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Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRJ Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho IBCCF TANIRA GIARA MELLO Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais do Cordão Umbilical em Modelo Animal de Acidente Vascular Encefálico Hemorrágico RIO DE JANEIRO 2019

Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

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Page 1: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – IBCCF

TANIRA GIARA MELLO

Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais do

Cordão Umbilical em Modelo Animal de Acidente Vascular

Encefálico Hemorrágico

RIO DE JANEIRO

2019

Page 2: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

ii

TANIRA GIARA MELLO

Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais do Cordão

Umbilical em Modelo Animal de Acidente Vascular Encefálico Hemorrágico

Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia) do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Fisiologia)

Primeiro orientador: Dra. Rosalia Mendez Otero

Segundo orientador: Dr. Pedro Moreno Pimentel Coelho

Co-orientador: Dr. Paulo Henrique Rosado de Castro

Rio de Janeiro

2019

Page 3: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

iii

Mello, Tanira Giara.

Avaliação do potencial terapêutico de células mesenquimais do cordão umbilical

em modelo animal de acidente vascular encefálico hemorrágico. / Tanira

Giara Mello. – Rio de Janeiro: UFRJ / Centro de Ciências da Saúde, Instituto

de Biofísica Carlos Chagas Filho, 2019.

xviii, 94 f.: il.; 31 cm.

Orientadores: Rosalia Mendez Otero e Pedro Moreno Pimentel Coelho.

Coorientador: Paulo Henrique Rosado de Castro.

Tese (doutorado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro / Instituto de

Biologia, Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia), 2019.

Referências: f. 87-94 .

1. Acidente Vascular Cerebral. 2. Terapia Baseada em Transplante de

Células e Tecidos. 3. Células-Tronco Mesenquimais. 4. Cordão Umbilical. 5.

Fisiologia - Tese. I. Mendez-Otero, Rosalia. II. Coelho, Pedro Moreno

Pimentel. III. Rosado de Castro, Paulo Henrique. III. Universidade Federal do

Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica, Pós-Graduação em Ciências Biológicas

(Fisiologia). IV. Título.

Page 4: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

iv

Tanira Giara Mello

Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais do Cordão Umbilical em

Modelo Animal de Acidente Vascular Encefálico Hemorrágico

Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia) do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Fisiologia)

Aprovada por:

_______________________________________ Dra Rosália Mendez Otero

______________________________________ Dr Pedro Moreno Pimentel Coelho

_____________________________________ Dr Paulo Henrique Rosado de Castro

_____________________________________ Dra Fernanda Ferreira Cruz (Revisora)

_____________________________________ Dra Ana Maria Blanco Martinez

_____________________________________ Dra Leandra Santos Baptista

_____________________________________ Dr Wagner Baetas Cruz

Rio de janeiro, de de 2019.

Page 5: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

v

O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Neurobiologia Celular e Molecular

do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de

Janeiro na vigência de auxílios concedidos pela Fundação Carlos Chagas Filho de

Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), pelo Conselho Nacional

de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e pelo Departamento de Ciência

e Tecnologia (DECIT) do Ministério da Saúde.

Page 6: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

vi

Ao meu pequeno e amado Samir,

que dividiu parte da sua infância com esse trabalho.

Page 7: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

vii

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora Professora Rosália Mendez-Otero, por me aceitar como

aluna no seu grupo de pesquisa, apesar da minha condição em ter que dividir o

trabalho desta pesquisa com emprego e maternidade.

Ao meu segundo orientador Professor Pedro Moreno Pimentel Coelho, que foi

quem me ensinou a trabalhar com modelo animal e me deu imenso apoio para a

realização desta pesquisa.

Ao meu Co-orientador Professor Paulo Henrique Rosado de Castro, por todo

suporte para a realização dos experimentos de biodistribuição e ressonância

magnética, assim como apoio em diversos outros momentos.

À minha ex-chefe Ana Maria Braghirolli, ao meu atual chefe Julio César Suíta e

à diretoria do Instituto de Engenharia Nuclear, por terem me concedido um período de

liberação parcial de horas, para que eu pudesse fazer as disciplinas e realizar a parte

experimental desta Tese.

Aos diversos colaboradores deste trabalho: Professor Sérgio Augusto Lopes de

Souza, Professora Bianca Gutfilen, Professor Fernando Fernades Paiva, Fernanda

Meirelles, Juliana Ferreira Vasques, Teresa Puig Pijuan e Maria Fernanda.

À professora Fernanda Ferreira Cruz, que aceitou o convite para ser revisora

desta Tese.

Aos alunos de iniciação científica Raphael Santos de Almeida Rezende de

Mattos, William Simões Rangel Junior e Carla Araújo.

Ao técnico Felipe Marins e aos colegas do Laboratório de Neurobiologia Celular

e Molecular por todas as vezes que solicitei suporte.

À Erica Lima e à Marcilene pelo apoio no meu trabalho do IEN, quando precisei

me ausentar para realizar este trabalho.

Aos meus amigos de IEN Héricka Kennup, João Francisco e Brandão pelo

apoio moral.

Page 8: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

viii

Aos meus pais Iara e Luiz e meus irmãos Márcia e Marcelo, que mesmo à

distância, sempre acreditaram em mim.

Aos meus sogros Lúcia e Angelo.

Ao meu filho Samirzinho, que é uma luz na minha vida, e levantou meu astral e

meu deu energias para prosseguir, em diversos momentos difíceis.

Ao meu marido Samir, que sem o seu apoio não seria possível eu realizar o

doutorado.

Às agências de fomento CNPq, FAPERJ e ao Ministério da Saúde pelo

financiamento a esta pesquisa.

Page 9: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

ix

Resumo

MELLO, Tanira Giara. Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais do Cordão Umbilical em Modelo Animal de Acidente Vascular Encefálico Hemorrágico. Rio de Janeiro, 2019. Tese de doutorado em Ciências Biológicas – Fisiologia. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro.

O acidente vascular encefálico hemorrágico (AVEh) representa entre 10 a 20% de causas de AVE no mundo e tem uma taxa de letalidade de 40% em um mês, assim como alto índice de morbidade. O volume inicial do hematoma e a sua expansão são fatores que afetam o prognóstico do paciente. Apesar disso, até o momento não há um tratamento específico, existindo apenas terapias sintomáticas e/ou de apoio. Nesse contexto, a terapia celular representa uma perspectiva promissora para os pacientes com AVEh. Neste trabalho, estudamos a terapia celular realizada com células mesenquimais estromais extraídas da geleia de Wharton de cordão umbilical humano (hWJ-MSCs), injetadas por via intravenosa, em modelo animal de injeção de colagenase, que promove hemorragia dentro da região estriatal do cérebro de ratos. Foram estabelecidos dois graus diferentes de severidade da lesão (moderado e severo), assim como foram testadas duas janelas terapêuticas, uma na fase hiperaguda (1 h) e outra na fase aguda (24 h) após o AVEh severo, bem como o transplante na fase aguda (24 h) do AVEh moderado. Foi avaliada a eficácia da terapia celular através da realização de testes funcionais e da análise do volume de lesão em imagens adquiridas por ressonância magnética. No modelo de AVEh moderado, não foram demonstrados prejuízos funcionais permanentes, não sendo possível avaliar a eficácia do tratamento com os testes utilizados (Rotarod, Elevated body swing test e teste do cilindro). No entanto, houve uma redução estatisticamente significativa no volume de lesão no grupo tratado com hWJ-MSCs, em comparação ao grupo veículo. No modelo de AVEh de grau severo, no grupo tratado em 24 h, observou-se prejuízo funcional dos animais do grupo veículo no elevated body swing e no teste do cilindro em todos os tempos avaliados, e de forma transiente no teste do rotarod. No entanto, o grupo hWJ-MSCs não apresentou diferenças significativas em relação ao grupo veículo. A análise do volume de lesão também não demonstrou diferenças significativas entre os grupos. Já no modelo de AVEh de grau severo tratado com hWJ-MSCs apenas 1 h após início da hemorragia, não conseguimos detectar diferenças entre os grupos nos testes funcionais e na análise do volume de lesão. Esses resultados nos indicam que a eficácia da administração intravenosa de hWJ-MSCs para redução do volume de lesão parece depender do volume inicial do hematoma e que a administração das células na fase hiperaguda ou início da fase aguda da hemorragia parece não afetar o desfecho do AVEh severo. A biodistribuição das hWJ-MSCs marcadas com Tecnécio 99m mostrou haver uma captação preferencial pelos pulmões, rins, fígado e baço nas primeiras 24 h após a injeção, nos modelos de AVEh moderado e severo, assim como uma maior captação das células no hemisfério cerebral ipsilateral à lesão, indicando uma possível migração em direção ao hematoma.

Palavras-chave: Acidente vascular encefálico hemorrágico, terapia celular, células estromais mesenquimais, biodistribuição

Page 10: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

x

Abstract

Intracerebral hemorrhage (ICH) represents between 10 and 20% of the causes of stroke worldwide and has a 40% mortality rate in one month, as well as a high morbidity rate. The initial hematoma volume and its expansion are factors that affect the prognosis of the patient. Nevertheless, there is no specific treatment so far, only symptomatic therapies and / or supportive care. In this context, cell therapy represents a promising perspective for ICH patients. In this study, we evaluated the cellular therapy performed with intravenous injection of human umbilical cord Wharton jelly stromal mesenchymal cells (hWJ-MSCs), using the collagenase injection ICH model to promote hemorrhage within the striatal region of the rat brain. We used two different degrees of injury severity (moderate and severe), as well as tested two therapeutic windows, one in the hyperacute phase and one in the acute phase in the model of severe ICH. We evaluated the effectiveness of cell therapy by performing behavioral tests and analyzing the lesion volume using magnetic resonance imaging. In the moderate ICH model, no permanent functional impairment was demonstrated, and it was not possible to evaluate the efficacy of the treatment with the tests used. However, there was a statistically significant reduction in lesion volume in the hWJ-MSCs group compared to the vehicle group. In the severe ICH model, in the group treated at 24 h, we observed functional impairment of the animals of the vehicle group in the elevated body swing test and cylinder test at all times evaluated, and a transient impairment in the rotarod test. The hWJ-MSCs group did not present significant differences in relation to the vehicle group. Injury volume analysis showed no significant differences between groups. In the severe ICH model which received hWJ-MSCs 1 h after the onset of bleeding, we could not detect differences between groups in the behavioral tests and in the lesion volume analysis. These results showed that the efficacy of intravenous administration of hWJ-MSCs to reduce lesion volume seems to depend on the initial hematoma volume and that administration of cells in the hyperacute or early acute phase of hemorrhage for severe ICH does not seem to affect the outcome of severe ICH. The biodistribution of technetium 99m-labeled hWJ-MSCs showed preferential uptake by the lungs, kidneys, liver and spleen within the first 24 h after injection, in moderate and severe ICH models, as well as increased uptake of cells in the ipsilateral brain hemisphere, indicating a possible migration towards the hematoma.

Keywords: intracerebral hemorrhage, stroke, cell therapy, mesenchymal stromal cells,

biodistribution

Page 11: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Número de óbitos no Brasil causados por acidente vascular encefálico.......2

Figura 2: Representação do modelo de injeção de colagenase .................................... 6

Figura 3: Representação da fisiopatologia do AVEh ................................................... 12

Figura 4: Representação da aparência da hemorragia na ressonância magnética e a

estrutura da hemoglobina e seus produtos de oxidação ............................................. 18

Figura 5: Representação gráfica dos modelos animais .............................................. 25

Figura 6: Representação da extração das células mesenquimais da geleia de Wharton

de cordão umbilical humano........................................................................................ 37

Figura 7: Caracterização das MSCs de cordão umbilical por imunofenotipagem.. ..... 47

Figura 8: Diferenciação das hWJ-MSCs em linhagens celulares mesodérmicas. ....... 48

Figura 9: Teste do Rotarod no AVEh moderado ......................................................... 49

Figura 10: Elevated body swing test no AVEh moderado. .......................................... 50

Figura 11: Teste do cilindro no AVEh moderado ......................................................... 51

Figura 12: Volume de lesão nos animais com AVEh moderado.................................. 52

Figura 13: Avaliação do volume de lesão nos animais com AVEh moderado. ............ 53

Figura 14: Representação do volume de hematoma residual nos animais com AVEh

moderado em uma sequência T2* .............................................................................. 54

Figura 15: Avaliação do volume dos hemisférios cerebrais nos animais com AVEh

moderado .................................................................................................................... 55

Figura 16: Avaliação dos hemisférios cerebrais nos animais com AVEh moderado ... 56

Figura 17: Teste do Rotarod no AVEh severo 24 h.. ................................................... 57

Figura 18: Elevated body swing test no AVEh severo 24 h ......................................... 58

Page 12: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

xii

Figura 19: Teste do cilindro no AVEh severo 24 h. ..................................................... 59

Figura 20: Volume de lesão nos animais com AVEh severo 24 h. .............................. 61

Figura 21: Avaliação do volume de lesão nos animais com AVEh severo. ................. 62

Figura 22: Representação do volume de hematoma residual nos animais com AVEh

severo 24h em uma sequência T2*. ............................................................................ 63

Figura 23: Avaliação do volume dos hemisférios cerebrais nos animais com AVEh

severo 24 h. ................................................................................................................. 64

Figura 24: Avaliação dos hemisférios cerebrais nos animais com AVEh severo 24 h. 65

Figura 25: Avaliação funcional dos animais AVEh severo que receberam injeção 1 h

após cirurgia.. .............................................................................................................. 67

Figura 26: Volume de lesão nos animais com AVEh severo 1 h.. ............................... 69

Figura 27: Avaliação do volume de lesão nos animais com AVEh severo 1 h.. .......... 70

Figura 28: Representação do volume de hematoma residual nos animais com AVEh

severo 1h em uma sequência T2*. ............................................................................. 71

Figura 29: Avaliação do volume de lesão nos animais com AVEh severo 1 h versus 24

h. ................................................................................................................................. 71

Figura 30: Representação da imagem de corpo inteiro dos animais que receberam

MSCs marcadas com 99mTc ........................................................................................ 73

Figura 31: Distribuição das hWJ-MSCs marcadas com 99m Tc. ................................... 74

Figura 32: Distribuição das hWJ-MSCs marcadas com 99m Tc nos hemisférios

cerebrais...................................................................................................................... 75

Page 13: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

xiii

LISTA DE SIGLAS

AD-MSCs – células estromais mesenquimais extraídas de tecido adiposo

AVE – acidente vascular encefálico

AVEh - acidente vascular encefálico hemorrágico

BHE – barreira hematoencefálica

BM-MSCs – células estromais mesenquimais extraídas da medula óssea, do inglês

bone marrow

BSA – soro de albumina bovina, do inglês bovine serum albumine

CMMO – células mononucleares derivadas da medula óssea

CXCR4 - receptor de quimiocina CXC tipo 4

EBST – teste de balanço corporal elevado, do inglês elevated body swing test

ESCs - células tronco embrionárias, do inglês embryonic stem cells

DMEM – meio Eagle modificado por Dulbecco, do inglês Dulbecco’s modified Eagle

medium

FGF-2 - fator de crescimento de fibroblasto 2, do inglês fibroblast growth fator 2) e

interleucina 1β (IL-1β)

GBD – carga global de doenças, do inglês global burden of disease

GFAP – proteína glial fibrilar ácida, do inglês glial fibrillary acidic protein

GRE - eco gradiente, do inglês Gradient echo

hWJ-MSCs – células mesenquimais humanas extraídas da geleia de Wharton, do

inglês human Wharton’s jelly

IDO – indoleamina 2,3 dioxigenase

IFN-γ - interferon γ

IL-1β - interleucina 1β

Page 14: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

xiv

IL-6 – interleucina 6

IL-10 – interleucina 10

iPSCs – células-tronco pluripotentes induzidas do inglês induced pluripotent stem cell

ISCT - Sociedade Internacional de terapia Celular, do inglês International Society of

Cell Therapy

MAC – complexo de ataque a membrana, do inglês membrane attack complex

MHC – complexo principal de histocompatibilidade, do inglês major histocompatibility

complex

MMPs – metaloproteinases de matriz, do inglês matrix metalloproteinases

MSCs – células estromais mesenquimais, do inglês mesenchymal stromal cells

NSCs – células-tronco neurais, do inglês neural stem cell

NOS2 – óxido nítrico sintetase 2, do inglês nitric oxide synthase 2

PBS – tampão salina fosfato, do inglês phosphate buffer saline

PFA - paraformaldeído

PGE2 – prostaglandinas E2

PPARγ - receptor ativado por proliferadores de peroxissoma gama, do inglês

peroxisome proliferator-activated receptors

RGCs - células ganglionares da retina, do inglês retinal ganglion cells

RM – ressonância magnética

rMSCs – células estromais mesenquimais de ratos

ROI - região de interesse, do inglês region of interest

ROS – espécies reativas de oxigênio, do inglês reactive oxygen species

SDF-1 - fator derivado de célula estromal 1, do inglês stromal cell-derived factor 1

SFB – soro fetal bovino

Page 15: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

xv

SNC – sistema nervoso central

SPECT – tomografia computadorizada por emissão de fóton único, do inglês single

photon emission computed tomography

STICH II – Ensaio cirúrgico para hemorragia intracerebral II, do inglês Surgical Trial

for Intracerebral Haemorrhage II

TGF-1- fator de transformação do crescimento, do inglês transforming growth fator 1

TLR – receptor do tipo toll, do inglês toll-like receptor

TNF-α – fator de necrose tumoral, do inglês tumor necrosis factor α

TSG-6 – proteína do gene 6 estimulada por TNF, do inglês TNF-stimulated gene 6

protein

UC-MSCs - células estromais mesenquimais extraídas de cordão umbilical

VEGF - fator de crescimento do endotélio vascular, do inglês vascular endothelial

growth fator

Page 16: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

xvi

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS ............................................................................................... VII

Resumo .................................................................................................................... IX

Abstract ..................................................................................................................... X

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. XI

LISTA DE SIGLAS ................................................................................................. XIII

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 1

1.1 ACIDENTE VASCULAR ENCEFÁLICO .............................................................. 1

1.2 ACIDENTE VASCULAR ENCEFÁLICO HEMORRÁGICO (AVEH) .................... 2

1.3 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS E TERAPIAS EM ACIDENTE VASCULAR

ENCEFÁLICO HEMORRÁGICO ................................................................................. 3

1.4 MODELOS PRÉ-CLÍNICOS DE AVEH ............................................................... 5

1.5 AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO SENSORIOMOTORA EM MODELOS ANIMAIS ..... 8

1.6 FISIOPATOLOGIA DO ACIDENTE VASCULAR ENCEFÁLICO HEMORRÁGICO

.......................................................................................................................... 10

1.7 AVALIAÇÃO DA EVOLUÇÃO DO AVEH POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA EM

MODELO ANIMAL .................................................................................................... 14

1.8 TERAPIA CELULAR ......................................................................................... 19

1.8.1 Células-tronco ................................................................................................ 19

1.9 TERAPIA CELULAR COM MSCS EM DOENÇAS NEUROLÓGICAS .............. 23

1.9.1 Terapia celular com MSCs no AVEh............................................................... 24

1.10 BIODISTRIBUIÇÃO DE CÉLULAS TRONCO APÓS TRANSPLANTE

INTRAVENOSO ........................................................................................................ 28

2. JUSTIFICATIVA ................................................................................................. 31

3. HIPÓTESE .......................................................................................................... 32

4. OBJETIVOS ....................................................................................................... 33

5. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 34

5.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS ............................................................................. 34

5.2 DESENHO EXPERIMENTAL PARA TESTE FUNCIONAL E RESSONÂNCIA

MAGNÉTICA ............................................................................................................. 34

5.3 CIRURGIA ........................................................................................................ 35

Page 17: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

xvii

5.4 EXTRAÇÃO DAS MSCS DA GELEIA DE WHARTON E CULTIVO CELULAR ....

36

5.5 CARACTERIZAÇÃO DAS MSCS DA GELEIA DE WHARTON ........................ 38

5.5.1 Imunofenotipagem das hWJ-MSCs ................................................................ 38

5.5.2.1 Diferenciação Condrogênica .................................................................... 39

5.5.2.2 Diferenciação Osteogênica ...................................................................... 39

5.5.2.3 Diferenciação Adipogênica ....................................................................... 40

5.6 ADMINISTRAÇÃO INTRAVENOSA DE CÉLULAS .......................................... 40

5.7 PERFUSÃO TRANSCARDÍACA ....................................................................... 41

5.8 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA.......................................................................... 41

5.8.1 Ressonância Magnética – Modelo AVEh moderado ....................................... 41

5.8.2 Ressonância Magnética – Modelo AVEh severo ............................................ 42

5.9 BIODISTRIBUIÇÃO ATRAVÉS DA MARCAÇÃO DE CÉLULAS COM 99m TC . 43

5.10 AVALIAÇÃO FUNCIONAL ................................................................................ 44

5.10.1 Rotarod ........................................................................................................... 44

5.10.2 Elevated body swing test ................................................................................ 44

5.10.3 Teste do cilindro ............................................................................................. 45

5.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................... 45

6. RESULTADOS ................................................................................................... 47

6.1 CARACTERIZAÇÃO DAS MSCS DA GELEIA DE WHARTON ........................ 47

6.2 AVALIAÇÃO FUNCIONAL DOS ANIMAIS COM AVEH MODERADO ............. 48

6.3 AVALIAÇÃO DO VOLUME DE LESÃO NOS ANIMAIS COM AVEH MODERADO

51

6.4 VOLUME DOS HEMISFÉRIOS NO AVEH MODERADO ................................. 54

6.5 AVALIAÇÃO FUNCIONAL DOS ANIMAIS COM AVEH SEVERO 24 H ........... 57

6.6 AVALIAÇÃO DO VOLUME DE LESÃO NOS ANIMAIS COM AVEH SEVERO

24H .......................................................................................................................... 59

6.7 VOLUME DOS HEMISFÉRIOS NO AVEH SEVERO 24 H ............................... 63

6.8 AVALIAÇÃO FUNCIONAL DOS ANIMAIS COM AVEH SEVERO 1 H ............. 66

6.9 AVALIAÇÃO DO VOLUME DE LESÃO NOS ANIMAIS COM AVEH SEVERO 1H

.......................................................................................................................... 68

6.10 BIODISTRIBUIÇÃO ATRAVÉS DA MARCAÇÃO DE CÉLULAS COM 99m TC7272

7. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 76

Page 18: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

xviii

7.1 AVALIAÇÃO DA TERAPIA COM HWJ-MSCS SOBRE O VOLUME DE LESÃO

EM ANIMAIS COM AVEH ......................................................................................... 76

7.2 AVALIAÇÃO DA TERAPIA COM HWJ-MSCS SOBRE O PREJUÍZO

FUNCIONAL DOS ANIMAIS COM AVEH ................................................................. 80

7.3 BIODISTRIBUIÇÃO DAS HWJ-MSCS EM ANIMAIS COM AVEH ...................... 83

8. CONCLUSÕES .................................................................................................. 86

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 87

Page 19: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

1

1. INTRODUÇÃO

1.1 ACIDENTE VASCULAR ENCEFÁLICO

O acidente vascular encefálico (AVE) é classicamente definido pela Organização

Mundial da Saúde como ―um conjunto de manifestações clínicas decorrentes de

perturbação neurológica focal ou global, de início súbito, com duração superior a 24

horas e/ou evolução para o óbito, atribuído a causa vascular‖. No entanto, a American

Heart Association e a American Stroke Association, consideram essa definição

desatualizada, pois leva em conta apenas os sintomas clínicos, sem considerar os

avanços em tecnologia, como as imagens por ressonância magnética (RM) ou

tomografia computadorizada, e incluiria também na sua definição infartos silenciosos

(SACCO et al., 2013; COUPLAND et al., 2017).

O AVE é a segunda principal causa de morte no mundo, sendo que em 2016

causou 5,5 milhões de mortes. Também é a segunda causa de incapacitação,

havendo mais de 80 milhões de sobreviventes de AVE no mundo. São estimados

116,4 milhões de anos de vida perdidos ajustados por incapacidade relacionados ao

AVE, segundo o estudo do GBD (GBD, do inglês Global Burden of Disease) de 2016

(JOHNSON, 2019). É um problema de saúde global, susceptível a aumentar no

futuro, devido às alterações demográficas em curso, incluindo o envelhecimento da

população e as transições de saúde observadas em países em desenvolvimento

(FEIGIN et al., 2015).

No Brasil, segundo o Sistema de Informação de Mortalidade do Datasus (2019),

entre 2015 e 2017, ocorreram 117.893 óbitos causados por acidente vascular

encefálico não especificado como hemorrágico ou isquêmico (Figura 1). Estatísticas

brasileiras indicam que em 2016, o AVE foi a segunda causa mais frequente de óbito

na população, apresentando uma taxa bruta de 52,2 mortes por 1000 habitantes. As

taxas padronizadas de morte para 100 mil habitantes foram de 62,5 para o sexo

masculino e de 43,4 para o sexo feminino (Ministério da Saúde, 2019).

Page 20: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

2

1.2 ACIDENTE VASCULAR ENCEFÁLICO HEMORRÁGICO (AVEH)

O AVE pode ser classificado nos tipos hemorrágico e isquêmico. O AVE

hemorrágico (AVEh) representa entre 10% a 20% dos casos no mundo (AN; KIM;

YOON, 2017). Uma hemorragia será classificada como um AVE se for causada por

um evento vascular, se resultar em uma injúria ao sistema nervoso central (SNC), e

se não for causada por origem traumática. O processo hemorrágico pode ser

subaracnóide ou intracerebral. A primeira ocorre quando há extravasamento de

sangue para o espaço subaracnóideo, geralmente por ruptura de aneurisma

intracraniano. Já a hemorragia intracerebral, pode ser definida como um sangramento

dentro do parênquima cerebral ou do sistema ventricular e que não foi causada por

trauma (SACCO et al., 2013). O AVEh apresenta uma incidência no mundo de 24,6

para cada 100.000 pessoas e uma taxa de letalidade de aproximadamente 40% em

um mês, 54% em um ano e 71% em 5 anos, sendo que metade das mortes ocorre

nas primeiras 48 a 72 h (AGUILAR e BROTT, 2011). O AVE do tipo isquêmico é mais

freqüente, mas o AVEh é responsável por mais mortes e mais anos de vida perdidos

ajustados por incapacidade (KATAN; LUFT, 2018). A prevalência no mundo em 2013

foi estimada em 4 milhões de homens e 3,36 milhões de mulheres (FEIGIN;

NORRVING; MENSAH, 2017). Apenas 12% a 39% dos pacientes atingem

independência funcional a longo prazo (AN; KIM; YOON, 2017).

A idade, o sexo e a etnia influenciam na incidência do AVEh, como provavelmente

também os fatores ambientais. Ocorre uma incidência maior entre asiáticos do que

Figura 1: Número de óbitos no Brasil por região, causados por acidente vascular encefálico não especificado isquêmico ou hemorrágico entre 2015 e 2017. Fonte: Datasus, 2019.

Page 21: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

3

em outros grupos étnicos, sendo que entre japoneses, há maior incidência em

homens do que em mulheres (não sendo essa diferença significativa em outros

grupos) (VAN ASCH et al., 2010). A incidência aumenta com a idade, sendo quase

dez vezes maior entre pessoas acima de 85 anos do que em pessoas entre 45 a 54

anos (VAN ASCH et al., 2010). No Brasil, pesquisa realizada nos hospitais de

Fortaleza mostrou que a incidência de AVEh intraparenquimal foi de 15,2% (DE

CARVALHO et al., 2011).

O principal fator de risco do AVEh é a hipertensão arterial, que está mais

associada a uma hemorragia localizada em região profunda no cérebro, enquanto a

segunda maior causa é a angiopatia amiloide cerebral, mais relacionada às

hemorragias que ocorrem nos lobos frontal, occipital e parietal. Outros fatores de risco

modificáveis associados são: tabagismo, álcool, hipercolesterolemia, diabetes

mellitus, e o uso de anticoagulantes, especialmente a warfarina, drogas

simpaticomiméticas (como cocaína, heroína e anfetaminas) e agentes

antiplaquetários (DASTUR; YU, 2017; AN; KIM; YOON, 2017). Um prognóstico de má

qualidade de vida parece estar mais associado a uma hemorragia intracerebral

profunda, na qual uma hemorragia nos núcleos da base pode causar déficits motores

mais graves ou prejudicar múltiplas funções corticais, como linguagem, sensação e

percepção espacial (CHRISTENSEN; MAYER; FERRAN, 2009).

1.3 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS E TERAPIAS EM ACIDENTE VASCULAR

ENCEFÁLICO HEMORRÁGICO

Os sintomas mais comuns do AVEh são cefaleia, náusea e vômito. A cefaleia

é mais comum em pacientes que apresentam grandes hematomas e é atribuída à

tração nas fibras de dor das meninges, aumento da pressão intracraniana ou sangue

no líquido cerebrospinal. Pacientes com grandes hemorragias frequentemente tem

uma diminuição no nível de consciência devido ao aumento da pressão intracraniana

e à compressão do tálamo e tronco cerebral. A deterioração neurológica é comum

antes e durante a internação hospitalar e pode indicar aumento precoce do hematoma

ou agravamento do edema (AN; KIM; YOON, 2017). A hemorragia intracerebral

profunda ocorre principalmente nos núcleos da base e cápsula interna (35-70%),

Page 22: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

4

tronco cerebral (5-10%) ou cerebelo (5-10%), correspondendo a dois terços da

hemorragia intracerebral espontânea, enquanto a hemorragia lobar corresponde a um

terço dos casos (AGUILAR e BROOT, 2011). Broderick et al. (1993) mostraram que o

volume de hemorragia intracerebral é um forte preditivo de mortalidade em 30 dias

para todos os locais de hemorragia intracerebral, combinado com a escala de

Glasgow. Pacientes com hemorragias parenquimais superiores a 60 mL e com escala

de Glasgow igual ou inferior a 8 apresentaram uma mortalidade prevista em 30 dias

de 91%. Além disso, 44% do total de pacientes, com volume de hemorragia tanto

superior quanto inferior a 60 mL, foram a óbito em 30 dias, sendo que a metade dos

óbitos ocorreu nos dois primeiros dias.

Estudo de Salihovic et al. (2013) mostrou que a melhor taxa de sobrevida em 6

meses ocorreu em pacientes que apresentavam um volume de hematoma de até 29

mL, enquanto a maior taxa de mortalidade ocorreu em pacientes com volumes de

hematoma maiores que 60 mL. Mais da metade dos pacientes que sobreviveram 6

meses após AVEh ficaram funcionalmente independentes, indicando que o volume de

hematoma influenciou significantemente no prognóstico no período de 6 meses.

O AVEh é uma emergência médica, sendo crucial que haja um diagnóstico

rápido e um manejo clínico eficiente do paciente, pois é comum a deterioração

neurológica ocorrer nas primeiras horas. Mais de 20% dos pacientes sofrem uma

diminuição na escala de coma de Glasgow de 2 ou mais pontos entre o atendimento

pré-hospitalar e a avaliação inicial na emergência médica. Além disso, 15% a 23%

dos pacientes demonstram deterioração contínua nas primeiras horas após a

chegada ao hospital. Assim, o risco da deterioração neurológica precoce e as altas

taxas de resultados ruins em longo prazo fazem com que seja necessário um

tratamento precoce agressivo (HEMPHILL et al., 2015).

O tratamento cirúrgico para muitos pacientes com AVEh espontâneo

permanece controverso (CHEN; ZENG; HU, 2014). A fundamentação teórica para a

retirada do hematoma gira em torno dos conceitos de prevenir uma herniação, reduzir

a pressão intracraniana, e diminuir o impacto fisiopatológico do hematoma no tecido

circundante, através da diminuição dos efeitos de massa e da toxicidade celular dos

produtos sanguíneos, como será discutido adiante (HEMPHILL et al., 2015). Ensaios

clínicos randomizados comparando a cirurgia com um tratamento conservador não

demonstraram um claro benefício a favor da intervenção cirúrgica. O momento para

Page 23: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

5

realizar a cirurgia também permanece controverso. Ensaios prospectivos

randomizados relataram uma janela de tempo para realizar a cirurgia entre 4 a 96

horas após início dos sintomas. A análise de subgrupos em STICH II (do inglês

Surgical Trial for Intracerebral Haemorrhage II) sugeriu uma tendência de resultados

melhores para pacientes operados antes de 21 horas. Uma meta-análise de 2186

pacientes de oito ensaios de cirurgia para AVEh encontrou que a cirurgia apresentava

melhores resultados quando realizada dentro de 8 horas após a hemorragia para

pacientes com as seguintes características: volume de hematoma entre 20 a 50 mL,

escala de coma de Glasgow entre 9 e 12, pacientes entre 50 a 69 anos e que

apresentavam hematomas superficiais sem hemorragia intraventricular (CHEN;

ZENG; HU, 2014; HEMPHILL et al., 2015).

Como se pode observar, as intervenções clínicas ou cirúrgicas existentes para

tratamento do AVEh são apenas terapias sintomáticas e/ou de apoio e não são

suficientemente efetivas para melhorar os maus resultados funcionais e a alta taxa de

mortalidade. Em vista dessa realidade, uma medicina regenerativa baseada em

células-tronco, representa uma perspectiva promissora para os pacientes com AVEh

(HEMPHILL et al., 2015; MA et al., 2015). A terapia celular para AVEh será tratada no

item 1.9.1.

1.4 MODELOS PRÉ-CLÍNICOS DE AVEH

Os modelos animais mais utilizados para induzir AVEh são o da injeção de

sangue autólogo, coletado de vasos superficiais e injetado geralmente na região do

estriado, e principalmente, o modelo da injeção de colagenase bacteriana tipo IV, VII

ou XI, descrito por Rosenberg et al. em 1990. Neste modelo, a colagenase leva à

degradação do colágeno presente na lâmina basal dos vasos sanguíneos cerebrais,

provocando assim o AVEh. Um terceiro modelo existente é o da inserção de um micro

balão no núcleo caudado. No entanto, esse último modelo serve apenas para estudar

os efeitos de massa do AVEh, pois não reproduz fatores como a toxicidade dos

elementos do sangue e a ruptura da barreira hematoencefálica (BHE/unidade

neurovascular) (MANAENKO et al., 2013).

O modelo de injeção de sangue mimetiza um único grande sangramento,

mas não reproduz um sangramento espontâneo, e nem o fato de que um

sangramento pode perdurar até 24 h em alguns pacientes. Assim, esse modelo não é

Page 24: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

6

apropriado para estudar sangramentos contínuos ou intervenções que possam afetar

o sangramento, mas é melhor para investigar mecanismos de danos hemorrágicos. Já

o modelo de injeção de colagenase (Figura 2), em que há a ruptura da lâmina basal

dos vasos sanguíneos, fazendo com que o sangue vaze para o tecido cerebral

adjacente, é mais utilizado por aqueles que querem uma hemorragia espontânea e

mais consistente (MACLELLAN et al., 2008), permitindo avaliar também a formação

do edema e as alterações histológicas resultantes da hemorragia (MANAENKO et al.,

2013).

Figura 2: Representação do modelo de injeção da colagenase, mostrando a inserção da agulha na região estriatal. A seringa contém colagenase bacteriana, que ao ser injetada degrada o colágeno presente nos vasos sanguíneos. Modificado de Huang et al.(2015).

Em estudo comparativo entre os dois principais modelos, Maclellan et al.

(2008) observaram que o modelo induzido por colagenase produzia déficts

neurológicos mais significantes, quando avaliados pelo teste da escala de déficits

neurológicos. Os dois modelos apresentaram déficit neurológico, porém com o

modelo induzido por colagenase, o déficit produzido foi significantemente maior do

que o com o modelo de injeção de sangue. A recuperação funcional também ocorreu

de maneira mais gradual com a injeção de colagenase, com os animais não

apresentado recuperação nos 28 dias de avaliação. Já os animais que receberam a

injeção de sangue mostraram recuperação no 21° dia. Também consideraram que o

modelo da injeção de colagenase era melhor para observar a ruptura da BHE,

demonstrando que a ruptura ocorria entre um período de 12 h a 2 dias após cirurgia,

Page 25: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

7

como demostrado através de aquisição de imagens por RM realizada com contraste.

Observaram também que a perda neuronal era maior neste modelo, visto que havia

uma lesão maior na região estriatal e em regiões mais distais do hematoma, já que

ocorria uma maior difusão da colagenase pelo tecido cerebral. O modelo da

colagenase também permite a obtenção de diferentes volumes de lesão, ou seja,

diferentes graus de severidade de AVEh. Maclellan et al. (2006) trabalharam com a

injeção estriatal de três diferentes doses de colagenase. Injetaram 0,06 U, obtendo

um grau de lesão branda; 0,12 U, obtendo uma lesão moderada; e 0,18 U de

colagenase, levando a uma lesão severa. Os volumes de lesão obtidos foram

crescentes, conforme o aumento da dose injetada, sendo estatisticamente diferentes

entre si.

Beray-Berthat et al. (2010) mostraram que um volume de lesão médio inicial

(no tempo de 24h), de 48.9 mm3 em ratos, produzido pela injeção de 0,12 U de

colagenase, conduzia a um déficit neurológico por aproximadamente 2 meses nos

animais. No beam walking test, o prejuízo funcional foi observado por 35 dias,

enquanto no teste de remoção de adesivo e de escala neurológica o déficit por 56

dias. Maclellan et al. (2006) já haviam também demonstrado um déficit por 21 dias

com uma lesão produzida com essa mesma dose de colagenase e por 28 dias

quando a lesão era induzida com 0,18 U de colagenase. Em termos de desvantagens

do modelo da injeção da colagenase, tem-se o fato da mesma poder causar

inflamação, visto que é de origem bacteriana (MANAENKO et al., 2013).

Como observado, nenhum dos dois modelos reproduz com precisão todos os

aspectos da doença humana. No entanto, ambos os protocolos resultam em

tamanhos de hematoma reprodutíveis e devem continuar a ser utilizados até melhores

métodos serem desenvolvidos (TURNBULL et al., 2019). Para o estudo dessa tese,

escolheu-se utilizar o modelo da injeção da colagenase, o qual se considerou mais

pertinente por reproduzir melhor o sangramento espontâneo que ocorre durante o

AVEh e causar um maior prejuízo neurológico nos animais.

Page 26: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

8

1.5 AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO SENSORIOMOTORA EM MODELOS ANIMAIS

Como mencionado anteriormente, a hemorragia intracerebral profunda ocorre

principalmente nos núcleos da base, mais frequentemente no putâmen (AN; KIM;

YOON, 2017), umas das regiões que fazem parte do estriado, junto com o núcleo

caudado. Nos roedores, essas duas regiões são estruturalmente fundidas,

diferentemente dos primatas (JIANG; KIM, 2018). Nos modelos animais de isquemia

cerebral e de AVEh, o córtex sensório-motor e/ou o estriado de um hemisfério são

frequentemente danificados com uma lesão severa (SCHALLERT, 2006), havendo a

perda de função de membros, concentrando assim os testes em avaliações motoras e

sensoriais (SCHAAR; BRENNEMAN; SAVITZ, 2010).

É importante que os testes funcionais sejam sensíveis para detectar as

deficiências que ocorrem após um AVE. As avaliações funcionais também oferecem a

oportunidade de monitorar os tratamentos farmacêuticos e os baseados em terapia

celular, através da observação das melhorias funcionais ao longo do tempo

(SCHAAR; BRENNEMAN; SAVITZ, 2010). Assim, com o objetivo de avaliar a perda

funcional em decorrência do AVEh e se houve ou não recuperação funcional dos

animais com a terapia celular proposta neste trabalho, foram escolhidos três

diferentes testes funcionais: Rotarod, elevated body swing test (EBST) e teste do

cilindro.

O teste do rotarod é utilizado para avaliar a coordenação motora e alterações

do equilíbrio nos roedores (SCHAAR; BRENNEMAN; SAVITZ, 2010). Este teste

consiste em colocar o animal sobre um cilindro giratório, avaliando-se o tempo que o

animal consegue se equilibrar sobre esse cilindro. Os animais com AVE demonstram

ter tempos significantemente mais curtos de permanência no cilindro. Pacientes que

sobreviveram a um AVE frequentemente sofrem de falta de coordenação motora, e

essa avaliação comportamental oferece uma abordagem para investigar déficits de

coordenação em modelo animal.

O EBST foi descrito em 1995 por Borlongan e Sanberg como um teste para

avaliar o comportamento motor assimétrico em um modelo animal de doença de

Parkinson. Logo depois disso, o EBST foi empregado pelo mesmo grupo de pesquisa

Page 27: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

9

também em estudos animais da doença de Huntington e AVE isquêmico. A ideia

básica é que quando o animal é levantado pela cauda e mantido verticalmente, ele

balança a cabeça para a esquerda ou para a direita. Enquanto os animais saudáveis

são capazes de balançar cerca de 50% para ambos os lados, animais com uma lesão

cerebral unilateral, devem apresentar uma direção de oscilação

dominante/tendenciosa. Sugere-se que a extensão de tal atividade de oscilação

enviesada, é uma medida de lateralização do comportamento motor. Nos casos de

lesão unilateral do estriado, já foi descrito que os animais apresentam uma

preferência pelo lado contralateral da lesão.

Assimetrias no uso do membro anterior durante a exploração espontânea das

paredes de um recipiente cilíndrico são comuns após isquemia cerebral ou

hemorragia unilateral em ratos e camundongos. Essa observação foi primeiramente

descrita por Schallert et al. (2000), que relataram que o teste distinguia com sucesso

os ratos sham de ratos que sofreram AVE isquêmico, até um mês após o evento. O

teste do cilindro é um teste de exploração vertical-lateral e fornece uma maneira de

avaliar o uso espontâneo do membro anterior de um roedor e tem sido usado em

vários modelos de lesão do sistema motor. Os ratos exploram ativamente as

superfícies verticais do cilindro, elevando-se em seus membros posteriores e

explorando a superfície com seus membros anteriores e vibrissas (SCHAAR;

BRENNEMAN; SAVITZ, 2010). O uso diminuído do membro anterior comprometido

tem sido interpretado como um déficit motor (JENSEN et al., 2011). Giraldi-Guimarães

et al. (2009) observaram que no teste do cilindro, em modelo de AVE isquêmico, os

animais do grupo controle tinham preferência ao uso da pata ipsilateral à lesão,

durante um período avaliado de 28 dias. O mesmo ocorreu no trabalho de

Vasconcelos-dos-Santos et al. (2010), que demonstrou não haver recuperação

funcional para os animais com AVE isquêmico do grupo controle, por um período de

77 dias.

Page 28: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

10

1.6 FISIOPATOLOGIA DO ACIDENTE VASCULAR ENCEFÁLICO HEMORRÁGICO

Durante uma hemorragia intracerebral, a rápida acumulação de sangue

dentro do parênquima cerebral leva à ruptura da anatomia normal e ao aumento da

pressão local. Dependendo da dinâmica de expansão do hematoma (crescimento), o

dano primário ocorre dentro de minutos a horas desde o início do sangramento e é

resultado principalmente de danos mecânicos associados ao efeito de massa

(ARONOWSKI; ZHAO, 2011). Embora mais de dois terços dos pacientes com AVEh

parem de sangrar logo após o icto, a expansão do hematoma ocorre em um terço dos

pacientes (20 a 40% dos pacientes) em 24 horas (HU et al., 2016).

Em um estudo em que se demonstrou que 22% dos pacientes tinham

expansão do hematoma, também se revelou que em 17% dos casos, a expansão

ocorreu após 6 horas ou mais do AVEh. Outro estudo mostrou que 38% dos pacientes

tiveram a expansão do hematoma dentro de 20 horas (XI; KEEP; HOFF, 2006; HUA

XI, 2012). A expansão precoce do hematoma está associada a desfechos clínicos

ruins e a taxas de mortalidade mais elevadas, em comparação quando não há

expansão. Já foi relatado que pacientes que apresentam expansão do hematoma

observada após 1 h do início da hemorragia por tomografia computadorizada

apresentaram reduções significantes na escala de coma de Glasgow e no National

Institute of Health Stroke Scale, quando comparadas com aqueles pacientes sem

crescimento do hematoma, sugerindo que intervenções que visem a reduzir tal

processo podem ser uma importante estratégia para melhorar a sobrevida e o

funcionalidade dos pacientes após o AVEh (LIM-RING e RINCON, 2017). Se o

volume da hemorragia for menor que 140 mL, muitos pacientes sobrevivem ao AVE

inicial. Entretanto, o próprio hematoma pode levar a uma lesão cerebral secundária,

resultando em déficit neurológico severo e algumas vezes em fatalidade tardia (XI;

KEEP; HOFF, 2006). Essa lesão secundária pode ser causada por uma cascata de

eventos iniciada pela lesão primária, pela resposta fisiológica ao hematoma (ex.:

inflamação) e pela liberação de componentes de coagulação (KEEP; HUA; XI, 2012).

O edema cerebral peri-hematoma se desenvolve imediatamente após o

AVEh e tem picos vários dias mais tarde. Em modelos experimentais, o pico do

edema ocorre em torno do terceiro ou quarto dia após a hemorragia, e declina

lentamente depois. Em seres humanos o edema peri-hematoma se desenvolve dentro

Page 29: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

11

de 3 horas após o início dos sintomas e tem seu pico entre 10 e 20 dias após a

hemorragia (XI; KEEP; HOFF, 2006), tendo sido implicado como um fator contribuinte

para a deterioração neurológica tardia no AVEh (LIM-RING e RINCON, 2017). Estudo

com 17 pacientes que passaram por uma tomografia computadorizada 5 horas após o

início dos sintomas, e 1, 3 e 10 dias depois, mostrou que o tamanho do hematoma

estava reduzido significantemente no dia 10, enquanto o volume de edema aumentou

gradualmente ao longo desse tempo (HUA et al., 2007). Há várias fases da

formação do edema após o AVEh. A fase inicial envolve aumento da pressão

hidrostática e a retração do coágulo com circulação de soro do coágulo para o tecido

circundante. A segunda fase (dois primeiros dias) está relacionada com a cascata de

coagulação e a produção de trombina, e a terceira fase está relacionada com a lise

dos eritrócitos e a toxicidade da hemoglobina (XI; KEEP; HOFF, 2006).

Evidências sugerem que a hemoglobina e o ferro liberados do hematoma são

os principais contribuintes da lesão cerebral induzida por uma hemorragia

intracerebral. Injeções de eritrócitos lisados em cérebros de roedores causam lesão

cerebral, o que é mimetizado pela infusão de hemoglobina e ferro (KEEP; HUA; XI,

2012). O heme é degradado no cérebro pela heme oxigenase-1 em ferro (Figura 3),

monóxido de carbono e biliverdina, a qual é convertida em bilirrubina pela biliverdina

redutase (XI; KEEP; HOFF, 2006). Já foi encontrada uma concentração três vezes

maior de ferro não-heme na zona de peri-hematoma no cérebro após AVEh em ratos,

e este nível permaneceu elevado por pelo menos um mês (HUA et al., 2007). O

mecanismo proposto da neurotoxicidade induzida pelo heme e pelo ferro seria o da

ativação da heme oxigenase-1 e da produção de radicais livres mediados pelo ferro

via reação de Fenton (MRACSKO; VELTKAMP, 2014). Os radicais livres de oxigênio

e nitrogênio podem causar dano nas células endoteliais, ativar as vias de ativação

celular que regulam a permeabilidade da BHE (KEEP et al., 2014), assim como

induzir apoptose neuronal (DUAN et al., 2016).

Uma resposta tecidual inicial na hemorragia intracerebral é a ativação dos

mecanismos hemostáticos para limitar o sangramento. A trombina tem um papel

central na hemostasia, sendo imediatamente produzida após o AVEh para interromper

o sangramento, no entanto, ela também pode participar na lesão induzida por

hemorragia intracerebral (HU et al., 2016). Uma infusão direta no cérebro de grandes

Page 30: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

12

doses de trombina induz infiltração de células inflamatórias, formação de cicatriz

tecidual e edema cerebral. A trombina pode ainda resultar em ativação da microglia

(KEEP; HUA; XI, 2012).

Uma reação inflamatória pronunciada ocorre após hemorragia intracerebral,

com a ativação da microglia residente, um influxo de leucócitos para o cérebro, e a

produção de mediadores inflamatórios. Os resultados de vários estudos em animais

sugerem que a inflamação tem um papel importante não só na lesão cerebral após a

hemorragia intracerebral, mas também na recuperação cerebral. A ativação da

microglia ocorre cedo após a hemorragia intracerebral, a partir de cerca de 1 h, com

picos após 3 a 7 dias, persistindo durante 3 a 4 semanas, em modelo de infusão

intracerebral de sangue autólogo em ratos (WANG, 2010; WANG; DORÉ, 2007a).

Os neutrófilos são os primeiros subtipos de leucócitos a infiltrarem-se no

cérebro hemorrágico, e estes podem danificar o tecido diretamente através da

produção de espécies reativas de oxigênio (ROS, do inglês reactive oxygen species),

Figura 3: Representação da fisiopatologia do AVEh. Observa-se na figura os danos cerebrais primários e secundários relacionados à hemorragia dentro do parênquima cerebral. Modificado de Mracsko e Veltkamp (2014).

Page 31: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

13

liberando proteases pró-inflamatórias e modulando a permeabilidade da BHE. Tem

sido demonstrado que neutrófilos isolados agravam a morte de células neuronais,

induzida por excitotoxicidade ou pela privação de oxigênio e glicose. Após entrarem

no cérebro hemorrágico, os leucócitos morrem por apoptose após alguns dias. O

conteúdo dos leucócitos que morrem pode promover danos teciduais cerebrais,

estimulando microglia/macrófagos vizinhos a secretarem fatores pró-inflamatórios

tóxicos. Foi observado, em modelo pré-clínico de AVEh induzido por colagenase em

camundongos, que os neutrófilos aparecem em torno do hematoma após 4 h, com um

máximo sendo atingido em 3 dias (WANG, 2010). Wang e Doré (2007a) mostraram

que no modelo de AVEh por colagenase, a microglia se mostrou ativada entre 1 h a 2

h após injeção, tornando-se mais proeminente no dia 1, atingindo seu pico no dia 7 e

retornando ao normal no dia 21.

Estudos mostraram que a ativação de astrócitos é similar à da microglia no

modelo de AVEh, sendo maior na região próxima à lesão e diminuindo gradualmente

com a distância. Eles participam do processo inflamatório pela expressão de

metaloproteinases da matriz (MMPs, do inglês matrix metalloproteinases) após

ocorrer o AVEh, tanto no modelo de colagenase quanto no de infusão de sangue

(WANG, 2010) e são mais resistentes à lesão por danos oxidativos provocados por

ROS do que os neurônios, após indução de AVEh (WANG; DORÉ, 2007b). Diversos

estudos em modelos pré-clinicos de AVEh focaram nas MMPs 2, 3, 9 e 12,

demonstrando, por exemplo, que as MMPs 2 e 9 são ativadas dentro de 24 h após

indução do AVEh por colagenase em ratos (WANG, 2010).

O sistema complemento está envolvido nas reações imunes, incluindo lise

celular e resposta inflamatória. Os componentes de proteínas plasmáticas são

normalmente excluídos do cérebro pela BHE, mas podem entrar quando a mesma é

rompida após a hemorragia intracerebral. A ativação do complemento e a formação

do complexo de ataque à membrana (MAC, do inglês membrane attack complex)

(C5b-9) foram observadas após hemorragia intracerebral. O MAC tem seu papel na

lise dos eritrócitos e poderia, além disso, estar envolvido na liberação de hemoglobina

e de ferro, resultando em dano tecidual peri-hematoma. Além disso, o MAC pode

induzir diretamente uma lesão nos neurônios do peri-hematoma, na glia e nos vasos

sanguíneos (KEEP; HUA; XI, 2012).

Page 32: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

14

1.7 AVALIAÇÃO DA EVOLUÇÃO DO AVEH POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA EM

MODELO ANIMAL

A RM é hoje um método de diagnóstico por imagem, estabelecido na prática

clínica e em crescente desenvolvimento. Dada à alta capacidade de diferenciar

tecidos, o espectro de aplicações se estende a todas as partes do corpo humano e

explora aspectos anatômicos e funcionais. Resumidamente, é o resultado da

interação do forte campo magnético produzido pelo equipamento com os prótons de

hidrogênio do tecido humano, criando uma condição para que se possa enviar um

pulso de radiofrequência e, após, coletar a radiofrequência modificada, através de

uma bobina ou antena receptora. Este sinal coletado é processado e convertido numa

imagem ou informação (MAZZOLA, 2009).

Após o pulso, os prótons relaxam de volta ao seu estado inicial dentro do

campo magnético do aparelho de RM. O tempo necessário para que o vetor de

magnetização longitudinal dos prótons recupere 63% do seu eixo principal é

chamada de relaxação longitudinal, sendo que as imagens obtidas nessa relaxação

são denominadas T1. Na ponderação T1, a água fica com hiposinal (escuro), a

gordura fica com hipersinal (brilhante claro), a substância branca fica clara e a

substância cinzenta fica escura. Já a relaxação transversal é o tempo necessário

para que o vetor de magnetização transversal decaia até 37% do seu eixo principal

e as imagens obtidas são denominadas T2. Na ponderação T2, a água fica com

hipersinal (brilhante claro), a gordura fica com hiposinal (escuro), a substância

branca fica escura e a substância cinzenta fica clara (TODESCATTO, 2016). Outra

sequência utilizada na RM para visualizar hemorragias é a ponderação T2*. T2* é

um tempo de relaxamento de decaimento da magnetização transversal, porém mais

curto que T2, sendo um dos principais determinantes de contraste de imagem com

sequência gradiente eco (GRE) e forma a base para muitas ressonâncias

magnéticas. Sequências ponderadas em T2* são utilizadas para representar

hemorragias, calcificações e depósitos de ferro em vários tecidos e lesões. Nesta

sequência as hemorragias e depósitos de hemosiderina apresentam sinal hipointenso

(CHAVHAN et al., 2009).

A aparência variável da hemorragia na RM depende da estrutura da

hemoglobina e de seus vários produtos de oxidação (Figura 4). Na circulação, a

Page 33: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

15

hemoglobina alterna entre as formas oxi e desoxi-hemoglobina. À medida que o

sangue passa pelo ambiente altamente oxigenado do pulmão, o oxigênio molecular é

ligado, formando a oxi-hemoglobina. Quando o sangue então passa pelo ambiente

com menos oxigênio, o O2 é liberado, formando desoxi-hemoglobina. Para ligar

reversivelmente o oxigênio, o ferro na hemoglobina deve ser mantido no estado

ferroso reduzido (Fe2+). Quando os eritrócitos são removidos desse ambiente

oxigenado da circulação, a desoxi-hemoglobina sofre uma desnaturação para meta-

hemoglobina e o ferro heme passa para a forma Fe3+. Com a contínua desnaturação

oxidativa, a meta-hemoglobina é convertida em derivados hemicromos. Quando os

eritrócitos são lisados, a hemoglobina é quebrada em globina e ferro heme e esse

ferro é estocado na forma de ferritina (forma solúvel). Com a sobrecarga desse ferro,

forma-se a hemosiderina, que representa aglomerados insolúveis de partículas de

ferritina. A aparência do hematoma na RM depende se há elétrons desemparelhados,

isto é, se há a presença de espécie paramagnética, que é o caso da desoxi-

hemoglobina e da meta-hemoglobina, enquanto a oxi-hemoglobina e o hemicromo

são espécies diamagnéticas, isto é, não possuem elétrons desemparelhados

(BRADLEY, 1993).

Cinco estágios envolvem um hematoma nas imagens adquiridas de RM nas

sequências ponderadas de T1 e T2, conforme mostrado no quadro 1.

Page 34: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

16

Estágio Tempo Compartimento

Estado da

Hemoglobina

Intensidade comparada no

cérebro

Imagem em

T1

Imagem em

T2

Hiperagudo <24 h Intracelular Oxi-

hemoglobina

Isointenso Levemente

hiperintenso

Agudo 1–3

dias

Intracelular Desoxi-

hemoglobina

Levemente

hipointenso

Muito

hipointenso

Subagudo

Inicial

Final

>3 dias

>7 dias

Intracelular

Extracelular

Meta-

hemoglobina

Meta-

hemoglobina

Muito

hiperintenso

Muito

hiperintenso

Muito

hipointenso

Muito

hiperintenso

Crônico

Centro

Aro

>14

dias

Extracelular

Intracelular

Hemicromo

Hemosiderina

Isointenso

Levemente

hipointenso

Levemente

híperintenso

Muito

hipointenso

Quadro 1: Quadro da evolução do hematoma como observado na ressonância magnética. Adaptado de

BRADLEY, 1993.

Durante as primeiras horas (fase hiperaguda) o hematoma consiste de uma

mistura de oxi e desoxi-hemoglobina dentro dos eritrócitos, inicialmente como um

líquido em suspensão de eritrócitos intactos. Nos dias seguintes (fase aguda) o

hematoma consiste principalmente de desoxi-hemoglobina dentro dos eritrócitos

intactos. Durante o período subagudo, que se inicia após 3 dias, a hemoglobina sofre

desnaturação oxidativa, formando a meta-hemoglobina. No estágio inicial do período

subagudo, os eritrócitos ainda estão intactos, porém no estágio final deste período (1

semana), já ocorreu a lise dessas células. Na segunda semana a microglia remove o

ferro da meta-hemoglobina extracelular, marcando o início da fase crônica, quando o

ferro heme é depositado na periferia, como um aro de hemosiderina e ferritina

(BRADLEY, 1993).

Page 35: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

17

Del Bigio et al. (1996) compararam imagens de RM em ponderação T2 com

cortes histológicos do cérebro de ratos submetidos a hemorragia pelo método de

injeção da colagenase. Passados 30 min após a injeção de colagenase observaram

que os eritrócitos se agregavam em múltiplos locais na periferia dos feixes da

substância branca no corpo estriado, e em menor grau, ao longo do local onde foi

inserida a agulha. Após 1 h, o acúmulo de sangue ainda era descontínuo, embora o

hematoma já assumise um formato ovóide, com sangue restrito às margens dos

feixes da substância branca. No tecido cerebral, o sangue provavelmente seguiu um

caminho de menor resistência ao longo dos vasos sanguíneos ou ao longo dos

axônios. Na RM, o centro do hematoma mostrava-se hipointenso com focos dispersos

de iso e hiperintensidade e um aro hiperintenso. Após 2 h, o acúmulo de sangue era

quase contínuo, ignorando os limites microanatômicos e ocupando quase dois terços

da área do estriado. Após 12 h, havia tecido cerebral desintegrado no local do

hematoma, contendo neurônios eosinofílicos e núcleos fragmentados. Ao redor da

periferia do hematoma, estavam dispersos neutrófilos e células gliais inchadas. Após

24 h, os neutrófilos se concentraram em uma banda compacta, correspondendo a um

aro hipointenso visível na RM. O pico do edema também ocorreu com 24 h, mas se

resolveu totalmente em uma semana. A invasão do hematoma por monócitos, que se

diferenciaram subsequentemente em macrófagos, teve início em torno de 48 h.

Depois de passada uma semana, o hematoma estava resolvido e havia um aumento

dos ventrículos laterais, principalmente o do hemisfério ipsilateral à lesão, com o

centro do hematoma apresentando debris celulares. Na RM, observou-se o centro do

hematoma hiperintenso, com algumas bandas iso/hipointensas, correspondendo a

neutrófilos em degeneração. À medida que os macrófagos se deslocaram para o

hematoma, os compostos de ferro fagocitados foram degradados e o ferro foi

sequestrado na forma de hemosiderina e ferritina, aparecendo nas imagens de RM de

forma hipointensa.

Com 2 semanas, o local do hematoma consistia em uma pequena cavidade

preenchida por fluído e alguns macrófagos, sem haver neutrófilos evidentes, não

ocorrendo mudanças significativas para a terceira semana. O tecido circundante

continha muitos astrócitos reativos. Nas imagens de RM observaram-se um aro

periférico hipointenso e um centro iso/hiperintenso, correspondendo ao espaço

preenchido com fluído e alguns poucos vasos. A região estriatal apresentava uma

Page 36: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

18

hiperintensidade irregular. O estudo concluiu que as imagens de RM se

correlacionaram bem com as mudanças histológicas no modelo experimental de

AVEh utilizado, e que dessa forma poderiam ser utilizadas para acompanhar in vivo

mudanças ocasionadas por tratamentos. (DEL BIGIO, 1996).

Oxi-hemoglobina

Desoxi-hemoglobina

Meta-hemoglobina

Hemicromo reversível

Ferritina / Hemosiderina

Figura 4: Representação da aparência da hemorragia na ressonância magnética e a estrutura da hemoglobina e seus produtos de oxidação. Nesta imagem podemos observar a aparência da hemorragia nas diversas fases de um AVEh em rato, em uma ponderação T2, correlacionado com os diferentes estruturas químicas da hemoglobina e seus produtos de oxidação. Modificado de Del Bigio et al. (1996)

Page 37: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

19

1.8 TERAPIA CELULAR

1.8.1 Células-tronco

As células-tronco são células indiferenciadas que podem ser definidas por

duas características: (1) o potencial de autorenovação, por várias divisões celulares, o

que é um pré-requisito para a manutenção de um pool de células-tronco, (2)

capacidade de gerar células descendentes diferenciadas, em geral de múltiplas

linhagens (LOS; SKUBIS; GHAVAMI, 2019). Elas podem ser classificadas por seu

potencial regenerativo. A célula-tronco totipotente tem o potencial de se transformar

em um embrião completo (ou seja, para formar qualquer tipo de célula), inclusive em

tecidos extra-embrionários: membranas embrionárias, cordão umbilical e placenta.

Aparece com a fertilização do óvulo e desaparece quando o embrião atinge o estágio

de 16 a 32 células. Com divisões subsequentes, as células-tronco embrionárias

perdem a capacidade de gerar tecidos extra-embrionários. No entanto, elas são

capazes de se diferenciarem em células presentes nas três camadas germinativas

(ectoderme, mesoderme e endoderme), sendo chamadas pluripotentes (BRIGNIER;

GEWIRTZ, 2010).

As células-tronco pluripotentes podem ser as embrionárias (ESCs, do inglês

embryonic stem cells), obtidas a partir da massa interna dos blastocistos, possuindo a

capacidade de autorenovação, permitindo a manutenção indefinida do estado

indiferenciado in vitro (BRIGNIER; GEWIRTZ, 2010). Apesar de achados promissores,

o uso clínico disseminado de ESCs é atualmente elusivo, devido ao potencial de

imunogenicidade e tumorigenicidade. Além disso, controvérsias éticas e restrições

legais cercam o uso de ESCs (DUSCHER; WONG; MAAN, 2015). Mais recentemente

foi descrita por Takahashi e Yamanaka (2006) a possibilidade de geração de células-

tronco pluripotentes induzidas (iPSCs, do inglês induced pluripotent stem cells), em

que uma reprogramação nuclear leva a mudanças na expressão gênica que permite

que células adultas sejam reprogramadas e se tornem células-tronco pluripotentes

(BRIGNIER; GEWIRTZ, 2010). O uso de iPSCs permite a geração de populações de

células-tronco pluripotentes autólogas derivadas de tecidos adultos diferenciados,

Page 38: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

20

evitando assim as questões éticas associadas às ESCs humanas (DUSCHER;

WONG; MAAN, 2015).

Com divisões seguintes, as células-tronco se tornam cada vez mais limitadas

na sua capacidade de se diferenciar em várias linhagens. Elas são então chamadas

de multipotentes; isto é, são capazes de gerar um número limitado de tipos celulares,

dentro de um mesmo folheto embrionário. Esta é a propriedade de células-tronco

adultas, também denominadas células-tronco somáticas ou células-tronco não

embrionárias, que são capazes de se auto-renovar durante o tempo de vida do

organismo e de gerar células filhas diferenciadas (BRIGNIER; GEWIRTZ, 2010). As

células-tronco adultas são frequentemente isoladas de medula óssea, sangue, tecido

adiposo, fígado e pele. No entanto, como consequência natural do envelhecimento, a

sua quantidade e qualidade diminui com a idade. O envelhecimento das células-

tronco afeta o seu potencial regenerativo, crescimento e divisões celulares (LOS et

al., 2019). O exemplo mais conhecido de célula-tronco adulta é a célula-tronco

hematopoiética, que está localizada no nicho da medula óssea em adultos, podendo

ser colhida a partir da medula óssea e do sangue do cordão umbilical (BRIGNIER;

GEWIRTZ, 2010).

Outro tipo de células adultas multipotentes são as células-tronco

mesenquimais (MSCs, do inglês mesenchymal stromal cells). O termo ―MSCs‖ é

usado para descrever uma população heterogênea de células estromais, que são

frequentemente caracterizadas usando critérios propostos pela Sociedade

Internacional de Terapia Celular (ISCT, do inglês International Society of Cell

Therapy) como células aderentes ao plástico, expressando um conjunto distinto de

antígenos de superfície e com a capacidade de se diferenciar in vitro em linhagens

osteogênicas, adipogênicas e condrogênicas (DOMINICI et al., 2006; WILSON et al.,

2019). A população de MSCs é definida como > 95% positiva para CD105, CD73 e

CD90 e 95% negativa para CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79 ou CD19 e HLA-DR

(MESENTIER-LOURO et al., 2016). Nos humanos, essas células podem ser isoladas

de fontes como medula óssea, tecido adiposo, membrana sinovial, polpa dentária,

derme, osso trabecular, periósteo, cordão umbilical, placenta, fígado fetal e líquido

amniótico (SHIRJANG et al., 2017). Vários estudos descrevem as MSCs como células

imunoprivilegiadas ou hipoimunogênicas. Elas expressam baixos níveis de MHC

classe I e moléculas coestimulatórias CD40, CD80 e CD86 (TSE et al., 2003), assim

Page 39: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

21

como não expressam ou expressam em níveis desprezíveis as moléculas de MHC

classe II (BLANC, 2003).

O uso das MSCs para fins clínicos tira proveito da sua fraca imunogenicidade

observada em estudos in vitro, em estudos pré-clínicos e estudos em humanos, os

quais suportam o seu uso alogênico. Em condições clínicas mais agudas para as

quais o uso da terapia com MSCs tem sido considerada, as MSCs alogênicas podem

ser a única opção, já que haveria uma limitação de tempo para a proliferação e

expansão in vitro de células autólogas (UCCELLI; MORETTA; PISTOIA, 2008).

Como mencionado, o cordão umbilical humano é uma das fontes de MSCs,

tendo comprimento médio de 50 a 60 cm, diâmetro médio de 14,42 ± 1,50 mm e peso

aproximado de cerca de 40 g. Contém duas artérias umbilicais e uma veia umbilical

embebidas em uma gelatina rica de proteoglicanos chamada de geleia de Wharton e

rodeada por uma única camada de âmnio. Um grande estoque de MSCs pode ser

encontrado em várias regiões do cordão umbilical humano (WATSON et al., 2015),

sendo ele dividido em vários compartimentos, tais como a membrana epitelial

amniótica, a região subaminiótica, a geleia de Wharton e a região perivascular em

torno dos vasos sanguíneos umbilicais, sendo que as MSCs vêm sendo isoladas de

cada um desses compartimentos (SUBRAMANIAN et al., 2015). As MSCs derivadas

de cordão umbilical tem grande capacidade de expansão e a sua extração é

considerada não invasiva, já que o cordão umbilical é frequentemente considerado

um refugo e descartado (TAGHIZADEH; CETRULO; CETRULO, 2011; WATSON et

al., 2015), manifestando poucas preocupações éticas (PALADINO et al., 2019). Além

disso, apresentam, em comparação com MSCs de tecidos adultos, um maior

comprimento de telômero, que as protege de perda prematura de viabilidade

(KALASZCZYNSKA; FERDYN, 2015).

Entre as células do cordão umbilical, as MSCs da geleia de Wharton

oferecem a melhor utilidade clínica, pois elas apresentam menor contaminação com

outros tipos celulares e podem ser geradas em grande número com pouca

manipulação, enquanto as células de outros compartimentos do cordão requerem

maior número de passagens para gerar um número adequado de células para

aplicação. Além disso, seu isolamento é simples, rápido e fácil de padronizar, são

proliferativas e têm alto potencial de diferenciação (SUBRAMANIAN et al., 2015).

Page 40: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

22

Estas vantagens logísticas fazem a geleia de Wharton uma atraente fonte de

células-tronco para terapia celular. As hWJ-MSCs (do inglês human Wharton’s jelly

derivaded MSCs) têm sido propostas como agente terapêutico em uma ampla gama

de doenças com base em estudos em modelos animais. Nestes estudos, foi

demonstrado que elas são capazes de induzir a reparação neuronal, apresentam

propriedades imunomoduladoras, são multipotentes, e secretam vários fatores tróficos

importantes para a neuroregeneração (OPPLIGER et al., 2016).

A respeito das propriedades imunomoduladoras, tornou-se cada vez mais

claro que, em resposta a um meio inflamatório, as MSCs preparam o microambiente

para a reparação tecidual, produzindo moléculas imunorreguladoras que modulam a

progressão da inflamação, liberando fatores de crescimento para produzir matriz

extracelular, estimulando as células progenitoras in situ a se diferenciar e repor as

células perdidas e promovendo a angiogênese (PALADINO et al., 2019). Os

receptores na superfície das MSCs são ativados por estímulos externos, e levam à

produção de vários fatores imunomoduladores (CASTRO et al., 2019). Entre esses

receptores, estão os do tipo toll (TLR, do inglês toll-like receptor), que podem ser

ativados, quando expostos a ligantes, em locais de lesão ou inflamação (SHIRJANG

et al., 2017). Como consequência, as MSCs podem inibir a ativação e a apresentação

de antígenos por células dendríticas; suprimir a ativação de células natural killer;

suprimir a resposta de macrófagos e polarizar os macrófagos em fenótipo M2;

suprimir a proliferação, a secreção de citocinas e a citotoxicidade de linfócitos T;

induzir a expansão de células T reguladoras; e diminuir a viabilidade dos linfócitos B,

afetando a secreção de anticorpos e a expressão pelos linfócitos B de moléculas

coestimulatórias (CASTRO et al., 2019).

Vários estudos sugerem que a interação entre as MSCs e o microambiente

causa a secreção de fatores solúveis por essas células. As MSCs podem responder

ao estímulo de citocinas pró-inflamatórias, tais como fator de necrose tumoral alfa

(TNF-α) e interferon gama (IFN-γ), e secretar mediadores imunossupressores,

incluindo prostaglandina E2 (PGE2), indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO), fator de

transformação do crescimento beta-1 (TGF-1) e interleucina 10 (IL-10)

(MESENTIER-LOURO et al., 2016).

Page 41: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

23

1.9 TERAPIA CELULAR COM MSCS EM DOENÇAS NEUROLÓGICAS

Os estudos pré-clínicos indicam que além da habilidade de diferenciação em

células da linhagem mesodérmica, as MSCs secretam importantes fatores de

crescimento, citocinas e elementos de matriz extracelular que podem aumentar a

sobrevivência celular em tecidos lesionados. Estes efeitos favoráveis das MSCs foram

experimentalmente testados em vários modelos animais das principais doenças

neurológicas, incluindo AVE, doença de Huntington, doença de Parkinson, esclerose

lateral amiotrófica, doença de Alzheimer e esclerose múltipla (DRELA et al., 2013). A

partir de vários estudos, ficou claro que a substituição celular não é o método de ação

mais comum das MSCs. Ao invés disso, as MSCs fornecem suporte trófico para as

células sobreviventes e modulam a natureza inflamatória do meio-ambiente, tornando-

o mais propício para as células sobreviventes (SANBERG et al., 2012). A partir de

dados pré-clínicos que já foram reunidos, parece que na grande maioria das situações

clínicas testadas, a liberação de fatores tróficos e substâncias bioativas pelas MSCs

suprimiram eficazmente a neuroinflamação, diminuíram as lesões e atenuaram os

déficits funcionais neurológicos (DRELA et al., 2013).

Estudos prévios do nosso grupo demonstraram em modelo de AVE isquêmico

uma recuperação da função motora, observada no teste de cilindro, em animais

tratados com 3 x 106 MSCs de medula óssea de ratos (BM-MSCs), um dia após

isquemia (VASCONCELOS-DOS-SANTOS et al., 2010). Em modelo de doença de

Alzheimer, BM-MSCs de ratos protegeram neurônios em cultura do estresse oxidativo

induzido por oligômeros Aβ, ocorrendo um aumento de interleucina-6 (IL-6), IL-10 e

de fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) (GODOY et al., 2018). Outro

exemplo é o estudo de Mesentier-Louro et al. (2014), em que foi investigado o

potencial terapêutico de 5 x 105 BM-MSCs de ratos injetadas dentro do corpo vítreo

em um modelo de lesão de nervo ótico, mostrando que a terapia celular protegeu e

ajudou na regeneração axonal das células ganglionares da retina (RGCs) após 16 e

28 dias da lesão do nervo. Mostraram também um aumento da expressão dos fatores

tróficos fator de crescimento de fibroblasto 2 (FGF-2, do inglês fibroblast growth fator

2) e interleucina 1β (IL-1β) na camada das RGCs, sugerindo uma modulação da

neuroinflamação. Em outro trabalho, Mesentier-Louro et al. (2019) mostraram que as

BM-MSCs puderam promover neuroproteção das RGCs por um período mais longo,

Page 42: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

24

pois possibilitaram que o dobro de células sobrevivessem pelo período de 60 dias,

além de promover a regeneração dos axônios em até 0,5 mm. Já em trabalho do

nosso grupo utilizando hWJ-MSCs, também em modelo de lesão do nervo ótico,

Jordão da Silva-Junior (2018) observou que as hWJ-MSCs possibilitaram uma

sobrevivência maior das RGCs nos períodos de 14 (38%), 60 (20%) e 120 dias (10%)

quando comparado ao grupo veículo, que foi respectivamente de 20%, 10% e 5%,

além de uma significativa diferença na extensão axonal em 120 dias de tratamento.

Também demonstrou que as hWJ-MSCs aumentavam a transcrição de TNF-α e IL-6,

nos períodos iniciais à lesão e posteriormente havia uma mudança no perfil da

transcrição, com redução nos níveis de TNF-α e aumento de IL-10.

1.9.1 Terapia celular com MSCs no AVEh

Assim como em outras doenças neurológicas, a terapia celular também tem

sido usada em diversos modelos pré-clínicos de AVEh, como também em estudos

clínicos, que serão citados à frente. Em relação à origem das MSCs utilizadas nos

modelos pré-clínicos, aproximadamente 60% foram de medula óssea, 30% de fontes

como cordão umbilical, placenta e membrana amniótica e 10% de tecido adiposo,

segundo levantamento realizado por Turnbull et al. (2019). Um pouco menos de

metade desses estudos utilizou injeção intracerebral estereotáxica, seguida da

administração por via intravenosa, administração intra-arterial e por último por

administração intranasal.

Em relação aos modelos pré-clínicos de AVEh utilizados nos estudos de

terapia com MSCs, a revisão de Rosado-de-Castro et al. (2016) mostrou que entre 18

estudos pré-clínicos de terapia celular utilizando MSCs de medula óssea e 1 de

células mononucleares da medula óssea (CMMO) (fração que contém as células-

tronco hematopoiéticas), o modelo de indução por colagenase foi utilizado em 11

estudos, o de injeção de sangue autólogo em 6, e o modelo de hemorragia

subaracnóide foi empregado em 2, sendo que a maioria dos trabalhos foram

conduzidos em ratos (Figura 5). Esse levantamento também mostrou que 14

trabalhos utilizaram MSCs de ratos, enquanto 4 fizeram uso de MSCs de humanos.

Page 43: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

25

Quanto à janela temporal da terapia com MSCs para o AVEh, diferentes

estudos tiveram resultados controversos. Por um lado, a maioria dos estudos

realizados preconizou um tratamento precoce. A administração precoce de MSCs,

especialmente na primeira semana, pode reduzir efetivamente a lesão secundária

após o AVEh, incluindo inflamação e apoptose, o que contribui para haver a

recuperação funcional, pois a lesão secundária ocorre mais frequentemente ainda na

primeira semana. Por outro lado, alguns estudos sugerem que a administração mais

tardia poderia ser benéfica no caso do AVEh, pois a lesão secundária pode ser tão

grave na primeira semana, que poderia trazer danos às células transplantadas e até

mesmo levar à morte delas, sendo que após o estágio agudo do AVEh, as MSCs

poderiam substituir os tecidos danificados e refazer a função neuronal (GAO et al.,

2018).

Figura 5: Representação gráfica dos modelos animais (A), espécies (B) e sexo dos animais utilizados (C) em estudos pré-clínicos que avaliaram o potencial de células derivadas de medula óssea para tratamento do AVEh. Modificado de Rosado-de-Castro et al. (2016).

Page 44: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

26

Nas revisões realizadas por Rosado-de castro et al. (2016) e Turnbull et al.

(2018) a maior parte dos estudos, aproximadamente 40%, realizou a administração

das MSCs após 24 h do início da lesão, seguindo a premissa que as células podem

ajudar a modular os eventos precoces da fisiopatologia do AVEh. Interessante

observar que alguns trabalhos utilizaram tempos menores ainda, administrando as

células imediatamente após iniciar a lesão,1 h, 2 h e 6 h, já que a possibilidade de

reduzir a expansão do hematoma na fase hiperaguda poderia melhorar o prognóstico

da doença. Um desses estudos foi o de Huang et al. (2019), que demonstraram

menor volume de lesão, menor resposta inflamatória e melhor recuperação funcional

em animais submetidos à hemorragia intracerebral pelo modelo da injeção de sangue

autólogo e que receberam BM-MSCs por via intraventricular 30 minutos após lesão.

Outra pesquisa que também realizou o transplante de células na fase

hiperaguda foi o de Chen et al. (2015), que demonstraram em estudo utilizando

administração intravenosa de BM-MSCs, realizada 2 horas após provocar a lesão

hemorrágica, uma diminuição no volume de água do cérebro (menor edema) e uma

menor disfunção da BHE no grupo tratado. Além disso, verificaram a redução de

células da microglia/macrófagos e de neutrófilos no cérebro, bem como a diminuição

da expressão de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ).

Cui et al. (2017) mostraram em estudo que utilizou o modelo de injeção de

sangue autólogo, que o transplante intravenoso de BM-MSCs e de meio condicionado

de BM-MSCs imediatamente após induzir o AVEh, reduziu o edema cerebral no

período de 6 dias e mostrou recuperação funcional nos animais no 3° dia, através da

escala de déficit neurológico e do teste de forelimb placing. O meio condicionado de

BM-MSCs também reduziu os níveis de IL-1β, IL-6 e TNF-α na região do

perihematoma, mas manteve os níveis de IL-10 próximos ao dos animais sham. O

meio condicionado também aumentou os níveis de expressão de mRNA da proteína

43 associada ao crecimento (GAP-43), que é associada a extensão dos neuritos.

Em resumo, vários estudos que investigaram o transplante de diferentes tipos

de células-tronco em modelos animais de AVEh indicam uma melhora funcional ou

uma atenuação do hematoma. As MSCs e as células-tronco neurais (NSCs, do inglês

neural stem cell) são as mais usadas e promissoras nestes estudos. Entretanto, a

dose administrada, a rota, o intervalo de tempo, a origem das células, o tipo celular, a

Page 45: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

27

manipulação e o índice de qualidade de cada estudo são tão divergentes, que é difícil

avaliar os efeitos terapêuticos de forma integral, continuando desconhecido qual seria

o padrão ótimo de terapia celular para o AVEh (HU et al., 2015).

Xie et al. (2016) demonstraram que o tratamento com MSCs de cordão

umbilical, por via intracerebral ou via intravenosa, forneceu um efeito neuroprotetivo

14 dias após a cirurgia, ao reduzir o volume de hematoma, ao promover a

angiogênese e a resultar em melhora do déficit neurológico.

Ma et al. (2015) mostraram em um trabalho de revisão e meta-análise de

terapia celular com células-tronco em modelo animal de AVEh, que entre 30 estudos,

todos foram realizados com um aparato esterotáxico, com localização do AVEh na

região dos núcleos da base, sendo que alguns especificaram a localização exata,

como núcleo caudado, estriado e globo pálido. Quinze pesquisas utilizaram o modelo

de injeção de sangue autólogo, oito de injeção de colagenase tipo VII e sete de

injeção do tipo IV. Esses estudos incluíam cinco diferentes tipos de células-tronco,

utilizando tanto roedores, quanto macacos. Em outro estudo de revisão realizado por

Cordeiro et al. (2015), de terapia celular em modelos de AVEh conduzidos apenas em

ratos, foram levantadas 26 metodologias diferentes utilizadas, em que o número de

células administradas variaram de 2 x 105 a 16 x 106 e o volume administrado variou

de 10 µL a 2000 µL, sem que necessariamente o volume fosse proporcional ao

número de células em suspensão. A injeção de quantidades maiores de células, como

1 x 106 células-tronco derivadas da medula óssea, foram mais efetivas

terapeuticamente do que 5 x 105 células. Em estudo utilizando 4, 8, ou 16 milhões de

células mononucleares de sangue de cordão umbilical, o volume da lesão após 14

dias foi inverso às doses administradas de células (SEGHATOLESLAM et al., 2013).

Dos 26 estudos, a maioria (nove) teve a administração de células realizada por

injeção intraparenquimal, além das seguintes outras vias utilizadas em menor número:

intra-arterial (artéria carótida), intravenosa (veias cervical, femoral, safena, da cauda)

e intraventricular (CORDEIRO; HORN, 2015).

Diferente dos estudos pré-clínicos, os estudo clínicos de tratamento de AVEh

com MSCs são ainda bastante limitados. No presente momento, consulta nos ensaios

clínicos registrados na base de dados do National Institute of Health (clinicaltrials.gov,

acesso em 25/07/2019) sobre AVEh e terapia celular com MSCs, mostrou haver

Page 46: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

28

apenas um estudo em andamento, em etapa de recrutamento, para avaliar efeitos

adversos de diferentes doses de MSCs proveniente de medula óssea de fonte

alogênica. Entre os estudos já publicados, Chang et al. (2016) acompanhou 24

pacientes divididos em três grupos: grupo controle em que os pacientes passaram por

cirurgia para remoção do hematoma, grupo que passou pela cirurgia de remoção do

hematoma e recebeu BM-MSCs autólogas e um terceiro grupo que passou pela

cirurgia e recebeu MSCs de cordão umbilical (UC-MSCs), sendo as células

administradas na cavidade do hematoma. Os três grupos tiveram os hematomas

reabsorvidos após 3,5 meses, mas os grupos que receberam BM-MSCs e UC-MSCs

tiveram melhor resultado funcional após 5 anos. As UC-MSCs alogênicas e as BM-

MSCs autólogas foram bem toleradas, não havendo rejeição imunológica pelos

pacientes.

Outro estudo clínico que mostrou segurança e eficácia foi o de fase I/II

realizado por Tsang et al. (2017), em que injetaram por via intravenosa MSCs

autólogas de medula óssea, divididas em duas doses, cada uma em média de 4,57 x

107 células por infusão. Nesse estudo também foi observada segurança e uma

melhora nos resultados neurológicos após um ano de realizado o transplante.

Os poucos estudos clínicos realizados até agora demonstram que a terapia

celular é possível e segura, necessitando porém, mais estudos pré-clínicos e clínicos

para definir a sua eficácia em AVEh.

1.10 BIODISTRIBUIÇÃO DE CÉLULAS TRONCO APÓS TRANSPLANTE

INTRAVENOSO

Trabalho anterior do nosso grupo de pesquisa já havia demonstrado que as

CMMO marcadas com 99mTc e injetadas por via intravenosa ou intra-arterial em

animais com AVE isquêmico distribuíam-se após 2 h preferencialmente para pulmões,

seguido de rins e baço, quando observada a porcentagem de captação por grama de

tecido. Em 24 h, a maior porcentagem de captação por grama de tecido foi nos rins,

seguido pelo baço e fígado e pulmões. Uma pequena captação foi observada nos

hemisférios cerebrais, principalmente no hemisfério ipsilateral à lesão

(VASCONCELOS-DOS-SANTOS et al., 2012). Já em trabalho similar realizado,

porém, com pacientes com AVE isquêmico, a quantificação da captação feita nas

imagens de SPECT (do inglês Single Photon Emission Computed Tomography),

Page 47: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

29

mostrou que a via intravenosa apresentou após 2 h maior captação pelo pulmão,

seguida por fígado, rins e baço. Após 24 h, a maior captação observada foi no fígado,

seguida por pulmão, rins e baço (ROSADO-DE-CASTRO et al., 2013).

Quanto às MSCs, um grande número de estudos em animais e também em

humanos vêm explorando o seu uso terapêutico por administração intravenosa, como

mencionado no item 1.9. Na maioria dos estudos a origem das MSCs não se mostra

decisiva para influenciar a sua biodistribuição, sendo que células de várias fontes de

tecidos já foram pesquisadas. As metodologias de marcação utilizadas incluem a

marcação radioativa das MSCs, marcação com corantes vitais fluorescentes, agentes

de contraste, transdução com genes repórteres ou o uso de marcadores de DNA

específicos. As metodologias de marcação foram, na maior parte, projetadas para

detectar apenas o homing de curto prazo das MSCs, não permitindo determinar se as

células detectadas se mantêm vivas (LEIBACHER; HENSCHLER, 2016).

Os principais resultados comuns dos estudos de biodistribuição já realizados

mostraram que: as MSCs se distribuem para uma variedade de tecidos após injeção

intravenosa. Os sinais das células injetadas foram encontrados logo após

administração das mesmas em freqüências mais altas nos pulmões, seguidos pelo

fígado e baço, e em freqüências baixas ou muito baixas nos demais tecidos. Após os

primeiros estudos sobre homing e migração de MSCs, questões adicionais foram

abordadas sobre a sua biodistribuição, incluindo a quantificação de MSCs, seu

direcionamento preferencial para vários locais-alvo e a influência do tamanho das

MSCs na sua biodistribuição (LEIBACHER; HENSCHLER, 2016).

Após a expansão em cultura, as MSCs são relativamente grandes, com

tamanho médio estimado em torno de 30 µm em suspensão (variando de 16 a 53

µm). Seu tamanho também pode variar dependendo da osmolaridade do meio de

cultura, número de passagem e/ou densidade celular durante a semeadura, bem

como das condições de cultura (bidimensional versus tridimensional). Portanto,

eventos obstrutivos durante a passagem pulmonar são esperados após a

administração intravenosa de MSCs (LEIBACHER; HENSCHLER, 2016). Na infusão

intravenosa, mais de 80% das MSCs são aprisionadas nos pulmões e menos de 1%

são detectadas no coração isquêmico, em modelo de infarto do miocárdio, ou no

cérebro (WANG et al., 2015). Outro fator que impacta no aprisionamento das células

Page 48: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

30

nos pulmões foi demonstrado por Wang et al. (2015) que observaram que os níveis

de integrinas aumentavam acentuadamente após a expansão de MSCs em culturas

em monocamadas e que isso contribuiria para o aprisionamento das células nos

pulmões, já que possibilitariam a ligação à fibronectina e à vitronectina presentes nas

células endoteliais deste órgão. Quando utilizavam anticorpos para bloquearem as

integrinas, notaram uma redução das MSCs aprisionadas nos pulmões.

Page 49: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

31

2. JUSTIFICATIVA

O AVEh apresenta uma elevada taxa de letalidade, com 40% de mortalidade

no primeiro mês, assim como mais anos de vida perdidos ajustados por incapacidade,

quando comparado ao AVE isquêmico. As intervenções médicas ou cirúrgicas

existentes até o momento são apenas terapias sintomáticas e/ou de suporte. Ou seja,

apesar da alta morbidade e mortalidade, não há intervenções específicas que tenham

demonstrado melhorar o desfecho clínico após AVEh.

Em vista disso, a terapia celular apresenta uma perspectiva promissora como

tratamento, sendo que as hWJ-MSCs conferem diversas vantagens, como fácil

disponibilidade, grande capacidade de expansão e efeitos imunomodulatórios já

observados em diversos estudos pré-clínicos, além da segurança clínica já

demonstrada em estudos em seres humanos. Além disso, existem poucos trabalhos

na literatura descrevendo o uso de MSCs derivadas de cordão umbilical para terapia

em modelo de AVEh, sendo que a maioria utilizou a via de administração

intracerebral. Encontrou-se apenas um trabalho que utilizou a via de administração

intravenosa (XIE et al., 2016), que apresenta mais segurança e facilidade de

aplicação, quando comparada à via intracerebral.

Dessa forma, decidiu-se avaliar pela primeira vez a eficácia do tratamento com

as hWJ-MSCs, comparando dois modelo pré-clínico de AVEh, um de grau moderado

e outro de grau severo, através da análise do volume da lesão em imagens adquiridas

por RM, pois na prática clínica o volume da lesão hemorrágica é um dos fatores que

afeta o prognóstico do paciente e uma redução do mesmo pode melhorar os

resultados funcionais pós AVEh. Ao mesmo tempo, também se escolheu avaliar duas

janelas terapêuticas diferentes, hiperaguda (1 h) e aguda (24 h), para verificar se

nesses tempos, a administração das hWJ-MSCs poderia modular os eventos

precoces da fisiopatologia do AVEh e reduzir o tamanho da lesão. Este trabalho

também avalia pela primeira vez a biodistribuição das hWJ-MSCs em modelo de

AVEh.

Page 50: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

32

3. HIPÓTESE

A terapia celular com hWJ-MSCs por via intravenosa pode promover a redução

de prejuízos funcionais e de volume de lesão nos animais com AVEh moderado e

severo.

Page 51: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

33

4. OBJETIVOS

O objetivo deste trabalho é avaliar o potencial terapêutico da administração aguda

ou hiperaguda de hWJ-MSCs, bem como sua biodistribuição em modelo de AVEh em

dois níveis de severidade em ratos, quando administradas pela via intravenosa.

Os objetivos específicos são:

• Avaliar se há uma melhora funcional e uma redução no volume de lesão dos

animais tratados com hWJ-MSCs 24 h após início da hemorragia, em relação

aos animais do grupo veículo, em um modelo de AVEh moderado;

• Avaliar se há uma melhora funcional e uma redução no volume de lesão dos

animais tratados com hWJ-MSCs 24 horas após início da hemorragia, em

relação aos animais do grupo veículo, em um modelo de AVEh severo;

• Avaliar se há uma melhora funcional e uma redução no volume de lesão dos

animais tratados com hWJ-MSCs 1 hora após início da hemorragia, em relação

aos animais do grupo veículo, em um modelo de AVEh severo;

• Rastrear a migração das hWJ-MSCs nos modelos de AVEh moderado e

severo, injetadas 24 h após início da lesão, comparando com os grupos sham

e naive, avaliando para quais órgãos as células são distribuídas e em qual

percentual;

Page 52: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

34

5. MATERIAIS E MÉTODOS

5.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS

Foram utilizados ratos Wistar machos jovens, com aproximadamente 2 meses

de vida (média de 55 ± 7,4 dias de idade), pesando entre 240 e 345 g. A utilização

destes animais foi aprovada em 17/12/2014 através do número de referência 111/14,

pela Comissão de Ética no Uso de Animais em Experimentação Científica do Centro

de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio de Janeiro, sendo que toda a

parte experimental com os animais foi realizada dentro do período de validade do

protocolo aprovado. Os animais foram mantidos em caixas de dimensões de 34 x 40,5

x 17,5 cm (L x C x A), com até quatro animais por caixa em uma sala com ciclo

dia/noite de 12h/12h, com temperatura controlada e comida água ad libitum.

5.2 DESENHO EXPERIMENTAL PARA TESTE FUNCIONAL E RESSONÂNCIA

MAGNÉTICA

Grupo sham: 10 animais foram designados randomicamente para o grupo sham, no

qual receberam injeção na região estriatal de solução salina (NaCl 0,9% p/v). 24 h

depois receberam 500 µL de veículo (salina tamponada com fosfato 10 mM pH 7,4

(PBS) /DNAse) pela veia da cauda. Nenhum animal morreu nos 22 dias que se

seguiram.

Grupo AVEh moderado: 24 animais receberam injeção na região estriatal de 0,1U de

colagenase. 4 animais morreram nas primeiras 24 h, restando 20 animais que foram

designados randomicamente para receber as hWJ-MSCs (10 animais) ou veículo (10

animais). Nenhuma outra morte foi registrada no período até completar 22 dias. 1

animal do grupo veículo e 2 do grupo célula não participaram do teste do Rotarod,

devido a problemas no equipamento. 2 animais do grupo MSCs foram excluídos dos

resultados do teste do cilindro, por não terem conseguido realizar o teste em todos os

tempos avaliados. 1 animal do grupo veículo foi excluído posteriormente devido à

ausência de lesão visível na imagem de RM.

Page 53: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

35

Grupo AVEh severo 24 h: 47 ratos receberam injeção na região estriatal de 0,25 U de

colagenase. 19 animais morreram nas primeiras 24 h, restando 28 animais que foram

designados randomicamente para receber as hWJ-MSCs (14 animais) ou veículo (14

animais). 01 animal morreu 24 h após receber o veículo e nenhuma outra morte foi

registrada no período até completar 22 dias. 3 animais do grupo veículo foram

excluídos dos resultados do teste do cilindro, por não terem conseguido realizar o

teste em todos os tempos avaliados. 1 animal do grupo veículo foi excluído

posteriormente devido à localização anômala da lesão na imagem de RM.

Grupo AVEh severo 1 h: 30 ratos receberam injeção na região estriatal de 0,25 U de

colagenase. 3 animais morreram nas primeiras 24 h, restando 27 animais que foram

designados randomicamente para receber as hWJ-MSCs (14 animais) ou veículo (13

animais). 1 animal morreu 10 dias após receber veículo. 1 animal do grupo veículo foi

excluído posteriormente da análise por neuroimagem devido à presença de um

artefato na imagem de RM, que atrapalhou a quantificação do volume de lesão.

5.3 CIRURGIA

Neste trabalho foi utilizado o modelo de AVCh desenvolvido por Rosenberg et al.

(1990), com modificações, que consiste na injeção intraestrital de colagenase

bacteriana IV-S com auxílio de um esterotáxico.

Os animais foram primeiramente anestesiados com cloridrato de cetamina (100

mg/kg, Syntec, Santana de Parnaíba, Brasil) e cloridrato de xilazina (15 mg/kg,

Syntec) e analgesiados com cloridrato de tramadol (12,5 mg/kg, Cristália, Itapira,

Brasil), diluídos com solução salina (NaCl 0,9% p/v), através de injeção

intraperitoneal. Após verificação da efetividade do plano anestésico, os animais eram

posicionados no esterotáxico (Stoelting, Wood Dale, Estados Unidos) e submetidos à

tricotomia e a assepsia cirúrgica. Em seguida, era feita uma injeção intradérmica de

cloridrato de lidocaína (Cristália) (5 mg/kg) no local onde seria feita incisão na pele de

aproximadamente 1,5 cm na linha média do escalpe. O bregma era localizado e em

seguida eram encontradas as seguintes coordenadas estereotáxicas: 0,2 mm

anteroposterior e 3 mm médio-lateral. Uma cranioectomia de aproximadamente 1,5

mm de diâmetro era realizada, e após expor-se as meninges e o parênquima cerebral,

subtraia-se 6 mm da coordenada do eixo dorso-ventral e eram injetados 2 L de

Page 54: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

36

colagenase tipo IV-S (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Estados Unidos), previamente

preparada e estocada em uma solução balanceada de Hank’s (Gibco, Grand Island,

Estados Unidos). Foram utilizadas as doses de 0,1 U (0,05 U/L) e 0,25 U (0,125

U/L) de colagenase para os modelos de AVEh moderado e severo, respectivamente.

A administração da colagenase foi executada na velocidade de 0,25 L/min utilizando

seringa de 10 L (Hamilton Company, Reno, Estados Unidos), com auxílio de uma

bomba de infusão (Harvard Apparatus, Orlando, Estados Unidos). Ao término da

infusão, a agulha foi mantida pelo tempo de 10 min, com o objetivo de evitar refluxo

do líquido. A retirada da agulha foi feita lentamente (2 mm a cada minuto), o orifício

ósseo fechado através de cimento cirúrgico e a pele colada com cola cirúrgica.

5.4 EXTRAÇÃO DAS MSCS DA GELEIA DE WHARTON E CULTIVO CELULAR

Os cordões umbilicais foram coletados após a assinatura do Termo de

Consentimento Livre e Esclarecido (aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital

Universitário Clementino Fraga Filho, consubstanciado pelo parecer HUCFF519.235).

O nosso laboratório mantém uma coleção de células congeladas para uso e ao

chegar um novo cordão umbilical, a extração era realizada conforme descrito a seguir,

seguindo protocolo adaptado de Goldenberg et al. (2012): o cordão umbilical recolhido

era mantido sob refrigeração (Figura 6), em solução salina com 5% de glicose, por no

máximo 24 h após o parto até ser processado. Primeiramente, o cordão era lavado

com salina tamponada com fosfato 10 mM pH 7,4 (PBS, do inglês phosphate buffer

saline) para retirar o sangue dos vasos. A geleia de Wharton era então separada com

auxílio de pinça, triturada e colocada em Erlenmeyer com tampa. Adicionava-se 0,4%

de colagenase tipo II e mantinha-se por 16 h a 37°C, sob agitação lenta. Coletava-se

o material digerido, diluia-se em PBS até o dobro de volume inicial e homogenizava-

se. O material era submetido a três centrifugações consecutivas de 15 min cada,

sendo 2000 xg, 1000 xg e 500 xg, intercaladas com o descarte do sobrenadante e

nova suspensão em PBS a cada centrifugação. Após a última centrifugação,

ressuspendia-se o precipitado de células e plaqueava-se em meio DMEM low glucose

(do inglês Dulbecco’s modified Eagle médium, Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos)

suplementado com 15% de SFB (soro fetal bovino, Invitrogen) e 1% de

Page 55: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

37

penicilina/estreptomicina (P/S) (Sigma-Aldrich). As células eram então incubadas a

37°C e 5% de CO2.

Lavagem com PBS

3X • 2000 xg

• 1000 xg

• 500 xg

Material digerido PBS

Colagenase II 16 h 37°C

Ressuspensão DMEM 15%SFB 1% P/S

Trituração

Plaqueamento DMEM 15%SFB 1% P/S 37°C/5%CO2

Tripsinização Congelamento das hWJ-MSCs

Coleta do cordão

Figura 6: Representação da extração das células mesenquimais da geleia de Wharton de cordão umbilical humano. Adaptado da descrição de Goldenberg et al. (2012).

Page 56: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

38

As culturas eram mantidas em garrafas de 75 cm2, sendo feita a primeira troca de

meio após 4 ou 5 dias. Posteriormente, a renovação do meio ocorria a cada 2 ou 3

dias com lavagem em PBS após a primeira troca e até a primeira passagem. Ao

atingir cerca de 80-90% de confluência (aproximadamente 5 milhões de células), o

meio de cultura era descartado e a lavagem feita com PBS. Em seguida era realizada

a remoção enzimática das células aderidas ao plástico através da incubação por 5

min com solução de tripsina (0,25% de tripsina e 1 mM de EDTA, Gibco, Grand

Island, Estados Unidos) em estufa a 37°C e 5% de CO2. A tripsina era inativada com

a ressuspensão em 5 mL de meio DMEM-F12 suplementado com 15% de SFB 1% de

P/S e em seguida o conteúdo ressuspendido e centrifugado por 5 min a 300 xg. O

precipitado formado era ressupendido e plaqueado na proporção 1:3 em garrafas

(aproximadamente 1 milhão de células), caracterizando uma passagem.

As células eram mantidas congeladas na quantidade de 2 x 106 células por

criotubo em galão de nitrogênio líquido. Para a rotina da terapia celular realizada

neste trabalho as células eram utilizadas recém-descongeladas. O descongelamento

era feito com adição de DMEM-F12 com 15% SFB para ressuspensão das células,

transferidas para tubo Falcon de 15 mL e centrifugadas a 300 xg por 5 min. O meio

era descartado e as células ressuspendidas em DMEM-F12 sem soro suplementado

com glutamina e P/S. As células eram contadas e avaliada a sua viabilidade,

centrifugadas novamente, o meio descartado, e então ressuspendidas em PBS

contendo DNAse tipo 1 (15 L para cada 50 mL, Pulmozyme®, Roche, Basiléia,

Suiça). A viabilidade das células foi em média 88,68% ± 3,7. As células foram

utilizadas entre a terceira e quinta passagens.

5.5 CARACTERIZAÇÃO DAS MSCS DA GELEIA DE WHARTON

5.5.1 Imunofenotipagem das hWJ-MSCs

A caracterização das hWJ-MSCs foi realizada através da detecção de

marcadores de superfície típicos desse tipo celular por citometria de fluxo. Para isso,

as células em 3º passagem foram tripsinizadas e incubadas com os anticorpos

diluídos 1:50 em PBS 0.5% com albumina de soro bovino (BSA, do inglês bovine

serum albumine; Sigma-Aldrich) durante 20 minutos a 4ºC. Os anticorpos utilizados

Page 57: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

39

foram: anti-CD73 conjugado com APC (cat. 560847) (BD Biosciences), anti-CD90

conjugado com PE-Cy5 (cat. 555597) (BD Biosciences), anti-CD105 conjugado com

PE (cat. 560839) (BD Biosciences) e anti-HLA-DR conjugado com PE-Cy5 (cat.

551375)(BD Biosciences). Em seguida, as células foram lavadas uma vez com PBS e

centrifugadas a 300 xg durante 5 min. O sobrenadante foi ressuspendido em 300 µL

de PBS e a leitura foi realizada no citômetro de fluxo FACSAria II (BD Biosciences).

As análises foram realizadas utilizando o software FlowJo versão X, (Flowjo LLC,

Ashland, Estados Unidos).

5.5.2 Análise de Multipotência das hWJ-MSCs

5.5.2.1 Diferenciação Condrogênica

A diferenciação em linhagem condrogênica foi realizada utilizando o StemPro

Chondrogenesis Differentiation kit (A10071-01, StemPro, Gibco) e hWJ-MSCs na 4º

passagem. Para isso, as células de uma placa de 100 mm de diâmetro a uma

confluência de 70-80% foram tripsinizadas e centrifugadas a 300 xg durante 5 min. O

pellet foi ressuspendido em meio DMEM-F12 suplementado a uma concentração de

1,6 x 107 células/mL. Em seguida, 5 µL de solução de células foram gotejados com

cuidado no meio de poços de placas de 24 poços. A micromassa de células foi

incubada a 37ºC e 5% CO2 durante 2 h e em seguida foram adicionados 290 µL de

meio de condrogênese (StemPro Osteocyte/Chondrocyte Differentation Basal Medium

suplementado com 10% StemPro Chondrogenesis Supplement e 0,5% de P/E). O

meio foi trocado a cada 2-3 dias durante 14 dias e as massas celulares foram fixadas

com paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1 M (PFA 4%) durante 30 min. Depois

de fixadas, as massas celulares foram incubadas com solução 1% de Alcian Blue

preparada em HCl 0,1 N durante 30 min, e seguidamente cortadas no criostato e

montadas em lâminas. As imagens foram adquiridas por microscopia de campo claro

em um microscópio invertido Axiovert 135 (Carl Zeiss, Estocolmo, Suécia).

5.5.2.2 Diferenciação Osteogênica

Page 58: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

40

A diferenciação em osteócitos foi realizada utilizando o StemPro Osteogenesis

Differentiation kit (A10072-01, StemPro, Gibco). As células foram plaqueadas em

placas de 6 poços a uma densidade de 5 x 104 células por poço. Quando as células

chegaram a uma confluência de 60-70%, o meio foi trocado por meio de diferenciação

osteogênica (StemPro Osteocyte/Chondrocyte Differentation Basal Medium

suplementado com 10% StemPro Osteogenesis Supplement e 0,5% de P/S). O meio

foi trocado a cada 3-4 dias e após 7 dias as células foram fixadas com PFA 4%

durante 30 min. As células foram lavadas 2 vezes com água destilada, incubadas com

solução de Alzarin Red S 2% durante 3 min e lavadas novamente 2-3 vezes com

água destilada. As imagens foram adquiridas por microscopia de campo claro em um

microscópio invertido Axiovert 135 (Carl Zeiss).

5.5.2.3 Diferenciação Adipogênica

A diferenciação adipogênica foi realizada utilizando o StemPro Adipogenesis

Differentiation kit (A10070-01, Stempro, Gibco). As células foram plaqueadas em

placas de 6 poços a uma densidade de 1 x 105 células por poço. Quando as culturas

atingiram uma confluência de 60-70%, o meio foi trocado por meio de diferenciação

adipogênica (StemPro Adipocyte Differentation Basal Medium suplementado com

10% StemPro Adipogenesis Supplement e 0,5% de P/S). O meio foi trocado a cada 3-

4 dias e após 7 dias as células foram fixadas com PFA 4% durante 30 min. As células

foram lavadas 2 vezes com PBS e incubadas com Oil Red O, e finalmente as imagens

foram adquiridas por microscopia de campo claro em um microscópio invertido

Axiovert 135 (Carl Zeiss).

5.6 ADMINISTRAÇÃO INTRAVENOSA DE CÉLULAS

As hWJ-MSCs foram administradas por injeção intravenosa na veia da cauda,

na quantidade de 3 x 106 células, suspensas em 500 L de PBS/ DNase. Nos animais

do grupo veículo e do grupo sham foram administrados 500 L de PBS/DNAse. No

modelo de AVEh moderado as células foram injetadas 24 h após cirurgia e no modelo

de AVEh severo nos tempos de 1h ou 24 h após a cirurgia.

Page 59: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

41

5.7 PERFUSÃO TRANSCARDÍACA

Os animais foram submetidos à eutanásia, com cloridrato de cetamina e

cloridrato de xilazina, no 22º dia após a lesão e a uma perfusão transcardíaca com

infusão de solução salina 0,9%, visando à retirada de todo o sangue do sistema

vascular. Em seguida foi realizada a infusão de solução de PFA 4% em tampão

fosfato 0,1 M, para fixação do tecido. As cabeças dos animais eram armazenadas em

tubo Falcon, em solução de PFA 4%, até o dia da realização de RM.

5.8 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA

Com o objetivo de analisar o volume de lesão, foram adquiridas imagens de RM

das cabeças dos animais, 22 dias após a cirurgia.

5.8.1 Ressonância Magnética – Modelo AVEh moderado

Para o modelo de AVEh moderado, as imagens foram adquiridas em um

scanner de 7 T (Varian 7T/210, Agilent Technologies, Palo Alto, Estados Unidos, do

Centro Nacional de Biologia Estrutural e Bioimagem (CENABIO/UFRJ). Foram

realizadas imagens nas sequências gradiente 3D T1 e gradiente T2* axial, usando os

mesmos parâmetros geométricos: FOV = 30,7 x 30,7 x 30,7 mm com matriz de 256 x

256 x 256, voxel isotrópico de 0.12 mm.

As imagens ponderadas em T1 foram adquiridas com uma sequência gradiente

eco (GRE) com os seguintes parâmetros: TR/TE: 50/5ms, ângulo de flip = 20 graus,

17 médias; tempo de aquisição: 15 h 28 min. As imagens ponderadas em T2* foram

adquiridas com uma sequência GRE com os seguintes parâmetros: TR/TE: 500/15

ms; Flip Angle: 20º, espessura: 1 mm, 14 cortes contínuos, 40 médias, tempo de

aquisição: 1h25 min

O volume de lesão e volume dos hemisférios foram calculados com o uso do

software OsiriX versão 4.0 (Pixmeo SARL, Bernex, Suíça) por um examinador cego.

Para avaliar a lesão hemorrágica, a região de interesse (ROI, do inglês region of

interest), foi marcada em torno da lesão, em todos os cortes coronais que a mesma

Page 60: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

42

era visível. Ao final, solicitou-se que o software integrasse todas as regiões

demarcadas, obtendo-se assim o volume total, que era calculado automaticamente

pelo próprio software.

Para calcular o volume dos hemisférios, a área de cada hemisfério foi medida

em 40 cortes coronais a partir da coordenada estereotáxica anteroposterior +2,20 mm

do bregma. Ao final, solicitou-se que o software integrasse todas as regiões

demarcadas, obtendo-se assim o volume total, calculado automaticamente pelo

próprio software. O procedimento foi realizado individualmente para cada hemisfério.

5.8.2 Ressonância Magnética – Modelo AVEh severo

Para o modelo de AVEh severo, as imagens foram adquiridas em um sistema

de Ressonância Magnética de 2 T composto por um magneto Oxford Instruments

85310HR (Oxford Instruments, Abingdon, Reino Unido) e console Bruker Avance AVIII

(Bruker-Biospin, Ettlingen, Alemanha) no Centro de Imagens e Espectroscopia In Vivo

por Ressonância Magnética (CIERMag) do Instituto de Física de São Carlos (IFSC)

da Universidade de São Paulo (USP).

Sequências 3D ponderadas em T1, T2 e T2* foram adquiridas utilizando os

mesmos parâmetros geométricos: FOV = 32 x 32 x 32 mm com matriz de 128 x 128 x

128, resultando em uma resolução espacial isotrópica de 250 µm. As imagens

ponderadas em T1 foram adquiridas com uma sequência gradiente eco (GRE) com os

seguintes parâmetros: TE/TR = 15/3,5 ms, ângulo de flip = 30 graus, largura de banda

= 15 kHz e 16 médias (tempo total de aquisição: 1h). As imagens ponderadas em T2

foram adquiridas utilizando uma sequência PSIF com os seguintes parâmetros:

TR/TE: 24/7msângulo de flip = 60 graus, largura de banda = 15 kHz e 16 médias

(tempo total de aquisição: 2h). Finalmente, as imagens ponderadas em T2* foram

adquiridas com uma sequência gradiente eco (GRE) com os seguintes parâmetros:

TE/TR = 20/10,5 ms, ângulo de flip = 5 graus, largura de banda = 15kHz e 12 médias

(tempo total de aquisição: 1 h).

O volume de lesão e volume dos hemisférios foi calculado com o uso do

software Medical Image Processing, Analysis and Visualization versão 4.0 (National

Page 61: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

43

Institute of Health – NIH) por um examinador cego. Para avaliar o volume de lesão, a

região de interesse (ROI, do inglês region of interest) foi marcada em torno da lesão,

em todos os cortes coronais que a mesma era visível. Ao final, solicitou-se que o

software integrasse todas as regiões demarcadas, obtendo-se assim o volume total,

que era calculado automaticamente pelo próprio software.

Para calcular o volume dos hemisférios, a área de cada hemisfério foi medida

em 50 cortes coronais a partir da coordenada estereotáxica anteroposterior +2,70 mm

do bregma. Ao final, solicitou-se que o software integrasse todas as regiões

demarcadas, obtendo-se assim o volume total, calculado automaticamente pelo

próprio software. O procedimento foi realizado individualmente para cada hemisfério.

5.9 BIODISTRIBUIÇÃO ATRAVÉS DA MARCAÇÃO DE CÉLULAS COM 99M TC

Para avaliar a biodistribuição das hWJ-MSCs administradas intravenosamente, as

células foram marcadas com o radioisótopo tecnécio-99m (99mTc). Para cada animal,

3 x 106 hWJ-MSCs foram incubadas em 500 µL de solução de SnCl2 por 10 min à

temperaturas ambiente. Em seguida, aproximadamente 7 mCi de 99mTc foram

adicionados e a incubação continuou por mais 10 min. Após centrifugação de 500 xg

por 5 min, o sobrenadante foi descartado e as células lavadas com solução salina. O

precipitado de células foi ressuspendido em solução salina e a viabilidade das

mesmas foi avaliada usando azul de trypan. A eficiência da marcação foi calculada

pela atividade no precipitado dividida pela soma da radioatividade no precipitado mais

o sobrenadante, sendo maior que 90% em todos os casos (BARBOSA DA FONSECA

et al., 2010). A biodistribuição das células foi avaliada in vivo no tempo de 2 h após a

administração em uma gama câmara Millenium GE de duas cabeças com colimador

de alta resolução e baixa energia (General Eletric Medical Systems, Milwaukee,

Estados Unidos). Como controle de que o que estamos observando seria realmente a

distribuição corporal das hWJ-MSCs marcadas, injetamos 99mTc livre em um animal, o

qual também foi submetido à aquisição de imagem em gama câmara. Passadas 24 h,

os principais órgãos (sangue, coração, pulmões, rins, baço, fígado, estômago,

intestino, hemisfério cerebral direito, hemisfério cerebral esquerdo) foram dissecados,

pesados e a atividade medida em um contador gama (Perkin Elmer, Shelton, estados

Page 62: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

44

Unidos). A biodistribuição foi avaliada em 3 animais em cada grupo (AVEh moderado,

AVEh severo, naive e sham).

Para calcular a % dose/grama de tecido, foi realizado o seguinte cálculo:

% dose/órgão: radiotividade medida do órgão x 100

Soma das radioatividades de todos os órgãos medidos

Em seguida:

% dose/grama de tecido: % dose/órgão

massa do órgão (g)

5.10 AVALIAÇÃO FUNCIONAL

Os animais eram sempre ambientados por no mínimo 30 min na sala de

realização de teste funcional, mantidos no escuro, com uma iluminação mínima na

sala e os testes funcionais realizados por um examinador cego

5.10.1 Rotarod

Este teste consiste em colocar o animal sobre um cilindro giratório, avaliando-

se o tempo que o animal consegue se equilibrar sobre esse cilindro. Foram realizadas

três rodadas do teste, de 7 min cada ou até que o animal se desequilibrasse, não

ultrapassando 7 min. Entre uma rodada e outra, aguardava-se 5 min. A rotação do

cilindro era crescente, até atingir 37 rpm. Esse teste foi realizado nos tempos de -2

(pré-teste), 3, 7, 14 e 20 dias nos modelos de AVEh moderado e AVEh severo 24 h

Para avaliação dos animais do modelo de AVEh severo que receberam injeção 1 h

após início do hematoma, realizou-se o rotarod três dias consecutivos antes da

cirurgia (pré-teste) e após nos dias 3,14 e 21.

5.10.2 Elevated body swing test

O animal era suspenso pela cauda e era observado o comportamento de

rotacionar a cabeça e elevar o corpo para um lado. Um swing era contado sempre

Page 63: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

45

que o animal movia sua cabeça mais de 10° para fora do eixo vertical, para a direita

ou esquerda. Antes de o próximo swing ser contado, o animal devia retornar para a

posição vertical. O teste consistia em contar 20 swings, intercalados a cada 5. Foi

realizado nos seguintes tempos: -1 (pré-teste), 1 (antes de realizar a administração

IV), 8, 15 e 21 dias para os grupos sham, veículo e hWJ-MSCs nos modelos AVEh

moderado e AVEh severo 24 h. Para avaliação dos animais do modelo de AVEh

severo que receberam injeção 1 h após início do hematoma, realizou-se o body swing

apenas no tempo de 21 dias.

5.10.3 Teste do cilindro

O animal era colocado dentro do cilindro com as medidas de 20 cm x 30 cm

(D x A). Eram contados 20 eventos, dentro de no máximo 20 min. Caso não

ocorressem os 20 eventos neste tempo, o teste era encerrado com um número menor

destes. Os eventos correspondiam ao número de vezes que o animal se apoiava com

a pata direita (contralateral à lesão), com a pata esquerda (ipsilateral à lesão) ou com

ambas na parede do cilindro. O teste somente era contabilizado se ocorressem pelo

menos 10 eventos. Ao final era utilizada a seguinte fórmula:

% de assimetria = [I/(I+C+B)] – [C/(I+C+B)], onde:

I = uso da pata ipsilateral (esquerda)

C = uso da pata contralateral (direita)

B = uso de ambas patas

O teste foi realizado nos dias -1 (pré-teste), 4, 8, 15 e 21 dias após cirurgia para os

grupos sham, salina e hWJ-MSCs nos modelos AVEh moderado e AVEh severo 24

h.

5.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad

Prism versão 6.01 (GraphPad Prism, Inc., San Diego, Estados Unidos). Os dados

foram expressos como média ± SD, ou como média ± SEM. Foram utilizados os

seguintes testes estatísticos: análise de variância de dois fatores (ANOVA), com teste

de comparação múltipla de Tukey, ANOVA com teste de comparação múltipla de

Page 64: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

46

Bonferroni ou teste t de Student, após confirmação da normalidade com teste

D’Agostino-Pearson. As diferenças observadas foram consideradas significantes

quando p < 0,05.

Page 65: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

47

6. RESULTADOS

6.1 CARACTERIZAÇÃO DAS MSCS DA GELEIA DE WHARTON

Todos os experimentos realizados neste trabalho foram conduzidos utilizando

hWJ-MSCs derivadas do cordão umbilical de um único doador. As células deste

cordão foram caracterizadas como mesenquimais tanto através da imunofenotipagem,

demonstrando a expressão dos marcadores CD73, CD90 e CD105 (≥95%) e baixa

expressão do marcador HLA-DR (≤2%), quanto através da diferenciação nas

linhagens celulares adipogênica, osteogência e condrogênica, conforme mostram as

figuras 7 e 8.

Figura 7: Caracterização das MSCs de cordão umbilical por imunofenotipagem. Análise

por citometria de fluxo demonstrou que as células estromais mesenquimais do cordão

umbilical utilizadas neste estudo eram CD73 (99,8%) (A), CD90 (98,9%) (B) e CD105

(99,7%)(C) positivas e HLA-DR (D) negativas. n = 1.

A B

C D

Page 66: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

48

6.2 AVALIAÇÃO FUNCIONAL DOS ANIMAIS COM AVEH MODERADO

A coordenação motora e as alterações do equilíbrio foram avaliadas através do

tempo de permanência dos animais no Rotarod. Para o modelo de AVEh moderado,

não foram observadas diferenças significativas entre os grupos hWJ-MSCs, sham e

veículo ao longo dos 20 dias de avaliação (Figura 9).

Linhagem adipogênica Linhagem condrogênica Linhagem osteogênica

100um 100um 100um

Figura 8: Diferenciação das hWJ-MSCs em linhagens celulares mesodérmicas. Fotomicrografias demonstrando a marcação da linhagem condrogênica com Alcian Blue, adipogênica com Oil Red e osteogênica com Alzarin Red. Barras de escala correspondem a 50 µm.

Page 67: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

49

Figura 9: Teste do Rotarod no AVEh moderado. Não houve diferença entre os grupos no modelo de AVEh moderado. Veículo n=8; hWJ-MSCs n = 8; sham n= 10. Os dados mostrados no gráfico representam a média ± S.E.M. hWJ-MSCs = células estromais mesenquimais da geleia de Wharton humana.

Outro teste utilizado de alterações motoras foi o EBST. Na avaliação do EBST,

no modelo de AVEh moderado, foi observada diferença significativa entre os grupos

sham e veículo apenas no tempo de 8 dias, com recuperação espontânea posterior,

não havendo prejuízo funcional nos demais tempos (Figura 10).

Page 68: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

50

Figura 10: Elevated body swing test no AVEh moderado. Foi observada diferença significativa no modelo de AVEh moderado apenas entre o grupo sham e salina no tempo de 8 dias. Veículo n = 9, hWJ-MSCs n = 10, sham n = 10; ** = ρ < 0,01 (comparação entre os grupos veículo e sham); Two-way ANOVA, com pós teste de Tukey. Os dados mostrados no gráfico representam a média ± S.E.M. MSCs = células estromais mesenquimais da geleia de Wharton humana.

No teste do cilindro, não houve diferença significativa entre os grupos salina e

sham no modelo de AVEh moderado em nenhum dos tempos avaliados, havendo no

entanto uma diferença entre os grupos hWJ-MSCs e sham nos tempos de 4 e 21 dias.

Este teste demonstrou não ser eficaz para avaliar o prejuízo funcional dos animais do

modelo de AVEh moderado, tendo ocorrido uma variabilidade grande nos resultados

entre os animais, além de alguns animais terem seus resultados descartados para

análise estatística, pois não cooperaram na realização do teste em algumas datas

avaliadas (Figura 11).

Page 69: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

51

Figura 11: Teste do cilindro no AVEh moderado. Não foi detectado prejuízo funcional no grupo veículo quando comparado ao grupo sham, porém houve maior assimetria no grupo hWJ-MSCs nos tempos de 4 e 21 dias. Veículo n=9; hWJ-MSCs n = 8, sham n= 10; † = comparação entre os grupos MSCs e sham. † = ρ < 0,05, Two-way ANOVA, com pós teste de Tukey. Os dados mostrados no gráfico representam a média ± S.E.M. MSCs = células estromais mesenquimais da geleia de Wharton humana.

6.3 AVALIAÇÃO DO VOLUME DE LESÃO NOS ANIMAIS COM AVEH MODERADO

Para avaliarmos se a terapia celular levaria a uma redução do volume de lesão,

realizamos a aquisição de imagens por RM de todos os animais (cabeças fixadas) dos

grupos veículo e hWJ-MSCs, no 22º dia após a cirurgia. Após a obtenção da imagem,

calculamos individualmente o volume da lesão em cada corte coronal na sequência

T1 eco 3D que apresentava lesão. Em seguida, solicitamos ao software para integrar

os valores e calcular o volume total da lesão. A figura 12 mostra imagens

representativas da lesão na região do estriado nos eixos axial, coronal e sagital em

um animal veículo e em um animal tratado com hWJ-MSCs, os quais apresentaram

um volume de lesão próximo da média de seu respectivo grupo. A extensão da lesão

no grupo veículo foi de +2,25 ± 0,36 mm a -2,47 ± 0,15 mm em relação ao bregma e

no grupo hWJ-MSCs de + 2,39 ± 0,21 mm a -2,04 ± 0,38 mm em relação ao bregma.

Page 70: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

52

O contorno em vermelho demonstra a região de interesse (ROI) marcada para

posterior cálculo do volume (figura 13). A análise do volume de lesão nos animais dos

grupos veículo e hWJ-MSCs demonstrou diferença significativa entre os grupos. A

média de volume da lesão no grupo veículo foi de 10,5 mm3 (DP = 2,36) e no grupo

hWJ-MSCs foi de 7,6 mm3 (DP = 3,08) (p = 0,0390, teste t de Student).

AV

Eh +

Ve

ícu

lo

AV

Eh +

hW

J-M

SCs

Figura 12: Volume de lesão nos animais com AVEh moderado. Imagens representativas de cortes axiais (A,D), coronais (B,E) e sagitais (C, F) obtidos em equipamento de RM com uma sequência T1 echo 3D. Grupo veículo (A,B,C,) e grupo hWJ-MSCs (D, E, F).

Page 71: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

53

Vo

lum

e d

e l

es

ão

(m

m3)

A V E h + V e íc u lo A V E h + h W J -M S C s

0

5

1 0

1 5

*

Figura 13: Avaliação do volume de lesão nos animais com AVEh moderado. Representação da região de interesse (ROI) marcada em vermelho (A e B). A = grupo veículo e B = hWJ-MSCs. A figura C representa o gráfico das medidas, nos grupos veículo (n= 9) e hWJ-MSCs (n = 10). (*) p = 0,0390; Teste t de Student; média do grupo veículo = 10,5 ± 2,27 mm

3; média do grupo hWJ-MSCs = 7,6 ± 3,1

mm3. Os dados mostrados no gráfico representam valores individuais, com as médias e o desvios

padrão. hWJ-MSCs = células estromais mesenquimais da geleia de Wharton humana

A figura 14 representa a lesão no eixo coronal na sequência T2*. A

desvantagem dessa sequência é que, ocasionalmente, o tamanho da lesão, é

impreciso devido aos artefatos que causam perda de sinal no limite das lesões

C

Page 72: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

54

(MIRZA E GOKHALE, 2017). Assim, optou-se em realizar a medida de volume

apenas na sequência T1, evitando superdimensionar o volume de lesão.

6.4 VOLUME DOS HEMISFÉRIOS NO AVEH MODERADO

Com o intuito de analisar se a terapia celular ajudaria a reduzir a atrofia do

hemisfério lesado, realizamos a medida de volume em 40 cortes de cada amostra,

através da marcação manual do ROI e posterior integração, obtendo o valor total do

volume de cada hemisfério. A avaliação realizada do volume dos hemisférios

esquerdo e direito nos grupos veículo e hWJ-MSCs mostrou uma diferença

significativa entre os dois hemisférios, em ambos os grupos experimentais, com o

hemisfério esquerdo (ipsilateral à lesão) aproximadamente 5% menor do que o direito

(Figura 15). No entanto, ao calcularmos a razão entre o volume do hemisfério

ipsilateral em relação ao volume do hemisfério contralateral (%ipsilateral/contralateral)

não observamos diferença estatisticamente significativa entre os grupos (Figura 16).

Ao calcularmos o percentual do volume de lesão em relação ao volume do hemisfério

ipsilateral observamos um valor médio ligeiramente menor do grupo hWJ-MSCs

quando comparado ao veículo, porém sem haver diferença significativa entre os

grupos.

A B

Figura 14: Representação do volume de hematoma residual nos animais com AVEh moderado em uma sequência T2*. Grupo veículo (A) e grupo hWJ-MSCs (B). Corte no eixo coronal.

Page 73: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

55

Vo

lum

e d

os

he

mis

fério

s n

o g

ru

po

ve

ícu

lo

(mm

3)

H e m is fé r io c o n tra la te ra l H e m is fé r io ip s ila te ra l

2 2 0

2 4 0

2 6 0

2 8 0

3 0 0

3 2 0

3 4 0

* *

Vo

lum

e d

os

he

mis

fério

s n

o g

ru

po

hW

J-M

SC

s

(mm

3)

H e m is fé r io c o n tra la te ra l H e m is fé r io ip s ila te ra l

2 2 0

2 4 0

2 6 0

2 8 0

3 0 0

3 2 0

* * *

B

A

Figura 15: Avaliação do volume dos hemisférios cerebrais nos animais com AVEh moderado. Grupos veículo (n=9) (A) e hWJ-MSCs (n=10) (B). (**) p = 0,0063; (***) p = 0,0002; Grupo Veículo (hemisfério contralateral = 285,8 ± 19,13 mm

3; hemisfério ipsilateral = 271,6 ± 17,71 mm

3); grupo hWJ-

MSCs (hemisfério contralateral = 271,9 ± 8,67 mm3; hemisfério ipsilateral = 256,6 ± 7,21). Os dados

mostrados no gráfico representam valores individuais. Teste t pareado.

A B

Page 74: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

56

% d

e v

olu

me

he

mis

fério

ip

sil

ate

ra

l /

co

ntr

ala

tera

l

A V E h + V e íc u lo A V E h + h W J - M S C s

8 0

8 5

9 0

9 5

1 0 0

1 0 5

1 1 0%

Vo

lum

e d

e l

es

ão

/

vo

lum

e h

em

isfé

rio

ip

sil

ate

ra

l

A V E h + v e íc u lo A V E h + h W J - M S C s

0

2

4

6

8

A

B

Figura 16: Avaliação dos hemisférios cerebrais nos animais com AVEh moderado.(A) Determinação do percentual do volume do hemisfério ipsilateral em relação ao volume do hemisfério contralateral dos grupos veículo (média= 95,6 ± 4,04) e hWJ-MSCs (média=94,5 ±2,85). (B) Determinação do % do volume de lesão em relação ao volume do hemisfério ipsilateral nos animais com AVEh moderado dos grupos veículo (média=3,86 ± 0,82) e hWJ-MSCs (média=2,99 ± 1,13). Teste t não pareado. Veículo: n = 9, hWJ-MSCs: n = 10. Os dados mostrados no gráfico representam

valores individuais. hWJ-MSCs = células estromais mesenquimais da geleia de Wharton humana.

Page 75: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

57

6.5 AVALIAÇÃO FUNCIONAL DOS ANIMAIS COM AVEH SEVERO 24 H

No modelo de AVEh severo tratado 24 h após a cirurgia, observamos um

prejuízo funcional no grupo veículo, quando comparado ao grupo sham, nos tempos

de 3 e 7 dias (Figura 17) no teste do Rotarod. No tempo de 3 dias, também

observamos que ocorreu diferença siginificativa entre o grupo hWJ-MSCs e sham,

mostrando que logo após a cirurgia ocorre um déficit motor tanto no grupo tratado

quanto no grupo veículo, e que só depois passa a ocorrer uma recuperação de ambos

os grupos, sugerindo que os animais do grupo hWJ-MSCs se recuperaram um pouco

mais rápido, visto que no tempo de 7 dias só houve diferença siginificativa entre o

grupo sham e veículo.

Figura 17: Teste do Rotarod no AVEh severo 24 h. Houve um prejuízo funcional nos tempos de 3 e 7 dias para o grupo veículo e apenas no dia 3 para o grupo hWJ-MSCs. Veículo n = 14; hWJ-MSCs n = 12, sham n= 10. # = comparação entre os grupos salina e sham; † = comparação entre os grupos hWJ-MSC e sham. † = ρ < 0,05, †† = ρ < 0,01, ### = ρ < 0,001; Two-way ANOVA com pós teste de Tukey. Os dados mostrados no gráfico representam a média ± S.E.M. hWJ-MSCs = células estromais mesenquimaisda geleia de Wharton humana.

Page 76: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

58

No EBST do modelo de AVEh severo tratado 24 h após a cirurgia (Figura 18)

observamos um prejuízo funcional em todos os tempos avaliados, sem haver

recuperação no grupo veículo, nos 21 dias analisados. O grupo hWJ-MSCs também

foi diferente do grupo sham em todos os tempos.

T e m p o (d ia s )

% E

lev

ão

pa

ra

a d

ire

ita

-1 1 815

21

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

A V E h + V e íc u lo (n = 1 4 )

S h a m (n = 1 0 )

A V E h + h W J -M S C s (n = 1 2 )

# # # #

† †† † †

# # # # # ## # # #

D ia 0

C iru rg ia

D ia 1

In jeção

† †

Figura 18: Elevated body swing test no AVEh severo 24 h. Observou-se diferença significativa dos grupos veículo e hWJ-MSCs em relação ao grupo sham em todos os tempos avaliados. Veículo n = 14; hWJ-MSCs n = 12, sham n = 10. # = comparação entre os grupos veículo e sham; † = comparação entre os grupos hWJ-MSC e sham. † = ρ < 0,05, ### = ρ < 0,001, #### = ρ < 0,0001; Two-way ANOVA, com pós teste de Tukey. Os dados mostrados no gráfico representam a média ± S.E.M. hWJ-MSCs = células estromais mesenquimais da geleia de Wharton humana.

No teste do cilindro, observamos também um prejuízo funcional do grupo

veículo em todos os tempos avaliados, com diferença significativa em relação ao

grupo sham (Figura 19). O grupo hWJ-MSCs mostrou diferença significativa em

relação ao grupo sham no tempo de 8 dias, sugerindo uma menor assimetria nos

Page 77: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

59

demais tempos avaliados. Ressalta-se que os animais que não conseguiram fazer o

teste em todos os tempos, foram desconsiderados na análise estatística.

Figura 19: Teste do cilindro no AVEh severo 24 h. Não foi observada recuperação funcional no modelo de AVEh severo. Veículo n = 11, hWJ-MSCs n = 12, sham n= 10. # = comparação entre os grupos veículo e sham; † = comparação entre os grupos hWJ-MSCs e sham. † = ρ < 0,05, ## = p < 0,01, #### = ρ < 0,0001, Two-way ANOVA, com pós teste de Tukey. Os dados mostrados no gráfico representam a média ± S.E.M. hWJ-MSCs = células estromais mesenquimais da geleia de Wharton humana.

6.6 AVALIAÇÃO DO VOLUME DE LESÃO NOS ANIMAIS COM AVEH SEVERO 24H

Para avaliarmos se a terapia celular levaria a uma redução do volume de lesão

também no AVEh severo tratado em 24 h, nós realizamos a aquisição de imagens por

RM de todos os animais dos grupos veículo e hWJ-MSCs, no 22º dia após a cirurgia.

Realizamos o procedimento conforme já descrito anteriormente, com a diferença de

que utilizamos outro scanner de RM para a aquisição das imagens. A figura 20 mostra

Page 78: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

60

imagens representativas da lesão na região do estriado nos eixos axial, coronal e

sagital em um animal veículo e um animal hWJ-MSCs, que apresentaram um volume

de lesão próximo da média de seu respectivo grupo. A extensão da lesão no grupo

veículo foi +2,09 ± 0,22 a -3,12 ± 0,19 mm em relação ao bregma e no grupo hWJ-

MSCs foi de + 2,5 ± 0,28 a -2,64 ± 0,24 mm em relação ao bregma. O contorno em

vermelho demonstra a região de interesse (ROI) marcada para posterior cálculo do

volume (Figura 21). A análise do volume de lesão nos animais dos grupos veículo e

hWJ-MSCs não demonstrou diferença significativa entre os grupos, quando avaliadas

as imagens na sequência T1 echo 3D (Figura 21). A média de volume da lesão no

grupo veículo foi de 20,16 mm3 (DP = 2,625) e no grupo hWJ-MSCs foi de 20,88 mm3

(DP = 2,763). A figura 22 mostra a lesão no eixo coronal na sequência T2*.

Page 79: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

61

AV

Eh +

Ve

ícu

lo

AV

Eh +

hW

J-M

SCs

Figura 20: Volume de lesão nos animais com AVEh severo 24 h. Cortes axiais (A,D), coronais (B,E) e sagitais (C,F) obtidos em uma sequência T1 echo 3D. Grupo veículo (A, B, C,) e hWJ-MSCs (D, E, F).

Page 80: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

62

Vo

lum

e d

e l

es

ão

(m

m3)

A V E h + V e íc u lo A V E h + h W J -M S C s

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

Figura 21: Avaliação do volume de lesão nos animais com AVEh severo 24 h. Representação da região de interesse (ROI) marcada em vermelho (A e B). A = grupo veículo e B = hWJ-MSCs. A figura C representa o gráfico das medidas dos volumes da lesão nos grupos veículo (n = 14) e hWJ-MSCs (n = 12). Não houve diferença significativa entre os grupos. Média do grupo veículo = 20,16 ± 2,625 mm

3;

média do grupo hWJ-MSCs = 20,88 ± 2,763 mm3. Os dados mostrados no gráfico representam valores

individuais. hWJ-MSCs = células estromais mesenquimais da geleia de Wharton humana.

C

Page 81: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

63

6.7 VOLUME DOS HEMISFÉRIOS NO AVEH SEVERO 24 H

Com o intuito de analisar se a terapia celular ajudaria a manter o volume

normal do hemisfério lesado no modelo severo tratado em 24 h, realizamos a medida

em 50 cortes de cada amostra, através da marcação manual do ROI e posterior

integração, obtendo o valor total do volume de cada hemisfério. A avaliação realizada

do volume dos hemisférios esquerdo e direito nos grupos veículo e hWJ-MSCs

mostrou uma diferença significativa entre os dois hemisférios, em ambos os grupos

experimentais, com o hemisfério ipsilateral à lesão aproximadamente 5% menor do

que o contralateral (Figura 23). Não observamos diferença estatisticamente

significativa entre os grupos quando calculamos o % do volume do hemisfério

ipsilateral em relação ao volume do hemisfério contralateral (%ipsilateral/contralateral)

ou ao calcularmos o percentual do volume de lesão em relação ao volume do

hemisfério ipsilateral (Figura 24).

B A

Figura 22: Representação do volume de hematoma residual nos animais com AVEh severo 24h em uma sequência T2*. Grupo veículo (A) e grupo hWJ-MSCs (B). Corte no eixo coronal.

Page 82: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

64

Vo

lum

e d

o h

em

isfé

rio

gru

po

ve

ícu

lo

(m

m3

)

H e m is fé r io c o n tra la te ra l H e m is fé r io ip s ila te ra l

2 5 0

3 0 0

3 5 0

4 0 0 ****V

olu

me

do

he

mis

fério

gru

po

hW

J-M

SC

s

(m

m3

)

H e m is fé r io c o n tra la te ra l H e m is fé r io ip s ila te ra l

2 5 0

3 0 0

3 5 0

4 0 0 ****

A

B

Figura 23: Avaliação do volume dos hemisférios cerebrais nos animais com AVEh severo 24 h. Grupos veículo (n = 11) (A) e hWJ-MSCs (n = 12) (B) (****) p = < 0,0001 (***). Grupo Veículo (hemisfério contralateral = 320,8 ± 24,41 mm

3; hemisfério ipsilateral = 304,5 ± 23,42 mm

3); grupo hWJ-

MSCs (hemisfério contralateral = 337,7 ± 18,46 mm3; hemisfério ipsilateral = 322,5 ± 20,31). Os dados

mostrados no gráfico representam valores individuais, as médias e desvios padrão. Teste t pareado.

Page 83: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

65

% d

e V

olu

me

he

mis

fério

ip

sil

ate

ra

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V e íc u lo h W J -M S C s

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A

B

Figura 24: Avaliação dos hemisférios cerebrais nos animais com AVEh severo 24 h.(A) Determinação do percentual do volume do hemisfério ipsilateral em relação ao volume do hemisfério contralateral dos grupos veículo (média = 94,97 ± 0,6895) e hWJ-MSCs (média = 95,48 ± 0,5908). (B) Determinação do % do volume de lesão em relação ao volume do hemisfério ipsilateral nos animais com AVEh severo 24 h dos grupos veículo (média = 6,536 ± 0,8112) e hWJ-MSCs (média = 6,564 ± 0,9331). Teste t não pareado. Veículo: n = 14, hWJ-MSCs: n = 12. Os dados mostrados no gráfico representam valores individuais, as médias e os desvios padrão hWJ-MSCs = células estromais mesenquimais da geleia de Wharton humana.

Page 84: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

66

6.8 AVALIAÇÃO FUNCIONAL DOS ANIMAIS COM AVEH SEVERO 1 H

Decidimos avaliar se os animais tratados com hWJ-MSCs apenas 1 h após a

injeção da colagenase, ainda na fase hiperaguda da hemorragia, apresentariam uma

maior recuperação funcional. Realizamos o teste do Rotarod, modificando o pré-teste.

Fizemos 3 dias consecutivos de pré-teste, para assim conserguimos obter uma

otimização do tempo máximo de permanência dos animais sobre o cilindro antes da

cirurgia. Após a cirurgia, os dois grupos mostraram uma queda no tempo de

permanência sobre o cilindro, porém mostrando uma recuperação similar ao longo do

tempo para os grupos veículo e hWJ-MSCs (Figura 25-A). Já o teste do EBST foi

realizado apenas no dia 21 após a cirurgia, não sendo nesse tempo detectada

diferença entre os grupos (Figura 25-B).

Page 85: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

67

T e m p o (d ia s )

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A V E h + h W J -M S C s (n = 1 0 )

A V E h + V e íc u lo (n = 1 2 )

A

B

Figura 25: Avaliação funcional dos animais AVEh severo que receberam injeção 1 h após cirurgia. Não há diferença significativa entre os grupos veículo (n = 12) e hWJ-MSCs (n = 14) no teste do Rotarod (A). Também não foi observada diferença no Elevated body swing test no 21º dia após a cirurgia (B); veículo (n = 12) e hWJ-MSCs (n =10). Os dados mostrados no gráfico representam a média ± S.E.M. hWJ-MSCs = células estromais mesenquimais de geleia de Wharton humana.

Page 86: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

68

6.9 AVALIAÇÃO DO VOLUME DE LESÃO NOS ANIMAIS COM AVEH SEVERO 1H

Para avaliarmos se a terapia celular promoveria uma redução do volume de

lesão quando realizada ainda na fase hiperaguda da hemorragia, tratamos os animais

1 h após terminar a injeção da colagenase e realizamos a aquisição de imagens por

RM de todos os animais no 22º dia após a cirurgia. Realizamos o procedimento

conforme já descrito anteriormente, com a diferença de que utilizamos também o

scanner 2T de RM para a aquisição das imagens. A figura 26 mostra imagens

representativas da lesão na região do estriado nos eixos axial, coronal e sagital em

um animal veículo e um animal hWJ-MSCs, que apresentaram um volume de lesão

próximo da média de seu respectivo grupo. O contorno em vermelho demonstra a

região de interesse (ROI) marcada para posterior cálculo do volume (Figura 27). A

análise do volume de lesão nos animais dos grupos veículo e hWJ-MSCs não

demonstrou diferença significativa entre os grupos, quando avaliadas as imagens na

sequência T1 echo 3D. A média de volume da lesão no grupo veículo foi de 23,82

mm3 (DP = 1,969) e no grupo hWJ-MSCs foi de 32,83 mm3 (DP = 5,853). Observa-se

no gráfico que dois valores (89,19 e 76,56 mm3) do grupo hWJ-MSCs ficaram

discrepantes em relação ao restante do grupo. Realizou-se então o teste estatístico

de ROUT para verificação de valores outliers. Como resultado, os dois valores foram

detectados como outliers. Caso os dois valores sejam retirados, a média do grupo

muda para 24,48 mm3 (DP =1,53), mas continua não havendo diferença significativa

no volume de lesão entre os grupos hWJ-MSCs e veículo. A figura 28 mostra a lesão

no eixo coronal na sequência T2*.

Page 87: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

69

AV

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Veí

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A

VEh

+ h

WJ-

MSC

s

Figura 26: Volume de lesão nos animais com AVEh severo 1 h. Cortes axial (A,D), coronal (B,E) e sagital (C,F) obtidos em uma sequência T1 echo 3D. Grupo veículo (A, B, C,) e hWJ-MSCs (D, E, F)..

Page 88: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

70

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Figura 27: Avaliação do volume de lesão nos animais com AVEh severo 1 h. Representação da região de interesse (ROI) marcada em vermelho (A e B). A = grupo veículo e B = hWJ-MSCs. A figura C representa o gráfico das medidas dos volumes das lesões, nos grupos veículo (n= 14) e hWJ-MSCs (n = 11). Não houve diferença significativa entre os grupos. Média do grupo veículo = 23,82 ± 1,969 mm

3; média do grupo hWJ-MSCs = 32,83 ± 5,853 mm

3.Os dados mostrados no gráfico representam

valores individuais, as médias e os desvios padrão. hWJ-MSCs = células estromais mesenquimais da geleia de Wharton humana.

C

Page 89: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

71

Decidimos comparar então o volume de lesão entre os grupos tratados e

veículo 1 h versus 24 h (Figura 29), não havendo diferença entre os grupos,

mantendo-se como esperado um volume médio similar entre os grupos veículos 1 h e

24 h.

Vo

lum

e d

e l

es

ão

(m

m3)

AV

Eh

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AV

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1 0 0

Figura 29: Avaliação do volume de lesão nos animais com AVEh severo 1 h versus 24 h. Representação da região de interesse (ROI) marcada em vermelho (A e B). A = grupo veículo e B = hWJ-MSCs. A figura C representa o gráfico das medidas, nos grupos veículo (n = 14) e hWJ-MSCs (n = 11). Não houve diferença significativa entre os grupos. Os dados mostrados no gráfico representam valores individuais. hWJ-MSCs = células estromais mesenquimais da geleia de Wharton humana.

B A

Figura 28: Representação do volume de hematoma residual nos animais com AVEh severo 1h em uma sequência T2*. Grupo veículo (A) e grupo hWJ-MSCs (B). Corte no eixo coronal.

Page 90: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

72

6.10 BIODISTRIBUIÇÃO ATRAVÉS DA MARCAÇÃO DE CÉLULAS COM 99M TC

A biodistribuição das hWJ-MSCs marcadas com 99mTc administradas

intravenosamente foi avaliada em 2 h, por imagem realizada em uma gama câmara e

em 24 h, através de contagem da radioatividade residual em contador gama. A figura

30 mostra a captação das células marcadas com 99mTc, 2 h após injeção, nos

pulmões, rins e fígado, de forma similar nos animais AVEh moderado, AVEh severo,

sham e naive. Como controle, também injetamos 99mTc livre em um animal, onde

observamos uma captação característica de 99mTc livre (no estômago e sistema

urinário), diferente da captação das hWJ-MSCs marcadas. A avaliação realizada após

24 h através da dissecação dos órgãos e posterior contagem da radioatividade

residual demonstrou uma captação maior nos pulmões, rins, baço e fígado, similar

nos três grupos (Figura 31). Quando analisamos separadamente os hemisférios

cerebrais, comparando os hemisférios ipsilateral à lesão e contralateral dentro de

cada grupo, observamos uma maior radioatividade residual no hemisfério ipsilateral à

lesão do que no contralateral, apenas nos grupos AVEh. Não observamos diferenças

entre os dois hemisférios nos grupos sham e naive.

Ao normalizamos o resultado da captação do hemisfério ipsilateral pela

captação do hemisfério contralateral e comparar os quatro grupos (Figura 32), apenas

o grupo AVEh severo demonstrou ser significantemente diferente em relação ao

grupos AVEh moderado, sham e naive.

Page 91: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

73

Figura 30: Representação da imagem de corpo inteiro dos animais que receberam hWJ-MSCs marcadas com

99mTc. AVEh moderado que recebeu hWJ-MSCs-

99mTc (A), AVEh severo que recebeu

hWJ-MSCs-99m

Tc (B), sham que recebeu hWJ-MSCs-99m

Tc (C), e naive que recebeu hWJ-MSCs-99m

Tc (D) demonstrando a biodistribuição das MSCs marcadas com 99m

Tc 2 h após a injeção intravenosa. Pode-se observar a captação nos pulmões, fígado e rins. A figura E mostra o animal que recebeu tecnécio livre, presente no estômago e bexiga

AVEh moderado AVEh severo Sham

Naive Tecnécio livre

Page 92: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

74

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H e m is fé r io ip s ila te ra l

***

A

B

Figura 31: Distribuição das hWJ-MSCs marcadas com 99m

Tc. Análise da distribuição das hWJ-MSCs marcadas com

99m Tc 24 h após a injeção intravenosa nos animais AVEh moderado e AVEh

severo, em comparação aos grupos sham e naive, em diversos órgãos (A) e nos hemisférios cerebrais (B). n= 3 por grupo. A radioatividade está expressa como % de dose por grama de tecido. * = comparação entre os hemisférios cerebrais contralateral e ipsilateral à lesão. Two-way ANOVA, com pós teste de Bonferroni. Os dados representam a média ± SD.

Page 93: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

75

Figura 32: Distribuição das hWJ-MSCs marcadas com 99m

Tc nos hemisférios cerebrais. Análise da distribuição das hWJ-MSCs marcadas com

99m Tc 24 h após a injeção intravenosa nos animais

AVEh moderado e AVEh severo, em comparação aos grupos sham e naive nos hemisférios cerebrais. n = 3 por grupo. * = comparação da captação do hemisfério ipsilateral / captação do hemisfério contralateral entre os 4 grupos. One-way ANOVA, com pós teste de Tukey. Os dados representam a média ± SD.

Page 94: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

76

7. DISCUSSÃO

O AVEh está associado a altas taxas de letalidade e morbidade, sendo que

diversos estudos pré-clínicos já demonstraram o efeito benéfico de terapias celulares

com MSCs de diversas fontes em modelos experimentais de AVEh. Poucos estudos,

no entanto, avaliaram o efeito terapêutico de hWJ-MSCs em modelos de AVEh, sendo

que a maioria desses estudos utilizou a via intracerebral para a administração das

células. Apenas um estudo comparou as vias intravenosa e intracerebral para o

transplante de hWJ-MSCs no AVEh, com resultados que indicaram que ambas as

formas de administração das células são benéficas (XIE et al., 2016).

Nesse estudo, utilizamos as hWJ-MSCs recém-descongeladas, que

apresentaram uma viabilidade média de 88%, visto que no futuro da prática clínica

esse seria um cenário mais viável. A grande maioria dos ensaios clínicos utilizam

MSCs alogênicas provenientes de criobancos e recém-descongeladas (GALIPEAU e

SENSÉBE, 2018), tornando interessante que estudos pré-clínicos utilizem da mesma

metodologia. Meta-análise de Satani et al. (2019) mostrou que na comparação do

uso BM-MSCs frescas versus descongeladas em modelos de AVE isquêmico, as

células descongeladas apresentaram um escore similar ou até mesmo superior em

resultados de melhora sensório motora. No trabalho de Cruz et al. (2015) comparando

o uso de células recém-descongeladas versus células cultivadas continuamente, em

modelo de inflamação alérgica das vias aéreas, foi observado que as células recém-

descongeladas foram tão efetivas quanto as células de cultura. No nosso grupo de

pesquisa, trabalho de Vasconcelos-dos-Santos (2011) já havia estudado o uso de

CMMOs inviáveis, aquecidas a 80°C, injetadas em ratos em modelo de AVE

isquêmico, e que apresentaram recuperação funcional ao realizar teste do cilindro.

7.1 AVALIAÇÃO DA TERAPIA COM HWJ-MSCS SOBRE O VOLUME DE LESÃO EM

ANIMAIS COM AVEH

O tamanho inicial do hematoma e a sua expansão são fatores que afetam o

prognóstico do paciente. Como o volume inicial e a localização do hematoma são

fatores que não podem ser modificados, terapias que ajudem a impedir a expansão

Page 95: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

77

do hematoma ou que acelerem sua remoção/absorção são oportunidades para

reduzir o volume final do AVEh e assim melhorar o prognóstico do paciente.

Nós hipotetizamos que a administração intravenosa das hWJ-MSCs na fase

aguda do modelo de AVEh moderado seria capaz de reduzir o tamanho do

hematoma. Através da análise do volume de lesão em imagens de RM nós

demonstramos que a terapia celular foi capaz de reduzir o tamanho do hematoma,

quando avaliado já em fase crônica. Kim et al. (2015) demonstraram em estudo

utilizando injeção de 0,2 U de colagenase e transplante de MSCs de sangue de

cordão umbilical, uma redução de volume de lesão, através de método histológico,

após 4 semanas depois da cirurgia, corroborando nosso resultado. As MSCs são

descritas por conduzir a efeitos imunomodulatórios, agindo principalmente por ação

parácrina, o que poderia explicar, pelo em menos em parte, a redução do hematoma.

Essa ação benéfica das hWJ-MSCs com a redução do volume de lesão mostra que a

injeção intravenosa, além da vantagem de ser um procedimento menos invasivo,

quando comparado a outros tipos de administração, também mostrou-se eficaz no

tratamento neste modelo de AVEh moderado.

Sanada et al. (2012) mostraram que MSCs derivadas de medula óssea, fígado,

cérebro e pulmão, eram capazes de secretar o fator de coagulação VIII. No trabalho

de Christy et al. (2017) foi mostrado que as MSCs extraídas de tecido adiposo

expressaram fator tecidual, um potente ativador da cascata de coagulação, e

apresentaram atividade procoagulante na presença de sangue ou plasma. George et

al. (2018) também estudaram o efeito procoagulante de MSCs de diversas fontes

teciduais, inclusive de cordão umbilical. Todas as MSCs testadas expressaram

atividade procoagulante que se correlacionou com a expressão do fator tecidual. O

tempo de coagulação e o tempo de formação de trombina diminuíram com o aumento

da formação tecidual.

Huang et al. (2019) mostraram uma redução no volume de lesão após

injeção intraventricular de 1 x 106 células / kg e 2 x 105 células / kg de BM-MSCs em

modelo de injeção de sangue autólogo. Ao mesmo tempo, houve uma redução na

resposta inflamatória, 21 dias após injeção de BM-MSCs, através da diminuição da

expressão das citocinas IL-1-α, IL-6 e IFN-γ na dose de 2 x 105 células / kg de BM-

MSCs. Por outro lado, em trabalho prévio do nosso grupo de pesquisa, Jordão da

Page 96: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

78

Silva-Junior (2018) demonstrou que as hWJ-MSCs aumentavam a transcrição de

citocinas descritas classicamente como pró-inflamatórias na retina, nos períodos

iniciais à lesão (1 dia), como TNF-α e IL-6.

Como já citado anteriormente, Del Bigio et al. (1996) haviam mostrado que a

infiltração de macrófagos no hematoma ocorria 48 h após a injeção de colagenase.

Sabe-se que os macrófagos levam a uma reação inflamatória em cascata, conduzindo

a uma revascularização e ao reparo em locais lesionados (LO SICCO et al., 2017).

Em um ambiente inflamatório, como o produzido durante as fases iniciais de um

processo de cicatrização, a atividade parácrina das MSCs é modulada, promovendo

uma troca funcional de macrófagos de um estado pró-inflamatório (M1) para um anti-

inflamatório (M2). Os macrófagos M2 possuem a capacidade de facilitar a reparação e

regeneração de tecidos. Entre os fatores responsáveis pelos efeitos parácrinos das

MSCs, as vesículas extracelulares (VEs) foram recentemente descritas como

participantes na comunicação célula a célula, servindo como veículo para a

transferência entre células de proteínas de membrana e citosólicas, lipídios e

informações genéticas (LO SICCO et al., 2017). Os estudos de Lo Sicco et al. (2017)

demonstraram que VEs extraídas a partir de AD-MSCs dispararam a proliferação e

polarização de macrófagos do fenótipo M1 para o M2 (CD36, CD51 e CD206

positivos). Essas VEs promoveram a redução de IL-6 e o aumento de IL-10 em

modelo de lesão muscular induzida por cardiotoxina.

CD36 é um receptor scavanger tipo B, expresso na superfície de diversos

tipos celulares: plaquetas, células endoteliais microvasculares,

monócitos/macrófagos, células dendríticas, adipócitos, células de músculo estriado e

células hematopoiéticas (GONG et al., 2017). Fang et al. (2014) mostraram que

pacientes com deficiência na expressão de CD36 apresentaram um volume de

hematoma maior 7 dias após hemorragia nos núcleos da base, do que pacientes não

deficientes em CD36, com uma taxa de absorção de hematoma menor para os CD36

deficientes. Obtiveram o mesmo resultado em modelo animal de injeção de sangue

autólogo, mostrando que o CD36 promove a redução do hematoma. Zhao et al.

(2009) já haviam mostrado que microglia/macrófagos utilizavam o CD36 para

promover a fagocitose dos eritrócitos, via receptor ativado por proliferadores de

peroxissoma gama (PPARγ), e que o aumento da sua expressão resultou em uma

resolução mais rápida do hematoma e uma melhora na recuperação funcional após

Page 97: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

79

AVEh, reduzindo os danos cerebrais secundários, já que ajuda a remover o sangue

intraparenquimal.

Wang et al. (2012) observaram a redução no volume de lesão ao realizarem

tratamento com BM-MSCs nos animais que sofreram lesão via injeção da colagenase,

demonstrando também que as BM-MSCs promoveram proteção neuronal através da

maior expressão da proteína de neurofilamento NF200 e do marcador astrocitário

proteína glial fibrilar ácida (GFAP, do inglês glial fibrillary acidic protein). Também

mostraram um maior número de células BrdU positivas na região do peri-hematoma,

demonstrando interação das BM-MSCs com o tecido cerebral danificado e a

proliferação celular das células transplantadas, assim como um menor número de

células caspase-3 positivas na região do peri-hematoma, evidenciando que as BM-

MSCs atenuaram a apoptose celular, quando comparado ao grupo controle.

Liao et al. (2009) mostraram que o tratamento com injeção intracerebral de

MSCs extraídas de cordão umbilical em AVEh, produzido através do modelo de

injeção da colagenase, promovia uma melhora na angiogênese e na escala

neurológica, assim como uma redução no volume de lesão. Verificaram que havia um

aumento siginificativo da densidade vascular na zona peri-hematoma em 14 dias de

tratamento. Além disso, a maioria dos vasos continha MSCs transplantadas

incorporadas na vasculatura cerebral. Mostraram também uma redução de ROS, um

dos principais responsáveis pelos danos cerebrais no AVEh, na zona do peri-

hematoma, 3 dias após a injeção das células. Demonstraram in vitro uma

transdiferenciação das MSCs em células endotoliais, na presença de VEGF e do fator

de crescimento de fibroblasto básico (bFGF).

Em outro grupo de animais realizamos a injeção de 0,25 U de colagenase o

que gerou um AVEh com um volume duas vezes maior do que o moderado. Nesse

grupo, ao analisarmos o volume de lesão dos animais do grupo AVEh severo que

receberam tratamento com hWJ-MSCs em 24 h, não encontramos o mesmo resultado

do grupo AVEh moderado, isto é, não houve redução no volume de lesão e os

volumes médios do grupo tratado e veículo foram iguais no tempo de 22 dias após a

cirurgia. Não realizamos uma comparação estatística dos volumes médios obtidos nos

dois modelos (moderado e severo) devido ao fato das imagens terem sido adquiridas

em dois scanners de ressonância magnética diferentes. No entanto, mesmo

Page 98: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

80

observando visualmente os cortes, é nítido que o modelo severo teve um volume

maior de lesão do que o modelo de grau moderado, assim como também o fato de ter

havido uma maior expansão da hemorragia. Apesar dessa diferença de volume, nós

utilizamos a mesma quantidade de células (3 x 106) para ambos os modelos, e este

pode ter sido o fator de não termos também observado uma redução de volume de

lesão no grupo hWJ-MSCs no AVEh severo. George et al. (2018) demonstraram que

a atividade procoagulante de BM-MSCs, MSCs de fluído amniótico e AD-MSCs

decaía conforme a diluição da concentração celular, mostrando ser um efeito dose

dependente. Assim, talvez fosse necessário um aumento na dose de hWJ-MSCs para

obtermos um resultado similar ao obtido no AVEh moderado para a redução do

volume de lesão.

Choi et al. (2018) demonstraram que a injeção de MSCs extraídas de placenta

humana, 1h após indução da hemorragia através de injeção de colagenase, foi capaz

de aumentar a expressão das proteínas de junção ocludente zônula-1 e ocludina, 24 h

após cirurgia. Esse efeito foi associado com redução de volume de hematoma,

sugerindo que o aumento da expressão dessas proteínas de junção ocludente

reduziriam a permeabilidade da BHE e os danos endoteliais, fazendo uma espécie de

bloqueio do vazamento de componentes do sangue para o parênquima cerebral e

atenuando assim os danos secundários. Quando nós avaliamos o efeito da terapia

celular na fase hiperaguda (1 h), não encontramos diferença significativa no volume

de lesão. No entanto, a dose de colagenase utilizada por Choi et al. (2018) para

provocar o hematoma foi de 0,1 U, enquanto nós testamos o efeito na fase

hiperaguda apenas nos animais do modelo severo, ou seja, que receberam 0,25 U de

colagenase na região estriatal. Esse fato está de acordo com a hipótese de que o

volume inicial do hematoma influencie o efeito das MSCs sobre a redução do

hematoma.

7.2 AVALIAÇÃO DA TERAPIA COM HWJ-MSCS SOBRE O PREJUÍZO FUNCIONAL

DOS ANIMAIS COM AVEH

A avaliação funcional dos animais do grupo AVEh moderado mostrou que

houve prejuízo funcional apenas no EBST no tempo de 8 dias, sem haver diferenças

significativas nos testes do rotarod e do cilindro. Maclellan et al. (2006) haviam

Page 99: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

81

testado três diferentes doses de colagenase tipo IV: 0,06 U (grupo brando); 0,12 U

(grupo moderado) e 0,18 U (grupo severo), fazendo uso de uma bateria de testes

funcionais. Diferente do nosso resultado, eles observaram que no conjunto de testes,

os grupos brando e moderado, que usaram doses de colagenase inferior e um pouco

superior ao que usamos no nosso grupo moderado (0,1 U), ocorreram diferenças

significativas em relação ao grupo sham. No entanto, essas diferenças não foram em

todos os tempos, como por exemplo, no teste do cilindro, em que não foi observada

diferença entre o grupo brando e sham no tempo de 3 dias, ou no teste de remoção

de adesivo, no qual a diferença ocorreu apenas nos dias 1 e 3 após lesão, não

havendo prejuízo detectável nos demais tempos. Uma das questões a serem

consideradas é de que o déficit depende da localização da lesão. Assim, danos em

regiões mais laterais do estriado rostral causam prejuízos severos e crônicos na

língua e nos membros anteriores, atingindo o movimento, enquanto danos na região

medial do estriado causam alterações leves ou não crônicas do movimento (PISA e

SCHRANZ, 1988; MACLELLAN et al., 2006). O AVEh muitas vezes também cruza os

limites funcionais, podendo causar danos ao corpo caloso, cápsula interna e estriado,

sendo que uma variedade de déficits pode ocorrer (MACLELLAN et al., 2006).

É possível que no nosso modelo de AVEh moderado, a lesão não tenha

atingido a área que afete de forma mais efetiva o movimento em todos os animais,

causando inclusive uma variabilidade grande de resultados entre eles. Como

mencionado anteriormente, o sangue provavelmente segue um caminho de menor

resistência ao longo dos vasos sanguíneos ou ao longo dos axônios, podendo haver

diferenças inclusive devido ao diferente peso/tamanho dos animais, embora tenhamos

utilizado animais dentro de uma faixa de peso/tamanho neste estudo. Importante

ressaltar que na literatura existem pequenas diferenças nas coordenadas

estereotáxicas utilizadas no modelo de injeção da colagenase, mesmo sendo todas

na região estriatal.

Por outro lado, quando avaliamos o prejuízo funcional do modelo de AVEh

severo, tivemos resultados mais consistentes, sem recuperação funcional dos animais

no EBST e no teste do cilindro em 21 dias de avaliação e com déficits nos tempos de

3 e 7 dias no teste do rotarod. É possível observar nas figuras 20 e 26, referentes ao

modelo severo, que a extensão da lesão foi maior, inclusive em direção à região mais

lateral do estriado. Liu et al. (2018) realizaram um estudo comparativo entre a lesão

Page 100: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

82

provocada pela injeção da colagenase nas coordenadas estereotáxicas igual à

utilizada neste trabalho (3,0 mm médio lateral, 0,2 mm anteroposterior, 6,0 mm dorso

ventral) com a injeção em uma coordenada no estriado que se aproximava mais da

cápsula interna (IC) (3,7 mm médio lateral, 2,0 mm anteroposterior, 6,0 mm dorso

ventral). A extensão da lesão no modelo que atingia a cápsula interna foi de + 1,0 a -

3,0 mm em relação ao bregma, no 28º dia após a cirurgia, muito próxima à extensão

da lesão do grupo veículo que obtivemos no AVEh severo, que foi de 2,1 a -3,12 mm

em relação ao bregma no 22º dia após a cirurgia. Para Liu et al. (2018), os resultados

funcionais do teste de escala neurológica e teste do cilindro foram mais permanentes

no grupo IC do que no grupo que recebeu colagenase nas mesmas coordenadas

estereotáxicas do nosso modelo.

Matsushita et al. (2013) fez comparação similar em camundongos.

Primeiramente, mostraram que os animais com volumes de hematoma até 5 mm3

sobreviviam por 4 semanas. Já naqueles animais com volumes de hematomas

maiores, foi demostrando que nos animais em que a lesão não se aproximava tanto

da cápsula interna, a taxa de sobrevivência era de 100%, enquanto naqueles em que

a lesão atingia a cápsula interna, a taxa de sobrevivência caía para aproximadamente

55%. Além disso, a invasão do hematoma na cápsula interna também causou maior

prejuízo funcional nos animais. A lesão na cápsula interna, área que contém as fibras

nervosas dos neurônios motores superiores descendentes e neurônios sensoriais

ascendentes, já foi reconhecida como evento chave na hemiparesia motora após

AVEh (MATSUSHITA et al., 2013).

Quanto à terapia com as hWJ-MSCs, observamos que o grupo tratado 24 h

não foi diferente do grupo sham nos tempos de 4, 15 e 21 dias no teste do cilindro e

sugerindo um melhor resultado no rotarod no último tempo avaliado. Talvez uma

avaliação mais longa pudesse a vir detectar diferenças significativas entre os grupos.

Kim et al.(2015) mostraram que no teste do cilindro o grupo MSCs apresentou melhor

resultado que o grupo controle apenas na 4º semana de tratamento.

Não foi possível avaliar se havia redução na mortalidade dos animais, visto que

os mesmos morrem quase todos nas primeiras 24 h, sendo então que os grupos só

são definidos com os animais sobreviventes. Quanto à terapia na fase hiperaguda,

também não foi detectada diferença funcional ou na mortalidade em relação ao grupo

Page 101: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

83

veículo. Huang et al. (2019) mostraram que a injeção de BM-MSCs apenas 30 min

após o AVEh resultou em uma diminuição na assimetria no uso das patas no teste do

cilindro, já no 3º dia após o tratamento. No entanto, a via de administração utilizada foi

a intraventricular, ao invés da sistêmica. Zhang et al. (2015) e Ding et al. (2017)

demonstraram melhora na escala de déficit neurológico 1 dia e 3 dias após o

transplante de células, respectivamente. No entanto, nesses trabalhos a injeção de

células também foi intracerebral, diretamente no local da lesão. Já Wang et al. (2012)

mostraram uma melhora na escala de déficit neurológico após 7 dias de tratamento,

que foi realizado 1 hora após AVEh através de injeção na veia da cauda,

acompanhado de uma aumento da expressão do fator estimulador de colônias

granulocitárias (G-CSF) no tecido cerebral na região do perihematoma, citocina que

estaria associada à redução de edema e assim à melhora da função neurológica. Os

demais trabalhos encontrados que fizeram administração de células em menos de 24

h não realizaram testes funcionais, demonstrando melhoras em outros parâmetros,

como por exemplo, redução de edema, diminuição de citocinas pró-inflamatórias e

aumento nos níveis da proteína zônula-1 da BHE.

7.3 7.3 BIODISTRIBUIÇÃO DAS HWJ-MSCS EM ANIMAIS COM AVEH

Os nossos resultados de biodistribuição demonstraram que as hWJ-MSCs se

dirigem em grande quantidade para os pulmões logo após a injeção (2 h) e

permanecem lá em maior quantidade, assim como nos rins e fígado nas primeiras 24

h. Como o nosso marcador foi o Tc99m, um radioisótopo que possui um tempo de

meia-vida de 6 h, não foi possível realizar o rastreamento em período superior a 24 h.

O primeiro obstáculo para as MSCs que são transplantadas pela via intravenosa é o

leito capilar pulmonar (LEIBACHER e HENSCHLER, 2016). Lee et al. (2009)

demonstraram que a injeção intravenosa de 2 x 106 MSCs de medula óssea humana

(hBM-MSCs) desapareciam da circulação de camundongos naive 5 min após a

injeção. De 2% a 3% das células reapareceram na circulação após um período de

cerca de 10 minutos, aparentemente após a liberação dos pulmões. Após 15 min,

aproximadamente 83% das células estavam nos pulmões, enquanto apenas um

baixíssimo percentual foi identificado em outros tecidos. Após 24 h, apenas metade

das células estavam presas nos pulmões. As células que desapareceram nos

Page 102: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

84

pulmões não apareceram em números significativos nos outros seis tecidos

analisados (cérebro, coração, fígado, pâncreas, baço e rim), havendo 0,04% em 48 h

e 0,01% em 96 h nos demais tecidos analisados, diferente do nosso modelo em que

observamos captação das células também nos rins, fígado e baço, inclusive nos

animais naive. Também mostraram que havia um aumento de aproximadamento 40

vezes na transcrição do RNA para a proteína do gene 6 estimulada por TNF (TSG-6,

do inglês TNF-stimulated gene 6 protein), no pulmão de animais naive avaliados 10 h

após a infusão de hBM-MSCs humanas. A TSG-6 é uma proteína conhecida por

apresentar forte ação anti-inflamatória. Quando as células foram injetadas em animais

de modelo de infarto do miocárdio, verificaram que havia esse mesmo aumento da

TSG-6 no pulmão dos animais, sendo que foi verificada uma redução do tamanho do

infarto nos animais que receberam o transplante de células. Nos animais que

receberam células knockdown para o gene de TSG-6, não foi observada melhora na

resposta inflamatória, no tamanho do infarto e nas funções cardíacas dos animais. Os

resultados indicaram que as hBM-MSCs retidas no pulmão eram ativadas para

secretar TSG-6, e que este suprimiu a resposta inflamatória excessiva de forma a

diminuir danos proteolíticos no coração e a cicatriz fibrótica.

Além da possível ativação para secretar TSG-6 no pulmão, outro possível

modo de ação das MSCs seria através da interação delas com as células do sistema

imune. Já foi observada a co-localização de MSCs com macrófagos residentes do

pulmão e que induziram a produção de IL-10 e diminuíram a quantidade de TNF-α e

IL-6 circulantes. As MSCs também parecem inibir a migração de neutrófilos do

sangue para os tecidos (NÉMETH et al., 2009).

Além do pulmão, também observamos uma acentuada captação das hWJ-

MSCs pelo baço 24 h após a injeção das células marcadas. O baço desempenha um

papel importante no turnover dos eritrócitos, na imunidade adaptativa, na produção de

anticorpos e na mobilização de monócitos após lesão tecidual. Igualmente importante

é a resposta aguda à inflamação induzida por trauma, em que o baço inicia a

produção de TNF-α, principalmente por macrófagos residentes, e por sua vez

influencia o recrutamento de células imunes para os tecidos inflamados (BADNER et

al., 2018). Recentemente foi demonstrado por Badner et al. (2018) em modelo de

lesão traumática da medula espinhal que quando MSCs extraídas de cordão umbilical

foram transplantadas por via intravenosa 1 h após a lesão, houve uma redução

Page 103: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

85

significativa no volume da lesão, da hemorragia parenquimatosa e um aumento nos

níveis plasmáticos de IL-10, 1 dia após o transplante, quando comparado ao grupo

veículo. Quando o experimento foi repetido na ausência de baço (esplenectomia),

esses efeitos mediados pelas MSCs de cordão umbilical foram perdidos, sugerindo

que o baço é um importante alvo e local dos efeitos das MSCs, quando injetadas

sistemicamente, e que o TNF-α liberado pelo baço teria um importante papel na

ativação das MSCs.

Em relação à migração para os hemisférios cerebrais, apesar da baixa

captação, conseguimos observar que no modelo de AVEh severo, quando comparado

aos grupos AVEh moderado, sham e naive, a migração tem uma preferência pelo

hemisfério lesado. Evidências sugerem que as MSCs migram para órgãos específicos

de maneira semelhante aos leucócitos. Elas aderem às células endoteliais no sistema

vascular e transmigram através do endotélio vascular, direcionando-se para áreas de

lesão seguindo um gradiente de quimiocinas, como o receptor de quimiocina CXCR4,

e o fator derivado de célula estromal 1 (SDF-1) (FABIAN et al., 2017).

Embora o número de células que migre para o hemisfério ipsilateral possa ser

baixo, o resultado pode indicar que a inflamação ativa pode mudar o comportamento

de homing de aprisionar as células em sítios não específicos para um recrutamento

específico (LEIBACHER e HENSCHLER, 2016).

Page 104: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

86

8. CONCLUSÕES

Neste trabalho demonstramos que a terapia celular com as hWJ-MSCs reduziu o

volume de lesão no modelo de AVEh moderado, quando comparado ao grupo veículo.

Porém, não conseguimos demonstrar um prejuízo funcional permanente nesses

animais, não tendo sido possível assim avaliar os efeitos benéficos das hWJ-MSCs

nesse modelo. A terapia celular com hWJ-MSCs no modelo de AVEh severo, em 1 h

e 24 h após AVEh, não reduziu o volume de lesão, quando comparado ao grupo

veículo. Foi possível detectar prejuízo funcional permanente no modelo de AVEh

severo nos teste do EBST e no teste do cilindro, porém a terapia celular em 24 h, não

foi capaz de demonstrar efeitos benéficos sobre os déficits funcionais nestes testes

Os resultados obtidos no AVEh severo sugerem que a eficácia da administração

intravenosa de hWJ-MSCs parece depender do volume inicial do hematoma.

Também observamos que a maior parte das hWJ-MSCs migram para pulmão,

rins, fígado e baço nas primeiras 24 h, nos modelos de AVEh moderado e severo, e

nos dois modelos observamos uma maior captação das hWJ-MSCs marcadas com

99m Tc no hemisfério ipsilateral à lesão do que no hemisfério direito, indicando uma

possível migração de hWJ-MSCs em direção à lesão. A presença de um percentual

elevado de hWJ-MSCs nos pulmões e baço, em 24 horas após a injeção das células

marcadas com 99mTc, sugere que haja mecanismos sistêmicos, além de mecanismos

locais, que possam estar envolvidos nos seus efeitos terapêuticos.

Page 105: Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais

87

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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