UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS NA TERAPIA DE LESÕES
TENDÍNEAS IATROGÊNICAS DE COELHOS: obtenção, aspectos
histológicos e ultraestruturais
Luiz Augusto de Souza
Orientador: Prof. Dr. Luiz Antônio Franco da Silva
GOIÂNIA
2012
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LUIZ AUGUSTO DE SOUZA
CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS NA TERAPIA DE LESÕES
TENDÍNEAS IATROGÊNICAS DE COELHOS: obtenção, aspectos
histológicos e ultraestruturais
Tese apresentada para obtenção do grau
de Doutor em Ciência Animal junto ao
Programa de Pós-Graduação da Escola
de Veterinária e Zootecnia da
Universidade Federal de Goiás.
Área de Concentração:
Patologia, Clínica e Cirurgia Animal
Orientador:
Prof. Dr. Luiz Antônio Franco da Silva
Comitê de Orientação:
Profª Drª Elisângela de Paula Silveira Lacerda (ICB/UFG)
Profª Drª Wilia Marta Elsner Diederichsen de Brito (IPTSP/UFG)
GOIÂNIA
2012
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
GPT/BC/UFG
S729c
Souza, Luiz Augusto de.
Células-tronco mesenquimais na terapia de lesões tendíneas
iatrogênicas de coelhos [manuscrito] : obtenção, aspectos
histológicos e ultraestruturais / Luiz Augusto de Souza. - 2012.
120 f. : figs, tabs.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Antônio Franco da Silva.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Goiás,
Escola de Veterinária e Zootecnia, 2012.
Bibliografia.
1. Células-tronco. 2. Colágeno. 3. Matriz extracelular. 4. Medula óssea. I. Título.
CDU: 602.9:591.81
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v
A minha mãe Marlene Xavier por todo este tempo que estive ausente de seus braços.
Ao meu pai Wilson Carlos (in memorian), que mesmo com
sua breve passagem em minha vida me ensinou a ser um homem digno.
A minha noiva e amada Taís, pelo amor, companheirismo e apoio incondicional nessa caminhada.
Aos meus irmãos Wilson, Maycon e Francielle pela torcida.
Aos meus queridos familiares,
Dedico
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AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, por ter me oferecido paciência e sabedoria nos momentos em
que mais precisei e pela força de vontade que me ajudou a conseguir ficar longe
das pessoas que mais amo.
Á minha família pela confiança, torcida e incentivo. Sem vocês tudo seria mais
difícil.
A minha família “Francana”. Agradeço de coração ao Acácio e a Beth, pelos
pensamentos positivos e por me acolherem de forma tão especial.
No início orientador e hoje um grande amigo Professor Dr. Luiz Antônio Franco
da Silva. Obrigado pelo apoio, incentivo e pela confiança depositada em mim.
Agradeço pelas oportunidades que foram de grande valia em minha vida
profissional.
Ao amigo Benito, grande companheiro e um dos responsáveis pela realização
desse projeto. Apesar das grandes dificuldades tenho certeza que valeu a pena e
espero contar com sua ajuda em projetos futuros.
Ao mestre e amigo Professor Dr. Duvaldo Eurides responsável pelo início dessa
linha de pesquisa e que “mesmo ausente sempre esteve presente” no decorrer
desse experimento.
Professor Dr. Marcelo Emílio Beletti que admiro como pessoa e tenho como
exemplo de profissional. Agradeço por fazer parte desse projeto e espero que
essa parceria continue gerando bons frutos.
A todos do Laboratório de Genética Molecular e Citogenética da UFG
principalmente professora e co-orientadora Dra. Elisângela de Paula Silveira
Lacerda e as novas colegas Aliny e Flávia por ceder o laboratório e pela
paciência perante as “milhares” de dúvidas.
vii
Aos colegas e parceiros de cirurgia Sabrina, Morgana, Paulo, Jéssica, Lucas,
Flávia, Danilo e Damila pela ajuda e sacrifício de seus afazeres, não medindo
esforços para que esse trabalho fosse realizado da melhor maneira possível.
Agradeço a todos os colegas, professores e funcionários da Escola de Veterinária
e Zootecnia da UFG que por mim torceram e principalmente dona Vilda Maria por
estar sempre disposta a ajudar.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico pela
concessão da bolsa.
Aos animais, que de forma involuntária cederam seus corpos em prol da ciência.
O meu muito obrigado!
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“Não viva para que a sua presença seja notada,
mas para que a sua falta seja sentida...”
“Bob Marley”
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SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS .......................................................... 1
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 1
2 TENDÃO .............................................................................................................. 2
2.1 Anatomia e biomecânica tendínea .................................................................... 2
2.2 Lesões tendíneas .............................................................................................. 5
2.3 Reparação do tecido tendíneo .......................................................................... 8
3 TERAPIA CELULAR........................................................................................... 19
3.2 Conceitos, fisiologia e classificação das células-tronco .................................. 23
3.3 Isolamento celular: gradiente de densidade .................................................... 27
3.3.1 Determinação do rendimento e viabilidade celular ....................................... 30
3.4 Cultivo celular .................................................................................................. 31
3.4.1 Tipos de Culturas Celulares ......................................................................... 32
A) Explante primário versus desagregação ........................................................... 32
B) Subculturas ....................................................................................................... 34
3.4.2 Ambiente de cultivo ...................................................................................... 35
3.4.3 Método de tripsinização ................................................................................ 36
3.5 Aplicabilidade e potencial terapêutico das células-tronco ............................... 36
3.6 Métodos de avaliação de tendões ................................................................... 38
3.6.1 Macroscópico ............................................................................................... 38
3.6.2 Histológico .................................................................................................... 38
3.6.3 Microscopia eletrônica .................................................................................. 38
3.6.4 Ultrassonografia ........................................................................................... 39
3. 7 Objetivos ........................................................................................................ 40
4 REFERÊNCIAS .................................................................................................. 40
x
CAPÍTULO 2 - MÉTODO IMUNOMAGNÉTICO ASSOCIADO AO MEIO MESENCULT NA OBTENÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DA MEDULA ÓSSEA DE COELHOS .......................................................................... 52
RESUMO ............................................................................................................... 52
ABSTRACT ........................................................................................................... 53
INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 54
MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 55
RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 60
CONCLUSÕES ..................................................................................................... 67
REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 67
CAPITULO 3 – CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DA MEDULA ÓSSEA ASSCOIADAS A MATRIZ EXTRACELULAR DE COLÁGENO NO REPARO DE LESÕES TENDÍNEAS DE COELHOS .................................................................. 71
RESUMO ............................................................................................................... 71
ABSTRACT ........................................................................................................... 72
INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 73
MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 74
RESULTADOS ...................................................................................................... 79
DISCUSSÃO ......................................................................................................... 90
CONCLUSÕES ..................................................................................................... 96
REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 97
CAPÍTULO 4 - CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................ 101
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LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1
FIGURA 1 – Ilustração esquemática da estrutura hierárquica do tendão. O tendão tem uma estrutura composta por moléculas de colágeno, fibrilas, feixes de fibras, fascículos e a unidade de tendão que correm paralelas ao eixo longitudinal. ............................................................................................................. 4
FIGURA 2 - Membro pélvico esquerdo de coelho (Oryctolagus cunicullus). (A) tendão calcanear comum integro (seta). (B) tendão calcanear comum formado pelos tendões: (a) tendão do músculo gastrocnêmio, (b) tendão do músculo flexor superficial dos dedos e (c) tendão comum proveniente dos músculos semitendinoso, grácil e bíceps femoral. .................................................................. 7
FIGURA 3 - Representação esquemática da tenorrafia do tendão do músculo gastrocnêmio de coelho. (A) membro pélvico de coelhos: (a) sutura modificada de Kessler. (B) os números representam as perfurações e as setas a direção da sutura modificada de Kessler............ ................................................................. 9
FIGURA 4 - Demonstração dos locais para obtenção de medula óssea. Imagens radiográficas e de peças anatômicas referentes à região pélvica de cães. (A) imagem radiográfica na posição ventro-dorsal da região pélvica de um cão com a agulha introduzida no corpo do íleo; (B) e (C) demonstração em peça anatômica dos locais de introdução da agulha no corpo do íleo .................. 21
FIGURA 5 - Demonstração da punção medular através da fossa trocantérica do fêmur de cão com agulhas Steiss. Imagens radiográficas e de peças anatômicas referentes ao osso fêmur de cão. (A) imagem radiográfica na posição ventro-dorsal; (B) e (C) detalhes do local da introdução da agulha apoiada contra a face interna do trocânter maior do fêmur................................
22 FIGURA 6 - Demonstração da punção medular através do tubérculo maior do úmero com agulha de Steiss em cão. Imagens radiográficas e de peças anatômicas referentes ao osso úmero. (A) imagem radiográfica ântero-posterior do úmero de cão com a agulha introduzida no tubérculo maior do úmero. (B) e (C) detalhes do posicionamento da agulha em peça anatômica ........................... 22 FIGURA 7 - Demonstração da punção medular na região epifisária proximal da tíbia com agulha de Steiss em cão. Imagens radiográficas e de peças anatômicas referentes a tíbia. (A) imagem radiográfica látero-lateral e (B) crânio-dorsal da agulha introduzida na região epifisária proximal da tíbia; (C) detalhe do local demonstrado em peça anatômica. .............................................. 23 FIGURA 8 - Representação esquemática da propriedade das células-tronco de se dividirem e permanecem indiferenciadas ou se diferenciam e amadurecem ... 25
FIGURA 9 - Representação de diferentes possibilidades de transdiferenciação das células-tronco adultas (CTA), demonstrando haver grande plasticidade
xii
celular. Célula-tronco do sistema nervoso central (CT-SNC). Célula-tronco mesenquimal (CTM). Medula óssea (MO). ............................................................ 27
FIGURA 11 – Representação das culturas explante e por desagregação tecidual enzimática.em frascos de poliestireno. À esquerda, cultura explante com migração e crescimento das células em sentido radia, visto no diagrama abaixo. À direita, na desagregação tecidual enzimática células em suspensão dispostas em uma monocamada ........................................................................... 33
FIGURA 12 – Células mesenquimais da medula óssea, subcultivadas em meio modificado de Eagle suplementado com soro fetal bovino a 10%. (A) primeiros dias da subcultura, as células refringentes e com formato arredondado, o que corresponde à fase de divisão (seta branca). (B) células com formato alongado semelhante a fibroblastos.. .................................................................................... 35
CAPÍTULO 2
FIGURA 1 - Punção da medula óssea de coelhos. (A) agulha metálica de Rosenthal 16 gauge introduzida na epífise proximal do tubérculo maior do úmero. (B) seringa de 10,0mL contendo 0,3mL de heparina sódica acoplada a agulha de Rosenthal para colheita de 8,0mL do aspirado medular. ...................... 56 FIGURA 2 - Representação gráfica do rendimento médio, desvio padrão (barras) e viabilidade das células mononucleares (coluna escura) e das células-tronco mesenquimais (coluna clara) a partir de um volume de 8,0mL do aspirado medular de coelhos (n=10) após serem isoladas pelo gradiente Ficoll-paque® e purificadas em base imunomagnética. (CMN’s - células mononucleares; CTM’s – células-tronco mesequimais).. ...................................... 61 FIGURA 3 - Fotomicrografia das células-tronco mesenquimais aderentes provenientes da medula óssea de coelhos cultivadas em meio de cultura MesenCult®. (A) células-tronco mesenquimais no dia 0, (B) unidades formadoras de colônias fibroblásticas (setas), (C) início de confluência das células fibroblastóides no 3° dia, (D) células fibroblastóides confluentes no 10° dia de cultivo. (E) e (F) coloração pela técnica de Giemsa, início de confluência das células fibroblástóides no 3° dia. Aumento x40.. ............................................ 64 CAPÍTULO 3
FIGURA 1 – Tenectomia parcial do tendão do músculo gastrocnêmio de coelhos. Em (A) exposição do tendão do músculo gastrocnêmio, (B) e (C) remoção de um fragmento tendíneo de 1,0cm de comprimento por 0,3 de espessura, (D) e (E) pontos simples separados nas extremidades da lesão tendínea e (F) sutura simples separada na pele. .............................................
78
FIGURA 2 – Fotomicrografias de lâminas coradas por hematoxilina-eosina (A e B) e de microscopia eletrônica de transmissão (C e D) do tendão do músculo gastrocnêmio de coelhos referentes ao grupo controle após tenectomia parcial. (A) área de transição (AT) entre o tecido íntegro (TI) e o tecido cicatricial (TC) alta celularidade, infiltrado inflamatório (seta) e
xiii
delgadas fibras colágenas aos 45 dias de PO. (B) arteríolas na área de transição (*) e fibras colágenas desorganizadas e espaçadas entre si aos 90 dias de PO. Aumento x40. (C) corte transversal, setas indicam fibrilas colágenas espessas entremeadas por fibrilas colágenas delgadas (*) aos 45 dias de PO. (D) corte oblíquo, área de cicatrização formada por fibrilas colágenas delgadas e desorganizadas aos 90 dias de PO..............................
84
FIGURA 3 – Fotomicrografias de lâminas coradas com hematoxilina-eosina (A e B) e de microscopia eletrônica de transmissão (C) do tendão do músculo gastrocnêmio de coelhos referentes ao grupo células-tronco após tenectomia parcial. (A) aos 45 dias e (B) aos 90 dias de pós-operatório, células epiteliódes (retângulo) entre a área de tecido integro (TI) e a área de cicatrização (AC). (C) células epitelióides (retângulos) por microscopia eletrônica de transmissão aos 90 dias. (A) aumento de x40 e (B) aumento de x10................................................................................................................
85
FIGURA 4 – Fotomicrografias de lâminas coradas com hematoxilina-eosina (A e B) e microscopia eletrônica de transmissão (C e D) do tendão do músculo gastrocnêmio de coelhos referentes ao grupo células-tronco após tenectomia parcial. (A) presença de fibrina (*), eosinófilos (círculo) e macrófagos (seta) aos 45 dias de PO e (B) células fibroblásticas com características fusiformes aos 90 dias de PO. Aumento x40. A microscopia eletrônica (C) fibrilas colágenas ramificadas com perda do arranjo (*), prolongamentos citoplasmáticos (PC), hemácias (He) entre as fibrilas tendíneas e fibroblastos (círculo) aos 45 dias de PO. (D) reorganização das fibrilas de colágeno (Re) com atividade fibroblástica. prolongamentos citoplasmáticos de fibrócitos na área de cicatrização (AC) aos 90 dias de PO.......................................................................................................................
86
FIGURA 5 – Fotomicrografias de lâminas coradas com hematoxilina-eosina (A e B) e microscopia eletrônica de transmissão (C e D) do tendão do músculo gastrocnêmio de coelhos referentes ao grupo tratado com esponja de colágeno após tenectomia parcial. (A) macrófagos (setas), áreas com infiltrados inflamatórios, eosinófilos (círculo) e desorganização das fibras (*) aos 45 dias de PO. (B) células gigantes reabsorvendo a esponja de colágeno (retângulo), material amorfo entre as fibras (*) aos 90 dias de PO. Aumento x40. (C) microscopia eletrônica de transmissão, observar desarranjo das fibrilas colágenas em corte oblíquo (O) e transversal (T) e presença de macrófagos (setas) aos 45 dias de PO e (D) fibrilas de pequeno diâmetro e desorganizadas (círculo) aos 90 dias de PO....................................................
88
xiv
FIGURA 6 - Fotomicrografias de lâminas coradas em hematoxilina-eosina (A e B) e microscopia eletrônica de transmissão (C e D) do tendão do músculo gastrocnêmio de coelhos referentes ao grupo tratado com associação de células-tronco esponja de colágeno após tenectomia parcial. (A) processo de cicatrização com rearranjo e síntese das fibras colágenas com presença de fibroblastos ativos aos 45 dias de PO. (B) tecido organizado com fibras de colágeno entre os fibrócitos (setas) aos 90 dias de PO. Aumento x40 (A) e x100 (B). Em microscopia eletrônica de transmissão no corte transversal (C) fibrilas de colágeno organizadas e fibroblastos ativos (círculo) aos 45 dias de PO e (D) corte transversal com fibrilas tendíneas com predominância das com maior diâmetro aos 90 dias de PO..............................................................
90
xv
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2
TABELA 1 – Rendimento e viabilidade da fração de células mononucleares e
células-tronco mesenquimais isoladas da medula óssea de coelhos da raça
Nova Zelândia.. ..................................................................................................... 61
CAPÍTULO 3
TABELA 1 - Comparação das variáveis fibrina; infiltrado poliformonuclear;
infiltrado mononuclear; piócitos; células gigantes; fibroblastos; fibrócitos;
neovascularização; hemácias e necrose entre os grupos controle; células-
tronco; esponja de colágeno e células-tronco associadas à esponja de
colágeno para o período de 45 dias de pós-operatório. ........................................ 81
TABELA 2 - Comparação das variáveis fibrina; infiltrado poliformonuclear;
infiltrado mononuclear; piócitos; células gigantes; fibroblastos; fibrócitos;
neovascularização; hemácias e necrose entre os grupos controle; células-
tronco; esponja de colágeno e células-tronco associadas à esponja de
colágeno para o período de 90 dias de pós-operatório.. ....................................... 82
xvi
RESUMO
A maioria das lesões tendíneas está relacionada a traumas, e envolvem secção
parcial ou completa do tendão, devido à ação de objetos cortantes ou agudos, ou
laceração. Recentemente, os avanços médicos têm demonstrado crescente
interesse na utilização de terapia celular em tratamentos de doenças crônicas e
degenerativas com cicatrização lenta e ineficaz. Com este estudo objetivou-se
estabelecer um protocolo de isolamento das células mononucleares da medula
óssea (MO) de coelhos, seguido de purificação por depleção negativa com o
anticorpo monoclonal CD45 para separação das células-tronco mesenquimais
(CTMs) com posterior cultivo em meio de cultura MesenCult®. Em seguida, foram
avaliados os efeitos do transplante alógeno de CTMs com ou sem matriz
extracelular (MEC) de colágeno na cicatrização de lesões do tendão calcanear
comum de coelhos após tenectomia parcial. Foram realizadas avaliações clínicas,
físicas, macroscópicas, histológicas e por microscopia eletrônica das fibras
tendíneas. Concluiu-se que a obtenção, isolamento, purificação e a rápida
expansão de CTMs obtidas da fração mononuclear da MO podem ser alcançados
utilizando o gradiente de densidade Ficoll-paque®, a depleção negativa das
células hematopoiéticas em base imunomagnética e o meio de cultura
MesenCult®. Além disso, pôde-se observar que o número de passagens exerce
influência negativa sobre as características morfológicas das células. Em relação
ao tratamento das lesões tendíneas, o grupo tratado com CTMs da medula óssea
cultivadas em MesenCult® associadas a esponja de colágeno apresentou
melhores resultados em termos de progresso e qualidade da cicatrização com
deposição de fibras colágenas em orientação longitudinal.
Palavras-chave: células-tronco mesenquimais, colágeno, matriz extracelular,
medula óssea.
xvii
ABSTRACT
Most tendon injuries are related to trauma and involve partial or complete tendon
section due to the action of cutting or sharp objects or laceration. Recently,
medical advances have shown a growing interest in the use of cell therapy for the
treatment of chronic and degenerative diseases with slow and ineffective healing.
The aim of this study was to establish a protocol for mononuclear cells isolation
from bone marrow (BM) of rabbits, followed by purification using negative
depletion with the monoclonal antibody CD45 for separation of mesenchymal stem
cells (MSCs), with further cultivation in MesenCult ® medium. After that, it was
evaluated the effects of allogeneic transplantation of MSCs with or without
collagen extracellular matrix (CEM) on wound healing of the common calcaneal
tendon in rabbits after partial tenectomy. Clinical, physical, macroscopic,
histological and electron microscopy evaluations of tendon fibers were conducted.
It was concluded that the collection, isolation, purification and rapid expansion of
MSCs obtained from the mononuclear fraction of BM can be achieved using the
density gradient Ficoll-paque®, negative depletion of haematopoietic cells in
immunomagnetic base and MesenCult® medium. Furthermore, it was noticed that
the number of passages exerts a negative influence on the morphology of the
cells. Regarding treatment of tendinous injuries, the group treated with MSCs from
bone marrow cultured in MesenCult® soaked in collagen sponge showed better
results in terms of progress and quality of healing with deposition of collagen fibers
in longitudinal orientation.
Keywords mesenchymal stem-cells, collagen, extracellular matrix, bone marrow
CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS
1 INTRODUÇÃO
Lesões tendíneas e ligamentares são as principais causas de
claudicação em animais domésticos, resultando em queda de desempenho e
alteração da postura com difícil correção cirúrgica (NEURINGER & RANDELL,
2004). Estas lesões podem variar de um leve esforço a uma ruptura parcial ou
total, geralmente afetando os flexores digitais e o tendão calcânear comum,
devido à ação de objetos cortantes (RAISER, 2000). Métodos de tratamento vêm
sendo testados, porém os resultados são frustrantes quando considerados o
tempo de cicatrização e a qualidade do tecido cicatricial formado. Isso acontece,
devido à pobre oxigenação, irrigação e nutrição que o tecido tendíneo recebe.
Na tentativa de acelerar processos regenerativos do aparelho
locomotor têm sido efetuadas pesquisas com diferentes tipos de membranas
biológicas e tecidos, como a pele (KOTTON, 2001), osso (KOSACHENCO et al.,
1998), nervos (STAINKI et al., 1995), músculos e tendões (REDDY et al., 1998).
Entretanto, os pesquisadoremks têm voltado sua atenção para o potencial
terapêutico da engenharia celular quando aplicadas a enfermidades complexas ou
lesão de difícil cicatrização (HUANG et al., 2006).
A terapia celular, bem como a engenharia de tecidos provê novas
opções de tratamento para tecidos lesados como o tendão. Neste caso, há adição
de células a vários veículos e aplicação de estímulos mecânicos e químicos na
cultura, para tentar criar tecidos de reparação seguros e funcionais (BUTLER et
al., 1974). Concentrações elevadas de células-tronco mesenquimais (CTMs),
indiferenciadas, nos defeitos do tecido mostrou-se promissora nos estudos feitos
em animais para a reparação de osso, cartilagem e tendão (RICHARDS et al.,
1999; AWAD et al., 2003; KRAMPERA et al., 2006).
A experimentação laboratorial envolvendo esses tipos de células está
evoluindo, porém, faltam estudos fundamentados e controlados sobre as fontes
de diferentes células-tronco e métodos de purificação para expansão celular em
cultura que confirmem a contribuição deste método na qualidade da cicatrização
(ZAGO & COVAS, 2004).
2
Com base nessas informações, fazem necessárias avaliações mais
precisas e eficazes deste tipo de terapia e o uso de equipamentos que fornecem
imagens de alta resolução, como a microscopia eletrônica (FILHO et al., 1995).
Todavia, a maioria dos trabalhos publicados envolvendo tendões se baseia em
estudos retrospectivos e na descrição de novas técnicas de reparação conforme
as que serão apresentadas neste estudo, sendo escassas informações acerca
dos achados em exames laboratoriais e de imagem, situação que dificulta a
compreensão de todos os eventos que acontecem durante a reparação tendínea.
Diante da relevância do tema, realizou-se um estudo sobre a obtenção
das células-tronco mesenquimais da medula óssea de coelhos por meio das
amostras de células mononucleares após serem isoladas em gradiente de
densidade e purificadas em base imunomagnética, medotologia inédita na
Medicina Veterinária como método para obtenção de células-tronco
mesenquimais. As células obtidas foram expandidas em meio de cultura
MesenCult® e utilizadas associadas ou não a uma matriz extracelular
tridimensional de colágeno no reparo de lesões do tendão do músculo
gastrocnêmio de coelhos.
2 TENDÃO
2.1 Anatomia e biomecânica tendínea
Os tendões são estruturas fibrosas esbranquiçadas localizadas entre o
músculo e o osso. São formados por tecido conjuntivo denso altamente
organizado, composto por colágeno ordenado de maneira longitudinal envolvidos
por uma bainha de tecido conectivo frouxo denominado paratendão (AUER &
STICK, 1999). Sua composição fibrosa é representada pelas fibras colágenas,
além dos componentes amorfos sob a forma de gel (ALBERTS et al., 2006).
Possuem tenócitos envolvidos por matriz extracelular (MEC) e áreas que
requerem lubrificação são constituídas pelas bainhas sinoviais. Essas bainhas
são compostas por dois extratos, um externo ou parietal e um interno ou visceral,
tendo em sua composição água, colágeno, proteoglicanos e fibrócitos ordenados.
3
Os fibroblastos secretam as fibras colágenas controlando a produção e a
manutenção dessa matriz (ALVES & MIKAIL, 2006).
A MEC dos tendões é composta principalmente por moléculas de
colágeno do tipo I, que representam cerca de 80 a 90% do peso seco do tecido,
estando arranjadas em fibras e feixes de fibras dispostas longitudinalmente ao
maior eixo do tendão (LIN et al., 2004). São responsáveis pela estabilidade
estrutural e mecânica do tecido (EZURA et al., 2000). Junto ao colágeno tipo I,
também podem ser encontrados os colágenos tipos II e III, sendo este último
encontrado ao redor das fibras do tipo I e no endotendão (BERENSON et al.,
1996; ALVES, 1998). O diâmetro dessas fibras colágenas apresenta-se uniforme
durante a fase inicial de desenvolvimento mas, com o avançar da idade, é
observado um padrão bi ou tri-modal (GOODSHIP et al., 1994).
A principal característica de uma molécula de colágeno é a estrutura
longa e rígida de sua fita tripla helicoidal, na qual três cadeias polipeptídicas
denominadas de cadeia alfa mostram-se enroladas uma nas outras. Existem
diferentes tipos de colágenos organizados em diferentes arranjos estruturais,
entre eles, aqueles que se organizam em fibrilas são os colágenos dos tipos I e V,
encontrados nos tendões, ossos, pele, ligamentos, córneas e órgãos internos. Os
do tipo II e XI são observados na cartilagem, disco intervertebral, notocorda e
humor vítreo e do tipo III presente na pele, vasos sanguíneos e órgãos internos
(ALBERTS et al., 2006). Em particular, as fibrilas de colágeno do tipo III, referem-
se às fibras reticulares ou reticulina, consideradas estruturas importantes na
sustentação de componentes especializados da matriz extracelular (STEVENS &
LOWE, 1995). Além do colágeno e proteoglicanos, também estão presentes na
matriz extracelular as glicoproteínas não-colagênicas e glicoproteínas adesivas,
como a fibronectina e a trombospondina, que participam dos processos de
reparação e regeneração dos tendões (JOZSA et al., 1991).
Além do sistema de feixes de fibrilas de colágeno, existe um sistema
de “cápsulas” que envolve o tendão externamente e emite prolongamentos que
revestem os grupos de feixes que são chamados de endotendão. Já a fina
camada de tecido conjuntivo que reveste o tendão externamente corresponde ao
epitendão (ELLIOT, 1965). O endotendão é composto de fibras colágenas tipo III
e de tecido conjuntivo frouxo, que permeia o tendão separando-o em fascículos.
4
Com essa disposição, o endotendão circunda os vasos sanguíneos, linfáticos e
nervos, enquanto que o epitendão envolve toda unidade tendínea externamente.
As superfícies dos tendões são esbranquiçadas e brilhantes devido ao epitendão
que é ligado à membrana sinovial. Ambas as estruturas, endotendão e epitendão
são responsáveis pela vascularização do tecido tendíneo (KILLINGSWORTH,
1993).
O paratendão e o epitendão contêm fibras elásticas e colágenas
arranjadas irregularmente. Esse arranjo proporciona resistência ao movimento
deslizante através dos tecidos e precisa ser preservado para manter a função do
tendão (KILLINGSWORTH, 1993). Na figura 1, pode-se ver uma representação
esquemática de um tendão, mostrando as moléculas de colágeno, fibrilas, fibras
colágenas, os fascículos, endotendão e o epitendão (YANG et al., 2008).
FIGURA 1 – Ilustração esquemática da estrutura hierárquica do tendão. O tendão tem uma estrutura composta por moléculas de colágeno, fibrilas, feixes de fibras, fascículos e a unidade de tendão que correm paralelas ao eixo longitudinal. Fonte: YANG et al. (2008).
5
Os ligamentos anulares ou retináculos mantêm o tendão junto ao osso,
prevenindo seu deslocamento em articulações de grande mobilidade (STASHAK,
1994). Em locais onde o tendão necessita de maior proteção, os mesmos sofrem
processo de ossificação para formar ossos sesamóides, ou condrificação nas
inserções junto ao osso, como por exemplo, a inserção do tendão do músculo
flexor digital superficial (KILLINGSWORTH, 1993).
O suprimento vascular do tecido tendíneo provém dos vasos que
penetram pelo paratendão, dos capilares da junção miotendínea e do osso ao
qual se adere. Essa região é denominada de junção teno-óssea, e não é
considerada uma área importante de vascularização. Acredita-se que nos tendões
envoltos por bainha sinovial há difusão de nutrientes do líquido sinovial para a
bainha tendínea, sendo essa a sua maior fonte de nutrição. Os ossos e os
músculos são responsáveis por 25% do aporte vascular tanto proximal quanto
distal do tendão, com exceção da região metacarpiana central, que está
associada com o tendão do músculo flexor digital superficial. Nessa região há
vasos intrínsecos interconectados por uma rede capilar difusa localizados na
periferia medial e lateral do tendão que irrigam mais de 25% do tecido (PAYNE &
TOMLINSOM, 1993).
A principal função do tendão é manter o equilíbrio estático e dinâmico
do corpo, transmitindo aos ossos e articulações toda a força exercida pelos
músculos para gerar movimento (ALBERTS et al., 2006). Essa força, conhecida
como força biomecânica é armazenada e transmitida na forma de energia
propulsora pelos tendões. Outras funções atribuídas às fibras tendíneas são a
amplificação dinâmica durante as contrações musculares rápidas, reserva de
energia elástica e atenuação de forças durante movimentos abruptos
(MCILWRAITH, 1994). Os ligamentos possuem função similar ao tendão, mas
para tal, unem duas extremidades ósseas (SMITH & WEBBON, 1996).
2.2 Lesões tendíneas
Os sinais clínicos das lesões variam de acordo com alguns fatores,
como localização, tipo, severidade e evolução da lesão. As lesões agudas
6
geralmente são severas e caracterizam-se por sinais clássicos como dor, edema
e aumento da temperatura local. No exame estático, a palpação deve ser
realizada inicialmente com o membro em apoio e, posteriormente, flexionado e
elevado. Nessa posição, os tendões e os ligamentos apresentam-se relaxados e
são facilmente palpáveis. Além disso, é importante promover movimentos de
flexão e extensão, o que induz o deslizamento dos tendões notando-se eventual
presença de aderências e ou fibroses após o trauma (ALVES & MIKAIL, 2006).
Suspeita-se de ruptura ou avulsão do tendão calcâneo comum pelos
achados do exame físico. Para facilitar o diagnóstico, o animal deve sustentar seu
peso sobre o membro afetado, o que permite a visualização de hiperflexão do
tarso e hiperextensão do joelho (BLOOMBERG, 1998). Essas alterações
posturais, juntamente com a flacidez do tendão por ocasião da flexão do tarso e o
edema palpável na região confirmam o diagnóstico (FOSSUM et al., 2002). Caso
não exista qualquer ferimento cutâneo, deve-se suspeitar da avulsão da
tuberosidade calcânea (BLOOMBERG, 1998). Nesse caso, a palpação cuidadosa
revela a extremidade distal do tendão de consistência firme devido à fibroplasia a
cerca de dois a três centímetros proximais à tuberosidade calcânea (PIERMATTEI
& FLO, 1999).
Quando um tendão é submetido a uma força de grande magnitude ou a
uma súbita tração diferente da habitual, pode ser lesado gravemente a ponto de
ocorrer a sua ruptura (WESTPHALEN, 1995). Nos animais, os tendões
frequentemente envolvidos estão localizados nas porções distais dos membros
(RAISER, 2000). Dentre as injúrias observadas no cão, encontram-se as lesões
do mecanismo de Aquiles (Figura 2A), onde a ruptura é relatada com frequência
(COSTA NETO et al., 1999). Anatomicamente, o tendão calcâneo comum ou
mecanismo de Aquiles, consiste de três tendões que se inserem na tuberosidade
calcânea do tarso: o tendão do músculo gastrocnêmio; o tendão comum dos
músculos bíceps femoral, semitendinoso e grácil; e o tendão do músculo flexor
digital superficial (Figura 2B) (PIERMATTEI & FLO, 1999). Dentre esses, o tendão
do músculo gastrocnêmio é o principal componente deste mecanismo (FOSSUM
et al., 2002).
7
FIGURA 2 - Membro pélvico esquerdo de coelho (Oryctolagus cunicullus). (A) tendão calcanear comum integro (seta). (B) tendão calcanear comum formado pelos tendões: (a) tendão do músculo gastrocnêmio, (b) tendão do músculo flexor superficial dos dedos e (c) tendão comum proveniente dos músculos semitendinoso, grácil e bíceps femoral. Fonte: BERETTA (2005).
As rupturas do tendão calcâneo comum podem ocorrer em qualquer
ponto entre a junção músculo-tendínea e o tubérculo do calcâneo (REINKE,
1982). As lesões agudas que provocam ruptura ou avulsão do tendão estão
associadas a um ferimento penetrante ou a um traumatismo contuso direto,
resultante de quedas (FOSSUM et al., 2002). Esse tipo de trauma é bastante
comum nas espécies canina (BONNEAU et al., 1983), equina (GOODSHIP, 1993)
e humana (NYSTROM & HOLMLUND, 1983). Em alguns casos, a substituição do
tendão torna-se necessária, especialmente quando há grande perda de tecido.
Nesses episódios, os enxertos ou as próteses fornecem suporte e orientação para
a migração de células e formação das fibras tendíneas (VALDÉS-VÁSQUEZ et
al., 1996).
Em alguns casos pode ocorrer uma lesão crônica, também
denominada de ruptura por “fadiga”, caracterizada por degeneração gradual das
fibras tendíneas (PETERSEN, 1998). Outros fatores atribuídos às tenopatias com
rupturas espontâneas são o uso de fármacos responsáveis por danos de origem
oxidativa nas células (SIMONIM et al., 2000).
Quando o tendão flexor digital superficial sofre secção, o membro
torna-se mais plantígrado que o normal (BLOOMBERG, 1998), porém se esse
tendão estiver intacto, o animal permanece com os dígitos flexionados e apóia-se
8
nas extremidades distais das almofadas plantares. Com frequência é observado
edema regional e dor logo após a lesão. Posteriormente, a região torna-se
tomada pela fibroplasia e o músculo gastrocnêmio retrai-se, tracionando a
extremidade distal do tendão, proximalmente (PIERMATTEI & FLO, 1999).
Em equinos, as causas mais comuns de lacerações tendíneas são
lesões promovidas por arames de cerca, nas quais os tendões extensores
geralmente estão envolvidos. Já nos tendões flexores, as lacerações se devem ao
pisoteio e coices em objetos cortantes (STASHAK, 1994). Nessas situações há
um grande prejuízo funcional devido à perda de aposição entre as extremidades
rompidas, uma vez que a cicatrização espontânea do tendão não proporciona um
reparo ideal. Além disso, a força e o comprimento habitualmente não readquirem
proporções normais (WESTPHALEN, 1995).
De acordo com POWER (1981), as rupturas parciais geralmente
acontecem na junção músculo-tendínea, e as rupturas totais ocorrem com maior
frequência próxima à inserção do tendão junto ao tubérculo do calcâneo. Ainda,
segundo o autor, a etiologia das injúrias tendíneas pode estar relacionada com a
idade do animal, uma vez que, com o envelhecimento ocorre uma degeneração
dos tendões e eventualmente uma moderada contração resulta em ruptura. Essa
hipótese também é defendida por BRINKER (1990).
A etiologia da ruptura do tendão junto à sua porção tendínea em
fêmeas caninas idosas, assim como ocorre em mulheres idosas, pode estar
relacionada a fatores que incluem a osteoporose, o hipotireoidismo, excesso de
peso, altas doses de corticóides e vida sedentária associada à inatividade. Todos
esses fatores causam diminuição do suprimento sanguíneo e subsequente
degeneração do tendão com alteração na matriz colágena. Além disso, fraturas
avulsivas em cães com menos de dois anos de idade estão associadas à
incompleta maturação do osso no sítio de inserção do tendão (REINKE &
MUGHANNAM, 1994).
2.3 Reparação do tecido tendíneo
Durante a tenorrafia, sob o ponto de vista biomecânico, a resistência
9
elástica do tendão aumenta proporcionalmente ao número de fios que cruzam a
linha de ruptura e é incrementada quando é feito apenas um nó por ponto
posicionado fora da área de reparo. A sutura de Kessler modificada (Figura 3) é a
que melhor se presta para tenorrafia em Medicina Veterinária, pois atende a
maioria dos requisitos necessários (BLOOMBERG, 1998; RAISER, 1995). Como
os fios geralmente se rompem nos nós de sutura, o posicionamento desses fora
da linha de reparação evita a ação enzimática na área (WANG, 1998). Além
disso, esse padrão de sutura não danifica a microvascularização do tendão,
evitando áreas focais de isquemia e posteriormente decréscimo na força de
sustentação da sutura (ARON, 1996).
FIGURA 3 - Representação esquemática da tenorrafia do tendão do músculo gastrocnêmio de coelho. (A) membro pélvico de coelhos: (a) sutura modificada de Kessler. (B) os números representam as perfurações e as setas a direção da sutura modificada de Kessler. Fonte: BERETTA (2005).
Nas reconstituições tendíneas são recomendados fios
monofilamentares, como náilon e polipropileno, já que suturas com material
trançado, como poliéster, poliglactina 910 ou ácido poliglicólico deslizam com
dificuldade entre as fibras tendíneas na aproximação dos segmentos rompidos
(KILLINGSWORTH, 1993).
Com relação ao tempo, a tenorrafia pode ser primária, primária
10
protelada, secundária e secundária protelada. A reparação primária é aquela
iniciada em 12 horas após a ruptura, a primária protelada de dez a 14 dias, a
secundária após o período de duas semanas e a secundária protelada após
quatro semanas (RAISER et al., 2001). No homem, o tratamento de eleição é o
reparo primário, enquanto que em animais a reparação é protelada na maioria das
vezes, devido à dificuldade de se obter uma ferida limpa. Assim, o procedimento
cirúrgico só deve ser realizado quando a ferida não apresentar contaminação ou
infecção. Uma abordagem atraumática é necessária para prevenir futuras
aderências dos tecidos peritendíneos ao tendão e evitar danos à vascularização
que penetra pelo paratendão oriunda de vasos da junção miotendínea (PAYNE &
TOMLINSOM, 1993).
O objetivo fundamental da reparação do tendão é manter a função de
sustentação do tendão rompido, enquanto o desempenho do deslizamento é de
importância secundária (RAISER, 2000). A reparação secundária é necessária em
animais quando há falha, ou não tenha sido tentada a reparação primária. No
entanto, deve ser realizada entre duas e quatro semanas após cicatrização da
ferida inicial. Ela oferece boa função de sustentação, mas a função deslizante
pode ser perdida (KILLINGSWORTH, 1993).
Nos casos de reparo por segunda intenção, sem adequada
aproximação, pode deixar o tendão longo e espessado, devido à formação de
extensa cicatriz. Feridas extensas levam a destruição do tecido paratendíneo
adjacente ao tendão, de modo que o tecido cicatricial se justapõe ao tecido
tendíneo e não ao paratendíneo (MCILWRAITH, 1994).
Em equinos, não há um protocolo específico de tratamento para as
lacerações tendíneas, mas algumas regras gerais podem ser estabelecidas. Em
todos os casos devem-se respeitar os princípios da cirurgia asséptica, como
limpar e debridar a ferida (MCILWRAITH, 1994). No caso de secção dos tendões
extensores digitais, a ferida limpa é suturada para conseguir uma cicatrização por
primeira intenção. Se há presença de infecção, deve-se deixar a ferida cicatrizar
por granulação. Nesses casos pode-se esperar por mais de seis meses para que
seja obtida a função plena. Os resultados gerais nas lacerações dos tendões
flexores são menos satisfatórios (STASHAK, 1994).
Na maioria dos casos da ruptura tendínea completa do tendão
11
calcanear, procede-se ao reparo cirúrgico, não sendo indicado tratamento clínico.
A atividade física do animal deve ser limitada ou ausente até a realização do
procedimento cirúrgico (FOSSUM et al., 2002). Com base nessas observações,
recomenda-se tentar a reparação tendínea por primeira intenção, pois reparações
após 30 dias com contratura muscular podem requerer o uso de enxerto (WANG,
1998).
O tendão calcâneo é abordado por meio de incisão cutânea caudo-
lateral do membro afetado (FOSSUM et al., 2002). Em lesões agudas, a
extremidade avulsionada do tendão gastrocnêmio estará imediatamente evidente
e é possível identificar cada componente do complexo de Aquiles e suturá-los
individualmente (PIERMATTEI & FLO, 1999). Nos casos de ruptura crônica, o
reparo torna-se mais difícil devido à retração das extremidades tendíneas e pela
presença de um tecido de cicatrização extenso no local, impossibilitando a
identificação de cada componente (CASTRO & MATERA, 2002). Nesses casos, o
complexo é tratado como uma única estrutura (FOSSUM et al., 2002).
Independente da técnica cirúrgica escolhida para a reparação, é
importante minimizar o trauma às estruturas circunvizinhas, pois o tendão é
relativamente avascular e depende delas para reparar-se (CASTRO & MATERA,
2002). Na maioria dos casos é possível trazer a extremidade do corte para
aposição com a tuberosidade quando as articulações do joelho e do tarso estão
em ângulos normais (PIERMATTEI & FLO, 1999) e então, o tendão é fixado pela
aplicação da sutura na sua parte distal (BLOOMBERG, 1998).
Membros que sofreram rupturas tendíneas parciais ou totais e que
foram submetidos ao tratamento conservador ou cirúrgico devem ser
imobilizados. A imobilização é realizada em posição semi-estendida perdurando
de três a seis semanas. Posteriormente, aplica-se bandagem por três semanas,
preservando a aposição dos cotos tendíneos rompidos e impedindo tensão na
sutura aplicada (PIERMATTEI & FLO, 1999).
O sucesso do tratamento e, consequentemente o bom prognóstico,
está associado à resolução do processo da forma mais eficiente e rápida possível.
Para as lesões em tecidos moles, o prognóstico está associado às lesões de
menor severidade, com menor reação inflamatória e ao tratamento precoce.
Dentre as formas de terapia citadas para a fase aguda, destacam-se o uso
12
parenteral, tópico ou ambos de anti-inflamatórios não-esteróides (DAHLGREN et
al., 2005), a crioterapia (ALVES & MIKAIL, 2006) e repouso associado aos
exercícios controlados (GILLIS, 1997).
O uso de anti-inflamatório é preconizado por suas propriedades
analgésicas, anti-inflamatórias e antipiréticas, com ação inibitória da cicloxigenase
e consequente diminuição da produção de prostaglandinas. A fenilbutazona é
utilizada nas enfermidades do aparelho locomotor, pela sua eficácia e baixo custo.
Outros fármacos empregados são a flunixina meglumina, cetoprofeno, narprofeno,
carprofeno e o meloxicam (DAHLGREN et al., 2005).
O uso da crioterapia é eficaz na diminuição da formação de
hematomas e edema, uma vez que promove vasoconstrição local. As formas mais
comuns de crioterapia são as bolsas de gelo e banhos de imersão em baldes
contendo água e gelo. As sessões diárias são recomendadas até a remissão dos
sinais inflamatórios agudos (LOPES, 2006).
Quanto mais longo o período de recuperação, maiores são os prejuízos
financeiros, já que o animal fica impedido de desempenhar a atividade para a qual
foi selecionado e preparado. Na tentativa de acelerar os processos reparativos e
regenerativos, têm sido utilizados no pós-operatório de diversas cirurgias os
chamados adjuvantes da cicatrização (RAISER et al., 2001). Dentre eles,
encontram-se o laser, o ultrassom terapêutico, a estimulação elétrica
transcutânea e a eletroacupuntura (GUM et al., 1997). A hidroterapia é utilizada
na prevenção de edema (LEWIS, 2002), assim como a fisioterapia (BROMILEY,
2000) e a laserterapia na aceleração do processo regenerativo, modulando a
formação de tecido de granulação tão abundante no processo cicatricial (GIANINI,
2003).
As aderências podem ocorrer devido ao trauma cirúrgico, provocando
limitações articulares e prejuízo no mecanismo de deslizamento dos tendões.
BUNNELL (1956) relatou que após o trauma ou lesão tendinosa, ocorre um
grande extravasamento de exsudado serofibrinoso para fora dos tecidos. Com o
membro imobilizado por um período prolongado esse exsudato rico em proteína e
fibrina se organiza e dificulta o deslizamento das partes moles, o que resulta em
aderência tendinosa, devido à proliferação fibroblástica. KESSLER & NISSIN
(1969) referiram que lesões parciais ou totais dos tendões desenvolvem uma
13
intensa reação fibrótica, mas que com uma boa sutura a quantidade de aderência
é significativamente reduzida. O movimento precoce muda o curso natural das
aderências e preserva a função fisiológica do tendão.
No contexto anatômico, a bainha sinovial desempenha importante
função na prevenção de aderências. Deve-se evitar sua ressecção e preconiza-se
a sua reparação após o trauma (LUNDBORG et al., 1980). Estudos comprovam a
importância do líquido sinovial e da vascularização na cicatrização do tendão,
onde lesões tendíneas acompanhadas de alterações da circulação intrínseca e
extrínseca desencadeiam um processo isquêmico promovendo a aderência do
tendão (MATTAR JR., 1991). No entanto, além do processo isquêmico, a
hemorragia trans e pós-operatória também tem sido apontada como uma das
principais causas de aderência. Essa pode ser evitada utilizando coagulador
bipolar durante os procedimentos cirúrgicos para auxiliar na adequada
hemostasia (HATANO et al., 2000).
2.4 Cicatrização tendínea
A evolução do processo cicatricial envolve uma série de eventos que
representam tentativas de restabelecer a estrutura anatômica e a função normal
da região afetada. Neste fenômeno, vários fatores sistêmicos e locais estão
envolvidos e o desequilíbrio ou ausência de elementos, principalmente a
formação de colágeno, pode comprometer o resultado final da regeneração
(COELHO et al., 2002). Dentre os fatores sistêmicos, destacam-se a idade do
paciente e a concentração sérica de proteínas (WITTE & BARBUL, 1997) e entre
os fatores locais, pode-se citar a região anatômica da ferida, a presença de
infecção e a desvitalização dos tecidos envolvidos (SANTOS, 2000).
A cicatrização tendínea após o trauma segue o padrão similar ao da
maioria dos outros tecidos conjuntivos, sendo bem definida em relação à perfeita
união e a resistência cicatricial após a união das extremidades tendíneas
(CLARK, 1993). Pacientes com carência nutricional apresentam cicatrização lenta
em decorrência do suporte nutricional deficiente (FOSSUM et al., 2002). Um
quadro de hipoproteinemia, além de terem prolongado o tempo de cicatrização,
14
pode apresentar imunossupressão, diminuindo a oxigenação e a perfusão tissular,
que são essenciais na manutenção da integridade do processo cicatricial
(JOHNSTON, 1990). As proteínas são fundamentais para todos os aspectos da
reparação tecidual, tal qual a síntese de colágeno, a proliferação epidérmica e a
neovascularização (STARKEY, 2001).
Logo que ocorre a lesão, inicia-se uma resposta vascular intensa,
primeiramente com uma vasoconstricção por ação da noradrenalina e contração
do endotélio. Em seguida, a vasodilatação promove a chegada de células
inflamatórias para o local e sob a ação da histamina, ocorre alteração da
permeabilidade vascular formando o edema, característico da inflamação aguda
(BAXTER, 1994). O processo cicatricial inicia-se com o surgimento de capilares e
invasão de fibroblastos indiferenciados a partir do paratendão e dos tecidos
adjacentes (RAISER, 1995).
A sequência inflamatória começa no momento do trauma e estende-se
por aproximadamente três dias, com formação de coágulo de fibrina. Nessa fase
ocorre fagocitose das células e dos fragmentos de colágeno e, em seguida, inicia-
se a formação da substância fundamental e síntese do novo colágeno a partir de
fibroblastos derivados do epitendão, endotendão e dos tecidos adjacentes
(AUTEFAGE, 1999). Na segunda semana, ocorre uma intensa reação vascular
acompanhada por proliferação fibroblástica e produção de colágeno, que
alcançam seu pico máximo. Na terceira e quarta semanas, as fibras de colágeno
próximas às extremidades tendíneas orientam-se longitudinalmente e aquelas no
centro da ferida cicatricial permanecem desorganizadas e perpendiculares às
linhas de estresse (RAISER, 1995).
O remodelamento ocorre a partir da quarta semana estendendo-se até
a vigésima semana, período este caracterizado pela redução do tamanho da
ferida devido ao processo de colagenólise. Assim, as fibras de colágeno são
direcionadas em um plano paralelo ao eixo longitudinal do corpo do tendão, se
organizando. Essa organização confere resistência à tensão e é dependente de
movimentação do tendão que enfraquece as aderências aos tecidos adjacentes
(RAISER, 1995).
Em oito semanas, a resistência do tendão está aumentada e os
fibroblastos tornam-se tenócitos inativos com mínima capacidade para dividir-se
15
ou sintetizar proteína fibrosa em quantidade suficiente para desenvolver uma forte
união entre os segmentos rompidos. O fator mais importante para recuperar a
função deslizante não é a prevenção de aderências aos tecidos adjacentes, mas
a redução no teor de cicatriz. Essa redução depende de um mínimo traumatismo
evitando-se a formação de hematoma e abscesso. Deve-se proporcionar repouso
para permitir ótima cicatrização já que a ruptura de aderências, à medida que se
formam, aumenta a inflamação e a posterior formação de cicatriz. Um tendão
cicatrizado com uma função deslizante satisfatória é caracterizado não pela
ausência de aderências, mas pela presença de aderências que tenham sido fonte
de fibroblastos e vasos sanguíneos e que agora, tenham um tamanho que permita
o deslizamento adequado do tendão (JOHNSTON, 1985).
Conforme a cicatriz amadurece, a organização das fibras colágenas
dentro do tendão altera-se. Alterações na arquitetura da cicatriz são notáveis em
situações em que o tendão precisa restabelecer a função deslizante. O colágeno
na cicatriz entre as extremidades suturadas torna-se orientado em feixes
paralelos que lembram um tendão normal. Em contraste, fibrilas colágenas
adjacentes às superfícies deslizantes aumentam, mas mantêm sua orientação
livre, criando uma configuração de tecido frouxo. Os vasos sanguíneos na cicatriz
peritendínea tornam-se espiralados e tortuosos, permitindo movimento sem perda
da integridade. Assim, após vários meses, o tecido colágeno livremente orientado
é reorganizado em estruturas que lembram a condição pré-injúria (MADDEN,
1970).
A resistência das fibras tendíneas é igual a 56% na sexta semana após
intervenção e aumenta 79% após um ano. Por isso é possível permitir um
exercício limitado a partir da sexta semana, mas deve-se considerar ao menos um
ano para autorizar o exercício completo (AUTEFAGE, 1999). Após o colágeno
depositar-se na ferida, o ganho de resistência continua a aumentar devido ao
entrelaçamento e reorientação das fibras colágenas já formadas. Este aumento
ocorre por dois anos ou mais e há um ganho quase imperceptível na resistência.
As fibras colágenas adjacentes são submetidas à menor tensão linear que
aquelas no tendão e parecem desaparecer ou ser substituídas por fibras mais
finas e menores (JOHNSTON, 1985).
A cicatrização do tendão pode ser afetada por certos fatores
16
mecânicos. Um dos mais importantes é a quantidade de tecidos moles que são
traumatizados. Grandes quantidades de tecidos lesionados correlacionam-se com
a cicatrização predominantemente extrínseca. Portanto, técnica cirúrgica
deficiente e injúrias com alta energia podem aumentar a formação de aderências,
assim como bandagens aplicadas inadequadamente comprometem a drenagem
venosa e o fluxo linfático, causando edema e claudicação após o procedimento
cirúrgico (WANG, 1998).
A cicatrização requer imobilização do tendão por três semanas após a
cirurgia, para que receba suprimento vascular e o processo cicatricial tome lugar e
forme-se mínima cicatriz ao redor do tendão. O movimento restrito após três
semanas remodela o tecido peritendíneo. É importante não romper as aderências,
mas remodelar a cicatriz. Conforme permitido o movimento ativo, o ganho de
resistência na quinta semana será três vezes maior que na terceira (JOHNSTON,
1985). Todos os tratamentos cirúrgicos para rupturas do tendão calcâneo em
cães têm em comum a imobilização temporária da articulação társica em parcial
extensão para diminuir a tensão e promover uma revascularização precoce
(CLARK, 1993).
Uma das grandes dificuldades encontradas para o reparo de tendões
tem sido em situações em que há perda de substância com consequente não
união das extremidades tendíneas. Tal situação tem despertado o interesse de
vários autores no sentido de encontrar um material que seja adequado à
cicatrização do tendão lesado, com resistência suficiente, sem alterar seu
comprimento e manter sua capacidade de deslizamento. Enxertos biológicos, bem
como próteses sintéticas tem sido empregados nas rupturas tendíneas severas,
porém se faz necessário compreender o mecanismo reparativo desse material
(RAISER et al., 2001).
Diversas pesquisas têm sido desenvolvidas no intuito de encontrar um
material adequado para reparação de tendões extensamente lesionados.
Técnicas corretivas são realizadas com a utilização de membranas biológicas
devido à sua fácil obtenção, conservação e custo reduzido. Tendões de cães
(RAISER et al., 2001) e peritônio de bovinos (COSTA NETO et al., 1999)
conservados em glicerina a 98%, são utilizados principalmente na reparação do
tendão calcanear comum de algumas espécies domésticas. Em equinos pode-se
17
fazer transposição tendínea embora limitadamente, pois em grandes rupturas não
há como colher segmentos de tendão sem comprometer a funcionalidade dos
sítios doadores (VAUGHAN, 1979).
O uso de enxertos biológicos é benéfico na reconstituição de
ligamentos ou tendões. Os enxertos tendíneos autólogos são os preferidos, pois
não promovem reação antigênica. Já os enxertos homólogos não devem ser
antigênico ou carcinogênico, ser facilmente incorporado ao leito receptor,
estimular as propriedades mecânicas do segmento original e ser facilmente
armazenado e implantável. Embora haja pouca dúvida de que o colágeno solúvel
possa ser específico para espécie e possua caráter antigênico, a maioria dos
dados prova que o colágeno maduro é insolúvel e não antigênico (VÁMHIDY et
al., 1990). Além disso, a sobrevivência do enxerto dependerá de sua adequada
nutrição pelos tecidos adjacentes, já que os tendões são avasculares e seu
suprimento sanguíneo é oriundo do paratendão, da junção músculo-tendínea e
ósteo-tendínea (PAYNE & TOMLINSOM, 1993).
Quando se pretende utilizar os implantes biológicos em extensas
injúrias tendíneas é necessário que após a colheita dessas estruturas haja um
processo de redução da antigenicidade por meio de sua preservação em meios
químicos ou físicos. A preservação de enxertos pode ser feita em etanol,
mertiolate (CORDREY et al., 1963), glicerina (PIGOSSI, 1967), por congelamento,
soluções mercuriais, betapropriolactona, glutaraldeído (VÁMHIDY et al., 1990),
além da criopreservação a seco que permite fácil armazenamento por um período
indeterminado. A principal desvantagem dessa técnica é o alto custo para sua
realização (VÁMHIDY et al., 1990).
Segundo MAGNAGHI et al. (1994), a integração de enxertos tendíneos
homólogos liofilizados em coelhos se dá por meio da neoformação vascular,
invasão de células mesenquimais e organização de fibras colágenas. A utilização
de tecidos liofilizados proporciona bons resultados, assim como os biomateriais
que apresentam propriedades de biocompatibilidade o que diminui a capacidade
antigênica do material e permitiu sua preservação à temperatura ambiente.
Os biomateriais interagem com o sistema biológico e são utilizados na
área médica ou biomédica. São alternativas efetivas para a substituição de
tecidos, pois não apresentam riscos de transmissão de doenças ou rejeição
18
imunológica, além de apresentarem disponibilidade ilimitada (HALL et al., 1999).
Pesquisadores têm mostrado interesse nesses novos materiais capazes de serem
associados a outras substâncias que favoreçam a reparação e ou regeneração
(PARK et al., 2003).
Segundo VACANTI et al. (1995), a engenharia de tecidos é uma
estratégia interdisciplinar que emprega os princípios das ciências biológicas e de
materiais. É aplicada na geração de substitutos biológicos para criar, preservar ou
restaurar funções orgânicas. Embora outros pesquisadores possam ter definições
diferentes, há o consenso de que a engenharia tecidual depende de três
componentes básicos: a presença de células com capacidade de gerar novos
tecidos (células-tronco), moléculas indutoras (fatores de crescimento) para
orientar a atividade celular e um carreador adequado (biomateriais) para servir
como substrato para adesão, proliferação e diferenciação celular.
Assim, os biomateriais são empregados na engenharia tecidual em
associação ou não com as células. Quando implantados devem direcionar e
sustentar os processos regenerativos e serem capazes de substituir tecidos ou
órgãos que perderam a sua estrutura e/ou função. Os materiais utilizados devem
garantir uma estrutura funcional como: integração do implante no organismo
receptor, sua interação com as células do leito tecidual e a sua substituição
progressiva pelo tecido endógeno neoformado (VACANTI et al., 1995).
Dentre os biomateriais associados à terapia celular empregados na
Medicina Veterinária encontram-se os scaffolds. Utilizados na engenharia
tecidual, possuem propriedades biodegradáveis, são porosos e tridimensionais.
Quando embebidos em células específicas e/ou fatores de indução iniciam o
processo de reparação, sendo substituídos gradualmente. Apresentam uma alta
superfície área-volume e mimetizam a nanoestrutura da matriz extracelular do
tecido natural, facilitando a invasão de células com proliferação e deposição de
matriz. Além disso, sua característica hidrofílica facilita a invasão celular com
deposição de MEC e formação tecidual (MA & CHOI, 2001).
Apesar dos avanços nas terapias envolvendo autoenxertos e aloenxertos,
permanecem significantes limitações no manuseio dessas condições. Enxertos
biológicos apresentam limitações quanto à escassez de doador, possíveis
complicações no sítio doador, rejeição tecidual e transmissão de doenças,
19
enquanto os dispositivos protéticos apresentam complicações como a baixa
durabilidade e o pobre desempenho com o tempo (SOMMERICH et al., 1993). A
engenharia tecidual assegura promessas no tratamento dessas condições pela
substituição do tecido lesionado por tecidos com características mecânicas e
funcionais similares (LANGER & VACANTI, 1993).
Outra modalidade de tratamento em lacerações tendíneas parciais é o
transplante autólogo de células-tronco intralesional. Nesse tipo de terapia
empregam-se as células-tronco mesenquimais da medula óssea, promovendo
sua diferenciação em linhagens de células específicas capazes de substituir
órgãos e tecidos lesionados. Apesar de estar ainda em fase experimental, essa
terapia apresenta resultados encorajadores e promissores (SMITH & WEBBON,
2005).
3 TERAPIA CELULAR
O avanço tecnológico da ciência tem proporcionado benefícios
consideráveis para a humanidade por meio da introdução de novas terapias,
aumentando a expectativa de vida e promovendo melhorias na saúde das
pessoas de todo o mundo (SOUZA et al., 2003). Neste contexto, a terapia celular
é definida por ZAGO (2006b) como um conjunto de métodos e abordagens
tecnológicas fundamentadas no conhecimento de várias ciências, que visam a
utilização de células para o tratamento de inúmeras doenças sem tratamento
específico ou efetivo (KASSEM et al., 2004).
Essas novas técnicas são aplicadas a fim de retardar ou curar muitos
tipos de câncer, doenças neurológicas, lesões medulares, diabetes e cardiopatias.
Deste modo, a medicina regenerativa desponta como uma ferramenta terapêutica
no tratamento de várias doenças crônico-degenerativas, lançando mão de células,
como as células-tronco mesenquimais da medula óssea, plaquetas, fatores de
crescimento, biomateriais e enxertos biológicos que permitem ao próprio
organismo reparar tecidos lesionados (SANTOS et al., 2004; NIH, 2009).
Por meio de uma abordagem terapêutica, a terapia celular visa a
recuperação e ou regeneração de tecidos mediante o uso de diferentes tipos
20
celulares ou grupos de células. Suas formas clássicas incluem o transplante de
medula óssea e a transfusão de sangue. Entretanto, a utilização das células
diferenciadas e indiferenciadas associadas à engenharia de tecidos cresce como
nova forma dessa terapia (ZAGO, 2006a).
A tendência de se pesquisar células-tronco vem, sobretudo, da
esperança de que o uso destas células revolucionem as formas de tratamentos de
enfermidades que cursam com morte celular (COLOMÉ, 2007). Além disso, o seu
uso associado aos biomateriais desponta como uma ferramenta terapêutica, no
intuito de ampliar e acelerar os efeitos dos fatores de crescimento (BARBOSA et
al., 2008). Alguns ensaios científicos acentuaram a necessidade de mais estudos
no campo experimental, estimulando inúmeras pesquisas e ocupando o foco da
imprensa mundial (ZAGO & COVAS, 2006).
3.1 Células da medula óssea
A medula óssea (MO) apresenta dois sistemas-tronco distintos, o
hematopoiético e o não-hematopoiético que produzem tipos celulares com
funções específicas, dentre esses as células hematopoiéticas, as mesenquimais e
células progenitoras endoteliais (SHORT et al., 2003). As células-tronco
hematopoiéticas (CTHs) originam células sanguíneas e as do sistema imune,
sendo utilizadas para restaurar componentes do sangue e do sistema
imunológico. As mesenquimais são primordialmente indiferenciadas,
caracterizadas pela auto-renovação e potencial de diferenciarem-se em vários
tecidos. Quando estimuladas adequadamente originam músculos, ossos,
cartilagens e células de gordura (CAMPAGNOLLI et al., 2001). As células
progenitoras se diferenciam em células endoteliais, que integram os vasos
sanguíneos e capilares. A capacidade proliferativa, combinada com suas
habilidades especializadas, as tornam únicas (KIRSCHSTEIN, 2001).
As células-tronco mesenquimais são utilizadas na reparação e
regeneração celular. Isso se deve ao seu potencial de diferenciação em vários
tipos de células em resposta à transdução de sinais mediados por citocinas
(FRIEDENSTEIN et al., 2002). São facilmente colhidas e, como são provenientes
21
da medula óssea do próprio paciente, elimina-se a possibilidade de rejeição. Além
disso, a colheita do material autólogo não provoca controvérsias no que diz
respeito aos aspectos éticos e legais (WANG et al., 2004).
No ser humano, a medula óssea é a principal fonte das células
mesenquimais, porém estas são isoladas de outros órgãos e tecidos, como
músculo esquelético (YOUNG et al., 2001), tecido adiposo (ZUK et al., 2001),
membrana sinovial (DE BARI et al., 2001), endotélio e subendotélio da veia
umbilical (COVAS et al., 2003), rim (ALMEIDA-PORADA et al., 2002), sangue do
cordão umbilical (YU et al., 2004) e cartilagem articular (ALSALAMEH et al.,
2004). Segundo RASKIN (1998), a medula óssea de cães e gatos pode ser obtida
na epífise dos ossos longos e nas regiões do ílio, como crista ilíaca ou borda
acetabular (Figura 4). Além disso, sugere-se a colheita na crista ilíaca de cães,
pela facilidade de localização. Contudo, em cães de pequeno porte ou gatos, as
amostras medulares são obtidas na porção proximal do fêmur (Figura 5).
FIGURA 4 – Demonstração dos locais para obtenção de medula óssea. Imagens radiográficas e de peças anatômicas referentes à região pélvica de cães. (A) imagem radiográfica na posição ventro-dorsal da região pélvica de um cão com a agulha introduzida no corpo do ílio; (B) e (C) demonstração em peça anatômica dos locais de introdução da agulha no corpo do ílio. Fonte: MÜLLER et al. (2009).
22
FIGURA 5 - Demonstração da punção medular através da fossa trocantérica do
fêmur de cão com agulhas Steiss. Imagens radiográficas e de peças anatômicas referentes ao osso fêmur de cão. (A) imagem radiográfica na posição ventro-dorsal; (B) e (C) detalhes do local da introdução da agulha apoiada contra a face medial do trocânter maior do fêmur. Fonte: MÜLLER et al. (2009).
Para cães obesos ou musculosos, a porção crânio-lateral da tuberosidade
maior do úmero (Figura 6) é uma ótima opção para colheita de material
(ZAMPROGNO, 2007). No entanto, MÜLLER et al. (2009) sugeriram a epífise
proximal da tíbia (Figura 7) como uma região para a obtenção de grande
quantidade de medula óssea, assim como a porção proximal do fêmur.
FIGURA 6 - Demonstração da punção medular através do tubérculo maior do
úmero com agulha de Steiss em cão. Imagens radiográficas e de peças anatômicas referentes ao osso úmero. (A) imagem radiográfica ventrodorsal do úmero de cão com a agulha introduzida no tubérculo maior do úmero. (B) e (C) detalhes do posicionamento da agulha em peça anatômica. Fonte: MÜLLER et al. (2009).
23
FIGURA 7 - Demonstração da punção medular na região epifisária proximal da tíbia com agulha de Steiss em cão. Imagens radiográficas e de peças anatômicas referentes a tíbia. (A) imagem radiográfica látero-lateral e (B) crâniocaudal da agulha introduzida na região epifisária proximal da tíbia; (C) detalhe do local demonstrado em peça anatômica. Fonte: MÜLLER et al. (2009).
Apesar do número limitado dessas células na medula óssea, a sua
proliferação e a expansão dessas células sob condições adequadas podem ser
obtidas in vitro (KRAUS & KIRKEY-HEAD, 2006). A caracterização morfológica e
funcional das células estromais foi estabelecida em roedores e humanos.
Entretanto, em outras espécies são necessárias novas pesquisas para estimular a
terapia celular na Medicina Veterinária (MARTIN et al., 2002).
3.2 Conceitos, fisiologia e classificação das células-tronco
A terminologia “célula-tronco” tem essa denominação por ser um tronco
comum do qual se originam outras células. Essa versatilidade as torna a grande
promessa para o tratamento de doenças degenerativas graves (MAYHALL et al.,
2004).
A presença de células precursoras não-hematopoiéticas na medula
óssea foi sugerida por Julius Cohnheim em 1867 (citado por PROCKOP, 1997;
FEHRER & LEPPERDINGER, 2006). Estas células foram identificadas a partir de
células mononucleares da medula óssea de camundongos, denominadas células
formadoras de colônias fibroblásticas (FRIEDENSTEIN et al., 1966). As células-
24
tronco mesenquimais correspondem a 0,001% a 0,01% de todas as células
nucleadas medulares. São isoladas a partir de aspirados de medula óssea,
separando-se a fração mononuclear por gradiente de densidade. Expressam um
amplo espectro de citocinas, receptores de citocinas e fatores de crescimento.
Também produzem moléculas de matriz extracelular, incluindo fibronectina,
laminina, colágenos e proteoglicanos (COVAS, 2006).
As células-tronco são definidas com base no potencial de auto-
renovação, na capacidade de diferenciação em múltiplas linhagens celulares e na
habilidade de reconstituir funcionalmente, in vivo, um tecido lesado. Inicialmente
essas características foram demonstradas nas células-tronco hematopoiéticas e
nas células-tronco embrionárias. Com o avanço da ciência, outras células foram
isoladas e conceituadas como células-tronco, denominadas de células-tronco
mesenquimais (VERFAILLIE, 2002). As células-tronco hematopoiéticas foram as
primeiras a serem descritas, melhor compreendidas e as mais aplicadas em
protocolos clínicos (NARDI & AFONSO, 2006). As células-tronco não-
hematopoiéticas apresentam ampla capacidade de diferenciação, bem como de
originar e regenerar diversos tecidos (POUNTOS & GIANNOUDIS, 2005).
As células-tronco são caracterizadas por serem indiferenciadas e não
apresentarem função específica nos tecidos. São capazes de se proliferarem,
mantendo-se indiferenciadas por longos períodos de tempo, tanto in vitro, quanto
in vivo. Esta última propriedade, denominada de auto-regeneração, permite que o
compartilhamento de células seja mantido constante ao longo do tempo (NARDI &
ALFONSO, 2006). Conforme a Figura 8, quando uma célula-tronco se divide, uma
das células filhas fica para substituir a progenitora, enquanto que outra se divide e
diferencia em células maduras, com o aspecto do tecido específico (SANTOS et
al., 2004).
25
FIGURA 8 - Representação esquemática da propriedade das células-tronco de se dividirem e permanecem indiferenciadas ou se diferenciam e amadurecem Fonte: ZAGO (2006a).
O processo de auto-renovação é importante, uma vez que, se todas as
células filhas se tornassem células progenitoras, a população diminuiria
progressivamente a partir de cada evento de ativação. Isso resultaria em uma
depleção rápida de células de todos os tecidos normais, resultando em um
número insuficiente para suportar os processos de remodelação e reparação do
organismo (LIN, 1998).
As células-tronco e as progenitoras estão presentes na maioria dos
tecidos e são fundamentais para a saúde, manutenção e resposta a lesões ou
doenças durante a vida. São as fontes de tecidos formados pelos sistemas de
reparo e remodelação (BIANCO et al., 2001). Dentre essas, são conhecidas as da
pele, mucosa intestinal, epitélio olfativo, cérebro, fígado, gordura, córnea, pulmões
e músculos esqueléticos e cardíacos. Denominadas de células-tronco somáticas,
podem dar origem a um único ou alguns tipos de células diferenciadas, como
unipotentes, oligopotentes ou multipotentes (ZAGO, 2006b). Além disso, são
moduladas por sinais químicos e físicos que controlam sua ativação, proliferação,
migração, diferenciação e sobrevida (BIANCO et al., 2001).
26
De acordo com o grau de diferenciação que as células-tronco podem
se submeter, são classificadas em diferentes categorias. As totipotentes ou
embrionárias que são capazes de diferenciar em todos os tecidos do corpo
humano, inclusive a placenta e anexos embrionários. As células-tronco
pluripotentes que conseguem se diferenciar em quase todos os tipos de tecidos
de um indivíduo adulto, com exceção da placenta e anexos embrionários. Além
disso, existem as multipotentes que são isoladas de vários órgãos adultos auto-
renováveis e diferenciadas em múltiplos tipos celulares específicos. As células
adultas com capacidade restrita de se diferenciar em poucos tipos celulares e
normalmente da mesma linhagem são chamadas de oligopotentes. Além disso, as
com limitado poder de renovação e diferenciação em apenas um único e definido
tipo celular são denominadas de unipotentes (DEL CARLO, 2005; ZAGO, 2006a).
Existem evidências de que células-tronco da medula óssea circulam no
sangue periférico e se dirigem para tecidos lesados, tanto no contexto de doenças
hematológicas (XU et al., 2005), quanto não-hematológicas (ABE et al., 2004).
Consequentemente voltam para a medula óssea em um processo fisiológico
regulado por uma complexa interação de citocinas (PETIT et al., 2005).
Observações recentes de quimerismo cardíaco após transplante de medula
podem ser explicadas por esse fenômeno fisiológico (DEB et al., 2003).
Sugere-se que as células-tronco somáticas de um tecido possam
atravessar as barreiras das linhagens celulares e adotar um perfil de expressão
gênica, função e fenótipo de células de outros tecidos (HERZOG et al., 2003).
Isso ocorre por um mecanismo conhecido como plasticidade, mas que ainda não
foi bem esclarecido (VERFAILLIE, 2005).
Há pelo menos quatro explicações para essa plasticidade. A
transdeterminação das células-tronco programadas para gerar linhagens de
células; a transdiferenciação, processo pelo qual a célula se diferencia e ganha
fenótipo de outra diferenciada (Figura 9) e a dediferenciação, quando as células
progenitoras ou precursoras se diferenciam em outras células adultas e, por fim, o
processo de fusão em adulta (WATT, 2003).
27
FIGURA 9 - Representação de diferentes possibilidades de transdiferenciação das células-tronco adultas (CTA), demonstrando haver grande plasticidade celular. Célula-tronco do sistema nervoso central (CT-SNC). Célula-tronco mesenquimal (CTM). Medula óssea (MO) Fonte: Adaptado de NIH (2001).
Enquanto se observa relativa facilidade de avaliar o potencial de
diferenciação celular in vitro, o mesmo não acontece in vivo, pois o significado
fisiológico e a correspondência destes processos são questionáveis (NARDI &
ALFONSO, 2006). Diante do exposto, a resposta final depende da avaliação do
quanto um determinado tipo de célula, após administração in vivo, pode originar
células de diferentes tecidos. Geralmente se tem utilizado a sua administração
com marcadores específicos a fim de determinar a identidade celular por análise
morfológica, imunofenotípica e/ou funcional (COLOMÉ, 2007).
3.3 Isolamento celular: gradiente de densidade
Em testes de histocompatibilidade, imunoensaios celulares in vitro,
protocolos de cultivo celular e outros procedimentos em geral, têm sido utilizados
28
diversos gradientes de densidade de alto peso molecular, os quais apresentam a
função de isolar linfócitos e células mononucleares do sangue periférico e da
medula óssea (ISLAM, 1994). São constituídos por uma mistura de
polissacarídeos neutros hidrofílicos de alta densidade que se dissolve
prontamente em solução aquosa. BOYÜM (1968) foi o primeiro pesquisador a
descrever a técnica de isolamento de células mononucleares utilizando o ficoll
como gradiente de densidade. Nesse estudo, o autor demonstrou que a baixa
viscosidade do gradiente, comparado com outros agentes de agregação de
eritrócitos, foi eficaz no isolamento in vitro de linfócitos do sangue periférico
humano a partir de centrifugações rápidas e de baixa velocidade.
O gradiente de densidade ficoll tem merecido destaque, por ser de fácil
aplicabilidade, rápido e favorecer a concentração de células mononucleares da
medula óssea, atingindo altos níveis de rendimento celular (SOUZA, 2009). O
Ficoll-Paque® 400 é uma solução aquosa com densidade de 1,077 ± 0,001 g/mL
contendo 5,7g de Ficoll, 9g de diatrizoato de sódio e 0,0231g de ácido
etilenodiaminotetracético para cada 100mL. Essa composição é responsável pela
formação de uma solução de baixa viscosidade e alta densidade (AMERSHAM
BIOSCIENCES, 2002).
O princípio da técnica de separação baseia-se na densidade do
gradiente em relação aos linfócitos, monócitos e plaquetas, os quais não
conseguem penetrar pelo gradiente (Figura 10A). Esses se depositam na
interface entre o ficoll e o plasma, formando o chamado “anel celular” (Figura
10B). A migração celular durante o processo de centrifugação com o ficoll resulta
na formação de camadas contendo diferentes tipos celulares. A fração celular
constituída de eritrócitos e granulócitos atravessa o gradiente e se sedimenta no
fundo dos tubos, podendo ocorrer o aprisionamento de alguns linfócitos durante a
agregação eritrocitária da medula óssea a fresco. Contudo, esse processo pode
ser evitado diluindo-se inicialmente o sangue, aumentando o rendimento celular e
reduzindo a agregação das células vermelhas (AMERSHAM BIOSCIENCES,
2002).
29
FIGURA 10 – Técnica de separação das células mononucleares da
medula óssea por gradiente de Ficoll-paque®. (A) seta vermelha indica a solução composta por 2,0mL de medula óssea íntegra e 2,0mL da solução salina tamponada. Seta preta aponta o volume de 2,0mL de solução Ficoll-paque®. (B) o mesmo tubo após centrifugação á 495G durante 30 minutos a 15ºC. (1) plasma e sedimentos, (2) Ficoll-paque® e (3) células vermelhas. A seta azul exibe a nuvem de células mononucleares da medula óssea. Fonte: SOUZA (2009).
As principais soluções para a diluição da medula óssea ou do sangue
periférico são a solução salina tamponada (PBS) (OLIVEIRA, 2009) e meios de
cultivo modificados (CURY, 2005), podendo estes últimos serem suplementados
com soro fetal bovino (SFB) a 10% (BITTENCOURT et al., 2006). A amostra
diluída é, em seguida, depositada lentamente sobre o gradiente de densidade de
separação de células (CURY, 2005). Um fator a ser considerado é a temperatura
de centrifugação, pois a agregação eritrocitária é favorecida em altas
temperaturas (37ºC), enquanto que em baixas (4ºC), a taxa de agregação é
30
reduzida, porém, o tempo de separação é aumentado, o qual também reduz o
rendimento celular. Uma temperatura entre 18-20ºC fornece bons resultados no
processo de isolamento (AMERSHAM BIOSCIENCES, 2002).
Após o processo de centrifugação, o plasma sobrenadante é
desprezado utilizando-se uma micropipeta e o anel celular transferido para outro
tubo. Lavagens subsequentes são recomendadas com soluções salinas
balanceadas, com a finalidade de remover o remanescente de plasma, plaquetas
e a solução de ficoll. O rendimento e a diminuição da pureza dos linfócitos
dependem consideravelmente da eficácia na remoção das células vermelhas.
Diversos produtos comerciais estão disponíveis, como a solução de lise FACS
(NAKAGE et al., 2009) e/ou preparadas em laboratório, como o cloreto de amônio
0,16 M em solução de Tris 0,17 M, pH 7,6, recomendando-se diluir 1mL ao “botão
celular” isolado e manter em repouso durante cinco minutos. O tampão de lise,
segundo estudos, favorece a contagem das células na câmara hemocitométrica
de Neubauer, reduzindo as falhas na determinação do rendimento celular
(OLIVEIRA, 2009).
3.3.1 Determinação do rendimento e viabilidade celular
A determinação do rendimento e viabilidade celular precisam ser os
mais confiáveis possíveis, a fim de refletirem o estado de integridade da
membrana, uma vez que o sucesso de um transplante celular depende dessa
integridade para que as células possam colonizar a área afetada em uma
determinada lesão, interagindo com as demais células do hospedeiro e
recuperando o tecido lesado (CURY, 2005).
Existem vários testes para a determinação da integridade celular como
a citometria de fluxo e o método de exclusão vital pelo azul de Tripan. Este último
refere-se a um corante que tem a capacidade de penetrar no interior da célula,
cuja membrana esteja rompida. Tal teste é amplamente empregado devido a sua
praticidade, porém possui o inconveniente de produzir artefatos na penetração do
corante, comprometendo a sua determinação (MASCOTTI et al., 2002). Há
protocolos alternativos ao azul de Tripan, como aqueles baseados na citometria
de fluxo, os quais utilizam uma combinação de marcadores, como a Anexina, uma
31
proteína que possui afinidade pelos fosfolipídios expostos pela membrana celular,
e o corante 7-AAD, o qual penetra no interior da célula fornecendo informações
acerca da formação de poros da membrana celular (HÖPPNER et al., 2002).
3.4 Cultivo celular
O cultivo de tecidos se desenvolveu a partir dos últimos anos do século
XIX, como uma continuação das técnicas de embriologia, quando células do
embrião de aves eram mantidas em solução salina durante dias. Porém, o
zoólogo Ross Harrison é considerado o pioneiro no cultivo de tecidos animais já
que em 1907, empregou técnicas in vitro para o estudo de fenômenos in vivo,
realizando cultivos de medula espinhal embrionária de anfíbios. Pôde observar o
crescimento dos axônios dos neuroblastos e estabeleceu que o axônio se
formava por expansão, a partir do corpo neuronal e não pela fusão de uma cadeia
de células (REYNA, 2003).
Inicialmente, a primeira limitação para o estabelecimento de cultivos
era desenvolver um meio nutritivo adequado. Burrows, em 1910, utilizou plasma
de aves para nutrir explantes de tecidos embrionários e provou ser um método
eficaz, o qual lhe permitiu observar o crescimento de tecido nervoso, coração e
pele. Nesse mesmo ano, Burrows e Carrel realizaram os primeiros intentos de
estabelecer cultivos de células de mamíferos e conseguiram manter explantes
obtidos de cães, gatos e coelhos, assim como o crescimento de tumores sólidos.
Demonstraram que se pode prolongar a vida do cultivo mediante subculturas em
plasma suplementado com extratos de embrião. Em 1916, Rous e Jones
utilizaram, pela primeira vez, extratos enriquecidos em tripsina para dissociar
células embrionárias, estabelecendo o primeiro cultivo celular. Um dos maiores
problemas constatados no cultivo foi o aparecimento de múltiplas contaminações
e se desenvolveram numerosos métodos de manipulação em condições
assépticas, que ainda são utilizadas até hoje (FRESHNEY, 2005).
Em 1913, Carrel demonstrou a possibilidade de manter em cultivo
células extraídas de embrião de aves por um período de tempo superior à vida
deste. Manteve em cultivo células de aves durante 34 anos, o que só foi possível
32
pela utilização do frasco de Carrel (SONDAHL & SHARP, 1977). Entre os anos de
1920 e 1940, foram desenvolvidas diferentes estratégias de obtenção de cultivo e
a manutenção das condições estéreis, mas sem grandes avanços. A partir dos
anos 40, com o surgimento dos primeiros antibióticos, se desenvolveram
numerosas aplicações (REYNA, 2003).
3.4.1 Tipos de Culturas Celulares
A) Explante primário versus desagregação
Quando as células são isoladas do tecido do doador podem ser
mantidas sob diversas formas. Um pequeno fragmento de tecido que se adere à
superfície de crescimento, seja espontâneo ou por auxílio mecânico, como os
coágulos ou uma matriz extracelular constituinte (colágenos), geralmente dão
suporte ao crescimento celular. Esse tipo de cultura é conhecido como um
explante primário e as células que migram do tecido são células em crescimento.
Essas são selecionadas, no primeiro instante, pela sua habilidade em migrar do
explante e subsequentemente, subcultivadas pela habilidade de proliferação
(FRESHNEY, 2005). Quando uma amostra de tecido é desagregada, seja
mecânica ou enzimaticamente, forma-se uma suspensão de células e pequenos
agregados capazes de se ligarem a um substrato sólido, formando uma
monocamada (Figura 11).
33
FIGURA 11 – Representação das culturas explante e por desagregação
tecidual enzimática em frascos de poliestireno. À esquerda, cultura explante com migração e crescimento das células em sentido radia, visto no diagrama abaixo. À direita, na desagregação tecidual enzimática células em suspensão dispostas em uma monocamada. Fonte: FRESHNEY (2005).
As células da monocamada com capacidade de se proliferar são então
selecionadas da primeira subcultura e, como as do explante primário,
possivelmente originam uma linhagem celular. A desagregação tecidual é capaz
de produzir culturas com mais rapidez que a cultura explante, porém esta última
pode ser preferida quando são obtidos pequenos fragmentos de tecidos ou
quando a fragilidade das células impede sua sobrevivência após a desagregação
(FRESHNEY, 2006).
A vantagem dessas culturas é que, quando são recentemente
removidas da sua situação in vitro, espera-se que as suas características
funcionais se assemelhem às das células in vivo. Como desvantagens, são
citadas as reações das culturas às mudanças do ambiente e as alterações na
composição da cultura ocasionadas por células de culturas mistas que morrem e
outras que proliferam e/ou diferenciam (MATHER & ROBERTS, 1998).
Na desagregação, o tecido passa pelos estágios de lavagem,
dissecação, e ainda desagregação mecânica ou digestão enzimática em tripsina
34
e/ou colagenase. Este geralmente é requerido não para se ter uma suspensão
celular simples, pois muitas células primárias sobrevivem melhor em pequenos
agregados (FRESHNEY, 2006). A desagregação tecidual contém uma variedade
de diferentes tipos celulares, sendo necessária a utilização de técnicas de
isolamento como por gradiente de densidade de separação (PRETLOW &
PRETLOW, 1989), ou imunotipagem em vidrarias magnetizadas, utilizando
frascos com magneto positivo para se selecionar as células de interesse (CARR
et al., 1999) ou negativos para eliminar as células indesejadas (SAALBACH et al.,
1997). A população celular deve ser enriquecida, posteriormente, por meios de
cultivos adequados, os quais estão disponíveis comercialmente (FRESHNEY,
2006).
B) Subculturas
As subculturas podem ser requeridas periodicamente com a intenção
de promover nova fonte de nutrientes e espaço para o crescimento contínuo das
linhagens celulares. A frequência de subcultura, a proporção de semeadura e a
densidade de células plaqueadas dependem das características de cada
linhagem celular. Caso as células sejam rompidas com frequência, ou plaqueadas
a uma baixa densidade, essas podem não se desenvolver sob cultivo (MATHER &
ROBERTS, 1998).
Nas subculturas, deve-se realizar a remoção do meio de crescimento,
lavagem da placa, dissociação das células aderentes por enzimas proteolíticas e
diluição da suspensão celular em meio fresco, método este conhecido como
“passagem”. As trocas do meio devem ser feitas quando as células atingirem
aproximadamente 70% de confluência com o substrato (PEREIRA et al., 2008).
As passagens celulares para novos recipientes de cultura podem ser realizadas
inúmeras vezes com o objetivo de se obter um rendimento expressivo de células
(FRESHNEY, 2006).
Caso a subcultura seja feita em soro e a proporção de semeadura seja
alta, não se faz necessária a remoção da tripsina residual. Entretanto, em culturas
mantidas em meios livres de soro, deve-se neutralizar a enzima utilizando um
inibidor de protease, como o inibidor de tripsina soybean (MATHER & ROBERTS,
35
1998). Espera-se que, nos primeiros dias de subcultura, as CTMs da medula
apresentem um formato arredondado e refringência, e que, com o passar do
tempo, elas adquiram uma aparência fibroblástica (Figura 12) (BOURIN et al.,
2008).
FIGURA 12 – Células mesenquimais da medula óssea, subcultivadas em meio
modificado de Eagle suplementado com soro fetal bovino a 10%. (A) primeiros dias da subcultura, as células refringentes e com formato arredondado, o que corresponde à fase de divisão (seta branca). (B) células com formato alongado semelhante a fibroblastos. Fonte: BOURIN et al. (2008).
3.4.2 Ambiente de cultivo
Para o cultivo celular são utilizados meios artificiais preparados
mediante a mescla de componentes purificados ou de soluções orgânicas
completas, instrumentos que mantêm as condições físico-químicas adequadas e
recipientes que isolam as células do meio externo. Por esse fato, considera-se
que o ambiente de cultivo seja formado por quatro elementos: a natureza do
substrato onde as células crescem; a natureza e composição da fase gasosa; as
condições físico-químicas e fisiológicas do meio e as condições de incubação,
como a temperatura e a umidade (REYNA, 2003).
36
3.4.3 Método de tripsinização
A maior parte das células que se mantém em cultivos de desagregação
tecidual precisa estar aderida ao substrato (frascos e placas de cultivo) para o seu
desenvolvimento e manutenção. Para se ressuspender essas células, deve-se
realizar a desagregação mecânica ou digestão enzimática, empregando o método
de tripsinização (FRESHNEY, 2006). REYNA (2003) descreveu que para a
maioria das linhagens celulares, após as trocas do meio de cultivo, deve-se
utilizar tripsina 0,01 a 0,5% diluída em solução salina tamponada (PBS), e
mantida em estufa a 37ºC durante cinco a 15 minutos.
3.5 Aplicabilidade e potencial terapêutico das células-tronco
A maioria das pesquisas com células-tronco focaliza aspectos básicos
da fisiologia celular e sua capacidade de diferenciação em tecidos diversos,
sendo que uma parcela menor enfoca a aplicação clínica dessas células em
modelos experimentais. Alguns dos alvos terapêuticos mais investigados são
órgãos considerados por muito tempo como incapazes de desenvolver qualquer
processo de regeneração, como o cérebro e o coração. Apesar de todo potencial
terapêutico, poucas células isoladas parecem não ser suficientes para levar à
cura dependendo do dano tecidual que tenha ocorrido (SANTOS et al., 2004).
Segundo NHI (2009), houve um grande avanço nas terapias celulares
para as cardiopatias. Nos casos de infarto do miocárdio, a injeção de células-
tronco nas bordas da área lesionada pela isquemia induziu o reparo do miocárdio,
ocasionando melhora funcional, tanto em modelos animais como em humanos.
Isso comprova que as células-tronco obtidas do mesmo indivíduo são eficazes no
tratamento de insuficiência cardíaca de origem isquêmica e indicam o potencial de
utilização dessa terapia em outras cardiopatias. De maneira semelhante, esse
modelo poderia ser extrapolado para outras doenças como doença de Alzheimer,
mal de Parkinson, lesões na coluna espinhal, diabetes, queimaduras, osteoartrite
e artrite reumatóide (ZAGO & COVAS, 2004; GIORDANO et al., 2007; NIH, 2009).
A utilização de células-tronco mesenquimais para diferenciação em
37
células condrogênicas e osteogênicas para reparação cartilaginosa e óssea tem
sido aplicada experimentalmente em Medicina Veterinária, tendo ainda pouca
aplicação clínica, diferentemente de tendões e ligamentos, que já são tratados por
meio desta terapia há alguns anos (SUTTER, 2007). A reconstituição de tendões
e ligamentos de equinos e coelhos demonstraram a possibilidade de incremento
nas propriedades mecânicas dessas estruturas, sendo comprovada a
diferenciação dessas células em tenócitos com regeneração tecidual (OLSSON,
2009; SCHNABEL et al., 2009).
Em tecido ósseo, os principais alvos terapêuticos das células-tronco
são a osteoporose em humanos e as fraturas em animais. Essas são utilizadas
para reparar o osso com células novas e funcionais por meio da osteogênese
(BURWELL, 1985). Precursoras da linhagem osteogênica e encontradas na
medula, estão mais concentradas próximo à superfície endosteal com altos
índices osteogênicos (ASHTON et al., 1984). Em lesões articulares com perda ou
deformação de discos cartilaginosos, os estudos indicam melhora das
articulações pela infusão de condrócitos ou ainda pela reconstrução in vitro com a
utilização de arcabouços constituídos por biomateriais responsáveis pela adesão
celular (ZAMPROGNO, 2007; BYDLOWSKI et al., 2009).
Os mecanismos de reparo com a utilização das células-tronco ainda
são controversos e não totalmente definidos. No entanto, são amplamente
testadas em experimentos e mais pesquisas em relação à metodologia de
avaliação dos tecidos são necessárias tanto para garantir a segurança em utilizá-
las como para aperfeiçoar todo o seu potencial terapêutico. Todos esses estudos
preliminares têm o intuito de facilitar a aplicação clínica das células-tronco no
futuro. Assim, faz-se necessário a utilização de métodos para a avaliação dos
tecidos neoformados após a utilização das terapias celulares. Dentre os quais
estão os exames macroscópicos, histológicos e por imagem (NIH, 2009).
38
3.6 Métodos de avaliação de tendões
3.6.1 Macroscópico
O exame macroscópico avalia a eficácia da reparação tendínea após
um determinado tratamento, pela caracterização externa do tecido neoformado.
Segundo FERRARO et al. (2005), as principais alterações macroscópicas que
devem ser observadas em uma lesão tendínea são os crescimentos teciduais
adjacentes e na área da lesão a aproximação das extremidades nos casos de
rupturas e formação de aderências. O diâmetro e a retração tecidual decorrente
do processo de reparação também podem estar alterados (REES et al., 2006).
Nas tenopatias em geral, a aparência macroscópica é de um tecido
desorganizado com alterações na coloração e consistência dos tendões.
3.6.2 Histológico
O colágeno participa ativamente no restabelecimento da integridade
estrutural e força dos tendões, e pode ser avaliado histologicamente quanto a sua
quantidade e orientação. Os exames histológicos utilizam métodos de colorações
tradicionais para processar tecidos que são embebidos em parafina ou
congelados. Rotineiramente, nas colorações com hematoxilina e eosina (HE),
pode-se avaliar a orientação do colágeno e a densidade absoluta da matriz
extracelular. Corantes específicos de colágeno como “picrosirius red” são muito
utilizados não apenas na detecção da orientação e maturidade, mas também no
conteúdo de colágeno relativo. Outro método que pode ser utilizado na detecção
de colágeno é a extração bioquímica de colágeno e mensuração da hidroxiprolina
liberada, esta encontrada exclusivamente no colágeno (CARPENTER &
HANKENSON, 2004).
3.6.3 Microscopia eletrônica
A microscopia eletrônica é bastante difundida na avaliação de materiais
biológicos, pois permite a definição de imagens intracelulares, definição da
39
morfologia celular e aspectos gerais das organelas, fornecendo informações de
impossível visualização na microscopia ótica (GALLETI, 2003).
Os microscópios eletrônicos são classificados em dois tipos o de
transmissão (MET) e o de varredura (MEV). No MET, também chamado de
microscópio eletrônico direto, a formação das imagens se dá simultaneamente à
passagem do feixe de luz pela amostra, demonstrando alto poder de resolução.
Pode ser utilizado quando se deseja estudar os detalhes mais finos de uma
estrutura celular ou constituintes subcelulares, e dificilmente se obtém
informações sobre estruturas em três dimensões. O MEV, por outro lado, é ideal
no estudo da topografia superficial de materiais sólidos, porém, fornece pouca ou
nenhuma informação relacionada às estruturas internas. Seu poder de resolução
não se iguala ao do microscópio de transmissão, embora seja adequado para
muitos propósitos (BOZZOLA & RUSSELL, 1999). A definição de qual
equipamento deve ser utilizado depende do objetivo da pesquisa que está se
desenvolvendo, a fim de se atingir os resultados desejados (GALLETI, 2003).
3.6.4 Ultrassonografia
A ultrassonografia é uma técnica não invasiva de imagem que auxilia
no diagnóstico e prognóstico de lesões em tendões e ligamentos em associação a
outros exames físicos como a inspeção e palpação (ARISTIZÁBAL et al., 2005).
Esse meio diagnóstico tem sido utilizado com frequência em equinos com o
objetivo de identificar alterações ultrassonográficas da área transversal, textura e
ecogenicidade dos tendões e ligamentos. Esses parâmetros indicam adaptação
dos tendões ao exercício, permitindo controlar a carga de trabalho a que os
animais são submetidos para evitar a ocorrência de tendinites (GREIG et al.,
2005).
Para a devida interpretação dos achados ultrassonográficos é
fundamental um amplo conhecimento anatômico da região a ser avaliada
(MCDIARMID, 1995). A imagem ultrassonográfica de tendões sadios no corte
longitudinal apresenta os feixes de fibras como linhas longitudinais paralelas
ecogênicas e como pontos ecogênicos homogêneos uniformemente distribuídos
no corte transversal (MAAR et al., 1993).
40
3. 7 Objetivos
Os temas foram abordados em quatro capítulos, os quais representam
os objetivos principais do trabalho: capítulo 1: efetuar revisão bibliográfica
detalhada sobre os principais aspectos relacionados à anatomia, cicatrização
tendínea e métodos de avaliação do reparo tecidual. Assim como, discorrer sobre
a terapia celular e suas particularidades; capítulo 2: realizar a obtenção e
expansão in vitro das células-tronco mesenquimais obtidas da fração
mononuclear da medula óssea de coelhos após separação imunomagnética e
expansão em meio MesenCult®, para posterior aplicação in vivo; capítulo 3:
estabelecer um protocolo terapêutico empregando células-tronco mesenquimais
alógenas da medula óssea associadas à esponja de colágeno no reparo do
tendão do músculo gastrocnêmio de coelhos; capítulo 4: relatar as principais
perspectivas frente aos tratamentos propostos e os resultados encontrados.
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52
CAPÍTULO 2 - MÉTODO IMUNOMAGNÉTICO ASSOCIADO AO MEIO
MESENCULT® NA OBTENÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO
MESENQUIMAIS DA MEDULA ÓSSEA DE COELHOS
RESUMO
A capacidade das células-tronco se diferenciarem em outros tecidos é a base da
elaboração de estratégias terapêuticas promissoras. A expansão desses tipos
celulares in vitro de forma purificada torna viável sua aplicação in vivo em
doenças descritas como incuráveis. Objetivou-se com este estudo descrever um
protocolo de isolamento das células mononucleares da medula óssea de coelhos,
seguido de purificação por depleção negativa com o anticorpo monoclonal CD45
para separação das células-tronco mesenquimais e posterior cultivo em meio de
cultura MesenCult® expansão celular. No isolamento pelo gradiente de densidade
Ficoll-paque® foi obtido um rendimento médio de 7,31x106 células/mL. Após
purificação e obtenção das células-tronco mesenquimais pela base
imunomagnética, houve um decréscimo do rendimento para 2,28x106 células/mL,
mas o processo de expansão foi incrementado. Os resultados indicaram que as
células-tronco mesenquimais obtidas da fração mononuclear da medula óssea,
cultivadas in vitro foram capazes de gerar células aderentes 24 horas após o
cultivo, com predominância de células fibroblastóides. Concluiu-se que a
obtenção, de células-tronco mesenquimais pode ser alcançada após purificação
das células mononucleares da medula óssea de coelhos pelo método
imunomagético, o meio de cultura MesenCult® proporciona um ambiente
adequado para a rápida expansão in vitro e o número de passagens exerce
influência negativa sobre as características morfológicas das células.
Palavras-chave: células-tronco mesenquimais, fibroblastos, lagomorpha,
separação imunomagnética, viabilidade celular
53
CHAPTER 2 – IMMUNOMAGNETIC METHOD ASSOCIATED WITH
MESENCULT® MEDIUM TO OBTAIN BONE MARROW
MESENCHYMAL STEM CELL OF RABBITS
ABSTRACT
The ability of stem cells differentiation into other tissues is the elaboration of
promising therapeutic strategies basis. The in vitro expansion of these cells types
in a purified way makes possible its application in vivo in diseases described as
incurable. The aim of this study was to describe a protocol for isolation of
mononuclear cells from bone marrow of rabbits, followed by purification by
negative depletion with CD45 monoclonal antibody for separation of mesenchymal
stem cells and further cultivation in MesenCult® medium for cell expansion. In
isolation by density gradient Ficoll-Paque®, an average yield of 7.31 x 106 cells/mL
was obtained. After purification and acquisition of mesenchymal stem cells by
immunomagnetic base there was a decrease of the yield to 2.28 x 106 cells/mL,
but the expansion process was increased. The results indicated that the
mesenchymal stem cells obtained from the mononuclear fraction of bone marrow
cultured in vitro were able to generate adherent cells 24 hours after culture with a
predominance of fibroblastoid cells. It was concluded that the collection, isolation,
purification and rapid expansion of mesenchymal stem cells obtained from bone
marrow mononuclear fraction of rabbits can be achieved using the density gradient
Ficoll-Paque®, the negative depletion of hematopoietic cells in immunomagnetic
base and the culture in human medium MesenCult®. However, in vitro cultivation
may require adjustments with respect to the amount of antimicrobials.
Furthermore, the number of passages exerts a negative influence on the
morphology of the cells. It was concluded that obtaining mesenchymal stem cells
can be achieved after purification of the mononuclear cells from rabbits bone
marrow by immunomagnetic method, the MesenCult® medium provides a suitable
environment for the rapid in vitro expansion and the number of passages exerts
negative influence effect on the morphological characteristics of cells.
Keywords: mesenchymal stem cells, fibroblasts, lagomorphs, immunomagnetic
separation, cell viability
54
INTRODUÇÃO
As pesquisas científicas empregando células-tronco (CT)
fundamentam-se na expectativa destas unidades teciduais revolucionarem as
terapêuticas convencionais de enfermidades que cursam com morte celular
(RAFF, 2003). O termo células-tronco, do inglês stem cell, significa células
precursoras que possuem a capacidade de diferenciação e autorenovação
ilimitadas, podendo originar uma variedade de tecidos. Portanto, acredita-se que
estas células tenham papel regenerativo quando estes sofrem lesões ou injúrias
(BYDLOWSKI et al., 2009).
A medula óssea possui um pool de células-tronco mesenquimais
(CTMs), facilmente aspiradas de organismos adultos (BERTRAM et al., 2005).
Suas características regenerativas criaram expectativas de uso em terapias
celulares para regeneração de tecidos e órgãos acometidos por doenças tidas
como incuráveis. Para multiplicação in vitro, é necessário isolá-las e purificá-las,
sendo que ao se multiplicarem em cultura caracterizam-se por apresentarem
aderência ao plástico, ter aspecto de fibroblastos e se diferenciar em células
distintas (POUNTOS & GIANNOUDIS, 2005). Após o isolamento e expansão
podem se diferenciarem em osteoblastos (KASSEL et al., 1993), condrócitos
(JHONSTONE et al., 1998), músculo esquelético (SAMPAOLESI et al., 2005),
endotélio (ABE et al., 2004), cardiomiócitos (LEE et al., 2004), hepatócitos
(JUSTESEN et al., 2002), adipócitos (JIANG et al., 2002), tecido tendíneo (KWAN
et al., 2003) e outros tipos celulares não-mesodérmicos como os neurônios (DE
BARI et al., 2001).
Diferentes métodos de obtenção associados a protocolos de
isolamento e cultivo de células mesenquimais já foram empregados com sucesso,
mas todos envolvem uma etapa inicial de separação de células mononucleares
por meio de gradiente de densidade Ficoll-paque® (EURIDES et al., 2010; SOUZA
2009). Apesar dos resultados positivos observados, estudos relataram
dificuldades no isolamento, cultivo e manutenção dessas células in vitro (YU et al.,
2004), situação que ainda deixa vários questionamentos sobre o assunto, sem
respostas confiáveis. Assim, pesquisas envolvendo o isolamento, a expansão
55
celular e posterior aplicação in vivo podem ser uma alternativa eficaz para o
tratamento de doenças ou lesões críticas, crônicas e degenerativas.
Assim, objetivou-se com esse estudo realizar a obtenção e expansão in
vitro das células-tronco mesenquimais obtidas da fração mononuclear da medula
óssea de coelhos após separação imunomagnética e expansão em meio
MesenCult®, para posterior aplicação in vivo.
MATERIAL E MÉTODOS
Após aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade
Federal de Goiás (UFG), sob o protocolo n° 134/11 foram utilizados dez coelhos
machos, adultos da raça Nova Zelândia, com idade média de 1,0±0,2 anos e peso
médio 3,5±0,24kg, para padronização da metodologia de colheita, isolamento,
purificação e cultivo de células-tronco mesenquimais. O estudo foi desenvolvido
na Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia e no Laboratório de Genética
Molecular e Citogenética do Instituto de Ciências Biológicas, ambos da UFG.
Colheita da medula óssea e isolamento das células mononucleares
Precedendo a colheita da medula óssea (MO), as unidades
experimentais foram submetidas à medicação pré-anestésica composta por
2,0mg/kg de cloridrato de tramadol (Tramal®, Pfizer Ltda, São Paulo, SP) e
0,05mg/kg de acepromazina (Acepran® 1%, Vetnil, Ltda, Louveira, SP) por via
intramuscular. Posteriormente, a indução anestésica constou de uma associação
de 30,0mg/kg cetamina (Cetamin®, Syntec, Patrocínio Paulista, SP) e 5,0mg/kg
xilazina (Kensol®, Konig, Santana de Parnaíba, SP) pela mesma via. Na
sequência procedeu-se a tricotomia e antissepsia das regiões escápulo-umerais.
A colheita medular foi realizada por meio de uma agulha metálica de
Rosenthal (16 gauge) heparinizada, que foi inserida no tubérculo maior do úmero
e aspirados 8,0mL de medula óssea integra de cada animal com auxilio de uma
seringa de 10,0mL, contendo 0,3mL de solução estéril de heparina com
56
5000U/mL (Figura 1) (Liquemine®, Produtos Roche Químicos e Farmacêuticos
S/A, Rio de Janeiro, RJ).
FIGURA 1 – Punção da medula óssea de coelhos. (A) agulha metálica de Rosenthal 16 gauge introduzida no tubérculo maior do úmero. (B) seringa de 10,0mL contendo 0,3mL de heparina sódica acoplada a agulha de Rosenthal para colheita de 8,0mL do aspirado medular.
Em capela de fluxo laminar, os aspirados de cada animal foram
divididos em quatro amostras acondicionadas em tubos cônicos estéreis de
15,0mL. Cada amostra foi diluída em 2,0mL de solução salina tamponada
(DPBS®, Gibco Invitrogen, São Paulo, SP), acrescida de soro fetal bovino (SFB) a
10% e 10mM de EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) (Gibco®, Invitrogen,
São Paulo, SP). Em seguida, foram depositadas sobre 2,0mL de solução Ficoll-
paque® na densidade de 1,077g/mL (Amersham Biosciences, São Paulo, SP)
contida em outros tubos. As quatro soluções resultantes de cada animal foram
centrifugadas a 495 x g durante 30 minutos a 15ºC. As amostras foram separadas
em quatro porções distintas: plasma, nuvem celular, Ficoll-paque® e células
vermelhas.
Dando sequência ao procedimento, o sobrenadante composto pelo
plasma foi removido das quatro amostras referentes a cada animal e as nuvens
celulares formadas sobre a solução de Ficoll-paque® transferidas para um único
tubo estéril de 15,0mL com auxilio de uma pipeta Pasteur. Este foi centrifugado a
385 x g durante dez minutos a 4ºC por mais duas vezes com 10,0mL de DPBS e,
57
uma vez, com 10,0mL de meio de cultivo MesenCult® (MesenCult® MSC Basal
Medium Human, StemCell™, Vancouver, Canadá) suplementado com 10% de
SFB. Em seguida, o meio foi desprezado permanecendo aderido no fundo do tubo
apenas o volume do aglomerado celular.
Determinação do rendimento e da viabilidade das células mononucleares
O sedimento contendo células mononucleares da medula óssea
aderido no fundo dos tubos foram ressuspendidos em 2,0mL de meio MesenCult®
para determinação do rendimento e da viabilidade celular pela técnica de
exclusão vital por azul de Tripan (Sigma Aldrich®, St. Louis, EUA), conforme
descreveram BITTENCOURT et al. (2006). Deste volume, uma alíquota de 10µL
da suspensão foi adicionada a 10µL do corante azul de Tripan 0,4% em um
microtubo do tipo eppendorf para contagem das células em câmara
hemocitométrica de Neubauer. A contagem celular foi realizada sob microscopia
de luz a partir de uma alíquota de 10µL da solução resultante (células e corante) e
o cálculo do número de células por mililitro foi determinado pela seguinte fórmula:
V x FN x FT/#Q, onde V = número de células viáveis contadas; FN = fator da
câmara de Neubauer (104); FT = fator de diluição do azul de Tripan (2) e #Q =
número de quadrantes da câmara utilizados para a contagem, conforme realizado
por OLIVEIRA et al. (2011).
Obtenção das células-tronco mesenquimais em base imunomagnética
Após o isolamento das células mononucleares da medula óssea pelo
gradiente de densidade Ficoll-paque®, as células-tronco mesenquimais contidas
nessa fração foram obtidas a partir de um ensaio imunomagnético caracterizado
pela depleção negativa das células hematopoiéticas, utilizando o anticorpo
monoclonal CD45 de camundongo anti-coelho, complexo tetramérico e
nanopartículas magnéticas (EasySep, StemCell®, Vancouver, Canadá).
Inicialmente foi adicionado nas amostras de células mononucleares um
anticorpo monoclonal composto por imunoglobulina G (IgG1) de camundongo a
5%, permanecendo por cinco minutos. Na sequência, adicionou-se 20μL do
58
anticorpo CD45 com repouso de 15 minutos e 20μL das nanopartículas
magnéticas. A amostra foi acondicionada em tubo de poliestireno e acrescida de
PBS suplementado com 10% de SFB e EDTA até o volume final de 2,5mL.
Inserido na base magnética, o tubo permaneceu por dez minutos e em seguida foi
vertido em um novo tubo cônico de 15,0mL, onde foram depositadas apenas as
células-tronco mesenquimais para nova contagem de rendimento e viabilidade
pela técnica mencionada anteriormente. Procedeu-se a comparação entre o
número de células viáveis obtidas nos dois momentos distintos, ou seja, após
isolamento das células mononucleares com utilização de Ficoll-paque® e pelo
ensaio imunomagnético caracterizado pela depleção negativa das células
hematopoiéticas.
Expansão celular in vitro das células-tronco mesenquimais
As células-tronco mesenquimais isoladas pelo ensaio imunomagnético
e obtidas da fração mononuclear foram semeadas em frascos de poliestireno de
25cm3 (Techno Plastic Products- TPP, Trasadingen, Switzerland), a uma
densidade de 5x105 células imersas em meio MesenCult® suplementado com SFB
a 10%, 50μg/mL de gentamicina (Garamicina®, Shering-Plought, Rio de Janeiro,
RJ) e 2μg/mL de anfotericina B (Fungizone®, Gibco, Invitrogen, São Paulo, SP),
mantidas em estufa a 37°C e atmosfera umedecida contendo 5% de CO2.
Após 72 horas da primeira semeadura, o meio de cultura presente nos
frascos foi removido a fim de eliminar as células não aderentes, possibilitando a
seleção das células-tronco mesenquimais por aderência em plástico. O meio foi
substituído a cada três dias e o crescimento das células aderentes, a confluência
e morfologia das colônias foram avaliadas diariamente em microscópio invertido.
Quando as células atingiam confluência entre 80% e 90% eram realizados os
repiques ou passagem possibilitando dessa forma a transferência das células
para outros frascos de cultivo para obtenção de maiores rendimentos.
59
Passagens ou repiques das culturas
As passagens foram realizadas após tratamento com enzima
proteolítica para que as células-tronco mesenquimais cultivadas perdessem a
adesão ao plástico. Para isso, o meio de cultura foi removido e as células lavadas
com solução de PBS. Após o descarte da solução, foi acrescentado 3,0mL de
tripsina/EDTA a 0,25% (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) e 3,0mL PBS, com
o objetivo de recobrir toda a monocamada de células aderidas no fundo do frasco
de cultivo. As amostras foram incubadas a 37°C por três minutos e, logo após,
visualizadas em microscópio óptico invertido para a confirmação da perda de
adesão ao plástico. A ação da tripsina foi paralisada depois da adição de 3,0mL
de meio MesenCult® suplementado com SFB a 10%.
Posteriormente, as células contidas nos frascos foram transferidas para
novos tubos cônicos e centrifugadas a 1.200rpm por 10 minutos a 15°C. As
células aderidas no fundo dos tubos foram ressuspendidas em 2,0mL de meio
MesenCult® e retirou-se uma alíquota de 10μL para determinação do rendimento
celular pós-cultivo e avaliação da viabilidade por meio da exclusão vital pela
coloração de Tripan. A cada passagem celular era realizada uma nova contagem
total das células e a avaliação da viabilidade. Para visualização das colônias
fibroblastóides uma alíquota de cada amostra das células-tronco mesenquimais
foi fixada com formalina 4% e coradas pela técnica de Giemsa por 30 minutos em
temperatura ambiente.
Conforme o número de repiques e os rendimentos encontrados, as
células eram subcultivadas em garrafas de até 150cm3 com densidade de 1x106
células e mantidas em estufa, conforme metodologia estabelecida anteriormente.
Os valores das médias e dos desvios padrão foram utilizados para analisar o
rendimento e a viabilidade celular das células mononucleares após o processo de
isolamento por gradiente de densidade Ficoll-paque® e das células-tronco
mesenquimais obtidas das frações mononucleares após purificação em base
imunomagnética.
60
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A colheita do material medular do tubérculo maior do úmero foi
dependente do protocolo anestésico e não apresentou dificuldade para obtenção
de um volume expressivo com apenas uma punção. No entanto, GRINDEM et al.
(2002) recomendaram diversas punções na crista ilíaca e no trocânter maior do
fêmur para se obter um volume medular satisfatório.
A heparinização das seringas e agulhas facilitou o procedimento da
colheita e a proporção de anticoagulante (0,3mL) e volume medular (8,0mL) não
comprometeu o rendimento e a viabilidade das amostras. MUSCHLER et al.
(1997) não determinaram o volume adequado do anticoagulante, mas admitiram
que valores inadequados podem lesar as células medulares e YANAI et al.
(2005), empregando volumes variados de heparina em relação ao volume da
amostra, não fizeram referência à morte celular. A proporção do gradiente Ficoll-
paque para o volume medular (2:1) demonstrou eficácia no isolamento das
células mononucleares de coelhos, conforme comprovado pela formação do anel
celular.
A média e o desvio padrão [±dp] das células mononucleares
quantificadas após isolamento em gradiente de densidade Ficoll-paque® foram de
7,31 [±4,03] x 106 células/mL, variando entre 1,06 x 106 e 13,70 106 células/mL. A
viabilidade esteve entre 94,67% e 99,46%, com média de 97,15% [±1,47]. Após
serem submetidas à purificação em base imunomagnética para obtenção das
células-tronco mesenquimais, as amostras apresentaram rendimentos inferiores,
variando de 0,22 x106 a 5,0 x106 células/mL e rendimento médio de 2,28 [±1,45]
x106 células/mL com viabilidade média de 97,77% [±1,63], variando entre 94,67%
e 100% de células viáveis. Os resultados individuais de rendimento e viabilidade
das frações mononucleares isoladas por gradiente de densidade e das células-
tronco mesenquimais obtidas após a separação magnética se encontram
descritos na Tabela 1 e na Figura 2.
61
TABELA 1 – Valores de rendimento e viabilidade celular da fração mononuclear e células-tronco mesenquimais isoladas de 8,0mL da medula óssea após punção do tubérculo maior do úmero de coelhos da raça Nova Zelândia.
Amostras
Células mononucleares (CMNs)
Células-tronco mesenquimais (CTMs)
Rendimento (céls./mL) x 106
Viabilidade (%) Rendimento (céls./mL x 106)
Viabilidade (%)
1 7,04 98,05 5,00 97,20 2 13,00 96,74 3,77 96,15 3 13,70 95,32 1,50 96,77 4 3,72 99,46 2,22 99,10 5 9,22 98,71 3,45 98,57 6 3,20 94,67 0,22 100,0 7 1,06 96,36 1,16 98,30 8 6,88 98,00 1,32 100,0 9 8,16 96,91 1,42 95,94
10 7,12 97,26 2,70 95,74
Média 7,31 97,15 2,28 97,77
DP ±4,03 ±1,47 ±1,45 ±1,63
FIGURA 2 – Representação gráfica do rendimento médio, desvio padrão (barras) e viabilidade das células mononucleares (coluna escura) e das células-tronco mesenquimais (coluna clara) a partir de um volume de 8,0mL do aspirado medular de coelhos (n=10) após serem isoladas pelo gradiente Ficoll-paque® e purificadas em base imunomagnética. (CMN’s-células mononucleares; CTM’s–células-tronco mesequimais).
Apesar da padronização do volume medular colhido, foram
encontrados diversos valores de rendimento e viabilidade para cada animal.
62
MUSCHLER et al. (1997), afirmaram que a diferença no rendimento de células
mononucleares de um animal para outro é influenciada pelo volume de sangue
aspirado e pela diluição com o sangue periférico. BYDLOWSK et al. (2009)
acrescentaram que a idade do doador de células pode influenciar o processo de
expansão celular, o que justifica a estandardização das idades dos animais
utilizados neste experimento. No entanto, os achados do presente estudo estão
de acordo com SOUZA (2009) e OLIVEIRA (2011), os quais afirmaram que
apesar da padronização dos volumes medulares, existe grande variabilidade em
relação ao rendimento e viabilidade encontrados, devido aos fatores intrínsecos e
extrínsecos, microambiente, manipulação das células e da variação individual de
cada espécie, possibilidades não apontadas por CONNOLLY et al. (1989).
A técnica de separação celular com microesferas magnetizadas em
associação ao anticorpo monoclonal CD45 de camundongo anti-coelho, permitiu a
seleção negativas das células hematopoiéticas, sendo removidas seletivamente
pelo campo magnético. Diante dos resultados obtidos, é possível inferir que a
separação imunomagnética foi eficaz, uma vez que 30% do total das células
mononucleares isoladas pelo método de gradiente Ficoll-paque® eram compostas
por células-tronco mesenquimais da medula óssea. Contrariando os achados de
COVAS (2006) no qual relatou que as células-tronco mesenquimais podem
corresponder de 0,001% a 0,01% de todas as células nucleadas medulares.
O baixo rendimento de células-tronco mesenquimais de 2,28 [±1,45]
x106 células/mL após a purificação da fração mononuclear foi compensado pela
expansão in vitro, obtendo uma população celular padronizada com menor
número de subcultivos possíveis. A expansão utilizando o meio de cultura
MesenCult® proporcionou amplificação em 60% no momento da segunda
semeadura quando comparado o com o número de células semeadas na
primeira, intensificando o rendimento celular conforme eram realizadas as
passagens. FORRIOL & ESPARZA (2008) encontraram percentagens
semelhantes, mas MAZZETTI et al. (2010) cultivando celulas do tecido adiposo de
coelhos em meio DMEM, conseguiram incrementar o rendimento em 77% após a
segunda passagem no vigésimo dia. Esses resultados foram expressivos, porém
tardios quando comparados com o do presente estudo, pois a partir do décimo dia
de cultivo já era possível descrever rendimentos equivalentes.
63
Durante os primeiros ensaios para expansão celular, foi observada
contaminação bacteriana do cultivo entre 24 e 72 horas após a semeadura,
mesmo substituindo os lotes do meio de cultura e os materiais utilizados no
processo de isolamento e purificação das CTMs. O problema foi contornado após
dobrar as doses do antibiótico e do antifúngico que inicialmente eram de 25μg/mL
de gentamicina e de 1,0μg/mL de anfotericina B. Valores semelhantes foram
recomendados por FONTANA (2009), que indicava 50μg/mL de gentamicina e
0,3μg/mL de anfotecina B para cultura de células-tronco mesenquimais obtidas da
medula óssea humana. Assim, condições fundamentais como o meio de cultura,
densidade celular de semeadura e o tratamento com diferentes doses de
antimicrobianos e antifúngicos são necessárias para o desenvolvimento de uma
boa cultura. Caso a expansão se torne inviável a posterior aplicação das células
em estudos in vivo poderá ser prejudicada KASTEN et al. (2008).
As células-tronco mesenquimais obtidas da fração mononuclear da
medula óssea foram capazes de gerar células com diferentes morfologias logo
nas primeiras 24 horas após dar início ao cultivo, tempo necessário para que as
células aderissem ao plástico e formassem uma matriz de ancoragem
responsável pela sua sobrevivência e proliferação, resultados semelhantes foram
obtidos por MANSO et al. (2002) e SUNG et al. (2008). No entanto, ROMANOV et
al. (2003) conseguiram células aderentes apenas a partir do quinto dia,
empregando meio de cultivo diferente do usado no presente trabalho. Neste
contexto, o descarte das células não aderentes após o terceiro dia de cultivo pode
ter sido fundamental para a expansão das células com características
morfológicas diferentes das quais permaneciam aderidas na garrafa de cultura. Já
BIEBACK et al. (2004), trabalhando com células-tronco obtidas do sangue de
cordão umbilical, indicaram a remoção das células não aderentes a partir do
sétimo dia de cultura, justificando o fato do lento processo de aderência.
Dentre a população celular encontrada, as alongadas de aspecto
fibroblastóide eram predominantes, no entanto células ovais, bem como a
formação de unidades formadoras de colônias fibroblásticas (CFU-F) também
foram encontradas. As células que permaneciam aderidas ao frasco de cultura
constituíam uma população rara da medula óssea e apresentavam elevada
capacidade replicativa, principalmente as caracterizadas pelas colônias de
64
densidade e formato irregulares. Segundo MORI et al. (2005) esses tipos
celulares são capazes de formar tecido in vivo, mesmo após terem sido
extensivamente cultivados in vitro.
Após as passagens, houve predominância de células com
características fibroblastóides resultando numa cultura homogênea de CTMs em
diferentes fases de desenvolvimento (Figura 3A, 3B, 3C e 3D) e em alguns casos,
presença de grandes células arredondadas e multinucleadas. Acrescenta-se que
a técnica de coloração por Giemsa favoreceu a visualização das colônias
fibroblásticas e do aspecto fibroblastóide das células-tronco mesenquimais no 3°
dia após a semeadura (Figura 3E e 3F).
FIGURA 3 - Fotomicrografia das células-tronco mesenquimais aderentes provenientes da medula óssea de coelhos cultivadas em meio de cultura MesenCult®. (A) células-tronco mesenquimais no dia 0, (B) unidades formadoras de colônias fibroblásticas (setas), (C) início de confluência das células fibroblastóides no 3° dia, (D) células fibroblastóides confluentes no 10° dia de cultivo. (E) e (F) coloração pela técnica de Giemsa, início de confluência das células fibroblástóides no 3° dia. Aumento x40.
65
O meio de cultura empregado foi considerado etapa fundamental no
processo de expansão celular e a escolha do MesenCult® livre de componente
animal fundamentou-se no fato desse meio ser empregado com sucesso para
cultura de células-tronco mesenquimais humanas e utilizado de forma eficaz para
enumeração de colônias CFU-F. Na literatura consultada, autores como YANAI et
al. (2005) e MAZZETTI et al. (2010) não relataram seu uso na expansão de
células obtidas da medula óssea de coelhos. Portanto, ainda que o meio não
contenha componentes de origem animal, os resultados apresentados indicam a
eficácia na metodologia aqui empregada, pois o crescimento e o potencial celular
de diferenciação foram mantidos durante todo o tempo de expansão.
Ressalte-se ainda que o meio de cultura MesenCult® apresentou outros
aspectos positivos, como rápida expansão in vitro e a redução significativa das
células hematopoiéticas remanescentes nas passagens iniciais. Além disso, a
suplementação com soro fetal bovino a 10%, a adição de antimicrobianos e
antifúngicos para manutenção e propagação celular foram medidas importantes
no processo, pois, durante os primeiros ensaios notou-se que culturas livres de
soro não havia proliferação celular. Possivelmente pela ausência de proteína da
matriz extracelular encontrada no soro fetal bovino. Tais observações também
foram feitas por KELLER et al. (2003).
O emprego de garrafas de 25cm3 e 75cm3 e em seguida o subcultivo
em garrafas de 150cm3, fase em que já se encontravam entre a 4ª e 7ª passagem,
contribuíram para o aumento do rendimento das células cultivadas. As
submissões das culturas a várias etapas de tripsinização para expansão e
subdivisão celular possibilitaram a permanência em cultivo por períodos que
variaram de dois a três meses. Tal conduta promoveu a redução do potencial de
renovação dessas células, corroborando com KAWASAKI-OYAMA et al. (2008).
Quando avaliadas, as células mesenquimais apresentavam características
morfológicas de células inviáveis por meio da presença de vacúolos a partir da
10ª passagem. Contrariando esses achados, FRESHNEY (2006) relatou que as
passagens celulares podem ser realizadas inúmeras vezes, sem comprometer o
rendimento e a viabilidade do cultivo celular.
Durante a padronização da técnica, um dos pontos críticos no cultivo
celular foi o tempo de atuação da tripsina no momento do subcultivo, uma vez que
66
o aumento do tempo de ação diminuiu a viabilidade celular da cultura, conforme
afirmou também PRATA (2006). No presente estudo, o tempo considerado ideal
foi de três minutos utilizando tripsina/EDTA (0,25%), contrariando tais resultados,
MANSO et al. (2002) utilizando tripsina/EDTA (0,05%) e SILVEIRA et al. (2010)
com concentrações iguais as apresentadas neste estudo empregaram a tripsina
com tempos que variaram entre dois, cinco e dez minutos e não observaram
diferenças em relação ao rendimento e viabilidade celular da cultura entre o
primeiro e o segundo subcultivo empregando medula óssea.
Embora no presente estudo não tenham sido utilizados marcadores
específicos de CTMs e indução de diferenciação celular para confirmação da
presença de células-tronco, a intensa proliferação observada nas amostras foi um
indicativo da presença de células-tronco mesenquimais. Esse argumento
encontra-se respaldo no fato de as células diferenciadas ou senescentes
possuírem um tempo de vida limitado, caracterizado pela perda da capacidade de
proliferação, levando à estagnação da cultura conforme relatos de BIEBACK et al.
(2004), situação não observada neste estudo. A aderência das células isoladas à
superfície plástica e sua morfologia fibroblástica demonstrou a presença das
CTMs na cultura, de acordo com o padrão para identificação desse tipo celular
estabelecido por PITTENGER et al. (1999).
Acrescente-se que, apenas alguns autores como BAKSH et al. (2003),
MIRANVILLE et al. (2004) e MARTIN et al. (2010) fizeram referência ao emprego
do método imunomagnético de separação celular, mas não citaram o seu uso em
coelhos, aspecto que valoriza os dados apresentados. Deste modo, os resultados
in vitro obtidos no presente experimento, estão de acordo com os encontrados por
KELLER et al. (2003) e incrementam o desenvolvimento de modelos in vivo,
permitindo uma exploração mais acurada da relação entre as propriedades dos
materiais e suas respostas biológicas quando associados às células-tronco
mesenquimais da medula óssea.
67
CONCLUSÕES
A obtenção de células-tronco mesenquimais pode ser alcançada após
purificação das células mononucleares da medula óssea de coelhos pelo método
imunomagnético e que o meio de cultura MesenCult® proporciona um ambiente
adequado para a rápida expansão in vitro, no entanto o número de passagens
exerce influência negativa sobre as características morfológicas das células
principalmente após a 10ª passagem.
REFERÊNCIAS
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71
CAPITULO 3 – CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DA MEDULA ÓSSEA
ASSOCIADAS À MATRIZ EXTRACELULAR DE COLÁGENO
NO REPARO DE LESÕES TENDÍNEAS DE COELHOS
RESUMO
A maioria das lesões tendíneas está relacionada a traumas, e as mais
importantes envolvem secção parcial ou completa, devido à ação de objetos
cortantes ou agudos levando a uma incapacidade funcional do membro. Avanços
médicos têm demonstrado crescente interesse na utilização de terapia celular em
tratamentos de doenças degenerativas com cicatrização lenta e ineficaz.
Objetivou-se com este estudo estabelecer um protocolo terapêutico empregando
células-tronco mesenquimais alógenas da medula óssea associadas à esponja de
colágeno no reparo de lesões tendíneas de coelhos. Quarenta e oito coelhos
machos da raça Nova Zelândia foram submetidos à tenectomia parcial do tendão
do músculo gastrocnêmio. Os animais foram distribuídos em quatro grupos
conforme o tratamento preconizado: controle (GC), células-tronco (GCT), esponja
(GE) e células-tronco associadas à esponja de colageno (GCT-E). Foram
realizadas avaliações clínicas, físicas, macroscópicas, histológicas e por
microscopia eletrônica de transmissão (MET) das fibras tendíneas. Ao exame
macroscópico observaram-se tendões com discretas aderências em todas as
amostras analisadas. Nas leituras histológicas todos os grupos aos 45 e 90 dias
de pós-operatório, não foi observado tecido conjuntivo denso que indicasse
cicatrização total das lesões tendíneas. Os animais do grupo GCT e GCT-E
apresentaram organização de fibroblastos mais intensa e significativa aos 45º dia,
além de fibrocartilagem ectópica no reparo tendíneo. Por meio da MET observou-
se, nos grupos GC e GE, região cicatricial caracterizada por fibras colágenas
delgadas e desorganizadas. Discreto rearranjo das fibrilas de colágeno foi
encontrado nos grupos GCT e GCT-E. Conclui-se que o grupo tratado com
células-tronco mesenquimais da medula óssea cultivadas em MesenCult®
associadas a esponja de colágeno apresentou melhores resultados em termos de
progresso e qualidade da cicatrização em relação aos demais grupos.
Palavras-chave: colágeno, materiais biocompatíveis, MesenCult®, tendão.
72
CHAPTER 3 – BONE MARROW MESENCHYMAL STEM CELLS IN COLLAGEN
EXTRACELLULAR MATRIX FOR RABBITS TENDON REPAIR
ABSTRACT
Most injuries of the tendons are related to trauma and the most important injuries
are partial or complete section due to the action of sharp and acute objects leading
to a functional disability of the member. Medical advances have shown growing
interest in the use of cell therapy in treatment of degenerative diseases with slow
and ineffective healing. The aim of this study was to establish a treatment protocol
using allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells associated with a collagen
sponge to repair tendon injuries in rabbits. Forty-eight male New Zealand rabbits
underwent partial tenectomy of vastus lateralis tendon of the gastrocnemius
muscle. The animals were divided in four groups according to the recommended
treatment: control (GC), stem cells (GCT), sponge (GE) and stem cells associated
with collagen sponge (GCT-E). Clinical, physical, macroscopic, histological and
electron microscopy evaluations of tendon fibers were conducted. Macroscopic
examination found the presence of discrete tendon adhesions in all of the
analyzed samples. In the histological analysis of all groups at 45 and 90 days
postoperatively, there was no dense connective tissue indicating total healing of
the tendon. The animals in the GCT and GCT-E showed more intense and
significant fibroblasts organization until day 45 and ectopic fibrocartilage in tendon
repair. Electron microscopy showed, in CG and GE, a scar region characterized by
thin and disorganized collagen fibers. A discrete rearrangement of the collagen
fibrils was found in groups GCT and GCT-E. It was concluded that the group
treated with mesenchymal stem cells from bone marrow cultured in MesenCult®
and associated with collagen sponge showed better results in terms of progress
and quality of healing compared to the other groups.
Keywords: collagen, biocompatible materials, MesenCult®, tendon
73
INTRODUÇÃO
O aparelho locomotor é um complexo sistema que inclui músculos,
tendões, segmentos ósseos e articulações, cuja movimentação é controlada pelo
sistema nervoso central (BARREY, 2001). A força biomecânica dos músculos é
transferida para os ossos por intermédio dos tendões, promovendo a
movimentação (SMITH & WEBBON, 1996). Na rotina clínica cirúrgica, lesões
tendíneas são frequentes e podem resultar em secção parcial ou total do tendão.
A maioria das rupturas envolvendo o tendão calcâneo comum e dos flexores
digitais são decorrentes de lesões provocadas por objetos perfuro-cortantes que
desencadeiam alterações na postura e oferecem difícil correção cirúrgica. Tais
lesões são observadas com frequência em cães (VAUGHAN, 1979), equinos
(GOODSHIP, 1993) e no homem (NYSTRON & HOLMLUND, 1983).
Procedimentos terapêuticos para traumas ocorridos em tendões vêm
sendo testados, porém os resultados são frustrantes quando considerados o
tempo de cicatrização e a qualidade do tecido cicatricial. Estudos têm dado
importância ao traumatismo de tendão, particularmente do calcâneo, efetuando
técnicas corretivas com a utilização de membrana biológicas como enxerto
autógeno de fáscia lata (HADDAD et al., 1997), tendão homólogo (RAISER 2000),
peritônio bovino preservado (COSTA NETO et al., 1999) e pericárdio equino
(SARTORI FILHO et al., 1997). Entretanto, as pesquisas têm voltado sua atenção
para o potencial terapêutico da engenharia celular aplicadas a enfermidades
complexas ou lesões de difícil cicatrização (HUANG et al., 2004). Quando há
perda expressiva do tecido tendíneo, a sua substituição torna-se necessária e
nesses casos, o uso de enxerto fornece suporte e orientação para migração de
células e formação de fibras tendíneas (VALDÉS-VASQUEZ et al., 1996).
A cicatrização e o restabelecimento morfofuncional dos tendões
dependem de fatores intrínsecos e extrínsecos, como vascularização, migração e
adesão celular, além das manobras operatórias e da terapia utilizada
(GOODSHIP et al., 1985). Terapias convencionais nem sempre apresentam
resultados satisfatórios, por essa razão a medicina regenerativa desponta como
uma ferramenta terapêutica no tratamento de várias doenças para as quais ainda
não há tratamento específico ou efetivo (KASSEM et al., 2004). Mesmo que os
74
problemas relacionados ao aparelho locomotor tenham sido pesquisados, uma
série de questionamentos realizados na rotina clínica e cirúrgica ainda não foi
respondida em sua plenitude. Portanto, tendo em vista a importância dos tendões
para o bom funcionamento do aparelho locomotor e suas limitações relacionadas
ao tratamento, protocolos terapêuticos com a utilização de células-tronco
mesenquimais purificadas associadas aos biomateriais são alternativas para
acelerar o processo cicatricial em tecidos lesionados.
Assim, objetivou-se com esse estudo estabelecer um protocolo
terapêutico empregando células-tronco mesenquimais alógenas da medula óssea
associadas à esponja de colágeno no reparo do tendão do músculo gastrocnêmio
de coelhos.
MATERIAL E MÉTODOS
Após aprovação pelo Comitê de ética em Pesquisa da Universidade
Federal de Goiás (UFG), sob o protocolo n° 134/11, foram selecionados 48
coelhos machos adultos da raça Nova Zelândia com idade média de 1,0 ± 0,2
anos e peso médio de 3,5 ± 0,24kg para serem submetidos ao procedimento
cirúrgico de tenectomia parcial do tendão do músculo gastrocnêmio. Os
tratamentos das lesões fundamentaram-se na inoculação de células-tronco
mesenquimais (CTMs) alógenas da medula óssea (MO), associadas ou não a
uma matriz extracelular composta por esponja de colágeno hidrolizada e liofilizada
(Hemospon®, Technew Comércio e Indústria, Rio de Janeiro, RJ).
Os animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos,
controle (GC), células-tronco (GCT), esponja (GE) e o grupo que recebeu a
associação de CTMs e esponja de colágeno (GCT-E). Cada grupo (n=12) foi
subdividido em dois subgrupos (n=6) com o propósito de proceder avaliações aos
45 e 90 dias de pós-operatório (PO). Após os procedimentos cirúrgicos e
realização da terapia celular, foram realizadas avaliações clínicas e físicas dos
membros operados por meio da palpação e inspeção e avaliado o grau de
claudicação. Avaliações macroscópicas, histológicas e por microscopia eletrônica
também foram empregadas.
75
Antecedendo os procedimentos cirúrgicos, um animal foi selecionado
para realização da colheita, isolamento, purificação e expansão in vitro das CTMs
da medula óssea. O animal recebeu medicação pré-anestésica composta por
2,0mg/kg de cloridrato de tramadol (Tramal®, Laboratório Pfizer Ltda, São Paulo,
SP) e 0,05mg/kg de acepromazina (Acepran® 1%, Vetnil, Ltda. Louveira, SP),
ambos por via intramuscular. Na sequência, foi anestesiado com administração de
30,0mg/kg cetamina (Cetamin®, Syntec, Patrocínio Paulista, SP) e 5,0mg/kg
xilazina (Kensol®, Konig, Santana de Parnaíba, SP) pela mesma via. Após
tricotomia e antissepsia das regiões escápulo-umerais, procedeu-se à colheita
medular por meio de uma agulha metálica de Rosenthal (16 gauge) heparinizada
e inserida no tubérculo maior do úmero. Foram aspirados 8,0mL de medula óssea
integra com auxilio de uma seringa de 10,0mL contendo 0,3mL de solução estéril
de heparina com 5000U/mL (Liquemine®, Produtos Roche Químicos e
Farmacêuticos S/A. Rio de Janeiro, RJ).
Em capela de fluxo laminar, o aspirado foi distribuído em quatro
amostras de 2,0mL acondicionadas em tubos cônicos de 15,0mL. Cada amostra
foi diluída (volume/volume) em 2,0ml de solução salina tamponada (DPBS, Gibco®
Invitrogen, São Paulo, SP), acrescida de soro fetal bovino (SFB) a 10% e 10mM
de EDTA (Gibco® Invitrogen, São Paulo, SP). As soluções resultantes compostas
por medula óssea mais solução salina tamponada, foram depositadas sobre
2,0mL de solução Ficoll-paque® na densidade 1,077g/mL (Amersham
Biosciences, São Paulo, SP.) contida em outros tubos. Em seguida, as amostras
foram centrifugadas a 495 x g durante 30 minutos a 15ºC e separadas em plasma,
nuvem celular, Ficoll-paque® e células vermelhas. O sobrenadante composto pelo
plasma foi removido e as nuvens celulares formadas entre o plasma e a solução
de Ficoll-paque® foram transferidas para um único tubo que foi centrifugado por
mais duas vezes com 10,0mL de DPBS. Uma terceira centrifugação foi realizada
com meio de cultivo MesenCult® (MesenCult® Basal Medium Human, StemCell™,
Vancouver, Canadá) suplementado com soro fetal bovino a 10% (Stem Cells®,
Vancouver, Canadá) a 385 x g durante dez minutos a 4ºC.
Após a última centrifugação, o meio foi desprezado permanecendo
aderido no fundo do tubo apenas o volume do aglomerado celular que foi
ressuspendido em 2,0mL de meio de cultura. Uma alíquota de 10μL da
76
suspensão foi utilizada para avaliação do rendimento e da viabilidade das células
mononucleares pela técnica de exclusão vital por azul de Tripan 0,4% (Sigma
Aldrich®, St. Louis, EUA), conforme descreveram BITTENCOURT et al. (2006).
A amostra da fração mononuclear foi acondicionada em tubo de
poliestireno inserido na base magnética para seleção negativa das CTMs
utilizando o anticorpo monoclonal CD45 de camundongo anti-coelho, complexo
tetramérico e nanopartículas magnéticas, preparadas conforme a recomendação
do fabricante (EasySep, Stem Cell®, Vancouver, Canadá). Após seleção das
células-tronco mesenquimais, realizou-se novamente a avaliação do rendimento e
da viabilidade celular.
Dando continuidade, as células-tronco mesenquimais isoladas foram
cultivadas em garrafas de cultura contendo 5x105células imersas em meio de
cultivo MesenCult® suplementado com SFB a 10%, gentamicina (50μg/mL) e
anfotericina B (2μg/mL). As culturas foram mantidas em estufa a 37°C com 5% de
CO2 e a primeira troca de meio para eliminação das células não-aderentes foi
realizada 72 horas após o início do cultivo e trocado a cada três dias até atingirem
80-90% de confluência. Nesse momento, as células eram submetidas à
tripsinização e subdividas para outras garrafas de cultura. Após contagem
hemocitométrica para determinação do rendimento e viabilidade pós cultura, as
células foram ressuspendidas em 200μL de meio MesenCult® com concentração
celular ajustada em 1,0 x105 células-tronco mesenquimais para serem inoculadas
nas lesões tendíneas dos grupos experimentais.
As lesões tendíneas foram realizadas no membro pélvico esquerdo
sobre o terço médio do tendão do músculo gastrocnêmio por meio da técnica de
tenectomia parcial. Os animais receberam antibioticoterapia profilática composta
por 30mg/kg cefazolina sódica (Cefazolina sódica, BioChimico, Rio de Janeiro,
RJ) e sob o mesmo protocolo anestésico empregado na colheita medular,
procedeu-se a tricotomia e antissepsia do membro pélvico esquerdo. Em decúbito
lateral direito a pele e o tecido subcutâneo foram incisados no sentido longitudinal
por aproximadamente 3,0cm, seguindo do terço médio ao distal da face lateral da
tíbia. Após a exposição, o tendão do músculo gastrocnêmio foi individualizado
(Figura 1A) e seccionado, removendo aproximadamente 1,0cm de comprimento e
0,3cm de espessura (Figura 1B e 1C) e o paratendão preservado para
77
posteriormente ser reconstituído. As bordas das lesões tendíneas foram
delimitadas por aplicação de um ponto em cada extremidade com fio mononáilon
n° 4-0, (Figura 1D e 1E) a fim de facilitar a identificação da área lesionada durante
a colheita do material para avaliações laboratoriais.
As unidades experimentais do grupo GC não receberam tratamento
específico. Já o grupo GCT foi submetido à inoculação de 1,0 x 105 CTMs
alógenas cultivadas e o grupo GE recebeu apenas o implante de matriz
extracelular composta por esponja de colágeno (Hemospon®). No GCT-E foi
utilizada a mesma matriz extracelular associada a 1,0 x 105 CTMs presentes em
200μL de meio MesenCult®. Em seguida, as feridas cirúrgicas foram envolvidas
pelos seus respectivos paratendões e o tecido subcutâneo reaproximado com fio
poliglactina 910 n° 4-0 (Vicryl®, Ethicon, São Paulo, SP) em sutura continua. A
pele recebeu sutura simples interrompida (Figura 1F), com fio mononáilon n° 4-0
(Polysuture® Indústria e Comércio, São Sebastião do Paraíso, MG). A ferida
cirúrgica foi protegida por fita Micropore™ (3M) e curativos diários foram
realizados até o 10° dia, quando foram removidos os pontos.
FIGURA 1 – Tenectomia parcial do tendão do músculo gastrocnêmio de coelhos.
Em (A) exposição do tendão do músculo gastrocnêmio, (B) e (C) remoção de um fragmento tendíneo de 1,0cm de comprimento por 0,3 de espessura, (D) e (E) pontos simples separados nas extremidades da lesão tendínea e (F) sutura simples separada na pele.
78
Durante o período pós-operatório, exames clínicos e físicos dos
membros operados foram realizados conforme já mencionados. A marcha de
cada animal foi avaliada até o 10° dia de pós-operatório e foram considerados
como referência os parâmetros estabelecidos para claudicações em cães por
ANDERSON et al. (2003) de forma adaptada para coelhos. Grau zero (ausente):
deambulação normal, grau um (discreta): suporte do peso com sutil claudicação
intermitente, grau dois (moderada): suporte do peso com claudicação marcante e
grau três (intensa): não suporta o peso durante a deambulação.
Decorridos 45 e 90 dias de pós-operatório os animais foram
submetidos à eutanásia, com sobredose de tiopental sódico 2,5% (Cristália
Produtos Químicos Farmacêuticos, Campinas, SP) e cloreto de potássio 10%
(Darrow, Laboratórios S.A. Rio de Janeiro, RJ) para colheita de amostras dos
tendões operados. O material foi fixado em formalina tamponada a 10% e foram
confeccionadas lâminas com secções transversais de 5μm coradas com
hematoxilina-eosina (HE).
Os dados obtidos pela técnica de HE foram classificados de acordo
com a intensidade em que foram encontrados e transformados em variáveis
mediante atribuição de escores. As variáveis analisadas foram: intensidade de
fibrina, infiltrado de polimormonucleares, células gigantes, fibroblastos, fibrócitos,
assim como a presença de neovascularização, hemorragia e necrose. Os escores
variaram entre zero e três, onde, 0 (zero)= ausente; 1 (um)= discreta; 2 (dois)=
moderada e 3 (três)= acentuada. Tais valores foram baseados na metodologia
descrita por GARROS et al. (2006).
Para avaliação por microscopia eletrônica de transmissão (MET) as
amostras foram fixadas em Karnowsky modificado por 24 horas. Após desprezar
o fixador, os tecidos permaneceram imersos em tampão cacodilato de sódio a
0,2M (pH 7,2) a 4ºC por um período de 48 horas. Em seguida, o material foi
lavado três vezes em tampão cacodilato 0,1M (pH 7,2), por 15 minutos e pós
fixado em solução de tetróxido de ósmio 1%, por duas horas sob a mesma
temperatura. As amostras foram lavadas duas vezes em água bidestilada e
desidratadas em gradiente de etanol em concentrações crescentes de 30, 50, 70,
80, 95 e 100% por duas vezes. A secagem foi realizada em secador de ponto
crítico à base de dióxido de carbono e, posteriormente, incluídas em resina epon,
79
e contrastados com acetato de uranila e citrato de chumbo. Cortes transversais,
longitudinais e oblíquos com 70 a 90nm de espessura foram utilizados para
avaliar a espessura e a disposição das fibrilas, assim como, a quantidade de
fibroblastos e fibrócitos, além da presença de macrófagos típicos.
Os resultados obtidos das variáveis não paramétricas foram expressos
em escores e submetidos ao teste de Kruskall-Wallis com nível de significância de
5% (p<0,05) seguido de teste de Student-Newman-Keuls para comparação das
variáveis entre os grupos (SAMPAIO, 2007). As análises foram feitas no programa
computacional BioEstat 5.0.
RESULTADOS
Os procedimentos realizados para isolamento das células
mononucleares foram passíveis de serem realizados, empregando o gradiente de
densidade Ficoll-paque®, assim como a purificação das células mononucleares da
MO em base imunomagnética, obtendo-se após a expansão celular em meio de
cultivo Mesencult® uma concentração de 2,28 x 106 células/mL e viabilidade
celular acima de 95%.
As feridas cirúrgicas apresentaram evolução clínica satisfatória, sem
deiscências, abscessos ou fístulas. A técnica cirúrgica utilizada facilitou a
exposição e manipulação do tendão e possibilitou a abordagem para a inoculação
das células e aplicação da esponja de colágeno. Durante a abordagem cirúrgica,
verificou-se presença de pequenos sangramentos do tecido subcutâneo que
circundava o tendão estendendo-se ao paratendão.
Nas primeiras 48 horas foi verificado que sete (58,3%) animais do
grupo GC, cinco (41,6%) GCT, oito (66,6%) GE e quatro (33,3%) GCT-E
apresentavam claudicação discreta (grau um), pois havia o suporte do peso com
sutil claudicação de forma intermitente, que desapareceu gradativamente até o
terceiro dia. Achados clínicos, como aumento de volume local e sensibilidade à
palpação também foram observados em todas as unidades experimentais. Ao
exame macroscópico, observaram-se tendões com presença de discretas
aderências nos diferentes grupos experimentais e o espessamento foi evidente
80
em ambos os períodos de avaliação. Amostras tendíneas referentes aos 45 dias
de PO apresentaram um espessamento maior quando comparadas com as de 90
dias.
As avaliações histológicas aos 45 de PO revelaram eventos pertinentes
às fases iniciais do processo inflamatório com presença de fibrina, infiltrados de
células polimorfonucleares e proliferação de fibroblastos. Dentre as variáveis
analisadas, foram encontradas diferenças estatísticas entre os referidos
tratamentos (Tabela 1 e 2).
81
TABELA 1- Comparação das variáveis fibrina; infiltrado poliformonuclear; infiltrado mononuclear; piócitos; células gigantes; fibroblastos; fibrócitos; neovascularização; hemácias e necrose entre os grupos controle; células-tronco; esponja de colágeno e células-tronco associadas à esponja de colágeno para o período de 45 dias de pós-operatório.
GRUPOS VARIÁVEIS
p-valor (45 dias)
FBN PMN MNN PIO CG FBA FBC NEO HEM NEC
GC X GCT 0,0009* 0,0151* 0,2979ns
Ausentes 0,9674ns
0,0151* 0,4552ns
0,0392* 0,9484ns
0,3693ns
GC X GE 0,5403ns
0,3801ns
0,1779ns
Ausentes 0,0290* 0,9512ns
0,4552ns
0,7286ns
0,9484ns
0,3693ns
GC X GCT-E 0,0290* 0,7440ns
0,0982ns
Ausentes 0,0290* 0,0500ns
0,4552ns
0,1025ns
0,9484ns
0,3693ns
GCT X GE 0,0060* 0,0009* 0,7595ns
Ausentes 0,0321* 0,0128* 0,4552ns
0,0160* 0,9484ns
0,3693ns
GCT X GCT-E 0,2530 ns
0,0059* 0,0071* Ausentes 0,0321* 0,6387ns
0,4552ns
0,6682ns
0,9484ns
0,3693ns
GE X GCT-E 0,1160 ns
0,5815ns
0,0027* ausentes 1,000ns
0,0433* 0,4552ns
0,0477* 0,9484ns
0,3693ns
(*) houve diferença estatística entre os tratamentos. (ns) valores não significativos, não houve diferença estatística entre os tratamentos (p>0,05) pelo teste Kruskal-Wallis seguido de teste de Student-Newman-Keuls para comparação das variáveis entre cada tratamento. GC: controle; GCT: células-tronco; GE: esponja de colágeno; GCT-E: células-tronco associadas à esponja de colágeno; Variáveis analisadas: FBN: fibrina; PMN: infiltrado poliformonucleares; MNN: infiltrado mononuclear; PIO: piócitos; CG: células gigantes; FBA: fibroblastos; FBC: fibrócitos; NEO: neovascularização; HEM: hemácias; NEC: necrose.
82
TABELA 2- Comparação das variáveis fibrina; infiltrado poliformonuclear; infiltrado mononuclear; piócitos; células gigantes; fibroblastos; fibrócitos; neovascularização; hemácias e necrose entre os grupos controle; células-tronco; esponja de colágeno e células-tronco associadas à esponja de colágeno para o período de 90 dias de pós-operatório.
GRUPOS VARIÁVEIS
p-valor (90 dias)
FBN PMN MNN PIO CG FBA FBC NEO HEM NEC
GC X GCT 0,9177ns
0,1025ns
0,9135ns
ausentes 0,1000ns
0,2076ns
0,2214ns
0,0392* ausentes 0,5874ns
GC X GE 0,9177ns
0,0864* 0,9135ns
ausentes 0,2703ns
0,2076ns
0,2214ns
0,7286ns
ausentes 0,5874ns
GC X GCT-E 0,9177ns
0,6831ns
0,9135ns
ausentes 0,0128* 0,2076ns
0,2214ns
0,1025ns
ausentes 0,5874ns
GCT X GE 0,9177ns
0,0008* 0,9135ns
ausentes 0,2703ns
0,2076ns
0,2214ns
0,0160* ausentes 0,5874ns
GCT X GCT-E 0,9177ns
0,2207ns
0,9135ns
ausentes 0,0128* 0,2076ns
0,2214ns
0,6682ns
ausentes 0,5874ns
GE X GCT-E 0,9177ns
0,0338* 0,9135ns
ausentes 0,1651ns
0,2076ns
0,2214ns
0,0477* ausentes 0,5874ns
(*) houve diferença estatística entre os tratamentos. (ns) valores não significativos, não houve diferença estatística entre os tratamentos (p>0,05) pelo teste Kruskal-Wallis seguido de teste de Student-Newman-Keuls para comparação das variáveis entre cada tratamento. GC: controle; GCT: células-tronco; GE: esponja de colágeno; GCT-E: células-tronco associadas à esponja de colágeno; Variáveis analisadas: FBN: fibrina; PMN: infiltrado poliformonucleares; MNN: infiltrado mononuclear; PIO: piócitos; CG: células gigantes; FBA: fibroblastos; FBC: fibrócitos; NEO: neovascularização; HEM: hemácias; NEC: necrose.
83
Analisando os achados histológicos relativos aos 45 dias de PO,
verificou-se que o grupo GC quando comparado com o grupo GCT apresentou
valores significativos (p<0,05) para as variáveis fibrina, infiltrado polimorfonuclear,
intensidade de fibroblastos e neovascularização. Para o grupo GCT-E, os valores
significativos (p<0,05) foram para presença de fibrina e células gigantes. As
variáveis neovascularização, presença de hemorragia, infiltrados de
mononucleares e necrose não apresentaram diferença estatística entre o GC e os
demais grupos. Os vasos neoformados apresentavam-se envolvidos por tecido
conjuntivo frouxo, exsudação fibrosa e material basofílico amorfo. Pequenas
áreas de necrose, infiltrado inflamatório e fibras desorganizadas e espaçadas
(Figura 2A) também foram identificadas.
Aos 90 dias, o grupo GC apresentou valores significativos (p<0,05)
para as variavies neovascularização e intensidade de polimorfonucleares para os
grupos GCT e GE, respectivamente. A falta de orientação das células
fibroblásticas, principalmente no centro da cicatriz e discretos infiltrados de
inflamatórios também foram observados. Fibrina, hemorragia e necrose, assim
como atividade fibroblástica não diferiram estatisticamente dos grupos tratados
(p>0,05). Achados como neovascularização, fibras colágenas espaçadas sem
arranjo e material amorfo basofílico também puderam ser identificados (Figura
2B).
Avaliando o grupo GC aos 45 dias por microscopia eletrônica de
transmissão (MET), foi observado fibrilas colágenas desorganizadas com aspecto
entrelaçado e feixes de fibrilas com espessuras variadas, mostrando
predominantemente fibrilas delgadas entremeadas por fibrilas espessas (Figura
2C). Áreas de necrose caracterizadas por rarefação celular, bem como início de
processo degenerativo de fibrilas colágenas na área de transição. Também foram
encontrados vários prolongamentos citoplasmáticos e grande quantidade de
núcleos globosos típicos de fibroblastos ativos. A avaliação aos 90 dias mostrou
fibrilas ainda desorganizadas e com espessuras variadas, predominando fibras
delgadas (Figura 2D) e fibroblastos ativos, porém de forma menos expressiva
84
FIGURA 2 – Fotomicrografias de lâminas coradas por hematoxilina-eosina (A e B) e de microscopia eletrônica de transmissão (C e D) do tendão do músculo gastrocnêmio de coelhos referentes ao grupo controle após tenectomia parcial. (A) área de transição (AT) entre o tecido íntegro (TI) e o tecido cicatricial (TC) alta celularidade, infiltrado inflamatório (seta) e delgadas fibras colágenas aos 45 dias de PO. (B) arteríolas na área de transição (*) e fibras colágenas desorganizadas e espaçadas entre si aos 90 dias de PO. Aumento x40. (C) corte transversal, setas indicam fibrilas colágenas espessas entremeadas por fibrilas colágenas delgadas (*) aos 45 dias de PO. (D) corte oblíquo, área de cicatrização formada por fibrilas colágenas delgadas e desorganizadas aos 90 dias de PO.
No exame histológico de lâminas coradas por hematoxilina-eosina do
grupo GCT duas amostras (33,33%) aos 45 dias e uma amostra (16,66%) aos 90
dias de pós-operatório por microscopia eletrônica de transmissão apresentaram
células com características epitelióides, justapostas e pleomórficas, sugestivas de
células tumorais (Figura 3).
85
FIGURA 3 - Fotomicrografias de lâminas coradas com hematoxilina-eosina (A e
B) e de microscopia eletrônica de transmissão (C) do tendão do músculo gastrocnêmio de coelhos referentes ao grupo células-tronco após tenectomia parcial. (A) aos 45 dias e (B) aos 90 dias de pós-operatório, células epiteliódes (retângulo) entre a área de tecido integro (TI) e a área de cicatrização (AC). (C) células epitelióides (retângulos) por microscopia eletrônica de transmissão aos 90 dias. (A) aumento de x40 e (B) aumento de x10.
O grupo GCT revelou presença de fibrina, eosinófilos e macrófagos
(Figura 4A) com predominância de tecido fibrogranulomatoso e neovascularização
intensa, não apresentando diferença estatística (p>0,05) apenas para o grupo
GCT-E. Também foi observada a deposição das fibras colágenas, ainda
desorganizadas e presença de fibroblastos com núcleos globosos. A atividade
fibroblástica apresentou diferença estatística (p<0,05) para os grupos GC e GE.
Aos 90 dias verificaram-se valores significativos para a intensidade de
polimorfonucleares e neovascularização quando comparado ao GC. A presença
de células gigantes diferiu de forma significativa somente em relação ao grupo
GCT-E. O número de células fibroblásticas com características fusiformes e
colágeno em fase de organização foi intensa (Figura 4B), além de tecido
conjuntivo frouxo entre tendão e a cicatriz sendo substituído por tecido conjuntivo
denso caracterizado por presença de células com núcleo condensado típicos de
fibrócitos.
Quando avaliado aos 45 dias por meio da MET o grupo GCT
apresentou fibrilas colágenas finas e ramificadas com perda do arranjo, grande
quantidade de prolongamentos citoplasmáticos e fibroblastos ativos na área da
86
cicatriz. Além de hemácias entre as fibrilas tendíneas e macrófagos típicos com
presença de fagossomos (Figura 4C). Aos 90 dias observou-se início de
reorganização das fibrilas de colágeno com intensa atividade fibroblástica e
prolongamentos citoplásmaticos de fibrócitos na área de cicatrização (Figura 4D).
FIGURA 4 – Fotomicrografias de lâminas coradas com hematoxilina-eosina (A e B) e microscopia eletrônica de transmissão (C e D) do tendão do músculo gastrocnêmio de coelhos referentes ao grupo células-tronco após tenectomia parcial. (A) presença de fibrina (*), eosinófilos (círculo) e macrófagos (seta) aos 45 dias de PO e (B) células fibroblásticas com características fusiformes aos 90 dias de PO. Aumento x40. A microscopia eletrônica (C) fibrilas colágenas ramificadas com perda do arranjo (*), prolongamentos citoplasmáticos (PC), hemácias (He) entre as fibrilas tendíneas e fibroblastos (círculo) aos 45 dias de PO. (D) reorganização das fibrilas de colágeno (Re) com atividade fibroblástica. prolongamentos citoplasmáticos de fibrócitos na área de cicatrização (AC) aos 90 dias de PO.
87
Pela avaliação histológica do grupo GE aos 45 dias de PO foi possível
observar polimorfonucleares com diferença estatística (p<0,05) apenas para o
grupo GCT, além de áreas com infiltrados inflamatórios, matriz extracelular de
colágeno envolvida por macrófagos e desorganização das fibras (Figura 5A). A
discreta neovascularização foi semelhante ao do GC diferindo dos grupos que
receberam tratamento com CTMs. Nas avaliações aos 90 dias, o grupo GE
apresentou valores significativos (p<0,05) para polimorfonucleares em relação aos
demais grupos e a intensidade de neovascularização diferiu dos grupos GCT e
GCT-E. Presença de material amorfo entre o tecido fibrogranulomatoso e fibras
colágenas desorganizadas também foram visualizadas (Figura 5B).
Na avaliação ultraestrutural aos 45 dias do grupo GE observou-se,
assim como nos demais grupos, o desarranjo das fibrilas colágenas com
espessuras variadas, principalmente com fibrilas delgadas. Na região cicatricial
foram encontrados fibroblastos ativos, áreas de necrose e restos da esponja entre
as fibrilas tendíneas. A esponja de colágeno apresentava-se envolvida por
macrófagos, os quais apresentavam vacúolos preenchidos por conteúdo (Figura
5C). Aos 90 dias também foram observadas fibrilas de pequeno diâmetro e
desorganizadas na mesma proporção das encontradas aos 45 dias (Figura 5D),
além de resquícios de esponja e redução no número de fibroblastos ativos.
88
FIGURA 5 – Fotomicrografias de lâminas coradas com hematoxilina-eosina (A e B) e microscopia eletrônica de transmissão (C e D) do tendão do músculo gastrocnêmio de coelhos referentes ao grupo tratado com esponja de colágeno após tenectomia parcial. (A) macrófagos (setas), áreas com infiltrados inflamatórios, eosinófilos (círculo) e desorganização das fibras (*) aos 45 dias de PO. (B) células gigantes reabsorvendo a esponja de colágeno (quadrado), material amorfo entre as fibras (*) aos 90 dias de PO. Aumento x40. (C) microscopia eletrônica de transmissão, observar desarranjo das fibrilas colágenas em corte oblíquo (O) e transversal (T) e presença de macrófagos (setas) aos 45 dias de PO e (D) fibrilas de pequeno diâmetro e desorganizadas (círculo) aos 90 dias de PO.
O grupo GCT-E aos 45 dias apresentou processo de cicatrização
caracterizado por rearranjo das fibras colágenas, fibroblastos ativos (Figura 6A) e
tecido de granulação. A intensidade de neovascularização não apresentou
diferença estatística (p>0,05) para o GC, diferentemente das variáveis fibrina e
células gigantes. Esta última variável também diferiu para o grupo GCT. Em
relação aos infiltrados mononucleares e presença de neovascularização e
fibroblastos, houve diferença estatística apenas para o grupo GE. Aos 90 dias, a
89
presença de infiltrados inflamatórios difusos e a neovascularização apresentaram
valores significativos (p<0,05) para o grupo GCT. A intensidade de células
gigantes do grupo GCT-E apresentou diferença estatística (p<0,05) para os
grupos GC e GE. O tecido de granulação apresentava-se evidente e organizado
com fibras de colágeno rearranjadas principalmente entre os fibrócitos (Figura
6B). A presença de tecido conjuntivo frouxo vascularizado em fase de transição
para tecido conjuntivo denso estava associada à síntese das fibras colágenas
com presença de fibroblastos ativos.
As avaliações por MET do grupo GCT-E evidenciaram rearranjo das
fibras e fibrilas de colágeno quando comparado com os demais grupos aos 45
dias de PO. Além disso, fibrilas colágenas com espessuras mais homogêneas,
fibroblastos ativos (Figura 6C) e macrófagos com presença de material fagocitado
também foram observados. O processo cicatricial mostrava-se ativo com grande
quantidade de fibroblastos na margem da lesão aos 90 dias de PO, além de
fibrilas tendíneas rearranjadas com predominância das fibrilas com maior
diâmetro (Figura 6D) e resíduos da esponja de colágeno.
90
FIGURA 6 – Fotomicrografias de lâminas coradas em hematoxilina-eosina (A e B) e microscopia eletrônica de transmissão (C e D) do tendão do músculo gastrocnêmio de coelhos referentes ao grupo tratado com associação de células-tronco esponja de colágeno após tenectomia parcial. (A) processo de cicatrização com rearranjo e síntese das fibras colágenas com presença de fibroblastos ativos aos 45 dias de PO. (B) tecido organizado com fibras de colágeno entre os fibrócitos (setas) aos 90 dias de PO. Aumento x40 (A) e x100 (B). Em microscopia eletrônica de transmissão no corte transversal (C) fibrilas de colágeno organizadas e fibroblastos ativos (círculo) aos 45 dias de PO e (D) corte transversal com fibrilas tendíneas com predominância das com maior diâmetro aos 90 dias de PO.
DISCUSSÃO
O estudo experimental aqui desenvolvido empregou metodologia
similar a descrita por OLSSON (2009), que utilizou apenas a fração mononuclear
obtida de amostras da medula óssea de cães. Contudo, aspectos como a
purificação das células em base imunomagnética com resultados favoráveis em
91
humanos e a expansão in vitro das células-tronco mesenquimais não foram
abordados. Devido à pequena quantidade de células-tronco encontrada na
medula óssea a utilização de alternativas para aumentar a concentração celular
tende a incrementar o potencial terapêutico, razão que motivou a realização da
expansão celular na presente pesquisa. Além disso, o aumento da quantidade de
células resultou em melhor aproveitamento das amostras e maiores chances de
sobrevida no local, conforme descreveram STRAUER & KORNOWISK (2003).
Durante o procedimento cirúrgico, pequenos sangramentos
provenientes do tecido subcutâneo que se estendia ao paratendão foram
controlados por meio de hemostasia compressiva evitando-se lesionar os tecidos
adjacentes pela utilização de pinças hemostáticas. A dissecção dos tendões
calcâneo e do flexor superficial dos dedos facilitou a exposição do tendão do
ventre lateral do músculo gastrocnêmio e os pontos aplicados nas extremidades
da lesão tendínea foram fundamentais para identificar o local no momento da
colheita do material, além de evitar a retração tendínea durante o trans-operatório.
A reconstituição do paratendão e a associação prévia da esponja de colágeno às
células promoveu a permanência das mesmas junto à lesa,o o que minimizou a
migração do material para os tecidos adjacentes. Segundo CAMILO et al. (2006)
e OLSSON (2009), a estrutura tridimensional da esponja fornece um
microambiente adequado para que as células pudessem aderir, proliferar e se
diferenciar sobre a matriz.
Apesar de algumas unidades experimentais terem apresentado
discreta claudicação e sinais de edema, os achados não foram atribuídos a
ausência de imobilização do membro operado, mas ao trauma cirúrgico e a
reação inflamatória decorrentes do processo cicatricial, situação relatada por
SLATTER, (1998). Como a locomoção e a postura natural dos membros pélvicos
foram mantidas, haja vista que, houve apenas a secção de um componente do
tendão calcanear comum, entendeu-se que não havia necessidade de proceder à
imobilização, conforme relatou REZENDE et al. (2001) ao utilizarem prótese de
poliuretano de mamona como substituto de tendão do músculo gastrocnêmio de
coelhos. A imobilização do membro predispõe a formação de aderências, uma
vez que após o trauma há extravasamento de exsudato serofibrinoso para fora
dos tecidos. Segundo BUUNNELL (1956), esse material extravasado é rico em
92
proteína e fibrina, limitando o deslizamento do tendão dentro de uma estreita
bainha e, quando organizado em associação com a proliferação fibroblástica
resultará em aderência tendinosa, justificando, portanto, a ausência de
imobilização.
A discreta quantidade de fibrina observada nos grupos GCT e GCT-E
sugere que não houve hemorragias, situação confirmada pela ausência nos
cortes histológicos, já que essa proteína é um componente importante na cascata
de coagulação conforme afirmaram SLATTER (1998) e COELHO (2002).
Segundo GIGANTE et al. (1996) e DE PALMA et al. (2006) essa proteína pode
agir como barreira física à disseminação de patógenos e pode ser observada em
tecidos com inflamação intensa como a encontrada nos grupos GC e GE. A
ausência das células-tronco mesenquimais nesses grupos permitiu que o quadro
inflamatório apresenta-se de maneira mais intensa. BARTHOLOMEW et al. (2002)
verificaram que essas células podem imunomodular tipos celulares tanto do
sistema imune inato, como do sistema imune adaptativo e diminuir a quantidade
de Interleucina 12 que é responsável pela secreção de interferon-gama, o qual
estimula a produção de células imunológicas pelas células natural killers (NK) e
pelos linfócitos T auxiliares.
A quantidade de infiltrado de polimorfonucleados encontrados nos
grupos GC, GE e GCT-E, pode ser explicada pela presença da reação
inflamatória, conforme citou COELHO (2002). Mas, ao comparar os resultados
entre os grupos, este tipo celular foi mais intenso nos grupos GE e GCT-E devido
à resposta inflamatória provocada pela matriz de colágeno presente no material
analisado. VIOLA et al. (2007) e JÚNIOR (2010) avaliando lesões na cartilagem
articular não encontraram esponja de colágeno em nenhuma lâmina histológica
após duas semanas da aplicação. Os resultados deste estudo diferem dos
achados encontrados pelos pesquisadores, uma vez que aos 90 dias de pós-
operatório, resquícios da esponja de colágeno rodeados por macrófagos típicos
ainda eram encontrados no tecido conjuntivo ao longo das fibras colágenas.
As células gigantes e multinucleadas encontradas ao redor dos
fragmentos de esponja se formaram pela fusão dos citoplasmas dos macrófagos,
cuja função foi de separar, isolar ou envolver a matriz esponjosa. O mesmo
achado foi descrito por BERTONI et al. (1990), quando utilizou fio de fibra de
93
carbono no reparo de tendões flexores de equinos. Os resultados sugerem que
apesar de serem considerados biocompatíveis, os biomateriais desencadeiam
uma reação inflamatória persistente, conforme a encontrada nos grupos GE e
GCT-E, o que poderia resultar na modificação do potencial terapêutico. Segundo
POTIER & PETITE (2005), em certas ocasiões a presença de um material que
sirva de suporte é indispensável quando se necessita reconstituir um tecido
adulto, porém nenhum demonstrou possuir todas as características almejadas
para esta função.
Nas leituras histológicas realizadas aos 45 dias e 90 dias de PO, não
foi observada estrutura tecidual, como tecido conjuntivo denso que indicasse
cicatrização total das lesões tendíneas em todos os grupos. Porém, quando
comparadas as medianas das variáveis para quantidade de fibroblastos e
neovascularização, observou-se que nos animais do grupo GCT e do GCT-E a
organização de fibroblastos foi mais intensa e significativa aos 45° dias de PO.
Esses dados estão de acordo com os encontrados por JUNCOSA-MELVIN et al.
(2006), que implantaram esponja de colágeno com células-tronco autógenas para
recuperação do tendão patelar de coelhos e observaram manifestações de
melhora mecânica e histopatológica dos tendões após cirurgia.
O grupo que recebeu células associadas à matriz extracelular de
colágeno apresentou fibroblastos mais organizados com deposição de colágeno
caracterizando o processo de remodelamento das fibras tendíneas. Estes
resultados diferem daqueles observados por PACINI et al. (2007), os quais
apontam que a utilização de MEC é desnecessária, sendo que os resultados
podem ser favorecidos somente com a injeção de uma rica solução de células da
MO diretamente na lesão. Já NIRMALANANDHAN et al. (2006) verificaram que a
utilização da matriz extracelular e células mesenquimais auxiliam principalmente
no ganho de resistência do tendão durante a primeira fase de regeneração
tecidual em tendões de ratos. Portanto, os resultados obtidos são contraditórios, e
precisam ser melhores analisados.
A neovascularização observada esteve relacionada com a
hipercelularidade nos grupos GCT e GCT-E. Segundo GNECCHI et al. (2008), as
células-tronco mesenquimais secretam uma variedade de citocinas e fatores de
crescimento que possuem atividade tanto parácrina como autócrina. Esses
94
fatores quando secretados exercem ação pró-angiogênica e efeito reparador
endógeno que estimulam a neovascularização. Por ser um processo dinâmico, a
angiogênese restabeleceu a rede vascular e demonstrou aumento expressivo no
número de vasos durante a cicatrização. Para FRIEDRICH et al. (2001) e DE
PALMA et al. (2006), a rede vascular formada durante os sete primeiros dias após
uma lesão tende a regredir a partir do 15° dia. Esse achado não foi observado no
presente estudo, uma vez que os grupos GCT e GCT-E ainda apresentaram
neovascularização aos 45 dias de PO. Resultados semelhantes foram
encontrados por HATAKA (1998), que relatou a persistência de vascularização
até os 60 dias em tendões flexores de cães submetidos à tenotomia.
Conforme ocorreu a progressão do processo de reparação tecidual
verificou-se a diminuição da celularidade e da neovascularização nas amostras de
todos os grupos, provavelmente pela progressiva maturação do tecido de
granulação com deposição de colágeno, que segundo POOL (1996) exerce
pressão mecânica sobre as delicadas paredes de capilares neoformados, levando
à diminuição da vascularização.
Um resultado inesperado foi a presença de condrócitos com formação
de fibrocartilagem ectópica no centro do reparo tendíneo. O fato foi observado
apenas nos grupos que receberam o implante de células-tronco mesenquimais
(GCT e GCT-E). Casos semelhantes embora raros, têm sido descritos na
literatura como uma resposta ao trauma conforme relatos de BOSCH et al. (2000).
Contrariando esses resultados, CREVIER-DENOIX et al. (2005) afirmaram que
grande parte das formações de cartilagem fibrosa dos tendões ocorre
principalmente nas áreas próximas aos ossos devido à compressão crônica das
fibras tendíneas que estimula a produção de cartilagem pelas células
mesenquimais quando há redução da oferta de oxigênio. No tendão calcanear
comum, RALPHS et al. (1998) descreveram a presença dessas células em áreas
próximas ao calcâneo, justamente por ser uma área de adesão do tendão ao osso
e pelos movimentos de dorsoflexão.
Por meio da microscopia eletrônica de transmissão, observou-se nos
grupos GC e GE uma região cicatricial caracterizada por alta densidade de fibras
colágenas delgadas e desorganizadas com perda do arranjo, como as
encontradas no trabalho de TOVAR (2009). No entanto, o discreto rearranjo das
95
fibrilas de colágeno encontrado nos grupos GCT e GCT-E propõe que a
cicatrização natural por si só não é suficiente para restabelecer uma estrutura
organizada quando comparada à do tecido não lesionado, pois existe uma
correlação positiva entre o paralelismo das fibras e a capacidade de suportar
força de tensão pelo tendão. Conforme afirmaram DOWLING et al. (2000), um
tendão com fibras paralelas seria mais resistente do que outro com fibras
entrelaçadas e consideram que o sucesso de uma cicatrização depende do
alinhamento das fibras, situação não observada em sua totalidade no decorrer
deste estudo, já que aos 90 dias de PO, as amostras analisadas ainda
apresentavam-se em fase de remodelamento.
O aumento da quantidade de fibras de menor diâmetro após a lesão
tendínea foi um dos problemas que apareceram na cicatrização, principalmente
nos grupos GC e GE, achado também relatado por ASLAN et al. (2008). Como
nesses grupos não se empregou a terapia celular, provavelmente a formação das
ligações cruzadas entre as fibras de colágeno ocorreu enquanto ainda não
estavam paralelas, situação atribuída em parte, ao retardo no processo cicatricial.
Além disso, REEF (2001) afirmou que o animal deve ser submetido a um
programa de exercício controlado para que a atividade provoque linhas de tensão
ajudando na orientação das fibras antes que as ligações se formem.
Apesar de não ter sido realizada a caracterização do tipo de colágeno
das amostras, acredita-se que o tecido tendíneo encontrado aos 45 dias de PO
apresentou colágeno inicialmente imaturo com arquitetura desorganizada e fibras
de pequeno diâmetro, caracterizando colágeno do tipo III ou tipo II imaturo. Aos
poucos as fibras aumentaram de diâmetro, e conforme ALVES & MIKAIL (2006),
adquiriram características de fibras do tipo I. Portanto, a reparação tendínea
evoluiu com a deposição contínua das fibras colágenas junto ao local lesionado,
em progressiva orientação longitudinal, principalmente no grupo GCT-E, em
concordância com os achados de NIRMALANANDHAN et al. (2006).
Uma preocupação pertinente sobre o uso terapêutico de células-tronco
é a possibilidade de que a injeção das células no local da lesão possa se
diferenciar em uma linha inesperada de tenócitos e ocorrer evolução celular
inespecífica, causando o aparecimento de tecidos ectópicos. Conforme citado
anteriormente, foram encontradas células com características epitelióides típicas
96
de células carcinogênicas, com grande pleomorfismo no grupo GCT. Segundo
HARRIS et al. (2004), dependendo da matriz extracelular utilizada, pode haver
uma reatividade celular no receptor que interfere na regeneração. Esta
possibilidade foi demonstrada quando células associadas à esponja de colágeno
foram utilizadas na regeneração formaram tecido ósseo ectópico em reparos de
tendão de coelhos, segundo estudos de AWAD et al. (2003).
Embora a reparação tendínea possa ocorrer de forma intrínseca, tal
processo é mais lento quando comparado à participação extrínseca de células
produtoras de colágeno e adequado suprimento sanguíneo, conforme
GOODSHIP & BIRCH (1996). Dessa maneira, esses resultados permitem inferir
que a engenharia de tecidos utilizando células-tronco mesenquimais expandidas
in vitro, associadas à matriz extracelular apresenta tratamento clínico promissor
para a reparação de tendões. Contudo, estudos complementares devem ser
realizados para a determinação dos diferentes genes de expressão dos fatores de
crescimento, visando uma melhor compreensão da reparação tendínea in vivo,
obtendo-se tecido autólogo funcional.
CONCLUSÕES
Células-tronco mesenquimais alógenas da medula óssea estimulam a
reorganização das fibras colágenas, formação de fibrocartilagem e podem
estimular a diferenciação de células com características tumorais. Quando
associadas à matriz de colágeno, também promovem rearranjo das fibras com
formação de fibrocartilagem, mas desencadeia uma reação inflamatória tardia e
expressiva.
As avaliações histológicas e ultraestruturais sugerem que a terapia
celular promove discreta vantagem em termos de progresso e qualidade da
reparação tendínea, mas a análise ultraestrutural mostrou de forma mais clara a
deposição contínua das fibras colágenas em progressiva orientação longitudinal.
97
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101
CAPÍTULO 4 - CONSIDERAÇÕES FINAIS
As informações contidas na literatura consultada foram relevantes para
compreender as propriedades físicas e mecânicas apresentadas pelos músculos,
tendões e ligamentos, sendo que na rotina veterinária, lesões do aparelho
locomotor são frequentes e promovem alterações posturais com difícil correção,
além de prejuízos econômicos quando envolvem animais de produção.
Na tentativa de minimizar os danos decorrentes das lesões tendíneas
inúmeras pesquisas têm sido desenvolvidas em busca de materiais adequados à
cicatrização, visto que as terapias convencionais utilizadas nem sempre
apresentam resultados satisfatórios. Por essa razão, a medicina regenerativa
desponta como uma ferramenta terapêutica no tratamento de doenças
degenerativas e traumáticas, para as quais ainda não há tratamento efetivo.
Com o objetivo de aprimorar a prática cirúrgica ortopédica,
experimentos interdisciplinares têm sido realizados a fim de proporcionar ao
cirurgião veterinário técnicas inovadoras que facilitem a reconstituição de ossos,
articulações, tendões, músculos e nervos. Além disso, a utilização da terapia
celular associada à implantação de enxertos e biomateriais tem permitido a
obtenção de bons resultados em situações de alta complexidade, cujo tratamento
é considerado ineficaz e dispendioso.
Atualmente, as terapias celulares, a bioengenharia e a ciência de
biomateriais surgem como novas áreas repletas de promessas e de desafios, as
quais estão ligadas ao desenvolvimento tecnológico e científico crescente das
instituições de ensino e, principalmente das empresas voltadas à produção de
materiais, portanto, tem auxiliado os pesquisadores na obtenção de protocolos
terapêuticos eficazes.
É incontestável que existe um grande entusiasmo quanto às
possibilidades de empregar as células-tronco para tratar diversas doenças, no
entanto, os maiores desafios são a identificação de fontes de células purificadas e
a padronização de métodos adequados para condicionar sua diferenciação em
um tipo de tecido desejado. No momento, as fontes mais promissoras para terapia
são as células-tronco adultas, pois o uso de linhagens embrionárias é mais
problemático, uma vez que sua manipulação exige melhor aperfeiçoamento até
102
que possam ser amplificadas in vitro e dirigidas quanto à sua diferenciação in
vivo.
Sabe-se que a utilização de células mesenquimais indiferenciadas
exige o isolamento, a identificação e a caracterização dessas células, tornando
sua utilização onerosa na rotina clínica e cirúrgica. Os testes clínicos ainda são
incipientes e, em muitos casos, dispendiosos, compreendendo resultados que não
comportam interpretações unânimes. Além disso, faltam estudos sobre as
principais fontes de células-tronco, métodos de purificação e expansão em
cultura, associados a marcadores específicos para acompanhar o progresso das
células.
Ainda que a base imunomagnética e o meio de cultura MesenCult®
proporcionem condições ideais para a expansão celular e que o emprego de
células-tronco associadas ou não a matriz de colágeno estimule a reorganização
das fibras colágenas in vivo, ainda existem questionamentos sobre a terapia
celular que precisam ser esclarecidos. Uma vez que, o transplante de células
indiferenciadas para tecidos lesionados podem estimular a formação de tecidos
com aspectos indesejáveis e a diferenciação em linhagens de células com
características tumorais.
Deste modo, é fundamental que estudos posteriores preconizem a
utilização de fatores de crescimento, visando o controle da expansão e
diferenciação celular in vitro. Aliado a isso, o uso de marcadores celulares devem
ser associados a tais terapias, sem comprometer a viabilidade celular e o
potencial de diferenciação, o que permitirá o acompanhamento do processo
regenerativo e a identificação das principais células associadas ao processo
cicatricial in vivo.
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