIEMPO DE FACTOR DE
RETENCION (min) CAPACIDADt
Oleata de metilo 11.4 2 . 5
Linoleato de metilo 8.2 1.6
Unolenato de metilo6.4 1.0Palmitato de metilo 11.6 2.6
Estearato de metilo 17.2 4.4
DBEM 9.7 2.0
TBEM (l0 pieo) 7.5 1.3
TBEM(20 plco) 7 . 9 1.5
HBEMsol. 6.4 1.0
HBEMins. 6.2 0.9
DBHM 8.1 1.5
t Factor de capacidad = ( tR- t o ) / to
Del onolisls de la informacion presentada en la tabla X se
puede predecir que se tendron problemas de resoluci6n, par una
parte, entre los picas del DBHM, del linoleato de metilo y del TBEM,
y por otra, entre los picas del linolenato de mettle y sus derivados
bromadost . Para corroborar 10 anterior se inyect6 una mezela de
todos los analitos, utilizando las condiciones del metoda lsocrctlco,
EIeromotograma resultante se muestra en 10 figura 33 (Apendlce A,
tTorncien sefrostopcnon lospices del oleate y del palmitato de metilo pere, como ya
se habra seiialado, dichos analites no seron cuantificados y por eso no es necesaria
sucomplete resoluci6n.
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pp. 82) confirm6ndose las predicciones. Como se observa, si la
muestra a analizar est6 por completo bromada no se tendrfan
problemas con el usode este rnetodo crornotoqroflco: incluso, si la
muestra contiene restos de compuestos insaturados sin bromar, oun
es posible utilizar el rnetodo lsocrotlco siempre y cuando se utilice
como longitud de onda de detecci6n 220 nm y se este dispuesto a
perder sensibilidad. En efecto. 0 dicha longitud de onda los
compuestos insaturados disminuyen su absorci6n en mayor grado
que los derivados bromados como puede comprobarse 0 1 analizar
la figura 34 (Apendlce C, pp. 109);en dicha figura se comparan los
espectros UV de un compuesto insaturado y de un derivado
bromado. Par otra parte en 10 figura 35 [Apendlce A, pp. 83) se
reporto el cromatograma de la mezela de analitos 0 una longitud
de onda de 220 nm.
3.1.2 Analisis Crornotoqroflco por el Metoda Gradiente
Para lograr la resoluci6n de todos los analitos se utiliz6 como
eluente una mezela de agua y acetonitrilo. Despues de probar
diversas composiciones de fose m6vil se IIeg6 a la conclusi6n de
que eon un 9% de agua se lograbon los mejores resultados. Es
decir. se obtenfon los picos de linolenato de metilo. HBEMsoluble.
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HBEMinsoluble y linoleato de metilo completamente resueltos y
parcialmente resueltos los picas del TBEMy del DBHM.
EI siguiente paso fue intentar un gradiente para tratar de
mejorar la resoluci6n de los picas del TBEMy del DBHM, y disminuir
los tiempos de retenclon de los diferentes analitos. Los mejores
resultados se obtuvieron can el metoda descrito en el capftulo 2 y
que fue denominado "metodo gradiente". Aunque no se loqro una
completa resoluci6n de los picas mencionados. esto mejor6,
pasando de un valor de 0.9 a 1.2 entre el primer pico del TBEMy el
pica del DBHM; el segundo pica del TBEMse obtiene como pica
cola del DBHMen todos los casos.
En las figura 36-45 [Apendlce D. pp. 111-120)se reportan los
cromatogramas obtenidos bajo las condiciones de este metoda
cromatogr6fica para coda uno de los analitos estudiados y en la
tabla XI se resumen los tiempos de retenci6n y los factores de
capacidad de todos elias. EI cromatograma obtenido para 10
mezcla de analitos bajo estas condiciones cromatogr6ficas se
puede apreciar en 10 figura 46 (Apendlce D, pp.121). En base a
estos resultados se concluye que si el aceite no esto par completa
bromado es preferible utilizar este metoda crornotoqrotlco.
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En 10 que respecte ol tiempo de onollsls este se logro ocortor
can el rnetodo desarrollado. como puede observarse en la figura
47 [Apenoice 0, pp.122). En dicha figure se comparan 105
cromatogramas obtenidos para el DBEM bajo las siguientes
condiciones: elucton lsocrotlco con el eluente acetonitrilo:eguo,
91:9, y eluci6n bajo las condiciones del metodo gradiente; se
puede observar que odernos de lograr tiempos de onollsls mas
cortos se logran picas mas angostos 10 que repercutlro en una
mayor sensibilidad.
TA B LA X I
TIEM PO S D E R ETEN CIO N Y FA CTO RES D E CA PA CID A D D E LO S
A N A LITO S B A JO ES TU D IO (M ETO D O G R A D IEN TE )
ANALITO TIEMPO DE FACTORDE
RETENCION(min) CAPACfDAD
Oleato de metilo 26.6 7 . 3
Linoleato de metilo 19.1 5.0
Linolenato de metilo 12.5 2.9
Palmitato de metilo 26.8 7 . 4
Estearato de metilo 31.8 8.9
D B E M 2 4 . 7 6 . 7
TBEM{l0 pico] 19.5 5.1
TBEM1 2 0 pico) 20.6 5.4
HBEMsol. 15.9 4.0
HBEMins. 1 5 . 0 3.7
D B H M 20.4 5 . 4
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3.2Hoboroclon de Curvas de Calibraci6n
Para cuantificar los analitos de interes se utlllzo un rnetodo
de estondor interno y se trabaj6 en base a las alturas de pico. En
las figuras 48-51 (Apendlce E,pp. 129-132)se reportan las curvas de
calibraci6n, promedio de tres replicas, para cada uno de los
analitos que se cuantificaron, par el rnetodo lsocrctlco: por otra
parte, en las figuras 52-55 (Apendloe E,pp. 132-136) se muestran las
curvas correspondientes para el metoda grodiente. Cabe aclorar
que los dos compuestos de HBEMobtenidos se cuantificaron par
separado y que en el coso del TBEMse sumaron las alturas de los
dos picos obtenidos.
Encada figura se muestra, odernos. 10 linea de reqreslon de
y en x obtenida y el cuadrado del coeficiente de correlaci6n
resultante. Asl mismo se reporta en cada grafica 10 ecuoci6n de la
linea de regresi6n.
Como puede observarse, los valores de correlaci6n
obtenidos nos indican que 10 respuesta de nuestro sistema
crornotoqrotlco es lineal en el intervalo de concentraciones
evaluado para cada anolito, mismo que se reporta en la tabla XII.
Endicha tabla tornblen se incluyen los intervalos de concentroclon
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esperados para cada analito; esos valores se calcularon
considerando que 10 concentraci6n del aceite bromado en el
refresco sea de 15 ppm y tomando en cuenta la composici6n
tiplco de los aceites de rnolz y de soya (tabla I, pp. 6).
TA B LA X II
IN TERVA LO D E CO N CEN TRA C IO N EVA LU A D O
Y E SPER A D O PA R A C A D A A N A LITO
ANALITO INTERVAlO DEConc. INTERVALODEConc.
EVAlUADO (mg/ml) E S P E R AD O (mg/mL)
H B E M Soluble 0.016 - 0.12 0.03 - 0.08
H B E M Insoluble 0.015 - 0.12 0.03 - 0.08
T B E M 0.113 - 0.902 0.4 - 0.7
D B E M 0.0824 - 0.659 0.1 - 0.5
En las figura 56 (Apendlce A, pp. 84) y en la figura 57
(Apendlce D, pp. 123) se muestran cromatogramas tlplcos
obtenidos en cada rnetodo crornotoqroflco.
3.3 Caracferizaci6n par CLAR de AVB
3.3. 1 Tronsesterlflcoclon de Aceites Vegetales y de sus Derivados
Bromadas
AI comparar en 10 figura 58 [Apendlce A t pp. 85) los croma-
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togramas obtenidos para el aceife de soya antes y despues de ser
transesterificado confirmamos que 10 reacci6n se llevo a cabo;
efectivamente, observomos 10 desoporiclon de los picas
correspondientes al aceite y la aporici6n de los picas relacionados
can susderivados metflicos.
Par otro parte, en 10 que concierne a la evaluaci6n del
procedimiento de extracci6n se obtuvieron los siguientes
resultados. En la tabla XIII se reportan el porcentaje de
recuperaci6n promedio de cada analito osl como el coeficiente
de variaci6n en porciento (% C.V.) correspondiente. Observamos
que los porcentajes de recuperaci6n son buenos aunque podrfan
mejorarse y que el coeficiente de variaci6n se encuentra dentro
del valor esperado tomando en cuenta el nivel de concentraci6n
que se esto manejando para los analitos.
TABLAXIII
RESULTADOSDELAEVALUACI6N DELPROCEDIMIENTODE
EXTRACCIONPOSTERIORA LATRANSESTERIFICACION
ANA LITO % DE RECUPERACI6N % C.V. t
DBEM 85.4 3.8
TBEM 86.5 13.5HBEMSoluble 78 18.6
HBEMInsoluble 82 7.4
1% C.V. = (Desvlcclon Estondor x 100) / Valor Promedio
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3.3.2 Anollsls de los Aceites Vegetales y de sus Derivados
Bromados
AI analizar los cromatogromas correspondientes 0los aceites
vegetales de soya y de rnclz transesterificados (figuras 59 y 60,
Apendlce A, pp. 86 Y 87) se pueden identificar, por sus tiempos de
retenci6n y susespectros UV, los componentes esperados: oleato,
linoleato y linolenato de metilo. En reolidad no se esperaba
detectar el linolenato de metilo en el coso del aceite de moiz ya
que su porcentaje en el mismo suele ser muy bajo; sin embargo se
puede observar en el cromatograma correspondiente un pico que
coincide tanto en tiempo de retenci6n como en espectro UV con
el del linolenato de metilo.
En 1 0 que respecto a los componentes saturados, es decir,
palmitato y esteorato de metilo, estos no fueron detectodos tal vez
debido a su bajo factor de respuesta.
En el cramatograma del aceite de rnclz bromado y
transesterificado (figuro 61, Apendlce D, pp. 124) se pueden
identificar los picos correspondientes 0 1 TBEMY 0 1 DBEM; no se
observon los picas del HBEM debido posiblemente 0 10 baja
concentraci6n del linolenoto de metilo en el aceite de rnolz
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original. Por otra parte, 10 ausencia de los picas del oleato y del
linoleato de metilo nos indica que la bromaci6n fue completa.
En 10 que concierne al aceite de soya bromado se pudieron
identificar, en su producto transesterificado, los picos correspon-
dientes al HBEM,TBEMY DBEM(figura 62, Apendlce D, pp. 125); al
igual que en el coso anterior la ausencia de los picos de linolenato,
linoleato y oleato de metilo serialan que 1 0 bromaci6n fue
completa.
La composici6n del aceite de soya fue evaluada y los resultados
obtenidos se reportan en la tabla XIV; se indica el porcentaje
promedio de cada analito as! como el coeficiente de variaci6n en
porciento correspondiente en coda caso. Losvalores encontrados
dependen de 10 composici6n del aceite de partida 10 cuol no tue
determinada; sin embargo, a partir de datos de cornposlclon tipica
reportados en la literatura (tabla I, pp. 6), se pueden estimar de
monero oproximada los valores esperados para los componentes
bromados. Procediendo de esa forma, se observan resultados
dentro del intervalo esperado para el HBEMy un poco mas bajos
para el DBEMy TBEM.En 10 figuro 63 (Apendlce A, pp. 88) se puede
observar un cromatograma tipico de este onollsls.
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TABLA XIV
COMPOSICI6N DEL ACEITE DE SOYA BROMADO
ANALITO % PROMEDIO %C.V.
H B E M insoluble 3.07 4.98
H BEM soluble 5.78 4.70
T B E M 38.5 7.88
D B E M 12.6 11.28
Finolmente, en cuonto 0 1 onollsls del aceite bromodo
camercial se obtuvieron los siguientes resultados. Como puede
observarse en la figura 64 [Apendice D. pp. 126) se pudieron
detector los picas correspondientes a los derivados bromados,
DBEMY T B E M , asi como los picas de los esteres metflicos sin bromar
carrespondientes. es decir, oleato de metilo y linoleato de metilo.
No se pudo detector 10 presencia del segundo componente del
T B E M . debido posiblemente a su baja concentraci6n.
Por otro parte. se detectan dos picos que no pudieron ser
identificados (tiempos de retenci6n de 18.2 y 18.7minutos) y cuyos
espectros UV no corresponden a los clcslcos de los componentes
bromodos sin lnsaturociones C-C. Iomblen se incluye en el crorno-
tograma el pico del est6ndar interno, DBHM.
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3.4 Tratamiento de lo Muestra
En 10 tabla X V se reportan los resultados obtenidos para los
dos tipos de muestras preparadas. En dicha tabla se indican tanto
los porcentajes de recupercclon (% de Rec.) promedio obtenidos
para cada uno de los analitos, as! como los correspondientes
coeficientes de vorlcclon en porciento. Observamos que a mayor
porcentaje de solvente mejora el porcentaje de recuperocion: sin
embargo, aparentemente disminuye la precision como se refleja
en los coeficientes de vorlcclon. Suponemos que 10 mejora en los
poreentajes de recuperoclon se debe a una mejor dispersi6n del
aceite en el refresco pero no nos explicamos el aumento en 10
dispersion de los resultados obtenidos.
TABLA XV
RESULTADOS DELA EVALUACI6N DEL PROCEDIMIENTODETRATAMIENTODEMUESTRA
ANALITO MUESTRA10%SOLVENTE MUESTRA15%SOLVENTE
% de Ree. %C.V. % de Ree. %C.V.
HBEMins. 67.0 B .8 80.5 2.4
HBEMsol. 70.0 1.1 79.2 3.9
T B E M 73.9 6.1 79.6 12.0
DBEM 72.7 5.9 73.5 15.3
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En 10 figur~ 65 (Apendlce A. pp. 89) se reporta un
cromatograma tiplco obtenido en esta etopa del trabajo
experimental. d6nde se observan los picas correspondientes a los
analitos bromados bajo estudio.
3.5 Anollsls de un Refresco
En la figura 66 (Apendice D. pp. 127) se reporta un
cromatograma tipico obtenido al analizar un refresco bajo las con-
diciones del rnetodo gradiente. Endicho cromatograma se pueden
identificar los picos correspondientes a los siguientes derivados
bromadas: TBEM(el primer pico) y DBEM.As!mismo. se detectan los
picas de los compuestos sin bromar: oleato, linoleato y linolenato
de metilo. Losdos picos de tiempos de retenci6n de 18.3 min y 18.8
min son semejantes a los obtenidos en el anal isis del aceite
bromado comercial, tanto en tiempo de retenci6n como en
espectro UV.
En el refresco se cuantificaron los analitos DBEMy TBEM;los
resultados correspondientes se reportan en 10 tabla XVI. Sa indica
10 concentraci6n promedio obtenida para coda onollto asi como
el correspondiente coeficiente de voriaci6n en porciento.
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TA BLA X VI
RESU LTA D O S D E LA EVA LU A C I6N D EL REFRESCO
ANALITO CONC. (ppm) % C. V.
DBEM 1.5 12.4
T B E M 3.1 13.0
EI coeficiente de vorloclon obtenido en cada caso se en-
cuentra dentro de los Ifmitesesperados considerando las concen-
traciones que semanejan. A partir de los datos encontrados no es
posible calcular el contenido de aceite puesto que para ello se
debe conocer 10 cornposlclon del aceite utilizado.
Con el an6lisis de este refresco se demuestra la posibilidad
de aplicaci6n del rnetodo desarrollado para el onollsls de muestras
reales.
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CAPITULO 4
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Se cumpli6 el objetivo general de este trabajo de
investigaci6n, es decir, se logr6 desarrollar un metoda analftico,
utilizando 10 tecnica de cromatograffa de Ifquidos de alta
resoluci6n (CLAR). para cuantificar aceites vegetales bromados en
refrescos. Por su parte. en 1 0 que concierne a los objetivos
especfficos, se tienen las siguientes conclusiones y recomen-
daciones.
Sedemostr6 que es posible la caracterizaci6n de los esteres
metflicos y de sus derivados bromados utilizando la tecnlco de
cromatografla de Ifquidos de alta resoluclon. reportondoso dos
rnetodos de onotlsls para lograrlo. As! mismo, en base al metoda
crornotoqrcflco desarrollado can los est6ndares se lagro la
coroctertzoclon de los derivados metilicos del aceite vegetal
bromada y sin bramar. Cabe seAalar que al utilizar el denominado
60
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rnetodo gradiente se recomienda que la composici6n del eluente
sea 1 0 mas exacta posible ya que la resoluclon de los picos es muy
sensible a pequenos cambios en 10 composici6n empleada.
En el estudio de los aceites vegetales bromados es
interesante el onctlsls de los diversos productos obtenidos en lo
reacci6n de bromaci6n, sequn 10 destacan algunos investi-
gadores24• Can relaci6n a ese punto, la contribuci6n de este
trabajo es la siguiente: se determine que de forma principal se
forman los productos correspondientes a la reocclon de adici6n:
DBEM,TBEMY HBEMpero que no puede descartarse la posibilidad
de formaci6n de productos de deshldrobrornoclon. ya que, sabre
todo en el cromatograma del HBEM, se detectan una serie de
picos de baja intensidad. Para esclarecer este punta se debe
recurrir a una cromatografia preparativa que permita separar los
diversos componentes detectados y asf poder proceder a su
caracterizaci6n por tecnlcos espectroscoplcos,
En 1 0 que respecta al estondor interno utilizado cabe senolor
que fue un acierto la elecclon de un producto bromado en lugar
del sugerido en la literatura sabre el tema. Efectivamente,
normalmente habfa sido empleado el pentadecanoato de metllo,
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62
el cuol no se cornportorc. frente a una extrocclon. de manero tan
similar a los analitos bromados como nuestro estondor bromado.
Aunque, por otra parte, debido precisamente a la similitud del
mismo can los analitos bajo estudio no se loqro la completa
resoluclon del mismo. Eneste estudio no fue posible 10 evoluoclon
de otro compuesto como estondor interno pero es recomendable,
si se desea mejorar 10 precision del rnetodo desarrollado, trabajar
preferentemente con un estcndor completamente resuelto; para
ello se sugiere probar preparando el derivado bromado del ester
metflico del ocldo nonadecenoico 0del ocldo eicosenoico.
Un resultado importante de este trabajo fue el obtenido 01
elaborar las curvas de collbroclon. Las mismos indican que la
respuesta del sistema crornotoorcttco es lineal en el intervalo de
concentraciones esperadas para los diferentes analitos (tabla XII,
pp. 52), Y todos los coeficiente de correloclon resultantes son
significativos con 99%de confianza (t-test. valor de t=32).
En 10 que concierne 01 tratamiento de muestra este
involucra, en dos de susetapas, un procedimiento de extrocclon.
Enese punta una contribuci6n muy relevante de este estudio fue 10
cptlcoclon de sistemasde extracci6n en fase salida. En 10 literatura
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63
solo habra side reportado el uso de los rnetodos tradicionales de
extrocclon liquido-Ifquido. Con el rnetodo propuesto se simplifica el
trabajo mismo que cdernos se realiza con mayor seguridad al
disminuir el volumen de solvente involucrado. Estametodologfa fue
aplicada para la extrocclon del aceite vegetal bromado
contenido en un refresco y para la recuperaci6n de los analitos
despues de la transesterificaci6n del aceite. En ambos casas se
obtienen buenos porcentajes de recuperoclon y estos se podrian
mejorar 5 1 se utiliza olqun eluente de mayor poloridad. Se sugiere
evaluar otros eluentes como podria ser el eter etflico.
En 10 que concierne a 10 corocterlzoclon de los derivados
metflicos del aceite vegetal, bromado 0no, esta se loqro en base
al rnetodo crornotoqroflco desarrollado con los estondores.
Finalmente, cabe destacar que se opllco el rnetodo
propuesto en el cnollsls de un refresco comercial con resultados
satisfactorios. De esta forma se demostr6 la factibilidad de utilizar 10
metodologia desarrollada para el onolisls de un problema real,
loqrondose la cuontltlcoclon de los diferentes esteres bromados
derivados del aceite vegetal bromado contenido en el refresco.
Cabe sefiolor que para determinar la concentrocion del aceite
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utilizado en un refresco determinado se debe tener una muestra
del mismo para poder evaluar su composici6n; sobre todo si el
aceite no esta por completo bromado. Dicho cnollsls se lIevarfa a
cabo con el rnetodo desarrollado en este trabajo. Sl no es posible
saber cual aceite fue utilizado en un caso particular. se sugiere
evaluar una gran cantidad de aceites bromados comerciales y
obtener de eso monera una cornposlclon promedio; con esa
informacion se podrfa estimar 10 concentraci6n del aceite
contenido en el refresco en el coso especificodo. Por otro parte,
serio conveniente que 10 legislacion indicara los concentraciones
rnoxlmos permitidas para coda derivodo bromado y no para el
aceite total yo que finalmente son estos los productos sospechosos
de toxicidad y no el resto de componentes del aceite.
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APENDICES
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APEND ICE A
CROMATOGRAMAS OBTENIDOS UTILIZANDO
E L METODO ISOCRATICO
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Figura 4. Cromatograma del Oleato de Metilo.
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Figura5. Cromatograma del Linoleato de Metilo.
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Figura 6. Cromatogra ma del Linoleato de Metilo.
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Figura 8. Cromatograma del Estearato de Metila.
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Figura 14. Cromatograma del Solvente A.
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Figura 16. Cromatograma del TBEM.
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Figura 17. Cromatograma del HBEMSoluble.
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Figura 18. Cromatograma del HBEM Insoluble.
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Figura 30. Cromatograma del DBHM.
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Figura 33. Cromatograma de 10 Mezcla de Analitos (205 nm).1.-
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Soluble, 4.- TBEM, 5.- Linoleato de Metilo 6.- DBHM, 7.-
DBEM,8.- Oleato de Metilo, 9.- Palmitato de Metilo, 10.-
Estearato de Metilo.
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Figura 35. Cromatograma de la Mezela de Analitos (220 nm). 1.-
HBEM Insoluble, 2.- HBEM Soluble. 3.-TBEM, 4.- DBHM, 5.-
DBEM,6.- Oleato de Metila. 7.- Palmitate de Metilo, 8.-
Estearato de Metilo.
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Figura 56. Cromatograma de 10 Soluci6n No.3 Utilizada en la
Elaboraci6n de las Curvas de Calibraci6n (Metoda
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Figura 58. Cromatograma del Aceite de Soya: (a) Sin
esterificar, (b) Transesferificado.
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Figura 59. Cromatograma del Aceife de Soya.
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Figura 60. Cromatograma del Aceite de Marz.
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2.- HBEM Soluble
3.- T B E M
4.- T B E M
5.- DBHM
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Figura 63. Cromatograma del Aceite de Soya Bromado (Metoda
Isocr6tico] .
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