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Universidade de So Paulo Instituto de Fsica de So Carlos Bacharelado em Cincias Fsicas e Biomoleculares

Biologia Celular e Molecular I 2014

Aula Prtica 02: REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

A. Reao em cadeia da polimerase (PCR)

A tcnica da reao em cadeia da polimerase (PCR, Polymerase Chain Reaction) foi desenvolvida por Kary

Mullis nos anos 80 e lhe propiciou o prmio Nobel de Qumica em 1994. A PCR permite amplificar um gene de cpia

nica em milhes de cpias, a partir de uma pequena quantidade do DNA original (DNA molde).

O pr-requisito essencial a determinao da regio do gene que ser amplificada. Em seguida, so

desenhados e sintetizados um par de oligonucleotdeos iniciadores (primers) complementares s regies

flanqueadoras da sequncia a ser amplificada em cada fita do DNA. Geralmente, primers especficos possuem

tamanho entre 17 a 30 nucleotdeos, teor de GC entre 40 a 60% e no so auto-complementares ou

complementares entre si.

O processo composto de trs etapas: desnaturao, hibridizao (anelamento) e extenso, que juntas

correspondem a um ciclo da reao. Normalmente so realizados de 25 a 35 ciclos para cada reao na qual a taxa

de amplificao exponencial, 2 n de ciclos.

1) Desnaturao: a 94 C, as fitas do DNA so separadas.

2) Hibridizao: geralmente entre 45 a 65 C, os primers hibridizam com suas sequncias complementares no DNA

molde desnaturado.

3) Extenso: a 72 C, a DNA Polimerase, na presena ons Mg2+ e dNTPs (desoxinucleotdeos), sintetiza uma nova fita

de DNA a partir da extremidade 3 OH do primer que se encontra hibridizado ao DNA molde. A descoberta da

enzima Taq DNA Polimerase, oriunda da bactria Thermus aquaticus, que vive em fontes hidrotermais, permitiu

automatizar o processo utilizando-se os termocicladores. A enzima Taq possui uma atividade tima a 72 C, mas

permanece estvel at 94 C.

Alm da amplificao para clonagem molecular, a tcnica de PCR possui outras aplicaes como: teste de

paternidade, diagnstico de doenas genticas e infecciosas, medicina forense, testes de organismos transgnicos,

anlise de polimorfismo de DNA, sequenciamento de DNA e vrias aplicaes no uso das metodologias do DNA

recombinante.

Procedimento

A partir do DNA genmico de Streptomyces clavuligerus, ser amplificado por PCR o gene cas2, que codifica

a protena clavaminato sintase (CAS). A clavaminato sintase uma protena Fe (II)/2-oxoglutarato oxigenase

importante na biossntese do cido clavulnico, um produto do metabolismo secundrio utilizado na indstria

farmacutica como antibitico.

1) Coloque os regentes para degelar no banho de gelo e realize todo o preparo das amostras no gelo para evitar que

as reaes se iniciem prematuramente.

2) Em um tubo de 0,2 mL, prepare a reao no volume final de 50 L conforme discriminado na tabela a seguir.

Pipete os reagentes na mesma sequncia em que eles aparecem na tabela.

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Reagente Quantidade Concentrao Final

gua milli-Q estril 30,5 L -

Tampo da Pfu DNA Polimerase (5X) 10 L 1 X

MgCl2 (50 mM) 2,5 L 2,5 mM

dNTPs (10 mM) 1 L 0,2 mM

Primer forward (10 M) 1 L 0,2 M

Primer reverse (10 M) 1 L 0,2 M

DMSO (100%) 2,5 L 5%

DNA molde (DNA genmico) 1 L 0,1 1 g

Pfu DNA Polimerase (2 U/L) 0,5 L 1 U

3) Coloque o tubo no termociclador sob as seguintes condies de reao:

Etapa Temperatura Tempo

Desnaturao inicial 95 C 5 min

35 ciclos

(Desnaturao, hibridizao e extenso)

94 C 30 s

69 C 1 min

72 C 90 s

Extenso final 72 C 10 min

Armazenamento 4 C

A figura a seguir esquematiza os dois primeiros ciclos de reao.

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Questes

1) Compare as etapas da reao da PCR (desnaturao, hibridizao e extenso) com as etapas da replicao do

DNA na clula, destacando as diferenas e semelhanas.

2) Por que a PCR resulta em um fragmento de DNA de tamanho determinado?

3) Em uma PCR convencional, partindo de uma molcula de DNA, qual o nmero de molculas aps 30 ciclos?

4) Se fosse colocado apenas um dos primers, qual seria o nmero de molculas aps 2 ciclos? E aps 30 ciclos?

Informaes adicionais

No site NCBI (National Center for Biotechnology Information), esto disponveis sequncias de genes, RNA e

protenas de diversos organismos. No link http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6840451 encontram-se os registros

para o gene cas2 (Gene ID: 6840451).

Para mais informaes sobre as tcnicas, consultar: Sambrook J, Russel DW. Molecular Cloning: A Laboratory

Manual. 3th Edition. Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 2001.

B. Eletroforese do produto de PCR

Atravs de eletroforese em gel de agarose, verificaremos se o gene foi amplificado e se o tamanho do

produto de PCR est correto. Se positivo, procederemos, na prxima prtica, purificao do produto de PCR a

partir do gel de agarose para posterior ligao a um vetor de clonagem.

1) Retire 5 L do produto de PCR e adicione 1 L de tampo de amostra (soluo contendo: 20% (m/v) de Ficoll

400; 0,1 M de EDTA pH 8,0; 0,1% (m/v) de SDS e 0,25% (m/v) de azul de bromofenol).

2) Aplique a mistura em uma canaleta do gel de agarose 0,8%, contendo o corante Sybr Safe e, em seguida,

aplique a voltagem de 120 V por aproximadamente 40 min. Utilize o transluminador para analisar o gel no

comprimento de onda de 470 nm.