Avanços das biotecnologias genéticas e reprodutivas de
espécies nativas
Eduardo Sousa VarelaPhD, Genética e Biologia MolecularPesquisadorEmbrapa Pesca e Aquicultura
FENACAM’16 X Simpósio
Internacional de Aquicultura
“Aumentar a Produção para Atender aCrescente Demanda Interna com um Olhar Atento no Promissor Mercado
Internacional”
Desafios:
Volume de produção Melhorias nos
sistemas produtivos Diversificação de
produtos
Bacias hidrográficas brasileiras e Parques aquícolas:
Diversidade de ambientes para o cultivo
As espécies produzidas serão desafiadas a:
SISTEMA DE PRODUÇÃO
INTERAÇÃO GENÓTIPO AMBIENTE
RESISTÊNCIA A PARASITOSES E ENFERMIDADES
Espécies Nativas: Oportunidade de atendimento ao mercado interno e internacional
Pacu
Piaractus mesopotamicus
Tambaqui
Colossoma macropomum
Pirapitinga
Piaractus braquipomum
Pirarucu
Arapaima gigas
Surubins - Pseudoplatystoma sp.
DEMANDAS TECNOLÓGICAS
Entraves tecnológicos comuns para espécies nativas e estratégias
• Espécies ainda em fase de domesticação– Amostragem recente– Ne?
• Falta de germoplasma qualificado no mercado– Linhagens com diferentes atributos– Populações de ampla base genética – Programas de melhoramento
• Gestão e certificação de reprodutores– Híbridos– Gestão de genealogia
• Aplicação de técnicas de NexGenSeq para geração de dados moleculares
– RNASeq
– Genotipagem por sequenciamento
– Descoberta de QTLs por associação do Genoma versus Fenótipo (GWAS)
– Melhoramento animal: Seleção Genômica
• Reprodução assistida por implantação hormonal
Tendências da Biotecnologia na Pecuária Mundial
Estratégia da Embrapa na adoção de novas Biotecnologias
Para Gestão e Certificação de reprodutores
Geração de painéis de marcadores moleculares
Controle da reprodução Baseada no DNA
Reprodução assistida por implantação de hormônios
Para acelerar Ganhos Genéticos
Geração do genoma completo Geração de Populações
Segregantes de ampla base genética
Aplicação de GWAS e GS
PRINCIPAIS AVANÇOS
Sequenciamento e montagem do
genoma do tambaqui (Colossoma
macropomum)
Homozigosidade (SSR) Criopreservação do sêmen
• Bibliotecas de DNA 400bp SG• Bibliotecas de 800bp SG• Bibliotecas MP (10Kbp < 15Kbp < 5Kbp)
MONTAGEM DO GENOMA DO TAMBAQUI
nts in scaffs >
1000 (Gbp)
longest scaffold
(Mbp)N50 (Mbp) #scaffs N50 N90 (Mbp) #scaffs N90
1ª Montagem 1.29 9.1 0.71 389 0.07 2,877
2ª Montagem 1.36 18.0 2.00 162 0.2 1,009
Descoberta dos Genes no Tambaqui
• Resultados:
• 23,632 genes encontrados• ~ 20,000 compartilham com A. mexicanus
Montagem do Genoma da Cachara
Estratégia similar ao executado com o tambaqui. Resultados obtidos:
Total nucleotides in assembly: 1.2 GBAssembly stats:
N50: 2.359.149 (124 scaffolds)N90: 373.275 (589 scaffolds)N95: 178.077 (804 scaffolds)N99: 1.001 (4831 scaffolds)
Gap filling- antes: ~ 46%- depois: ~ 27%
CEGMA:- Completos: ~ 90%- Parciais: ~ 8%
Sequenciamento completo do
genoma mitocondrial da cachara
ANOTAÇÃO AUTOMÁTICA DO MITOGENOMA
MitoAnnotator
ORGANIZAÇÃO DO MITOGENOMA
37 genes estruturais:
»13 genes codificadores de proteína
»42 genes rRNA
»22 tRNAs
»DLoop
Pool - 24 indivíduos Pool – 44 indivíduosPool – 63 indivíduos
Desenvolvimento de um painel molecular para
identificação de hibrido pacu-tambaqui-
Caranha
Identificando as mutações (SNPs) entre os animais
Como identificar os SNPs?
Isolamentodo DNA PCR Genotipagem Análise
Estatística
SNP Discovery within and between related species
Total de SNP Descobertos entre
Tambaqui-Pacu-Caranha:
»1,06 Milhões
»Informativos = 50 mil
• Identificação de marcadores para compor painel de certificação de pureza específica
• Filtros
– Cobertura
– MAF
– SNPs adjacentes
– Localização
Mineração de SNPs
Mineração de SNPs
• 1115 SNPs candidatos para identificação de introgressão
Simulação População HipótesesNúmero de Marcadores
alpha de 5% alpha de 1%
Puro H0: p=1 x H1: p<1 1 1
F1 H0: p=0.5 x H1: p<0.5 1 1
1 F2 H0: p=0.75 x H1: p<0.75 3 4
2 BC1 H0: p=0.5 x H1: p<0.5 5 7
3 BC2 H0: p=0.25 x H1: p<0.25 11 17
4 BC3 H0: p=0.125 x H1: p<0.125 23 35
5 BC4 H0: p=0.0625 x H1: p<0.0625 47 72
6 BC5 H0: p=0.03125 x H1: p<0.03125 95 145
7 BC6 H0: p=0.015625 x H1: p<0.015625 191 293
Identificação de híbridos F1
Desafio em discriminar os morfotipos de alevinos
Melhorar a gestão dos reprodutores
Busca de um método simples, rápido e eficaz na identificação das espécies e híbridos
Plotagem de discriminação alélicaDe puros e híbridos F1
Abordagem baseada em marcador molecular para estimar parentesco genético em espécies nativas
Espécies demandadas: Tambaqui e Pirarucu
Desafio em classificar o vínculo genético de animais sem informação de genealogia no setor
Melhoria na gestão de BAGs,
Abordagem baseadas em SSR/SNP polimórficos disponíveis
Amostragem dos Plantéis de Tambaqui na EMBRAPA
CATIVEIRO
Em torno de 400 amostras+ 25 progênies
SILVESTRE
CATIVEIRO
Amostragem dos Plantéis de Pirarucu
Em torno de 600 amostras+ 15 progênies
PASSO 1: Identificação
pelo microchip
PASSO 2: Coleta de
material genético paraanálise de DNA
E aí, bora namorar? Só depois do
pedigree ou DNA! Não
quero filhos consanguineos!
Parentesco Genético e acasalamentos baseados em DNA
Esperando... Vai já começar a Chover...
Meu chip é oM112827
Bora lá ver a matriz de parentesco pelo
DNA!Meu chip é o
F112768
M107613 M107625 M110332 M110495 M110616 M112827 M112919 M113697 M120110 M120573
F110224 1 0 0 0 0 1 -3.7647 0 0 0
F110342 0 0 1 0 0 0 0 0 -3 -3
F110392 -2.545 0 0 -3.1667 0 -2.545 -3.7647 0 -3.1667 0
F110422 0 0 -3 0 0 0 0 0 1 1
F110457 0.1137 0 0 -0.0417 0 0.1137 -3.7647 0 -0.0203 0
F110462 -2.545 0 1 -3.1667 0 -2.545 -3.7647 0 -3.0811 -3
F111052 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
F111069 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
F112735 0.1137 0 0 -0.0417 0 0.1137 -3.7647 0 -0.0417 0
F112768 -3.1667 0 1 -3.1667 0 -3.1667 0 0 -3.0811 -3
F112785 0 0 -3 0 0 0 0 0 1 1
F112843 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
F112886 1 0 0 0 0 1 -3.7647 0 0 0
F112900 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
F113526 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Fêmeas
Machos
Legenda:
Casais consanguíneos Casais compatíveis
Matriz de Parentesco genético pelo DNA
• Melhorias na gestão do plantel
• Avanços nas estratégias de acasalamento
• Evita acasalamentos de consanguíneos
Vantagens do teste de DNA
O processo de Domesticação do pirarucu visto pelo DNA (SNP 1.6K)
Domesticação recente com sinais de gargalo genético Pisciculturas com similaridades e divergência genética
6 -Animais silvestres
Plantéis de Cativeiro
Caracterização das deformidades esqueléticas em pirarucu por Diafanização
No adulto apenas por tomografia computadorizada
Secreção Cefálica
0 181
Perfil Hormonal de:
-11-KT-testosterone-estradiol
♂
♀
62 76 111 146Tempo (dias)
sGnRHa - pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-DArg-Trp-Leu-Pro-Net
45µg.kg-1♂
-13 casais com implante-5 casais controle-Não fizemos biopsia do ovário
Manipulação hormonal- Implantes
Perfil hormonal após implante
Efeito do GnRH naelevação de 11-KT emmachos (hormônioatuante na espermiação)
♂
Perfil hormonal após implante
♀ ♀
Efeito sobre testosterona, mas nãoestradiol
Perdemos uma desova, mas ganhamos informação!
Stage I Stage II Stage III
Endoscopia gonadal
Confirmação da maturidade;
Confirmação do sexo
Não invasivo; Rápido
procedimento.
Vantagens
Obrigado