Instituto Nacional do Câncer Programa de Pós-Graduação Strictu-Sensu em Oncologia

Março de 2009

CAROLINA LAZZAROTTO-SILVA

Estudos Moleculares de

Células Tronco Mesenquimais

Cultivadas In Vitro

CAROLINA LAZZAROTTO-SILVA

Estudos Moleculares de

Células Tronco Mesenquimais

Cultivadas In Vitro

Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Oncologia Strictu-Sensu para

obtenção do grau de Doutor em Oncologia

Orientador: Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay

Rio de Janeiro

2009

L432e Lazzarotto-Silva, Carolina.

Estudos moleculares de células tronco mesenquimais cultivadas in vitro.

/ Carolina Lazzarotto-Silva. - Rio de Janeiro: INCA, 2009.

159 f. il.

Tese (Doutorado) - Instituto Nacional de Câncer. Programa de Pós-

graduação Stricto Sensu em Oncologia do Instituto Nacional de Câncer

(INCA-RJ), 2009. Orientadora: Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay.

1. Células Tronco Mesenquimais. 2. In Vitro. 3. Medula Óssea. 4.

Proteoma. 5. Expressão Gênica. I. Abdelhay, Eliana Saul Furquim

Werneck. II. Título.

CDD 616.02774

Carolina Lazzarotto-Silva

Estudos Moleculares de Células Tronco Mesenquimais

Cultivadas In Vitro

Tese de Doutorado

Instituto Nacional do Câncer

Pós-Graduação Strictu-Sensu em Oncologia

Data de Aprovação: _____/_____/_____

Dra. Nance Beyer Nardi ______________________________________

Dr. Alex Balduino de Souza ____________________________________

Dr. Hector Seuánez Abreu ____________________________________

Dr. Fábio Passetti __________________________________________

Dra. Teresa de Souza Fernandes _______________________________

Dra. Maria Eugênia Leite Duarte ________________________________

Agradecimentos

AGRADECIMENTOS

A todos que, de alguma maneira, contribuíram para o desenvolvimento

deste trabalho.

Mais importante ainda, agradeço a todos que ajudaram no meu

desenvolvimento científico e pessoal durante esses 4 anos, pois uma tese de

Doutorado é, acima de tudo, uma experiência de vida. E nessa minha

experiência, contei com a ajuda de muitos, cada um colocando um pedacinho

para construir a pessoa que sou agora.

Agradeço à minha orientadora Eliana, que exerce essa função desde

1996, quase 13 anos. Agradeço por toda sua dedicação, ensinamentos e

paciência, e pela oportunidade de partilhar sua companhia e experiência na

ciência.

Agradeço às minhas queridas amigas Luciana e Renata. Luciana, por ser

nossa mentora no mundo do proteoma, pela fundamental ajuda nas análises,

pelas relevantes discussões sobre nossos dados, e por ser a mãe mais linda

do ano. Renata, por ser praticamente meu braço direito e esquerdo nesse

trabalho, mas principalmente pelo carinho e companheirismo em todos os

momentos. E por ser uma mulher e amiga maravilhosa.

À Júlia e Bárbara, que contribuíram de forma essencial nos experimentos,

quando ainda eram alunas de IC, e agora que já trilham seus próprios projetos.

E pelo apoio nos momentos bons e nos difíceis.

Agradecimentos

Ao André, peça fundamental nas últimas análises desse trabalho, que

além de ser nosso mentor no PCR em tempo real, tem a paciência para

aguentar mais de 10 mulheres com seus problemas existenciais.

Aos queridos companheiros do Laboratório de Célula Tronco, incluindo

aqueles que já passaram e os que ainda estão (por favor, sintam-se todos

incluídos), pela amizade, companheirismo, parcerias científicas e festivas, e por

terem proporcionado momentos tão bons nesses anos. E à Dani pequena, por

não ter feito nada em especial, mas também por não ter atrapalhado.

À Teresa Fernandes, minha primeira orientadora, e que agora volta a me

ajudar nas análises citogenéticas.

A todos da Divisão de Laboratórios do CEMO, pela parceria no nosso

espaço.

Aos meus queridos pais e ao Juca, que sempre acreditaram e apostaram

em mim e na minha vitória, me proporcionando as melhores condições para eu

ser quem eu sou hoje, sobretudo amor e exemplo. Vocês são os maiores

homenageados hoje.

Ao meu amor Antônio, que é a pessoa mais maravilhosa que eu já

conheci, e que tem me ajudado a entender melhor o mundo, e a mim mesmo.

Enfim, agradeço a todos, e principalmente a Deus, por ter passado por

esse período de sacrifícios e vitórias da melhor forma possível, e poder

defender essa tese.

Abstract

ABSTRACT

Mesenchymal Stem Cells (MSC) can be expanded ex vivo and are able to

differentiate along multiple lineages, including chondrocytes, osteoblasts and

adipocytes. They secrete a number of cytokines and regulatory molecules

implicated in different aspects of hematopoiesis, and seem to modulate the

immune system. Because of these characteristics, MSC represent a promissing

tool for cellular therapies, especially that related to bone marrow

transplantation. The aim of this work was to improve the molecular

characterization of MSC cultures using genomic and proteomic tools. Protein

expression profile was analyzed by bidimensional electrophoresis and in

tandem mass spectrometry. In a window of observation (pH 4-7, MW 10-220

KDa), 84 distinct proteins were identified in MSC cultures. Our analyses

demonstrated a very similar proteomic profile of MSC cultures of the first

passage derived from different donors, suggesting that these cells have the

same expression pattern. Additionally, cells derived from different donors were

able to equally inhibit lymphocyte proliferation. Comparative analyses of

genomic and proteomic pattern of MSC under different culture passages

showed that the in vitro cultivation procedure is able to standardize the cells, in

terms of their molecular profile. Although MSC maintain their in vitro

immunomodulatory potential, after passage 5 they developed karyotypic

alterations, indicating genetic instability of cultured cells. Proteomic analyses of

MSC submitted to adipogenic and osteogenic differentiation suggest that these

processes strongly modify their molecular profile, affecting the expression of

various proteins, such as those involved in actin skeleton of cells.

Resumo

RESUMO

Células Tronco Mesenquimais (CTM) podem ser expandidas ex vivo e são

capazes de se diferenciar em diversas linhagens, incluindo condrócitos,

osteoblastos e adipócitos. Elas secretam uma série de citocinas e moléculas

regulatórias implicadas em diferentes aspectos da hematopoese, e parecem

modular o sistema imune. Devido a essas características, as CTM representam

promissoras ferramentas para a terapia celular, sobretudo aquelas associadas

ao transplante de medula óssea. O objetivo deste trabalho foi melhorar a

caracterização molecular de culturas de CTM, através da utilização de

ferramentas genômicas e proteômicas. O perfil de expressão proteica de

culturas de CTM foi analisado através de ensaios de eletroforese bidimensional

e espectrometria de massas in tandem. Na janela de análise utilizada (pH 4-7,

PM 10-220 KDa), foram identificadas 84 proteínas distintas em culturas de

CTM. Nossas análises mostraram um padrão proteômico muito similar entre

culturas de CTM derivadas de diferentes doadores já na primeira passagem,

sugerindo que as células apresentam o mesmo padrão de expressão protéica.

Além disso, culturas derivadas de diferentes doadores são igualmente capazes

de inibir a proliferação linfocitária in vitro. A análise comparativa dos padrões

genômicos e proteômicos de CTM submetidas a diferentes passagens em

cultura, mostrou que o procedimento de cultivo in vitro de células estromais é

capaz de uniformizar a população em cultura, pelo menos no que diz respeito a

seu perfil molecular. Apesar de manterem o potencial imunomodulatório in vitro,

as células adquiriram, depois da passagem 5, alterações no seu cariótipo,

indicando que elas apresentam instabilidade genética em cultura. Análises

Resumo

proteômicas de CTM submetidas à diferenciação adipogênica e osteogênica

sugerem ainda que a diferenciação in vitro das CTM altera de forma importante

o perfil molecular das culturas, afetando a expressão de diversas proteínas,

como as envolvidas na estrutura do esqueleto de actina das células.

Siglas e Abreviaturas

SIGLAS E ABREVIATURAS

µµµµg - micrograma

µµµµL – microLitro

µµµµM – microMolar

ACN - ACetoNitrila

ACTB - actina citoplasmática 1 (β-actina)

ACTBL2 - proteína 2 tipo ββββ-actina (κ-actina)

Ang-1 - Angiopoetina-1

ASB-14 – detergente Zwitteriônico

ββββ2M - ββββ-2 Microglobulina

BLAST - Basic Local Alignment Search Tool (ferramenta de procura por

alinhamento de sequências)

BSA – Bovine Serum Albumin, (Albumina Bovina Sérica)

CapG - proteína de capeamento de macrófagos

CD – Cluster of Differentiation (grupo de diferenciação)

cDNA – complementary DesoxyriboNucleic Acid (ácido desoxiribonucleico

complementar)

CEMO – Centro de Transplante de Medula Óssea

CFSE - CarboxyFluorescein Succinimidyl Ester

cGy – centiGray

cm – centímetro

CML - Culturas Mistas de Linfócitos

CMN - Células MonoNucleares

CMNe – Células MonoNucleares estimuladoras

CMNr – Células MonoNucleares respondedoras

CPH - Células Progenitoras Hematopoéticos

CTH – Célula Tronco Hematopoética

CTM – Célula Tronco Mesenquimal

dATP - deoxyAdenosine TriPhosphate (trifosfato de desoxiadenosina)

dCTP – deoxyCytidine TriPhosphate (trifosfato de desoxicitidina)

DEPC - DiEtil PiroCarbonato

Siglas e Abreviaturas

dGTP – deoxyGuanosine TriPhosphate (trifosfato de desoxiguanosina)

DMEM - Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (meio de Eagle modificado por

Dulbecco)

dNTP - deoxyNucleotIde TriPhosphate (trifosfato de desoxinucleotídeo)

DTT - DiTiTreitol

dTTP – deoxyThymidine TriPhosphate (trifosfato de deoxitimidina)

EDTA - Ethylene Dyamin Tetracetic Acid (Ácido etileno diamintetracético)

EGTA - Ethylene Glycol Tetracetic Acid (ácido etileno glicoltetraacético)

eIF5A - isoforma 2 do fator eucariótico de iniciação da tradução 5A-1

EUA – Estados Unidos da América

FGF-2 - Fibroblast Growth Factor 2 (fator de crescimento de fibroblastos 2 )

FGF-7 - Fibroblast Growth Factor 7 (fator de crescimento de fibroblastos 7)

FITC - Fluorescein IsoThioCyanate (isotiocianato de fluoresceína)

Flt3 - FMS-like tyrosine kinase 3 (tirosina quinase 3 tipo FMS)

g – grama

Gal-1 – Galectina 1

G-CSF – Granulocyte-Colony Stimulating Factor (fator estimulador de colônias

granulocíticas)

GM-CSF – Granulocyte/Macrophage-Colony Stimulating Factor (fator

estimulador de colônias granulocítica-macrofágicas)

IDT - Integrated DNA Technologies (tecnologias integradas de DNA)

IEF - IsoEletroFocalização

INCa – Instituto Nacional de Câncer

IPG - Immobilized pH Gradients (gradients imobilizados de pH)

IPI - International Protein Index (índice internacional de proteínas)

L – Litro

LIF - Leukemia-Inhibiting Factor (fator inibitório de leukemia)

LPL - LipoProteína Lipase

M – Molar

MALDI-TOF-TOF – Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization – Time Of

Flight - Time Of Flight

MCAM/CD146 - Melanoma-associated Cell Adhesion Molecule (molécula de

adesão celular associada a melanoma)

Siglas e Abreviaturas

M-CSF – Macrophage-Colony Stimulating Factor (fator estimulador de colônias

macrofágicas)

mg –miligrama

mL – mililitro

mM – milimolar

MS – Mass Spectrometry (espectrometria de massas)

NaCl - cloreto de sódio

NaF - fluoreto de sódio

ng – nanograma

NGF - Neural Growth Factor (fator de crescimento neural)

NH4HCO3 - bicarbonato de amônio

NK - Natural Killer

nM – nanolitro

nM – nanomolar

Pat - Plasminogen activator inhibitor (ativador do plasminogênio tecidual)

PBS – Phosphate Buffer Saline (salina de tampão fosfato)

PCR - Polymerase Chain Reaction (reação em cadeia da polimerase)

PDGF - Platelet-Derived Growth Factor (fator de crescimento derivado de

plaquetas)

PE - PhycoEritrin (ficoeritrina)

PFA – ParaFormAldeído

pg - picograma

pH – potencial Hidrogeniônico

pI - ponto Isoelétrico

pM – picoLitro

pM – picoMolar

PPARγ - Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ

RNAm - messenger RiboNucleic Acid

RNAmi – micro RNA

SBF - Soro Bovino Fetal

Sca-1 - Stem Cells Antigen-1 (antígeno 1 de células tronco)

SCF - Stem Cell Factor (fator de células tronco)

SDS-PAGE - Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

(eletroforese em gel de poliacrilamida com sulfato de dodecilsódico)

Siglas e Abreviaturas

αSMA – alfa Smooth Muscle Actin (αactina de músculo liso)

TCTH – Transplante de Células Tronco Hematopoéticas

TFA - TriFluoroacetic Acid, (ácido trifluoroacético)

TMO - Transplante de Medula Óssea

TNF-αααα - Tumor Necrosis Factor-alpha (fator alfa de necrose tumoral)

TUB - TUBulina

TUBA4B - αααα-TUBulina 4B

TUBA1A – cadeia αααα-1A da TUBulina

TUBB – cadeia ββββ-1ββββ-2 da TUBulina

TUBB2A – cadeia ββββ-2A da TUBulina

TUBB3 – cadeia ββββ-3 da TUBulina

UCHL - Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1

UFC-F – Unidades Formadoras de Colônia de Fibroblastos

VCL - isoforma 1 da vinculina

VEGF – Vascular Endothelial Growth Factor (fator de crescimento endotelial

vascular)

Wdr1 - Isoforma 2 da proteína 1 contendo repetição WD

Índice

ÍNDICE

Página

INTRODUÇÃO 1

Diferenciação das CTM 8

Caracterização Antigênica 11

Identidade In Vivo 14

Migração em Humanos e Modelos Animais 17

Envelhecimento e Efeito da Expansão in vitro na Biologia das CTM 18

Caracterização Molecular 24

Modulação do Sistema Imune 26

Potencial em terapias celulares 32

Terapias Celulares associadas ao Transplante de Medula Óssea 39

OBJETIVOS 43

OBJETIVO GERAL 43

OBJETIVOS ESPECÍFICOS 43

METODOLOGIA 44

1. Isolamento e Cultivo de CTM 44

2. Caracterização das Culturas de CTMh 46

2.1 Análise ao Microscópio Ótico 46

2.2 Análise de Marcadores de Superfície 46

2.3 Ensaios de diferenciação in vitro 46

2.3.1 Diferenciação Osteogênica 47

2.3.2 Diferenciação Adipogênica 47

3 Caracterização Molecular 47

Índice

3.1 Análise da Expressão Gênica 47

3.1.1 Extração de mRNA (messenger RiboNucleotidic Acid) 47

3.1.2 Elaboração dos iniciadores 48

3.1.3 Síntese de cDNA 49

3.1.4 Amplificação do cDNA por PCR em Tempo Real 50

3.2 Análise Proteômica 51

3.2.1 Preparação de extratos protéicos totais 51

3.2.2 Quantificação dos extratos protéicos 52

3.2.3 Análise da integridade das proteínas no extrato 52

3.2.4 Eletroforese Bidimensional 52

IsoEletroFocalização IEF (PRIMEIRA DIMENSÃO) 52

Eletroforese SDS-PAGE (SEGUNDA DIMENSÃO) 53

3.2.5 Análise dos Padrões Proteômicos 54

3.2.6 Espectrometria de Massas 54

4 Análise do potencial imunossupressor in vitro 56

5 Análise Citogenética 57

RESULTADOS 59

1 Definição do Protocolo de Estabelecimento das Culturas de CTM 59

2. Caracterização Molecular das Culturas

2.1 Análise Protéica Global

67

2.2 Comparação entre culturas derivadas de diferentes doadores

numa mesma passagem

74

2.2.1 Análise do Perfil Proteômico 74

Índice

2.2.2 Inibição In vitro de Células T Mediada por CTM de um terceiro

indivíduo (Third-Party)

79

2.3 Comparação entre Culturas de um Mesmo Doador em Diferentes

Passagens

81

2.3.1 Análise do Perfil de Expressão de RNA 83

2.3.2 Análise do Perfil Proteômico 85

2.3.3 Análise do Perfil Citogenético 91

2.3.4 Análise do Potencial de Inibição In Vitro de Células T 94

2.4 Comparação entre culturas submetidas à diferenciação e culturas

não diferenciadas

96

DISCUSSÃO 100

CONCLUSÕES 115

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 117

ANEXOS 145

Anexo 1 – Artigo publicado na Revista Cytotherapy 145

Introdução

INTRODUÇÃO

Na medula óssea, a manutenção da Célula Tronco Hematopoética (CTH)

e a regulação de sua auto-renovação e diferenciação in vivo dependem do

microambiente específico ao qual está submetida, conhecido historicamente

como “nicho da célula tronco hematopoética” (Wilson & Trumpp 2006).

O nicho hematopoético da medula óssea adulta é formado por um grupo

heterogêneo de células não hematopoéticas, derivadas do mesênquima

(mesenquimais), que inclui fibroblastos, adipócitos, precursores osteogênicos e

células reticulares.

Dentro deste grupo, acredita-se na existência de um conjunto de células

conhecido como células tronco ou progenitoras mesenquimais (Anjos-Afonso &

Bonnet 2007), ou células tronco esqueléticas (Bianco et al. 2006).

O conceito de células tronco mesenquimais (CTM) vem de trabalhos do

grupo de Alexander Friedenstein há quase 4 décadas atrás (Friedenstein et al.

1974). Eles notaram que, quando células da medula óssea eram submetidas à

aderência ao plástico, uma rara população se desenvolvia em Unidades

Formadoras de Colônia semelhantes a Fibroblastos (UFC-F). Após expansão in

vitro, culturas clonais derivadas de UFC-F individuais puderam ser introduzidas

em modelos experimentais, onde a formação de osso, cartilagem e elementos

estromais foi observada (Castro-Malaspina et al. 1980). A freqüência dessas

UFC-F era extremamente baixa, cerca de 1/10.000 a 1/100.000 das células

mononucleares da medula óssea (Castro-Malaspina et al. 1980).

Sua origem a partir das células estromais da medula óssea, e sua

possível natureza de célula tronco, levaram à adoção do termo, por Owen e

Friedenstein (1988), de “células tronco estromais da medula óssea”. O termo

Introdução

“Células Tronco Mesenquimais” (CTM, como tais células serão denominadas

nesse trabalho) foi proposto posteriormente para evidenciar a natureza não-

hematopoética das células tronco derivadas da medula óssea, muito embora

tais células não compartilhem todas as propriedades das células do

mesênquima embrionário, que se refere a um tipo celular embrionário com

capacidade de gerar não apenas tecido conectivo, mas também tecido

hematopoético e vascular (Bianco et al. 2006).

As CTM podem ser expandidas ex vivo e induzidas in vitro a se diferenciar

em diferentes tipos celulares esqueléticos encontrados em vários estágios do

desenvolvimento, assim como em sítios anatômicos específicos. Tais tipos

celulares incluem osteoblastos (osso), condrócitos (cartilagem), adipócitos

(estroma medular), fibroblastos (periósteo), e células reticulares (estroma

medular) (Bianco et al. 2008). Além disso, tem sido demonstrado que elas

podem ser induzidas experimentalmente a sofrer diferenciação não

convencional tanto in vitro como in vivo, formando células do tipo neural,

endodermal, e cardiomiócitos, derivadas, portanto, de folhetos embrionários

diferentes do mesenquimal. O tema da diferenciação não convencional é,

porém, bastante controverso, e muitos autores questionam a veracidade

dessas evidências (Bianco et al. 2006).

De maneira geral, ainda não é possível suprir em laboratório todos os

fatores extrínsecos gerados no nicho fisiológico de uma célula tronco (da Silva

Meirelles et al. 2008). Uma célula tronco fora do seu ambiente original não se

comporta da mesma maneira que em seu habitat natural. Assim, podemos

distinguir duas entidades celulares distintas, a CTM isolada e cultivada em

laboratório (CTM in vitro) e a CTM encontrada no organismo (CTM in vivo).

Introdução

Devido à ausência de marcadores específicos para isolar as CTM, ainda não

existe prova direta de que as células isoladas em cultura desempenham um

papel fisiológico in vivo.

Além disso, ainda não foi demonstrado que as CTM sejam realmente

células tronco. Uma célula tronco é definida por sua capacidade de auto-

renovação e sua habilidade em gerar pelo menos um ou mais progenitores

diferenciados. Até o momento, não foi possível demonstrar que a CTM seja

capaz de regenerar ou manter um compartimento tecidual ao nível de uma

única célula in vivo. As CTM não puderam ser transplantadas, isoladas e

serialmente transplantadas (Deans & Moseley 2000, Javazon et al. 2004).

Como ainda não é possível se isolar a CTM e caracterizá-la em um estado não

manipulado, sua definição está baseada em uma combinação de propriedades

morfológicas, fenotípicas e funcionais. Tais propriedades variam de acordo com

o método de isolamento/expansão empregado para o seu cultivo, e não existe

uma combinação específica de marcadores para a identificação dessas células

in vivo ou in vitro (Anjos-Afonso & Bonnet 2007). A ausência de marcadores

específicos torna a comparação de resultados entre os diversos grupos de

pesquisa difícil e retarda o progresso nesse campo.

Na tentativa de diminuir essa variação e uniformizar a terminologia

utilizada para essas células, o Comitê de Células Tronco Mesenquimais e

Teciduais da Sociedade Internacional de Terapia Celular (SITC) propôs

critérios mínimos para definir as CTM humanas. Primeiro, as CTM devem ser

“aderentes ao plástico” (aderentes ao substrato), quando mantidas em

condições padrão de cultivo in vitro. Segundo, as CTM devem expressar as

moléculas de superfície CD105, CD73 e CD90, e não expressar as moléculas

Introdução

de superfície CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79α ou CD19, e HLA-DR.

Terceiro, as CTM devem se diferenciar in vitro em osteoblastos, adipócitos e

condrócitos. Esses critérios ainda precisam ser revistos, conforme o

conhecimento da biologia das CTM for aprofundado, porém são essenciais

para uniformizar a caracterização das CTM e facilitar a troca de dados entre os

diferentes grupos de pesquisa (Dominici et al. 2006).

CTM já foram isoladas em diversas espécies como humanos (Pittenger et

al. 1999), camundongos (Pereira et al. 1995, da Silva Meirelles & Nardi 2003),

ratos (Wakitani et al. 1995), cachorros (Kadiyala et al. 1997), gatos (Martin et

al. 2002) e babuínos (Devine et al. 2003). O estroma da medula óssea é a fonte

mais freqüentemente utilizada para o isolamento de progenitores

mesenquimais. Em humanos, as CTM podem ser isoladas a partir de alíquotas

de medula óssea de doadores normais obtidas por aspiração para fins de

transplante alogenêico. Após o plaqueamento das células mononucleares de

baixa densidade em um meio basal suplementado com lotes selecionados de

soro bovino fetal, a população resultante de células aderentes é considerada a

fonte primária ex vivo de CTM (Prockop 1997, Conget & Minguell 1999).

Além da medula óssea, já foi demonstrado que as CTM podem ser

encontradas em vários órgãos e no sangue periférico de fetos jovens

(Campagnoli et al. 2001), no endotélio e subendotélio da veia do cordão

umbilical (Covas et al. 2003), no sangue de cordão umbilical (Lee OK et al.

2004), na placenta (In’t Anker et al. 2004) e no fluido amniótico no segundo

trimestre de gestação (Tsai et al. 2004), de onde já puderam ser isoladas e

expandidas em cultura. CTM isoladas do fluido amniótico expressam, além dos

marcadores usuais de progenitores mesenquimais, a proteína Oct-4, fator de

Introdução

transcrição expresso em células tronco embrionárias e células germinativas,

sugerindo um alto potencial proliferativo e de diferenciação para os

progenitores embrionários. CTM foram também isoladas de vários tecidos

adultos, como tecido adiposo, músculo e derme (Zuk et al. 2001, Young et al.

2001). Leonardi e colaboradores (2006) derivaram culturas de CTM a partir da

medula óssea femoral obtida durante cirurgias de artroplastia total de quadril.

Culturas de CTM humanas (CTMh) contêm uma população de células

com morfologia de fibroblastos bipolares e algumas células adipocíticas,

poligonais e arredondadas, que desaparecem à medida em que as culturas são

replaqueadas. As células fibroblastóides apresentam ciclo celular de cerca de

33 horas e possuem um potencial de expansão in vitro grande, porém variável

(Minguell et al. 2000). Enquanto algumas preparações de CTMh podem ser

expandidas mais de 15 vezes, outras páram de replicar após 4 subculturas.

Essa variabilidade pode estar relacionada à baixa freqüência de CTM na

medula (2-5 CTM por 106 células mononucleares) (Koc et al. 1999), à idade e à

condição física do doador da medula óssea de onde foi preparada a cultura.

CTM derivadas de doadores mais velhos apresentam menor taxa de

proliferação, menor freqüência na medula óssea morfologia mais larga e

achatada, além de alterações no seu potencial de diferenciação (Roobrouck et

al. 2008). Em um trabalho recente, Stolzing e colaboradores (2008) realizaram

ensaios de UFC-F associados à análise de marcadores de envelhecimento

celular, de dano oxidativo e de senescência, e mostraram que, além do número

de CTMh obtidas da medula óssea diminuir conforme a idade do doador, o

“fitness” das CTM também é reduzido (termo atribuído pelos autores para a

Introdução

menor propensão das células a sofrer senescência), o que pode ter

conseqüências práticas em sua utilização como fonte para terapias celulares.

Além disso, o potencial de proliferação das CTM aparece de forma

bastante variável na literatura, devido às diferentes metodologias empregadas

na derivação das culturas de CTM e às diferentes técnicas utilizadas para

avaliação de sua capacidade de proliferação. A densidade inicial de células é

também um fator crucial no potencial de expansão de uma cultura de CTM:

diversos trabalhos têm demonstrado que as culturas têm capacidade de

expansão maior quando plaqueadas em baixa densidade, provavelmente

porque, em alta densidade, o contato célula-célula ou fatores secretados no

meio levam a taxas de crescimento mais baixas (Colter et al. 2000, 2001,

Sekiya et al. 2002a).

A habilidade de células individuais de gerar colônias dentro de culturas de

células estromais, quando plaqueadas em baixa densidade, reflete diretamente

sua competência para o crescimento “independente da densidade” (Bianco et

al. 2006). Em outras palavras, apenas quando cultivados em baixa densidade,

progenitores mesenquimais mais primitivos, capazes de se diferenciar em

adipócitos, osteoblastos e condrócitos, e capazes de proliferar independente de

estímulos parácrinos, podem se sobressair na cultura, não concorrendo com

progenitores que proliferam mais rapidamente, mas que já estão em estágios

posteriores de diferenciação. A formação de colônias e a clonogenicidade

coincidem entre si apenas quando as colônias são formadas em densidade

clonal (baixas densidades). Colônias também aparecem quando suspensões

celulares são plaqueadas em densidades não clonais. Nessas condições as

Introdução

colônias não necessariamente são clonais, e a sua formação não denota um

crescimento do tipo “independente da densidade” (Bianco et al. 2006).

Análises clonais mostram que a população em cultura é uma mistura de

progenitores multi e bipotentes, precursores linhagem-restritos, e uma pequena

quantidade de fibroblastos sem capacidade de diferenciação nas linhagens do

tecido conectivo (Phinney et al 1999, DiGirolamo et al 1999, Muraglia et al

2000, Baksh et al. 2004). Após períodos prolongados de exposição ao soro

bovino fetal, os progenitores mais primitivos dão origem a precursores mais

comprometidos que crescem rapidamente e se diferenciam terminalmente.

Vários tipos de progenitores comprometidos estão presentes em culturas de

CTM derivadas da medula óssea: progenitores quadri-linhagem (capazes de

seguir a diferenciação osteo/condro/adipogênica/estromal), tri-linhagem

(osteo/condro/adipogênica), bi-linhagem (osteo/condrogênica) e progenitores

osteogênicos, o que parece refletir a hierarquia de diferenciação a partir da

célula tronco mesenquimal não comprometida (Muraglia et al. 2000).

Mets & Verdonk (1981) descreveram pela primeira vez 2 tipos de células

morfologicamente distintas nas culturas de CTM: as células tipo I, que são

fusiformes e crescem rapidamente, e as células tipo II, que são achatadas e

crescem lentamente. Posteriormente baseando-se no tamanho, morfologia e

granulosidade, Colter et al. (2001) demonstraram que as culturas contêm

também células muito pequenas com grande capacidade proliferativa (células

RS), que parecem ser os progenitores mais primitivos e com maior potencial de

diferenciação multilinhagem. Tais progenitores diferem das células mais

maduras numa mesma cultura pela expressão de marcadores protéicos

específicos (Colter et al. 2001).

Introdução

Estudos in vitro têm demonstrado que culturas de células estromais

expressam baixos níveis de fatores adipogênicos, como C/EBPα e PPARγ

(Kuznetsov et al. 2001), fatores osteogênicos, como Runx2 e Osx (Satomura et

al. 2002, Nakashima et al. 2002), e fatores condrogênicos, como Sox9

(Akiyama et al. 2002). Duas possibilidades podem explicar tal achado: ou os

fatores específicos de uma linhagem reprimem a expressão dos fatores das

outras linhagens, gerando um estado de repressão mútua; ou a presença de

diferentes reguladores linhagem-específicos nas culturas acontece, pois estas

representam uma população heterogênea de células (Anjos-Afonso & Bonnet

2007), composta por diferentes tipos de progenitores comprometidos.

Devido à inabilidade de serem identificadas em sua localização natural no

organismo, a caracterização atualmente disponível das CTM foi feita apenas

com as células em cultura e, portanto, a biologia das CTM é uma biologia “fora

de contexto” (Javazon et al. 2004).

DIFERENCIAÇÃO DAS CTM

Quando submetidas a estímulos apropriados em cultura, as CTM podem

se diferenciar terminalmente em diversos tipos de células de origem

mesenquimal. O potencial de diferenciação in vitro das CTM tem sido testado

em diversos estudos, onde as condições ideais de cultura, os estímulos

apropriados e os métodos para identificação do fenótipo diferenciado vêm

sendo determinados.

In vitro já foi possível estabelecer a diferenciação das CTM em células

ósseas, células adiposas, células estromais da medula, condrócitos e

cardiomiócitos (Phinney et al. 1999, Johnstone et al. 1998, Wakitani et al. 1995,

Introdução

Caplan 1994, Xu et al. 2004). A diferenciação adipogênica, por exemplo, pode

ser induzida pelo tratamento com 1-metil-3-isobutilxantina, dexametasona e

indometacina. A indução pode ser evidenciada pela acúmulo de vacúolos ricos

em lipídeos dentro das células. Para promover a diferenciação condrogênica,

CTM são removidas da monocamada e distribuídas em estruturas

tridimensionais, na ausência de soro e na presença de fatores de crescimento

da superfamília TGF (transforming growth factor), como TGF-β1, TGF-β3, BMP

(bone morphogenetic protein)-2, BMP-6 e BMP-9. As culturas desenvolvem

uma morfologia multicamada rica em matriz e com presença maciça de

marcadores condrogênicos. Sob a influência de dexametasona, β-glicerol

fosfato e ácido ascórbico, na presença de soro fetal, células mesenquimais

isoladas formam agregados e aumentam sua expressão de fosfatase alcalina

(diferenciação osteogênica) (Pittenger et al. 1999). Células diferenciadas a

partir das CTM podem suportar a hematopoese in vitro, através do

estabelecimento de culturas de longa-duração (diferenciação estromal)

(Majumdar et al. 1998).

A capacidade de diferenciação das CTM em osteoblastos, adipócitos e

condrócitos reflete sua contribuição para o nicho hematopoético da medula

óssea, fornecendo o microambiente adequado ao controle da maturação,

diferenciação e sobrevivência das células e progenitores hematopoéticos. Além

disso, populações CTM multipotentes também fazem parte do nicho medular.

Neste contexto, o contato direto célula a célula, através de proteínas de adesão

específicas e da matriz extracelular, tais como fibronectina 1, caderina 11,

molécula de adesão vascular-1, conexina 43, integrina-β1 e TGFβ1, tem

mostrado importante papel na manutenção do estado indiferenciado dos

Introdução

progenitores hematopoéticos. Wagner et al. (2007a) demostraram que

monocamadas de CTM fornecem adequado nicho para células progenitoras

hematopoéticas (CPH) humanas. Posteriormente, o mesmo grupo mostrou

que várias moléculas de adesão estão envolvidas na manutenção das CPH

primitivas (Wagner et al. 2007), em particular a glicoproteína CD44 (Wagner et

al. 2008a).

Alguns trabalhos mostraram a diferenciação in vitro de CTM para células

com morfologia de neurônio e glia e que expressavam marcadores neuronais e

gliais após estimulação com ácido retinóico, NGF, FGFb, ácido valpróico,

forscolina e GGF (Sanchez-Ramos et al. 2000, Tohill et al. 2004, Qian &

Saltzman 2004, Safford et al. 2004), demonstrando o potencial de trans-

diferenciação dos progenitores mesenquimais primitivos a células derivadas de

outros folhetos embrionários (no caso, neuroectoderma). Kopen e

colaboradores (1999) mostraram que CTM podem adotar fenótipos neurais

quando expostas ao microambiente do cérebro, após sua implantação em

cérebros de camundongos neo-natos. Rose e colaboradores (2008), porém,

mostraram que CTM de camundongos, quando co-cultivadas em

cardiomiócitos de ratos, passam a expressar marcadores cardíacos (como fator

natriuretico atrial, Nkx2.5 e α-actina cardíaca), mas que as células resultantes

não são capazes de gerar potenciais de ação ou correntes iônicas típicas de

cardiomiócitos, sugerindo que as células retêm o fenótipo estromal. A

diferenciação in vitro das CTM em tipos celulares endodérmicos (Sato et al.

2005) e ectodérmicos (Kopen et al. 1999) poderia ser uma conseqüência do

próprio cultivo celular, mais do que refletir um potencial intrínseco de

diferenciação in vivo (da Silva Meirelles et al. 2008).

Introdução

CARACTERIZAÇÃO ANTIGÊNICA

Embora anticorpos para vários antígenos de superfície possam ser

usados para reconhecer as CTM, não existem marcadores específicos para

identificá-las. Estudos realizados em culturas de CTM não clonais mostram

certo perfil característico: CD34-, CD45-, CD14-, CD13+, CD29+, CD44+,

CD49a+, CD63+, CD90+, CD105+, CD106+, CD146+, CD166+ (Barry et al. 1999,

Deschaseaux & Charbord 2000, Filshie et al. 1998, Gronthos et al. 1999,

Stewart et al. 2003, Vogel et al. 2003, Zannettino et al. 2003, revisado em

Bianco et al. 2006). Esse fenótipo pode ser modulado em cultura, e não reflete

o fenótipo in vivo. Grande parte desses marcadores é expresso em diferentes

níveis em linhagens de fibroblastos, que não se comportam como as células

estromais da medula óssea tanto in vivo quanto in vitro (Bianco et al. 2006).

Na busca de marcadores para as CTM, Jones e colaboradores (Jones et

al. 2002, 2006) identificaram uma rara população celular na medula óssea,

distinta das células hematopoéticas por sua baixa expressão de CD45 e por

seu maior tamanho. O marcador Stro-1 estava uniformemente expresso nessa

população, mas a reação cruzada deste marcador em outras populações da

medula óssea limitou sua utilização na identificação da CTM. O mesmo grupo

identificou outros marcadores muito expressos na população CTM, mas pouco

expressos nas outras populações da medula óssea. O receptor para o fator de

crescimento neural de baixa afinidade (Low-affinity Nerve Growth Factor

Receptor, LNGFR), também conhecido como CD271, foi identificado como o

marcador mais diferencialmente expresso nessa população (Jones et al. 2002,

2006). Outra molécula neural, o GangliosíDeo 2 (GD2), teve sua expressão

recentemente demonstrada em populações in vivo de CTM e após seu cultivo

Introdução

in vitro. Estudos recentes mostraram que SSEA-1 e SSEA-4, antígenos

embrionários estágio-específicos, são marcadores para células mesenquimais

primitivas na medula óssea humana e murina (Anjos-Afonso & Bonnet 2007).

Os progenitores mesenquimais compartilham fenótipo antigênico com

células endoteliais, epiteliais e musculares, e não expressam marcadores

hematopoéticos típicos, como CD45, CD34 e CD14. O padrão de expressão de

citocinas e receptores para fatores de crescimento das CTM é dinâmico e

complexo, e sugere que os progenitores mesenquimais na medula óssea

contribuem para a formação e função do microambiente estromal. Dentre esses

fatores estão moléculas de matriz extracelular, incluindo fibronectina, laminina,

colágeno e proteoglicanos (Prockop 1997, Chichester et al. 1993, Pittenger et

al. 1999), e receptores de matriz e de interações célula-célula (Conget &

Minguell 1999, Pittenger et al. 1999, Gronthos & Simmons 1995, Satomura et

al. 1998). De particular relevância é a forte expressão de CD44 (Conget &

Minguell 1999, Pittenger et al. 1999), receptor para vários ligantes importantes

na organização da matriz extracelular na medula e no osso, além da expressão

das proteínas SH-2, SH-3 e SH-4. As CTM secretam uma série de citocinas e

fatores de crescimento com atividades parácrinas e autócrinas, tais como Il-6,

Il-7, Il-8, Il-11, Il-12, Il-14, Il-15, fator estimulador de colônias macrofágicas (M-

CSF), ligante de Flt-3 e Stem Cell Factor (SCF), e são induzidas por Il-1α a

produzir Il-1α, leukemia-inhibiting factor (LIF), fator estimulador de colônias

granulocíticas (G-CSF) e fator estimulador de colônias granulocítica-

macrofágicas (GM-CSF) (Majumdar et al. 1998, Kim et al. 2005). Elas também

produzem reguladores negativos da hematopoese, como Il-8/CXCL8, proteína

inflamatória de macrófagos (MIP-1α/CCL3), TGF-β, e citocinas que induzem a

Introdução

síntese de outras citocinas por células do sistema imune (Majumdar et al.

1998). Os fatores secretados produzem uma série de respostas no

microambiente medular e no sistema imune local, além de potencializar a

angiogênese, e induzir a proliferação e diferenciação de células tronco

teciduais (Caplan & Dennis 2006). As células estromais expressam também

uma série de fatores pro-angiogênicos, como a Angiopoetina-1 (Ang-1), o fator

de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento derivado de

plaquetas (PDGF), fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF-2), FGF-7,

citocinas (Il-6 e TNF-α) e o ativador do plasminogênio tecidual (PAt). Além de

promover a angiogênese, as CTM induzem a expressão de proteínas de junção

e um aumento na integridade microvascular (Zacharek et al. 2007).

A molécula de adesão celular associada a melanoma (melanoma-

associated cell adhesion molecule, MCAM/CD146) foi descrita recentemente

como possível marcador da população de progenitores estromais na medula

óssea humana, capaz de regenerar osso e estroma, e reestabelecer o

microambiente medular in vivo (Sacchetti et al. 2007). A alta expressão de

MCAM/CD146 nesses progenitores é compartilhada com células subendoteliais

de sinusóides da medula óssea, mas não por células osteoblásticas capazes

de formar apenas osso heterotrópico (Sacchetti et al. 2007). Os progenitores

CD146+ descritos pelo grupo de Sacchetti são capazes de se auto-renovar in

vivo, expressam Ang-1 e, portanto, parecem participar ativamente dos eventos

angiogênicos para o estabelecimento de sinusóides anterior à hematopoese

(2007). Sorrentino e colaboradores (2008) descreveram uma metodologia

eficiente para isolamento e cultivo de células estromais mesenquimais

multipotentes CD146+, população com maior potencial de proliferação e

Introdução

manutenção em cultura, capaz de se diferenciar em osteoblastos, condrócitos,

adipócitos e de fornecer suporte para a hematopoese em ensaios de cultura a

longo termo. Essa população pode representar um modelo in vitro para estudos

do nicho hematopoético (Sorrentino et al. 2008).

IDENTIDADE IN VIVO

Embora as CTM sejam estudadas há mais de três décadas, a natureza

exata do progenitor presente in vivo está apenas começando a ser

caracterizada. Sua localização e identidade in vivo são questões ainda pouco

conhecidas. Algumas hipóteses podem ser levantadas no que se refere à sua

localização. As CTM poderiam estar localizadas em algum(s) sítio(s)/órgão(s)

específico(s) do organismo e serem mobilizadas, através da circulação, para

outros sítios/órgãos que necessitassem de reposição de suas populações

celulares (da Silva Meirelles et al. 2008). A aparente impossibilidade de se

isolar culturas de CTM do sangue periférico em condições fisiológicas é um

forte argumento contra essa hipótese (Lazarus et al. 1997, Wexler et al. 2003).

Em camundongos, porém, UFC-F circulam no sangue e representam uma

população de células estromais que podem migrar em órgãos hematopoéticos

(Piersma et al. 1983). Em humanos, células com características de

progenitores mesenquimais foram detectadas no sangue periférico de

pacientes com câncer de mama após mobilização com fatores de crescimento,

mas não no sangue de doadores (Fernandez et al. 1997).

Uma segunda possibilidade baseia-se no fato de que culturas

semelhantes às de CTM já foram isoladas de vários tecidos pós-natais, além

da medula óssea, como tecido adiposo (Zuk et al. 2001), tendão

Introdução

(Salingcarnboriboon et al. 2003), ligamento peridontal (Seo et al. 2004),

músculo (Lee et al. 2000, Kuroda et al. 2006), membrana sinovial (De Bari et al.

2001), pele (Toma et al. 2001), e pulmões (Sabatini et al. 2005). Em

camundongos, culturas semelhantes morfológica, fenotípica e funcionalmente

às de CTM puderam ser isoladas de vários tecidos e órgãos, mesmo quando

os animais tinham o sangue de suas veias previamente retirado por perfusão

(da Silva Meirelles et al. 2006), impedindo a circulação de progenitores.

Entretanto, a potência dos progenitores isolados de tecidos não-

hematopoéticos e da medula óssea não foi sistematicamente comparada por

ensaios in vivo (Bianco et al. 2008), e é possível que eles tenham

características diferentes. Por exemplo, UFC-F derivadas da polpa dentária

cultivadas e transplantadas em condições idênticas às utilizadas para UFC-F

da medula óssea, formam dentina e não osso (Gronthos et al. 2002).

Uma terceira hipótese, defendida por diversos autores (Shi et al. 2003,

Farrington-Rock et al. 2004, Bianco et al. 2001, da Silva Meirelles et al. 2006,

2008, Covas et al. 2008), considera a relação direta das CTM com células

perivasculares, ou seja, os pericitos seriam a identidade in vivo das CTM. Essa

possibilidade poderia explicar por que as CTM podem ser isoladas de vários

tecidos, uma vez que sua associação com a vasculatura aumentaria sua

disponibilidade para a substituição celular. Neste cenário, lesões em quaisquer

tecidos liberariam as CTM do seu sítio perivascular (Da Silva Meirelles et al.

2008), podendo assim secretar fatores tróficos e imunorregulatórios

necessários para a reconstituição/regeneração local. Evidências que favorecem

essa hipótese incluem o estabelecimento de culturas de CTM de vasos

sanguíneos isolados, incluindo o glomérulo encapsulado (da Silva Meirelles et

Introdução

al. 2006). Além disso, o possível marcador MCAM/CD146 (Sacchetti et al.

2007) é também expresso por pericitos (Li et al. 2003).

Crisan e colaboradores (2008) identificaram células perivasculares em

múltiplos órgãos humanos, como músculo esquelético, pâncreas, tecido

adiposo e placenta, com expressão nativa de CD146, αSMA, NG2, fosfatase

alcalina e PDGF-Rβ, e ausência de marcadores hematopoéticos, endoteliais e

miogênicos. Essas células, quando cultivadas por longos períodos, mantêm a

expressão dos marcadores perivasculares, apresentando também expressão

de antígenos típicos de CTM, tais como CD10, CD13, CD44, CD73, CD90 e

CD105. Em contraste, as células em cultura não expressam CD56, CD133,

CD324, CD326, CD344 e HLA-DR, antígenos tipicamente não expressos em

CTM. Além disso, células perivasculares derivadas de tecidos musculares e

não musculares, tais como pâncreas, gordura, medula óssea e placenta,

apresentam grande potencial miogênico. Esses resultados reforçam a hipótese

de que as paredes dos vasos sanguíneos abrigam um reservatório de células

progenitoras, que podem ser a origem das CTM e de outras células tronco

adultas.

MIGRAÇÃO EM HUMANOS E MODELOS ANIMAIS

Devido ao seu grande tamanho, e pelo fato de expressarem diversas

moléculas de adesão, tem sido demonstrado que CTM injetadas por via

intravenosa ficam inicialmente retidas nos pulmões (Fox et al. 2007).

Apesar disso, várias evidências mostram que CTM injetadas por via

intravenosa são capazes de migrar em modelos animais e se distribuir por

vários tecidos, como tecidos gastro-intestinais, fígado, rins, timo, pele e medula

Introdução

óssea (Pereira et al. 1995, Ferrari et al. 1998, Awad et al. 1999, Devine et al.

2003). A migração para tecidos que sofreram injúria é particularmente

importante após injeção sistêmica. CTM de ratos e humanos foram detectadas

em sítios de injúria no cérebro de ratos após isquemia e injeção por via

intravenosa (Mahmood et al. 2003). Ratos que sofreram rejeição de

aloenxertos de coração foram tratados com infusão intravenosa de CTM, e foi

observado que estas migraram para o sítio de rejeição e melhoraram a enxertia

(Wu et al. 2003).

Pouco se sabe, no entanto, a respeito dos mecanismos da migração

sistêmica transendotelial de CTM e das moléculas de adesão envolvidas. É

possível que o tecido lesado expresse receptores ou ligantes específicos que

facilitem o tráfego, adesão e infiltração ao sítio de injúria, de forma similar ao

recrutamento de leucócitos aos sítios de inflamação. Várias moléculas

envolvidas na adesão e transmigração de leucócitos da corrente sanguínea

para os tecidos são expressas nas CTM, incluindo integrinas, selectinas e

receptores de quimiocinas (Krampera et al. 2006), o que reforça essa hipótese

(Fox et al. 2007).

ENVELHECIMENTO E EFEITO DA EXPANSÃO IN VITRO NA BIOLOGIA DAS CTM

O envelhecimento é um processo complexo e a identificação dos

mecanismos que governam o envelhecimento de populações celulares requer

que estas possam ser isoladas e caracterizadas com relativa homogeneidade.

A maioria das células adultas sofre no máximo 50 a 60 divisões antes de se

tornar senescente. Essa limitada capacidade replicativa é conhecida como o

“limite de Hayflick”, termo utilizado por Leonardo Hayflick (1965) para descrever

Introdução

o processo resultante do progressivo encurtamento dos telômeros. A

transformação celular é o processo in vitro pelo qual células escapam desse

limite, através da aquisição de mutações em genes específicos (Roobrouck et

al. 2008).

Como o isolamento prospectivo da CTM ainda não foi possível, sua

utilização com propósitos terapêuticos depende do isolamento e expansão em

cultura. No entanto, os métodos de isolamento e as condições de cultivo para

selecionar e expandir as CTM são muito variáveis. Além disso, sua definição

em cultura se baseia em parâmetros físicos, fenotípicos e funcionais, e não em

marcadores definidos e únicos. A qualidade das preparações realizadas em

diferentes laboratórios varia enormemente.

CTM humanas apresentam morfologia fibroblastóide e usualmente param

de proliferar antes de 40 duplicações populacionais (population doublings,

PDs), quando se tornam maiores e mais achatadas (Bruder et al. 1997), o que

está possivelmente associado ao fenômeno da senescência in vitro. Um dos

mecanismos que levam à senescência celular é o encurtamento dos telômeros

sofrido durante o cultivo in vitro. Diversos autores têm estudado o tamanho dos

telômeros das CTM, bem como o encurtamento sofrido durante o cultivo in

vitro. Como esperado, os telômeros de CTM derivadas de doadores jovens são

maiores que os de doadores velhos (Baxter et al. 2004, Guillot et al. 2007,

Mareschi et al. 2006). Esses estudos concordam que ocorre uma perda no

tamanho dos telômeros a cada passagem in vitro, em torno de 1,5-2 kb,

embora o tamanho original dos telômeros varie em cada um.

As células tronco adultas apresentam baixos níveis de atividade da

telomerase, e as CTM não são uma exceção à regra (Roobrouck et al. 2008).

Introdução

Assim, uma estratégia adotada por diversos grupos para estender o tempo de

vida em cultura das CTM é a expressão forçada de hTERT, subunidade

catalítica da enzima telomerase humana, que é capaz de aumentar a

capacidade replicativa in vitro das CTM em mais de 80 (Simonsen et al. 2002)

e 260 (Shi et al. 2002) duplicações populacionais. As CTM transduzidas com

hTERT retêm o potencial de diferenciação in vitro para as linhagens osteo,

condro e adipogênica, e de diferenciação osteogênica in vivo (Simonsen et al.

2002, Shi et al. 2002).

Mesmo sendo expressa em baixos níveis nas CTM, e não tendo influência

direta na replicação celular, a telomerase parece ter um papel na diferenciação

in vitro dessas células, uma vez que CTM isoladas do camundongo knockout

para telomerase não são capazes de se diferenciar em adipócitos e

condrócitos, mesmo nas primeiras passagens (Liu et al. 2004).

Utilizando um modelo de envelhecimento acelerado que combina a

mutação Wrn (da síndrome de Werner) e o encurtamento acelerado dos

telômeros pela ausência da telomerase (camundongo duplo mutante Wrn-/- e

Terc-/-), Pignolo e colaboradores (2008) mostraram que CTM isoladas desse

camundongo apresentam diminuição no tempo de vida em cultura e

senescência prematura, além de redução do potencial de diferenciação

osteogênica in vitro. O duplo mutante apresenta diminuição na massa óssea,

resultando em osteoporose precoce, o que parece estar relacionado à

deficiência na diferenciação osteoblástica, uma vez que a diferenciação

osteoclástica se mantém intacta. Os dados desse modelo sugerem que o

envelhecimento replicativo de precursores osteoblásticos in vivo é um

importante mecanismo na osteoporose senil.

Introdução

Além do encurtamento dos telômeros, outros fatores como a inativação da

expressão de p16INK4A, um dos reguladores do ciclo celular, estão implicados

na indução da senescência (Roobrouck et al. 2008). Shibata e colaboradores

(2007) mostraram que a expressão de p16INK4A está fortemente associada à

senescência in vitro, e que o cultivo prolongado de CTM humanas pode induzir

a inativação do gene de p16, levando a aberrações cromossômicas.

Outra questão importante na biologia das CTM in vitro está relacionada à

idade do doador. CTM derivadas de doadores mais velhos apresentam menor

taxa de proliferação, mesmo em passagens iniciais (Banfi et al. 2000, Baxter et

al. 2004, Stolzing et al. 2008, Zhou et al. 2008), menor freqüência na medula

óssea (Baxter et al. 2004, Stolzing et al. 2008), medida pelo ensaio de UFC-F,

morfologia mais larga e achatada (Roobrouck et al. 2008), mesmo nas

passagens iniciais, além de alterações no seu potencial de diferenciação

(D’Ippolito et al. 1999, Mendes et al 2002, Baxter et al. 2004, Zhou et al. 2008).

Em relação a alterações na capacidade de diferenciação das CTM de

acordo com a idade do doador, a maioria dos trabalhos descreve uma redução

na geração de células positivas para fosfatase alcalina em UFC-F, diretamente

relacionada ao aumento na idade do doador (D’Ippolito et al. 1999, Baxter et al.

2004, Zhou et al. 2008). O grupo de Stenderup, no entanto, não observou

diferenças com a idade do doador no potencial de diferenciação ostogênica e

adipogênica in vitro, nem de diferenciação ostogênica in vivo, determinada

após implante das células associadas a matrizes de fosfato de cálcio em

camundongos NOD/SCID (Stenderup et al. 2003). Mendes e colaboradores

mostraram que CTM derivadas tanto de doadores jovens como de velhos eram

capazes de formar osso in vivo, embora a formação de osso diminuísse

Introdução

significativamente com a idade (Mendes et al. 2002). Para estudar a influência

da idade do doador no potencial condrogênico das CTM, Zheng e

colaboradores compararam a produção de matriz extracelular cartilaginosa

entre células derivadas de ratos de 1 semana, 12 semanas e 1 ano (Zheng et

al 2007). Somente as CTM derivadas de ratos de 1 semana produziram matriz,

sugerindo que o potencial condrogênico também diminui com a idade.

O trabalho do grupo de Muraglia, mostrando que os progenitores

mesenquimais da medula óssea seguem um modelo hierárquico de

diferenciação in vitro, sugere também que o potencial de diferenciação in vitro

das CTM diminui com a idade (Muraglia et al. 2000). Progenitores tripotentes e

bipotentes apresentam frequência absoluta maior em doadores jovens. Clones

de CTM cultivados in vitro perdem primeiro seu potencial adipogênico, o que

vai de encontro à observação in vivo de que a adipogênese na medula óssea

aumenta com a idade, enquanto que a osteogênese diminui (Roobrouck et al.

2008).

Para investigar a suscetibilidade de transformação de CTM em cultura e

determinar se as propriedades biológicas das células permanecem apropriadas

para terapia celular, Bernardo e colaboradores cultivaram CTM de doadores

humanos saudáveis até atingirem senescência, ou chegarem à passagem 25, e

realizaram a caracterização genética das culturas ao longo de várias

passagens (Bernardo et al. 2007). Uma grande variabilidade em termos do

potencial de proliferação e de vida útil da cultura foi observada entre diferentes

doadores. Não foram detectadas anormalidades cromossômicas nas culturas

analisadas, assim como não foram observadas atividade da enzima telomerase

e expressão de transcritos de hTERT, mostrando que os telômeros sofreram

Introdução

encurtamento durante o período de cultura (Bernardo et al. 2007). Esses

resultados sugerem que as CTM derivadas da medula óssea podem ser

seguramente expandidas in vitro, que elas não são suscetíveis à transformação

maligna, o que as torna adequadas para utilização em terapias celulares.

Para caracterizar o efeito da expansão in vitro na biologia da CTM,

Izadpanah e colaboradores compararam culturas derivadas da medula óssea e

do tecido adiposo de humanos e de macacos Rhesus (Izadpanah et al. 2008).

Análises cariotípicas revelaram o desenvolvimento de alterações citogenéticas

somente em células derivadas de macacos em passagens tardias (a partir da

passagem 20), mas não em células humanas. Não foram observadas

alterações cromossômicas em CTM humanas cultivadas por longos períodos,

enquanto que uma alta freqüência de aneuploidias foi detectada em culturas de

CTM de macacos Rhesus. Poucas alterações na expressão gênica, no entanto,

foram observadas em uma mesma amostra ao longo de diferentes passagens

(Izadpanah et al. 2008).

Com o objetivo de estudar o impacto da senescência replicativa em

preparações de CTM humanas, Wagner e colaboradores realizaram análises

morfológicas, imunofenotípicas e de diferenciação de CTM submetidas à

expansão in vitro, além de analisar como o padrão de expressão de RNAm e

RNAmi muda durante o cultivo e propagação in vitro (Wagner et al 2008b). Os

autores pretendiam estudar os efeitos moleculares da senescência replicativa

em passagens tardias, o que poderia ter implicações na qualidade de

preparações de CTM usadas em aplicações terapêuticas. Diversas alterações

foram observadas em passagens mais tardias (entre 7 e 12), tais como

anormalidades morfológicas, alterações na expressão de marcadores

Introdução

específicos, diminuição da proliferação, do potencial adipogênico e aumento do

potencial osteogênico. Além disso, foi observado que mudanças no padrão de

expressão gênica global não estão restritas a passagens tardias, mas são

adquiridas ao longo do subcultivo das CTM, o que sugere que a senescência

replicativa das preparações de CTM é um processo contínuo, que se inicia logo

nas primeiras passagens, e que precisa ser considerada para sua aplicação

terapêutica (Wagner et al 2008b).

A diminuição na capacidade proliferativa e a aquisição de defeitos na

diferenciação de populações em cultura são responsáveis pelo fenômeno do

envelhecimento, que tem implicação direta em terapias celulares. Diversos

estudos têm demonstrado o declínio na capacidade de diferenciação e

expansão em cultura das CTM, de acordo com o envelhecimento do organismo

(Roobrouck et al. 2008). A extensão dessa redução, no entanto, ainda não está

clara, sobretudo devido à ausência de um consenso na caracterização

fenotípica e condições de isolamento e cultivo das CTM. O melhor

entendimento nos efeitos da expansão in vitro sobre a biologia das CTM, e os

efeitos relacionados ao envelhecimento celular, tem grande impacto em seu

uso clínico como terapia celular.

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR

Devido à ausência atual de marcadores prospectivos para o isolamento e

caracterização das CTM, sua definição se baseia em propriedades físicas,

fenotípicas e funcionais (Dominici et al. 2006). Entretanto, a variabilidade de

protocolos empregados para estabelecer culturas de CTM, assim como a

diversidade das fontes iniciais, como a medula óssea, o tecido adiposo, o

Introdução

sangue e segmento de cordão umbilical e o sangue periférico, torna necessário

o desenvolvimento de estudos mais aprofundados de caracterização molecular

das preparações celulares.

A análise da expressão gênica e protéica surgiu, no campo de estudo das

CTM, como importante ferramenta para a caracterização molecular das

preparações celulares. Na definição do perfil de expressão gênica das CTM,

diversos estudos de análise em larga escala têm se focalizado na sua

diferenciação in vitro (Doi et al. 2002, Sekiya et al. 2002b, Qi et al. 2003,

Nakamura et al. 2003, Sekiya et al. 2004), na comparação direta entre

diferentes preparações de CTM (Majumdar et al. 1998, Jiang et al. 2002, Lee et

al. 2002), na estimativa absoluta da expressão de RNAm na CTM (Tremain et

al. 2001, Jiang et al. 2002, Wieczorek et al. 2003, Silva et al. 2003, Lee RH et

al. 2004), e na comparação entre CTM isoladas de diferentes fontes, como a

medula óssea, tecido adiposo e o cordão umbilical, e linhagens de fibroblastos

terminalmente diferenciados (Panepucci et al. 2004, Wagner et al. 2005).

Enquanto as propriedades biológicas únicas codificadas no genoma das

CTM podem ser analisadas ao nível do transcriptoma da célula, o fenótipo e

função celular são determinados em última instância pelas proteínas e enzimas

traduzidas. A análise proteômica tem facilitado a caracterização molecular e

permitido a identificação de proteínas essenciais para o papel das CTM no

microambiente hematopoético da medula óssea e na modulação das respostas

imunes.

Um dos primeiros trabalhos a determinar um mapa proteômico

bidimensional de referência de CTM foi realizado em 2006 por Wagner e

colaboradores. Os autores analisaram o padrão proteômico e transcriptômico

Introdução

diferencial de preparações de CTM da medula óssea humana, isoladas e

cultivadas em diferentes meios de cultura (10% ou 2% de soro bovino fetal).

Cento e trinta e quatro spots protéicos foram identificados por MADI-TOF-MS e

subsequente análise de bioinformática, e correspondiam a 81 proteínas

diferentes, a maior parte pertencente à categoria de proteínas do citoesqueleto.

Os spots protéicos encontrados nos géis das células cultivadas em diferentes

meios foram selecionados para análise por microarray (63 proteínas

representadas por 73 spots protéicos, que estavam representados por 105

clones de cDNA). Os resultados demonstraram uma intensidade de sinal

significativamente maior nos clones de cDNA que correspondiam às proteínas

mais expressas identificadas por proteoma. Entretanto, conforme demonstrado

por estudos anteriores (Griffin et al. 2002, Anderson & Seilhamer 1997), a

relação entre a quantidade absoluta de proteínas em uma célula não está

diretamente correlacionada à quantidade de RNAm, provavelmente devido às

modificações pós-transcricionais e pós-traducionais sofridas pelo RNAm e pela

proteína (Wagner et al. 2006).

Posteriormente, outros grupos realizaram análises do perfil proteômico de

preparações de CTM, nos mais diversos contextos. Park e colaboradores, em

2007, revisaram as análises proteômicas já publicadas, descrevendo cerca de

264 proteínas distintas presentes em culturas de CTM humanas (Park et al.

2007). Várias tecnologias foram empregadas nessas análises, tais como

Eletroforese Bidimensional (EB), Cromatografia Líquida (CL), Espectrometria

de Massas (EM), bioinformática e arrays de proteínas. Esses e outros estudos

de caracterização em larga escala têm ajudado a elucidar mecanismos de ação

Introdução

dessa população celular, contribuindo cada vez mais para a utilização das CTM

como importante ferramenta em terapias nas mais diversas áreas da Medicina.

MODULAÇÃO DO SISTEMA IMUNE

Diversos estudos têm demonstrado dois pontos cruciais no que se refere

à relação das CTM com o sistema imune: 1) elas são consideradas

imunoprivilegiadas (Deans & Moseley 2000, DiNicola et al. 2002, Krampera et

al. 2003).; e 2) elas parecem modular o sistema imune (Aggarwal & Pittenger

2005, Rasmusson 2006, Uccelli et al. 2007), tendo ação direta sobre células T

(Bartholomew et al. 2002, DiNicola et al. 2002, Le Blanc et al. 2003, Tse et al.

2003, Krampera et al. 2006, Benvenuto et al. 2007, Nasef et al. 2007, Sato et

al. 2007), células B (Corcione et al. 2006, Rasmusson et al. 2007), células

Natural Killer (NK) (Spaggiari et al. 2006) e células dendríticas (Ramasamy et

al. 2007, Djouad et al. 2007).

As primeiras evidências do papel das CTM sobre o sistema imune vêm do

trabalho de Bartholomew e colaboradores, que mostraram que a administração

intravenosa de CTM em babuínos foi capaz de prolongar a sobrevivência de

enxertos alogenêicos de pele, de forma similar a potentes drogas

imunossupressoras utilizadas rotineiramente na clínica (Bartholomew et al.

2002).

Posteriormente seu papel na regulação do sistema imune começou a ser

estudado in vitro, inicialmente na função das células T. Krampera e

colaboradores mostraram que as CTM diminuem a resposta de células T naive

e de células T de memória a seus antígenos específicos, um efeito que parece

ser independente de células dendríticas (Krampera et al. 2002). Foi também

Introdução

demonstrado que as CTM são capazes de atenuar a produção de Il-2 por

células T, o que resulta na diminuição da formação de células T CD8

citotóxicas (Rasmusson et al. 2003). Essa inibição afeta a proliferação de

células T induzida por aloantígenos, mitógenos, assim como por anticorpos

para CD3 e CD28 (Nauta & Fibbe 2007).

Uma questão controversa a respeito do efeito inibitório das CTM sobre as

células T é se o contato entre as duas células é necessário, ou se tal efeito é

exercido por fatores solúveis. A maioria dos estudos concorda que fatores

solúveis estejam envolvidos, muito embora outros sugiram que o contato

célula-a-célula seja essencial para esse efeito (Nauta & Fibbe 2007).

Sobrenadantes de culturas de CTM humanas e murinas não apresentaram

efeito inibitório, exceto quando as CTM haviam sido co-cultivadas com células

mononucleares (Potian et al. 2003, Djouad et al. 2003, Le Blanc et al. 2004a),

sugerindo que o fator supressor não seja secretado constitutivamente pelas

CTM, mas que seja necessária a interação dinâmica entre a CTM e a célula T

(Nauta & Fibbe 2007). Diversos fatores são candidatos para mediar o efeito

supressor das CTM sobre as células T, como TGF-β e HGF (Di Nicola et al.

2002), PGE2 (Tse et al. 2003), e InDOleamina 2,3-dioxigenase (IDO) (Meisel et

al. 2004).

A indução de anergia das células T tem sido proposta como potencial

mecanismo para o efeito imunossupressor das CTM. Os baixos níveis de

expressão de moléculas co-estimulatórias, como CD40, CD80 e CD86, tem

sido relacionado ao potencial estado de anergia das células T induzido pelas

CTM (Nauta & Fibbe 2007).

Introdução

O efeito de modulação in vitro sobre as células T depende da

concentração de CTM. Alguns trabalhos mostram que quando adicionadas a

culturas mistas linfocitárias (CML) e a linfócitos ativados por mitógenos, as

CTM são capazes de induzir inibição em altas doses, enquanto que um

aumento na proliferação de células T foi observado quando as CTM estavam

em baixas doses. Além disso, esse efeito parece ser independente do HLA (Le

Blanc et al. 2003).

Fang e colaboradores, estudando a aloreatividade de células T na

presença de CTM, levantaram mais uma hipótese relacionada ao

imunoprivilégio das CTM, e que poderia explicar as controvésias encontradas

nessa área. Eles mostraram que as CTM são capazes de induzir a proliferação

de células T e secreção de Il-2 em níveis mensuráveis apenas em baixas

concentrações (taxa CTM/célula T ≥0, 1:1) (Fang et al. 2006). Tal achado

sugere que o estado imunoprivilegiado da CTM existe apenas quando sua

capacidade de inibição do sistema imune, através da produção de fatores

imunomodulatórios, se sobrepõe ao seu próprio potencial aloestimulatório (por

se tratar de uma célula estranha ao sistema imune receptor). Portanto, o

imunoprivilégio das CTM representa um balanço de seus efeitos supressores e

estimuladores (Fang et al. 2006).

Sua atuação direta em células B foi pouco estudada até o momento.

Corcione e colaboradores mostraram inibição da proliferação de células B, em

co-culturas com CTM humanas, devido à parada do ciclo celular na fase

G0/G1. Nesse estudo, foi demonstrado também que as CTM parecem afetar as

propriedades quimiotáticas das células B, embora não afetassem sua produção

de citocinas (Corcione et al. 2006). Recentemente, porém, Rasmusson e

Introdução

colaboradores mostraram que as CTM estimulam a secreção de anticorpos por

células B in vitro. Dependendo do nível de estimulação das células B, as CTM

podem induzir ou inibir a secreção de IgG pelas células B (Rasmusson et al.

2007).

A relação das CTM com as células NK também tem sido investigada.

Spaggiari e colaboradores mostraram que células NK ativadas são capazes de

matar as CTM, enquanto que as CTM inibem fortemente a proliferação de

células NK induzidas por Il-2, suas atividades citotóxicas e de produção de

citocinas (Spaggiari et al. 2006).

As CTM atuam de forma importante sobre a diferenciação, maturação e

função das células dendríticas (English et al. 2008). As CTM são capazes de

bloquear a diferenciação de monócitos e precursores da medula óssea em

células dendríticas e inibir o aumento da expressão de CD1A, CD40, CD80

CD86 e HLA-DR durante a maturação das células dendríticas, mantendo-as em

um estado imaturo. Mais recentemente, foi demonstrado que as CTM induzem

a expressão de Il-10, uma citocina “tolerogênica”, pelas células apresentadoras

de antígeno (Gur-Wahnon et al. 2007), o que sugere que as CTM poderiam

induzir um fenótipo supressor ou inibitório das células dendríticas. Em

camundongos, esse achado foi visto como um fator protetor para o

desenvolvimento da Doença do Enxerto-Contra-Hospedeiro (DECH) (Sato et al.

2003).

O fenótipo imunogênico de CTM tanto humanas como de animais parece

explicar o conceito de imunoprivilégio atribuído às CTM, e seu papel ativo na

modulação das respostas imunes. Elas expressam baixos níveis de antígenos

Introdução

co-estimulatórios, como B7-1, B7-2, CD40 e CD40L, e de HLA classe II (Deans

& Moseley 2000, DiNicola et al. 2002, Krampera et al. 2003).

Evidências mais recentes, no entanto, contestam o imunoprivilégio das

CTM e mostram que, pelo menos em modelos murinos, as CTM são capazes

de induzir respostas de células T de memória após a injeção em hospedeiros

imunocompetentes (Eliopoulos et al. 2005, Nauta et al. 2006). Dando suporte a

esse conceito, a injeção de CTM humanas no miocárdio de ratos infartados

mostrou a “pega” das células xenogenêicas associada, porém, com significante

infiltração imune local (Grinnemo et al. 2004). Infiltrados imunes foram

observados em hospedeiros alogeneicos injetados com CTM murinas

modificadas geneticamente para expressar BMP-2, apesar de as células

injetadas terem se diferenciado em tecido ósseo e cartilaginoso (Noel et al.

2003). Além disso, o potencial imunomodulatório in vivo das CTM tem sido

questionado por alguns grupos, que obtiveram resultados que vão de encontro

à hipótese de que elas modulam o sistema imune. Min e colaboradores

mostraram que a injeção precoce de CTM após o transplante de medula óssea

não foi capaz de atenuar a severidade da DECH aguda, exceto quando as

CTM expressavam constitutivamente a citocina anti-inflamatória IL-10 (Min et al

2007), enquanto Sudres e colaboradores mostraram que células capazes de

suprimir a proliferação de linfócitos in vitro falharam na prevenção da DECH em

camundongos submetidos ao TCTH (Sudres et al 2006).

Como ainda não é possível se isolar as CTM do seu nicho in vivo, todo

conhecimento atual de sua biologia deriva de estudos realizados com as

células expandidas ex vivo. O conceito da imunomodulação exercida pelas

CTM está embasado principalmente em estudos in vitro e utilizando-se o que

Introdução

hoje denominamos de CTM. O potencial imunossupressor das CTM também

tem sido avaliado in vivo. No modelo experimental murino da esclerose múltipla

humana, a chamada encefalomielite auto-imune experimental, a administração

intravenosa de CTM antes e no início da doença, mas não após sua

estabilização, parece prevenir/melhorar seu desenvolvimento (Zappia et al.

2005). Esses estudos utilizaram as células manipuladas ex vivo, e que podem

não corresponder totalmente à identidade da CTM in vivo.

Algumas evidências sinalizam para um papel fisiológico da CTM na

manutenção da homeostase imune (Nauta & Fibbe 2007). CTM derivadas da

medula óssea de pacientes com anemia aplástica severa não foram capazes

de suprimir a proliferação de linfócitos in vitro (Bacigalupo et al. 2005), embora

a relevância desses defeitos na patogênese da anemia aplástica ainda seja

desconhecida. Progenitores endoteliais e estromais em pacientes com

esclerose sistêmica também foram descritos como funcionalmente defeituosos,

apresentando capacidade de proliferação e diferenciação reduzidas. O defeito

no microambiente da medula óssea poderia ser importante no prejuízo à

vasculogênese observado nesses pacientes (Del Papa et al. 2006). Assim, é

possível formular a hipótese de que a capacidade imunossupressora das CTM

poderia ser importante na criação de um sítio imunoprivilegiado dentro da

medula óssea que protegesse as CTH primitivas contra respostas imunes

locais (Nauta & Fibbe 2007).

Além disso, a observação de que as CTM humanas podem ser isoladas

da decídua (In’t Anker et al. 2004), do fluido amniótico (In’t Anker et al. 2003b),

do sangue fetal (In’t Anker et al. 2003a) e do sangue de cordão umbilical

(Bieback et al. 2004) são possíveis indicativos de um papel das CTM in vivo na

Introdução

tolerância fetal. Dados atuais sobre o mecanismo do imunoprivilégio no útero

de mulheres grávidas mostram similaridade aos efeitos imunossupressores já

descritos para as CTM, incluindo a produção de IDO (Barry et al. 2005).

Uma questão importante relacionada ao papel imunomodulatório das CTM

envolve sua utilização na terapia coadjuvante ao transplante de medula óssea,

uma vez que o efeito inibitório das CTM atingiria as células T do doador que

reagem contra o receptor, um efeito protetor para o desenvolvimento da DECH.

Entretanto, esse efeito inibitório poderia atingir também as células T do doador

que reagem contra a leucemia, diminuindo o efeito do Enxerto Contra

Leucemia (ECL). Nenhum estudo foi realizado até momento para avaliar esse

paradigma. No entanto, Djouad e colaboradores mostraram que a injeção de

CTM em conjunto com linhagens de melanoma em camundongos

imunocompetentes favoreceu o desenvolvimento de tumor, em comparação

com camundongos injetados somente com a linhagem tumoral, que não

desenvolveram tumor, indicando que a imunossupressão global pode favorecer

o crescimento do tumor (Djouad et al. 2003).

POTENCIAL EM TERAPIAS CELULARES

A multipotencialidade e a facilidade de isolamento e expansão em cultura

das CTM, suas propriedades imunomodulatórias e sua capacidade de migrar

para sítios de inflamação quando injetadas por via intravenosa (Chapel et al.

2003, Ortiz et al. 2003), têm gerado um grande interesse em sua utilização em

terapias celulares para o tratamento de diversas doenças.

Até recentemente, o conceito de tratamento para doenças do

coração,através da geração de novo tecido miocárdico funcional, era

Introdução

considerada fisiologicamente impossível. Esse conceito vem sendo

questionado, e células derivadas da medula óssea têm sido utilizadas para

testar a possibilidade de regeneração deste tecido. Diversos autores têm

demonstrado que a injeção intracoronariana de populações de células da

medula óssea pode representar uma estratégia simples e promissora para o

tratamento de doenças do coração (Orlic et al. 2001, Ohnishi & Nagaya 2007).

No entanto, ainda não está claro se a população responsável por esse efeito é

a de CTH, CTM ou de progenitores diferenciados.

Após a injeção direta de CTM no miocárdio infartado de um modelo de

porco, foi observada a diferenciação das células injetadas para a linhagem

miogênica, expressando proteínas musculares específicas, e as células

injetadas foram capazes de atenuar a disfunção cardíaca dos animais (Shake

et al. 2002). Além da diferenciação em células cardiomiogênicas, tem sido

proposto que as CTM exerçam seus efeitos na regeneração cardíaca através

de efeitos parácrinos, pela secreção de fatores angiogênicos, anti-apoptóticos e

mitogênicos, como VEGF, HGF, adrenomedulina (AM), e IGF-1 (Kinnaird et al.

2004, Nagaya et al. 2005). A injeção de CTM em um modelo de rato de

cardiomiopatia dilatada melhorou a função cardíaca dos animais, aumentando

a densidade capilar (Nagaya et al. 2005). Em ratos com miocardite aguda, a

administração intravenosa de CTM melhorou as alterações inflamatórias e a

função cardíaca (Ohnishi et al. 2007).

Com a experiência acumulada nos modelos animais, alguns grupos têm

testado a utilização de CTM e células da medula óssea em ensaios clínicos

para o tratamento de disfunções do coração. A administração intracoronariana

de células mononucleares autólogas de medula óssea foi capaz de induzir a

Introdução

melhora de alguns parâmetros cardíacos de pacientes com infarto agudo do

miocárdio (Wollert et al. 2004), enquanto que um resultado mais promissor foi

obtido quando a administração foi feita com populações de CTM derivadas da

medula óssea (Chen et al. 2004). Além disso, o mesmo ensaio realizado em

pacientes portadores de cardiomiopatias isquêmicas crônicas mostrou

resultados semelhantes na melhora da função cardíaca dos pacientes (Chen et

al. 2006). Katritsis e colaboradores mostraram que o transplante

intracoronariano de CTM contribui para a regeneração regional do tecido

miocárdico, mostrando melhora na contratilidade cardíaca de um ou mais

segmentos do miocárdio no grupo que recebeu as CTM, mas não no controle

(Katritsis et al. 2005). Trabalhos de outros grupos mostraram resultados

similares (Assmus et al. 2002, Katritsis et al. 2007), o que sugere que a terapia

celular com populações de células da medula óssea é possível, segura e pode

contribuir para regeneração do tecido do miocárdio lesado. Além disso, o maior

número de células multipotentes presente na população de células cultivadas

ex vivo, quando comparado com a população de células mononucleares da

medula óssea, é necessário para um efeito mais promissor da terapia.

O principal fator na homeostase óssea é o balanço entre a função das

células produtoras de osso (osteoblastos, derivadas das CTM) e a função das

células que reabsorvem osso (osteoclastos, derivadas das CTH). A CTM

influencia diretamente a homeostase óssea, pela taxa de geração de

osteoblastos e pela produção de fatores que afetam o balanço

osteoblasto/osteócito. A substituição óssea, necessária no tratamento de

tecidos lesados por trauma, doenças congênitas e degenerativas, e câncer, é

um dos maiores desafios atuais na pesquisa em ortopedia e traumatologia.

Introdução

Enxertos ósseos de vários tipos (autólogos, homólogos, próteses) podem ser

utilizados para a reconstrução de defeitos esqueléticos, cada um deles

apresentando vantagens e desvantagens (Niemeyer et al. 2006). Entretanto, as

propriedades osteocondutoras, osteoindutoras e osteogênicas estão presentes

apenas pela combinação de biomateriais artificiais com propriedades

osteocondutoras com células osteogênicas viáveis, como osteócitos e

progenitores mesenquimais. Neste sentido, CTM autólogas têm sido utilizadas

em conjunto com matrizes reabsorvíveis para a reconstituição de lesões

ósseas. Em modelos caninos, de coelhos e de ovelhas, a regeneração de

defeitos ósseos foi muito melhor nos grupos que receberam a matriz

colonizada com CTM, do que nos grupos que receberam somente a matriz

(Bruder et al. 1998a, Bruder et al. 1998b, Perka et al. 2000, Quarto et al. 2001).

A origem do novo osso formado nesses modelos é uma questão controversa:

enquanto alguns grupos sugerem que as CTM se diferenciam diretamente em

precursores osteogênicos, que formam posteriormente osteócitos maduros que

induzem a formação de novo osso (Pittenger et al. 1999), Bianco e Robey

sugerem que, em resposta a estímulos locais e sistêmicos (por exemplo,

fraturas), CTM se diferenciam em osteoprogenitores que formam matriz

extracelular (Bianco & Robey 2000). Tal matriz fornece as condições

ambientais osteogênicas ideais para que osteoblastos locais migrem e formem

osso novo. Independentemente do mecanismo biológico, o fato é que

resultados em modelos animais de diferentes grupos apontam para melhor

cicatrização óssea na presença das CTM (Niemeyer et al. 2006). Embora os

resultados desses estudos sejam bem promissores, ainda não existem relatos

Introdução

clínicos confiáveis desse tipo de tratamento na reconstrução óssea em

pacientes humanos (Petite et al. 2000).

Comparada ao osso, a cartilagem possui uma menor capacidade de

regeneração, devido à avascularidade e à acelularidade do tecido. Defeitos da

cartilagem articular podem levar à osteoartrtite e à perda da função da

articulação. Enquanto o transplante de condrócitos autólogos pode predispor a

articulação à osteoartrite, devido à retirada de tecido sadio da região, a

utilização de CTM autólogas derivadas de biópsias da medula óssea surge

como uma promissora opção terapêutica. Defeitos da cartilagem do côndilo

femoral de um modelo canino foram tratados com sucesso pelo transplante de

CTM autólogas em gel de colágeno (Wakitani et al. 1994). Em um modelo

caprino de osteoartrite, Murphy e colaboradores (2003) mostraram que a

injeção direta de CTM autólogas na região intra-articular potencializou a

regeneração do menisco medial. A terapia com CTM alogeneicas foi bem-

sucedida na prevenção do dano tecidual em um modelo de artrite induzida por

colágeno (Augello et al. 2007). Em humanos, o potencial do transplante de

CTM autólogas para o tratamento de lesões de cartilagem foi testado com

sucesso. Pacientes com defeitos no côndilo femoral medial receberam CTM

autólogas, com melhores resultados clínicos que o grupo controle (Wakitani et

al. 2002). Em um relato de caso recente, Centeno e colaboradores mostraram

que o transplante de CTM autólogas resultou no aumento do volume da

cartilagem do menisco (Centeno et al. 2008). Embora esses resultados sejam

bastante promissores, diversos problemas técnicos e biológicos têm sido

observados, como a formação de condrócitos hipertróficos a partir das CTM e a

migração das CTM no osso subcondral, e mais estudos ainda são necessários

Introdução

para desenvolver métodos e biomateriais funcionais para o controle da

diferenciação condrogênica e de sua incorporação nas camadas mais

profundas que margeiam o osso.

O grupo liderado por Horwitz fez avanços significativos na utilização de

progenitores mesenquimais para o tratamento da osteogenesis imperfecta (OI),

desordem genética das células mesenquimais caracterizada pela expressão de

uma forma defeituosa do colágeno tipo I. Os pacientes com OI severa

apresentam numerosas fraturas, deformidades esqueléticas progressivas e

crescimento ósseo retardado. Primeiro, o grupo demonstrou o potencial

terapêutico do transplante alogenêico de medula óssea convencional em

crianças com osteogenesis imperfecta (Horwitz et al. 1999, 2001). Embora em

curto prazo este procedimento tenha resultado em significativa melhora no

quadro dos pacientes transplantados, como formação de nova massa óssea,

aumento na taxa de crescimento e redução na freqüência de fraturas, em longo

prazo esses parâmetros voltaram aos níveis de antes do transplante.

Posteriormente, o mesmo grupo infundiu CTM isoladas da medula óssea de

doadores alogenêicos, em crianças com OI severa que haviam sido

submetidas anteriormente a transplante alogenêico de medula óssea (Horwitz

et al. 2002). O principal achado desse trabalho foi a demonstração da presença

de células diferenciadas derivadas das CTM infundidas no osso, no estroma

medular e na pele, uma vez que elas haviam sido marcadas por transdução de

retrovírus contendo o gene de resistência a Neomicina. Esses resultados

indicam que CTM alogenêicas administradas em crianças com OI severa

podem ser incorporadas em ossos geneticamente defeituosos e se diferenciar

Introdução

em osteoblastos capazes de estender os benefícios clínicos gerados pelo

transplante de medula óssea. Apesar dos resultados promissores, o

desenvolvimento de protocolos clínicos efetivos para o tratamento da OI ainda

não é uma realidade.

Devido à não existência de modalidades terapêuticas efetivas para o

tratamento de lesões do sistema nervoso central, causadas por trauma ou por

doenças neurodegenerativas, a utilização de terapias celulares surge como

uma alternativa para essas patologias. Vários estudos demonstram que o

transplante de CTM resulta em melhora clínica em modelos animais de

isquemia cerebral e de lesões da medula espinhal (Li et al. 2005), embora os

mecanismos envolvidos ainda não estejam definidos. Substituição celular,

liberação de fatores tróficos, e imunomodulação estão entre os possíveis

mecanismos (Kan et al. 2007). Estudos pré-clínicos em um modelo murino de

esclerose lateral amiotrófica, o camundongo SOD1-G93A (Zhao et al. 2007,

Vercelli et al. 2008) mostraram aumento na sobrevida e retardo no

desenvolvimento da doença nos animais que receberam injeção intravenosa de

CTM. Mazzini e colaboradores conduziram um estudo piloto com a

administração intra-espinhal de CTM derivadas da medula óssea em um

pequeno grupo de pacientes portadores dessa doença, que foram

acompanhados por 4 anos (Mazzini et al.2008). Os resultados foram

promissores, mas estão sendo repetidos em um estudo clínico de fase 1 com

maior número de pacientes.

Introdução

TERAPIAS CELULARES ASSOCIADAS AO TRANSPLANTE DE MEDULA ÓSSEA

Tem sido demonstrado na literatura que as CTM facilitam o crescimento

de células hematopoéticas em sistemas in vitro (Mourcin et al. 2005, Li et al.

2007) e em modelos animais. O cotransplante de CTM e CTH humanas

(células CD34+) em fetos de ovelha (Almeida-Porada et al. 1999, 2000) e em

camundongos NOD/SCID (Angelopoulou et al. 2003, in’t Anker et al. 2003,

Bensidhoum et al. 2004) foi capaz de induzir uma “pega” mais eficiente do que

o transplante isolado de células CD34+ humanas, ou seja, um menor número de

células CD34+ foi necessário para um transplante eficiente quando CTM eram

também injetadas. Esses estudos forneceram o racional para a utilização das

CTM em ensaios clínicos de terapias celulares associadas ao transplante de

CTH, com o objetivo de melhorar a reconstituição hematológica dos pacientes.

Após demonstrar, em um estudo piloto (Lazarus et al. 1995), a segurança da

infusão em pacientes de CTM autólogas expandidas in vitro, Koç e

colaboradores (2000) mostraram, num grupo de 28 pacientes com câncer de

mama submetidos à quimioterapia e transplante de células progenitoras do

sangue periférico que a infusão de CTM é factível e parece ter um impacto

positivo na hematopoese, com ausência de efeitos adversos significativos. Em

um ensaio subseqüente com 46 pacientes, a infusão de CTM foi bem tolerada

e o tratamento resultou na melhora da recuperação hematopoética na maioria

dos pacientes (Lazarus et al. 2005).

O transplante de CTH evoluiu nos últimos 30 anos em uma terapia efetiva

para doenças malignas hematológicas e desordens hereditárias ou adquiridas

do sistema hematológico/imune. Após submeterem-se a um regime de

condicionamento mieloablativo para combater a doença hematológica, os

Introdução

pacientes dessas desordens recebem uma infusão de células da medula

óssea, ou de CTH mobilizadas do sangue periférico provenientes do doador

(transplante de CTH), com o objetivo de reconstituir seu sistema

hematopoético. Em desordens malignas, a reconstituição da imunidade de

células T (provenientes do doador) tem um potente efeito antitumoral (ECL),

mas resulta também em um ataque aos tecidos do receptor, levando ao

desenvolvimento da DECH. A eficácia do transplante depende do balanço

desses dois efeitos, o que é bastante complicado, e a DECH atualmente é a

maior causa de morbidade em pacientes submetidos ao transplante de medula

óssea (Bolaños-Meade 2008).

As propriedades imunomodulatórias observadas in vitro geraram um

grande interesse na aplicação das CTM como uma nova terapia

imunossupressora para a DECH. Em modelos animais de TCTH alogeneico,

porém, não há consenso quanto ao potencial imunossupressor das CTM.

Alguns trabalhos demonstraram que a infusão de CTM foi eficaz na prevenção

da DECH, levando a um aumento na sobrevivência de camundongos que

receberam transplante de doador totalmente incompatível (Chung et al. 2004).

Ainda, a injeção subcutânea de células de melanoma B16 levou ao

crescimento de tumor em animais apenas quando CTM foram co-injetadas

(Djouad et al. 2003), o que poderia ser atribuído à diminuição do efeito ECL

devido à imunossupressão exercida pelas CTM. Em outros trabalhos, os

resultados obtidos foram opostos, o que tem levado à controvérsia a respeito

do potencial imunomodulatório das CTM em modelos animais. Eliopoulos et al.

(2005) e Nauta et al. (2006) mostraram que CTM alogeneicas são

imunogênicas e capazes de sofrer rejeição em camundongos

Introdução

imunocompetentes. Usando um modelo animal de DECH, Min et al. (2007)

mostraram que CTM foram capazes de atenuar a severidade da doença

apenas quando as células haviam sido transduzidas para expressar

constitutivamente a citocina antiinflamatória Il-10. Sudres et al. (2006)

mostraram que células capazes de suprimir a proliferação de linfócitos in vitro

falharam na prevenção da DECH em camundongos submetidos ao TCTH,

enquanto Tisato et al. (2007) mostraram ainda que CTM derivadas de sangue

do cordão umbilical podem previnir a GVHD, mas não são capazes de tratar a

doença.

A despeito da ausência de dados pré-clínicos consistentes, a utilização de

CTM na clínica tem evoluído rapidamente como um novo tratamento para a

DECH, em particular para a DECH refratária a esteróides. Neste contexto, o

primeiro trabalho a mostrar o uso clínico de CTM para o tratamento da DECH

foi desenvolvido pelo grupo de Le Blanc, em 2004, e tornou-se um marco para

os grupos que trabalham com aplicação clínica das CTM. Após infusão

intravenosa de CTM provenientes de sua mãe, um paciente com leucemia

linfoblástica aguda, que havia sido submetido a transplante alogenêico de CTH,

apresentou significativa melhora clínica e foi o único a sobreviver (1 ano após o

transplante) de um grupo de 25 pacientes que desenvolveram DECH (Le Blanc

et al. 2004b). Em 2006, Ringden e colaboradores mostraram a melhora na

DECH aguda refratária a esteróides na maioria dos pacientes submetidos ao

transplante após receber infusão de CTM (Ringden et al. 2006). Um ensaio

clínico de fase II foi desenhado para observar a toxicidade e segurança do

tratamento com CTM para DECH aguda refratária, e recentemente publicado

(Le Blanc et al. 2008). Trinta e nove de 55 pacientes com DECH aguda severa

Introdução

e resistente a esteróides responderam ao tratamento com CTM, com maiores

taxas de sobrevivência e menores de mortalidade relacionada ao transplante.

Conforme demonstrado nesses e em outros estudos, o grande potencial

das CTM como terapia celular para o tratamento de várias doenças, em

particular nas terapias associadas ao transplante de medula óssea, é atribuído

em grande parte às suas propriedades in vitro, tais como potencial

imunomodulatório, efeitos parácrinos sobre células e progenitores

indiferenciados, seu próprio potencial de diferenciação, e possível efeito

angiogênico.

O potencial terapêutico das CTM começou a ser utilizado há

aproximadamente duas décadas, após as descobertas de Friedenstein e

colaboradores, quando empresas de biotecnologia começaram a explorar este

potencial (Bianco et al. 2006). Apesar de controvérsias nos estudos em

modelos animais, e do pouco entendimento acerca dos mecanismos pelos

quais elas exercem seus efeitos, as CTM têm sido empregadas em grandes

ensaios clínicos no mundo inteiro, com alguns resultados bastante

promissores. Tal paradoxo assemelha-se ao que ocorreu com o medicamento

aspirina (ácido acetilsalicílico), que é utilizado há mais de 100 anos como uma

das mais potentes drogas antiinflamatórias, antipiréticas e analgésicas do

mercado, apesar de seu mecanismo de ação só ter sido desvendado 70 anos

depois que a droga foi lançada no mercado (Giordano et al. 2007).

Nesse contexto, estudos de caracterização molecular, em particular os de

larga escala, podem fornecer pistas importantes sobre seus mecanismos de

Introdução

ação terapêutica, possíveis efeitos adversos, além da influência de seu

isolamento e cultivo ex vivo sobre suas características essenciais.

Objetivos

OBJETIVOS

Tendo em vista a variação de resultados obtidos na literatura em relação

à biologia básica e às propriedades in vitro e in vivo das CTM, estudos de

caracterização molecular, em particular os de larga escala, podem fornecer

pistas importantes sobre seus mecanismos de ação terapêutica, possíveis

efeitos adversos, além da influência de seu isolamento e cultivo ex vivo sobre

suas características essenciais. Assim, os objetivos dessa tese estão descritos

a seguir.

OBJETIVO GERAL

� Caracterizar molecularmente culturas de CTM humanas estabelecidas a

partir de amostras da medula óssea de doadores de CTH no CEntro de

Transplante de Medula Óssea (CEMO) / Instituto Nacional de Câncer

(INCa).

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

� Estabelecer protocolo para o isolamento e cultivo de CTM a partir de

amostras da medula óssea de doadores de CTH;

� Caracterizar as culturas como CTM;

� Identificar características moleculares importantes, através de estudos

proteômicos, para sua utilização em terapias celulares associadas ao

Transplante de Medula Óssea (TMO).

Metodologia

METODOLOGIA

1. ISOLAMENTO E CULTIVO DE CTM

Esse projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa do INCa

(processo CEP INCa n°034/06) e todo material foi utilizado após assinatura por

parte dos doadores de medula óssea de um Termo de Consentimento Livre e

Esclarecido.

Amostras de medula óssea de doadores do CEMO, obtidas por aspiração

da crista ilíaca posterior em Cloreto de Sódio 0,9% com 10U/mL de heparina,

foram processadas para o cultivo in vitro de Células MonoNucleares (CMN)

aderentes: 5-10mL do aspirado foram primeiro diluídos em igual volume de

soro fisiológico (Cloreto de Sódio 0,9%); essa suspensão foi adicionada

cuidadosamente sobre cerca de 5-10mL de Ficoll-PaqueTM Plus, 1,077g/L

(Amersham Biosciences, Suécia); após centrifugação a 500g por 30 minutos a

10oC, as CMN foram removidas da interface do gradiente e lavadas 2 vezes em

soro fisiológico.

Para determinação da densidade inicial de plaqueamento das CMN da

medula óssea, elas foram distribuídas em poços de 9cm2 em sucessivas

densidades (2x103 células/cm2, 2x104 células/cm2, 2x105 células/cm2 e 2x106

células/cm2), em meio DMEM com baixa glicose (Dulbecco’s Modified Eagle’s

Medium, Invitrogen, EUA), 100U/mL de penicilina, 100µg/mL de estreptomicina,

2mM de glutamina e 15% de soro bovino fetal - SBF (meio CTM), e incubadas

em estufa a 37oC e 5% de CO2. Após vinte e quatro horas, as culturas foram

lavadas 2 vezes em PBS 1x (Phosphate Buffer Saline, KCl 2,7mM, K3PO3

1,8mM, NaCl 137mM, Na3PO3 10,1mM) para remoção das células não

Metodologia

aderentes. Após 13 dias de cultivo, as células foram lavadas em PBS 1x,

fixadas em metanol, e coradas em Giemsa (KaryoMAX Giemsa Stain improved

R66 solution “Gurr”, GibcoBRL/Invitrogen, EUA). O número de colônias obtidas

foi contado a olho nu, e comparado entre as diversas concentrações iniciais de

células. Este número foi correlacionado ao número de UFC-F presentes na

amostra de medula óssea.

Determinada a densidade inicial de plaqueamento para o estabelecimento

das culturas de CTM, as amostras de células da medula óssea passaram a ser

distribuídas em garrafas de 25cm2, na concentração de 2 x 105 células/cm2.

Quando atingiam 80% da confluência, as culturas eram submetidas a uma

solução de tripsina 0,05%-ácido etileno diamino tetraacético 0.53mM (Ethylene

Dyamin Tetracetic Acid, EDTA) (InVitrogen, EUA), para que as células

aderentes se soltassem da placa, e fossem distribuídas em novas

placas/garrafas, na proporção de 500-1000 células/cm2 (passagem 1).

2. CARACTERIZAÇÃO DAS CULTURAS DE CTM

2.1 Análise ao Microscópio Ótico

As culturas foram rotineiramente observadas em microscópio invertido de

contraste de fase (Zeiss, Alemanha). Para uma análise morfológica mais

detalhada, as células foram coradas em Giemsa após lavagem em PBS 1x e

fixação em metanol 100%.

2.2 Análise de Marcadores de Superfície

A caracterização dos marcadores de superfície das CTM foi realizada

através de ensaios de citometria de fluxo. A uma suspensão de 1 x 106 células,

Metodologia

obtidas após tripsinização de culturas de CTM, foram adicionados anticorpos

conjugados aos fluorocromos FITC, PE e Cy5-FITC. As células foram

analisadas em um citômetro de fluxo Fluorescence Activated Cell Analyser

(FACScan, Becton Dickson, EUA) e o software CELLQuestTM (Becton

Dickson, EUA). Células positivas foram identificadas por comparação com

controles isotípicos. Os anticorpos utilizados reconhecem os seguintes

marcadores de superfície: CD45, CD34 e HLA-DR.

2.3 Ensaios de diferenciação in vitro

O potencial de diferenciação das CTM foi testado em várias passagens

das culturas, começando pela passagem 1. Foram realizados ensaios para a

diferenciação adipogênica e osteogênica, utilizando-se protocolos específicos

para cada caso.

2.3.1 Diferenciação Osteogênica

Cerca de 104 células foram cultivadas em poços de 9cm2 em meio

osteogênico (DMEM, 10% SBF, 0,01µM dexametasona, 10mM β-glicerol

fosfato, 0,2mM ácido ascórbico), por no mínimo 3 semanas, com troca de meio

2 vezes por semana.

A diferenciação das células mesenquimais foi detectada pela observação

de depósitos de Cálcio nas culturas, através da coloração com Vermelho de

Alizarina pH4,2 por 5 minutos a temperatura ambiente.

2.3.2 Diferenciação Adipogênica

Metodologia

Cerca de 104 células foram cultivadas em poços de 9cm2 em meio

adipogênico (DMEM em 10%SBF, 0,01µM dexametasona, 5µg/mL insulina) de

2 a 3 semanas, com troca de meio 2 vezes por semana.

O fenótipo adipogênico das culturas foi confirmado pela presença de

gotículas de gordura, após fixação das células em PFA (ParaFormAldeído) 4%

por 1 hora e coloração com corante Oil Red O em isopropanol por 5 minutos.

3. CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR

3.1 Análise da Expressão Gênica

3.1.1 Extração de mRNA (messenger RiboNucleotidic Acid)

Culturas de CTM foram submetidas a uma solução de tripsina 0,05%-

EDTA, para individualização das células, que foram posteriormente lavadas em

PBS 1X por 2 vezes e adicionadas a 1mL de Trizol (Invitrogen, EUA), na

proporção de 106 células/mL de Trizol. Após homogeneização, as células foram

centrifugadas por 10 minutos a 12.000g a 4°C, e o sobrenadante foi recuperado

em um tubo novo. Ao sobrenadante foram adicionados 200µL de clorofórmio

para cada 1mL de Trizol, e em seguida a solução foi misturada vigorosamente

por 15 segundos e incubada por 2 a 3 minutos a temperatura ambiente. O tubo

foi então centrifugado por 15 minutos a 12.000g a 4°C, e a fase aquosa do

sobrenadante foi recuperada em um tubo novo. Foram adicionados então

500µL de isopropanol para cada 1mL de Trizol, e a mistura incubada por 10

minutos a temperatura ambiente. Após a incubação, o material foi centrifugado

por 10 minutos a 12.000g a 4°C e o sobrenadante descartado. O sedimento foi

lavado com 1mL de etanol 75% e submetido à agitação vigorosa em vórtex GV

Lab (Gilson, Inglaterra), sendo centrifugado por 5 minutos a 7.500g a 4°C, e o

Metodologia

sobrenadante descartado. O sedimento foi ressuspendido em 20µL de água

tratada com DiEtil PiroCarbonato (DEPC) e guardado a -70°C. Para a

quantificação da massa de RNA extraída das culturas, foi realizada análise em

espectrofotômetro Nanodrop ND-100 (Thermo Scientific, EUA) a 260nm. A

avaliação da qualidade do RNA foi realizada através de eletroforese em gel de

agarose 0,8%.

3.1.2 Desenho dos iniciadores

Os iniciadores utilizados para análise da expressão gênica por PCR

(Polymerase Chain Reaction) foram desenhados de acordo com instruções

contidas no manual do Power SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR

(Applied Biosystems, EUA), com auxílio da ferramenta disponível on-line na

página da IDT (Integrated DNA Technologies - www.idt.org). As seqüências dos

RNAm foram obtidas no banco de dados do genoma humano

(www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide). A especificidade dos oligonucleotídeos

foram determinadas previamente in silico diante de sua similaridade aos dados

de RNAm humanos através da ferramenta BLAST (Basic Local Alignment

Search Tool) / HumanGenome (www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Na Tabela 1,

está o resumo dos iniciadores usados.

Tabela 1: Oligonucleotídeos (iniciadores) utilizados para amplificação por PCR Nome Sequência No acesso GenBank

BMPR1A 5’-CGAAGTGCTGGACGAAAGCCT

5’-TTGACACACACAACCTCACGCA

NM_004329+2

CD44 5’-AGACCCACTCAGCCAAATCT

5’-CTTTCACAGGAGAGAACAGGTG

NM_000610+3

Metodologia

SCF 5’-ATGCAAATGGTTGCCTGGTCCC

5’TGCCAATGTCCTTCTTGGCAGA

NM_003994+4

Runx2 5’-CCTTGACCATAACCGTCTTCA

5’-ATGCGCCCTAAATCACTGHAG

NM_004348+4

LPL 5’-GGGCATGTTGACATTTACCC

5’-TGGAACTGCACCTGTAGGC

NM_000237+2

3.1.3 Síntese de cDNA (complementary DeoxyNucleotidic Acid, transcrição

reversa)

Para a síntese do cDNA foram utilizados 1µg de RNA, 250ng de Oligo

DT primer (Invitrogen, EUA), 10mM de dNTPs (10mM de dATP, 10mM de

dCTP, 10mM de dTTP e 10mM de dGTP, Invitrogen, EUA) e água MiliQ para

completar um volume final de 12µL. A reação foi incubada por 5 minutos a

65°C e mantida no gelo. Posteriormente, foram adicionados 4µL de tampão 5x,

2 µL de DTT (DiThioThreitol) e 1µL de inibidor de ribonuclease RNAguard (GE

Healthcare, Suécia), completando um volume final de 19µL. A reação foi

misturada gentilmente, e incubada por 2 minutos a 42oC. Após a incubação,

foram adicionadas 200 unidades da enzima Superscript II RT (Invitrogen, EUA),

completando o volume final para 20µL, e a reação foi incubada por 50 minutos

a 42 °C, e por 15 minutos a 70°C, e estocada a -20 °C.

3.1.4 Amplificação do cDNA por PCR em Tempo Real

Inicialmente, foram realizadas reações testes para a determinação das

condições ideais do ensaio (curva padrão e curva de dissociação), onde foram

utilizadas quantidades sucessivas de cDNA (50ng, 20ng, 5ng, 500pg), 2µM de

Metodologia

cada oligo específicos (senso e anti-senso) e 1X Power SYBR Green PCR

Master Mix (Applied Biosystems, EUA) em 20µL de reação. As reações para

análise por PCR em tempo real foram submetidas à incubação inicial no

termociclador (RotorGene RG-3000, Corbett, Austrália) de 95°C por 10min, e

por 50 ciclos de 95°C por 20s e 60°C por 1min. Como normalizador da

amplificação, foram utilizados oligonucleotídeos específicos para o gene da ββββ-2

Microglobulina (ββββ2M) humana (3 e 0,5 uM de cada iniciador). As alterações nos

níveis de MRNA foram calculadas pelo método baseado na curva padrão de

amplificação dos genes em questão. A quantidade de MRNA dos pontos

experimentais foi calculado com auxilio da equação da reta obtida da curva

padrão. Em seguida, os resultados foram normalizados pelos níveis de MRNA

de β2M. A diferença dos níveis de MRNA entre as condições experimentais foi

calculada em relação a uma amostra calibradora, estabelecida de acordo com

cada questão experimental.

3.2 Análise Proteômica

3.2.1 Preparação de extratos protéicos totais

Culturas de CTM foram tripsinizadas e lavadas três vezes em PBS (1X)

Após serem ressuspensas em Tampão de Extração de Proteínas a 4oC [50mM

de Tris pH7.5, 5mM EDTA, 10mM ácido etileno glicol tetraacético (Ethylene

Glycol Tetracetic Acid, EGTA), 50mM fluoreto de sódio (NaF) 20mM β-

Glicerolfosfato, 250mM cloreto de sódio (NaCl), 0.1% de Triton X-100, 20Mm

ortovanadato de sódio, e mix de inibidores de protease (2,4µg/mL 4-(2-

aminoetil) benzenosulfonil fluoreto hidrocloreto, 0,1µg/mL bestatina,

0,1µg/mLpepstatina, 0,1 µg/mL leupeptina, 1,8µg/mL E-64, Calbiochem, EUA],

Metodologia

as células foram incubadas durante trinta minutos a 4°C e centrifugadas a

12.000g por 30 minutos. O sobrenadante foi retirado e utilizado como extrato

total de proteínas. Após a clarificação dos extratos, estes foram quantificados e

armazenados a -70°C.

Para a análise proteômica das células após diferenciação, 103

células/cm2 na passagem 3 foram cultivadas em meio osteogênico (DMEM,

10% SBF, 0,01µM dexametasona, 10mM β-glicerol fosfato, 0,2mM ácido

ascórbico), ou adipogênico (DMEM em 10%SBF, 0,01µM dexametasona,

5µg/mL insulina) durante 3 semanas, sendo então tripsinizadas e submetidas

ao mesmo procedimento descrito acima. Concomitantemente, amostras das

mesmas células eram submetidas à diferenciação em poços de 9cm2

(conforme descrito no item 2.2.1), e o fenótipo diferenciado era evidenciado

como anteriormente.

3.2.2 Quantificação dos extratos protéicos

Os extratos protéicos foram quantificados segundo o método de Bradford

(1976), que se baseia na interação entre o corante Coomassie Brilliant G-250 e

macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos com cadeias laterais

básicas ou aromáticas, o que altera a coloração da amostra. Após a construção

da curva padrão de proteínas, obtida pela medida da densidade ótica de

soluções de concentrações conhecidas de Albumina Sérica Bovina (Bovine

Serum Albumin, BSA) e reagente de Bradford (0,01% Coomassie Brilliant G-

250, 4,75% Etanol e 8,5% Ácido Fosfórico), a concentração dos extratos

protéicos foi determinada.

Metodologia

3.2.3 Análise da integridade das proteínas no extrato

Para análise da integridade e qualidade dos extratos protéicos, 15 µg de

cada extrato foram submetidos à eletroforese unidimensional em gel de

poliacrilamida SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel

Electrophoresis) 10%, submerso em tampão de corrida (250 mM Tris-base,

192mM Glicina). Os géis foram corados em 0,1% Coomassie Blue R-250, 30%

Etanol e 0,5% Ácido Acético, descorados por 15 minutos em solução

descorante (25% Metanol e 5% Ácido Acético) e secos em solução de secagem

(30% Metanol e 3% Glicerol) por 15 minutos.

3.2.4 Eletroforese Bidimensional

IsoEletroFocalização IEF (PRIMEIRA DIMENSÃO)

Os extratos foram inicialmente precipitados com o kit 2D Clean up (GE

Healthcare, Suécia) e ressuspendidos em 200µL de tampão de reidratação. As

análises iniciais foram realizadas com tampão de reidratação 1 [8M uréia, 15mM

DiTiTreitol (DTT), 2% NP40, 0,5% tampão IPG pH 3-10, GE Healthcare, Suécia,

e traços de azul de bromofenol]. Outras análises foram realizadas com tampão

de reidratação 2 [6M uréia, 2M tiouréia, 15mM DTT, 2% ASB14, 0,5% tampão

IPG pH 3-10, e traços de azul de bromofenol]. Após dissolução no tampão, as

proteínas foram reidratadas a 40V, em tiras cilíndricas de poliacrilamida com

gradientes lineares de pH 4 a 7 com 11cm de comprimento, Immobiline DryStrip

(GE Healthcare, Suécia). A focalização foi realizada, no sistema Ettan IPGphor

II (GE Healthcare, Suécia), em um total de 30550VhT.

Metodologia

Eletroforese SDS-PAGE (SEGUNDA DIMENSÃO)

Após a primeira dimensão, as tiras foram equilibradas por 15 minutos

em tampão de equilíbrio (6M uréia, 30% glicerol, 2% SDS em tampão 0,05M

Tris-HCl pH 8,8, e traços de azul de bromofenol) contendo 100mg de DTT, e

incubadas por mais 15 minutos em tampão de equilíbrio contendo 250mg de

iodocetamida. As tiras foram submetidas a uma eletroforese desnaturante em

gel de gradiente de 8 a 18% de poliacrilamida (ExcelGel SDS 8-18%, GE

Healthcare, Suécia), utilizando-se o sistema Multiphor II (GE Healthcare,

Suécia), durante 1hora e 50 minutos, contendo 10µL de padrão de peso

molecular Benchmark (Invitrogen, EUA). As proteínas separadas na primeira

dimensão (por unidade de pH, que corresponde ao seu ponto Isoelétrico, pI)

foram então separadas por peso molecular, podendo ser identificadas em um

eixo cartesiano. Os géis preparativos foram corados em Comassie Blue

colloidal (2% Comassie Blue G-250, Sigma-Aldrich, EUA) por 72 horas e

descorados em água destilada.

3.2.5 Análise dos Padrões Proteômicos

Após a eletroforese bidimensional os géis foram escaneados utilizando

o software LabScan, analisados e comparados no software Image Master 2D

Platinum 6.0 (GE Healthcare, Suécia). Os pI foram determinados utilizando-se

uma distribuição linear de 4-7, e o peso molecular foi determinado baseando-se

no padrão Benchmark (Invitrogen, EUA), o que gerou uma curva logarítmica. Os

spots visualizados em cada gel foram comparados e tiveram seus volumes

normalizados. A intensidade de cada spot foi quantificada pelo cálculo do

volume do spot após normalização da imagem utilizando-se o método de

Metodologia

normalização do volume total do spot multiplicado pela área total de todos os

spots. Foram então geradas comparações qualitativas e quantitativas entre as

diferentes amostras. Para garantir a confiabilidade dos dados, apenas spots

apresentando diferenças maiores que 2x foram considerados diferencialmente

expressos.

Após esta análise, os spots proteicos de cada amostra foram retirados

para identificação, sendo transferidos individualmente para microtubos

siliconizados de 1500µL, e lavados em 50% de ACetoNitrila (ACN) / 25mM de

bicarbonato de amônio (NH4HCO3) pH 8.0 durante 30 minutos, até ficarem

completamente descorados. Os spots foram então desidratados em ACN 100%

por 10 minutos, e completamente secos a temperatura ambiente.

3.2.6 Espectrometria de Massas

Os spots selecionados para identificação foram digeridos pelo método

InGel Digest. Após a desidratação e secagem, os spots foram reidratados a 4oC

em tampão de digestão (25 mM NH4HCO3 pH 8.0) contendo 15 ng/µL de

tripsina (Sequence Grade Modified Trypsin, Porcine – Promega, EUA), e

incubados por 12 horas a 37°C. Os peptídeos gerados foram então extraídos do

gel com 50% de ACN/5% de Ácido Trifluoroacético (TriFluoroacetic Acid, TFA).

Os extratos digeridos foram concentrados em um concentrador Hetovac

(HetoLab Equipment, Dinamarca), e posteriormente redissolvidos em 3µL de

50% de ACN/1% de TFA.

Para as análises por espectrometria de massas, 0,5µL de cada amostra

foram misturados a 0,5 µL de matriz α-ciano recristalizada (10mg/mL em 50%

ACN e 0,1% TFA, Sigma-Aldrich, EUA), e aplicados em uma placa de MALDI,

juntamente com os calibrantes do kit Sequazyme Peptide Mass Standards

Metodologia

(Perseptive Biosystems, EUA). Os espectros foram adquiridos em um

espectrômetro MALDI-TOF-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization –

Time Of Flight - Time Of Flight) 4700 (Applied Biosystems, EUA), no modo

refletor de íons positivos. Os espectros de massas foram analisados por

fingerprinting das massas dos peptídeos gerados (MS) e confirmados pelo

perfil de fragmentação dos peptídeos (MS/MS) (Figura 1). Foram analisados

peptídeos de 800 a 4000Da. Os espectros adquiridos permitiram a identificação

das proteínas através do programa Mascot Daemon searching engine (Matrix

Science, EUA) contra a base de dados de sequências proteicas International

Protein Index (IPI, versão 3.12). Os parâmetros de busca para MS e MS/MS

foram 0,2Da, e os critérios para identificação positiva de proteínas foram um

mínimo de 2 peptídeos com score peptídico no Mascot ≥ 20.

Figura 1: Esquema de funcionamento do espectrômetro MALDI-TOF-TOF. O extrato de peptídeos gerado pela digestão in gel de cada proteína (1), após ser misturado com matriz de ácido forte (α-ciano), foi ionizado com laser (2). Os íons voam em um tubo a vácuo e o tempo de chegada de cada íon à placa detectora gera um espectro. Os espectros foram analisados por fingerprinting das massas dos peptídeos gerados (MS) e confirmados pela sequenciamento dos peptídeos (MS/MS) (3) (Modificado de Aebersold & Mann, 2003).

Metodologia

4. ANÁLISE DO POTENCIAL IMUNOSSUPRESSOR IN VITRO

Para testar a capacidade de culturas de CTM de inibir a proliferação de

linfócitos em resposta à estimulação por aloantígenos, foram realizadas

Culturas Mistas de Linfócitos (CML), que consistiram na estimulação de CMN

com CMN alogeneicas, na presença ou não de CTM.

Após serem ressuspendidas em meio RPMI completo (RPMI 1640

suplementado com 10% SBF, 2mM L-glutamina, 50U/mL penicilina e 50 µg/ml

estreptomicina), CMN derivadas de sangue periférico de dois doadores

distintos foram denominadas de CMN estimuladoras (CMNe) ou CMN

respondedoras (CMNr). As CMNe foram irradiadas a 2500 cGy e as CMNr

foram marcadas com CFSE (CarboxyFluorescein Succinimidyl Ester) 2,5 µM

por 5 minutos à temperatura ambiente, e a marcação foi interrompida

adicionando-se 5%SBF gelado. Ambas as células, CMNe e CMNr, foram

lavadas em PBS 1x, centrifugadas a 300g por 5 minutos, e ressuspendidas na

concentração de 5x106 células/mL em meio RPMI completo. As culturas foram

feitas em placas de 24 poços, adicionando-se 5x105 CMNr e 5x105 CMNe na

presença ou não de 5x104 CTM (10% CTM), num volume final de 1000µL. As

células foram cultivadas a 37°C em atmosfera de 5% de CO2, durante 7 dias,

sendo posteriormente analisadas por citometria de fluxo. Os dados foram

adquiridos no citômetro de fluxo FACScan (Becton Dickson, EUA) e analisados

com o software CELLQuest (Becton Dickson, EUA) e com teste T-student,

onde valores de P<0,05 foram considerados estatisticamente significativos. As

análises estatísticas e representações gráficas foram realizados através do

software GraphPad PrismTM (GraphPad, EUA).

Metodologia

5. ANÁLISE CITOGENÉTICA

Culturas de CTM em diversas passagens foram cultivadas em garrafas de

25cm2 até 70-80% da confluência. As culturas foram incubadas com 0.05µg/mL

colchicina (Sigma-Aldrich, EUA) por 2 horas a 37oC e 5% CO2., sendo então

tripsinizadas, lavadas em PBS 1X, e o precipitado obtido foi submetido ao

choque hipotônico, utilizando-se solução de 0.075M cloreto de potássio. O

material foi mantido a 37oC por 15 minutos. Em seguida, foi feita fixação com

Solução Carnoy 3:1 (metanol:ácido acético) por 20 min. O material foi

ressuspendido em um pequeno volume de fixador para preparo das lâminas.

Esse procedimento foi feito pingando-se uma gota da suspensão em lâmina e,

em seguida, o material foi corado em corante Giemsa (Merck, EUA) diluído em

tampão fosfato (14,08g/L NaH2PO4 + 13,91g/L Na2HPO4). Uma das lâminas foi

observada em microscopia ótica para verificação do índice mitótico e da

qualidade das metáfases. As outras foram submetidas à técnica de

bandeamento GTG (Seabright 1971). As lâminas foram envelhecidas de 1 a 2

dias. Em seguida, foram incubadas em tripsina 0,1% diluída em solução

Dulbeco pH 7,8 (8g/L NaCl, 200mg/L KCl, 200mg/L KH2PO4, 1,5g/L NaH2PO4)

aquecida a 37°C, em tempos que variaram de um segundo a um minuto.

Posteriormente, as lâminas foram lavadas em solução de soro fisiológico e

coradas em corante Giemsa 2% (Merck, EUA) por 15 minutos.

Os cromossomos foram identificados e classificados de acordo com o

Sistema Internacional de Nomenclatura de Citogenética Humana de 2005

(ISCN, 2005). A análise cromossômica foi realizada em microscopia óptica

utilizando-se no mínimo 20 metáfases por cultura. Foram adquiridas 5

Metodologia

metáfases para a montagem dos cariótipos de cada passagem da cultura,

através do Sistema de Cariotipagem Cytovision (Applied Image, EUA).

Resultados

RESULTADOS

1. Definição do Protocolo de Estabelecimento das Culturas de CTM e sua

Caracterização

A primeira etapa deste trabalho consistiu na determinação das condições

ideais para o cultivo e estabelecimento das culturas de CTM a partir das células

de medula óssea de doadores. Para isso, foram testados alguns protocolos, e o

sucesso no estabelecimento das culturas de CTM foi obtido quando utilizamos

o anel de células mononucleares, DMEM de baixa glicose (1g/L) e 15% de soro

bovino fetal. Aspirados de medula óssea foram obtidos de 41 doadores do sexo

masculino (média de idade de 40,3 anos, variando entre 30 e 59 anos) e 18

doadores do sexo feminino (média de idade de 40,4 anos, variando entre 32 e

47 anos), em um total de 59 amostras. As amostras foram processadas e

colocadas em cultura para obtenção de culturas de CTM. Não foi possível o

obter sucesso no estabelecimento de culturas de CTM de 9 amostras de

medula óssea. Consideramos sucesso no estabelecimento quando as culturas

puderam ser expandidas por mais de 4 passagens, ainda mostrando a mesma

aparência morfológica e potencial proliferativo das passagens iniciais (0 e 1).

Os motivos que levaram ao não sucesso de algumas culturas incluíram

problemas técnicos do laboratório, e somente de 2 amostras, as células na

passagem 0 não proliferaram, o que podemos atribuir à própria quantidade de

CTM presentes na amostra de medula óssea coletada, ou a algum problema no

cultivo que não pudemos determinar.

Resultados

Nesse trabalho, foi adotada a seguinte terminologia: para cada cultura de

CTM (derivada de um doador de medula óssea) foi atribuída uma sigla, CTM

XX, com XX sendo o número da amostra, seguido de PY, com Y

correspondendo à passagem da cultura, por exemplo, CTM14 P1 é a cultura

estabelecida a partir da amostra de medula óssea de número 14, na primeira

passagem, ou seja, após o primeiro repique.

A melhor concentração de células mononucleares para o cultivo primário

foi determinada através da análise de UFC-F obtidas após o plaqueamento de

amostras de células mononucleares em diversas concentrações. Foram

distribuídas concentrações sucessivas de células mononucleares em poços de

9cm2, cultivadas por 13 dias, e o número de colônias obtidas foi avaliado e

comparado. Podemos observar na Figura 2 que as melhores concentrações

variaram de 105 a 106 células/cm2, e a concentração escolhida para o

estabelecimento das culturas foi a de 2 x 105 células/cm2, uma vez que era

suficiente para obtenção não clonal de culturas de CTM (Bianco et al 2006),

que atingiam a confluência após 7 a 10 dias de cultivo.

Figura 2: Determinação da melhor concentração de células mononucleares para o plaqueamento inicial da cultura de CTM.

0

5

10

15

20

25

2 x 10E3 2 x 10E4 2 x 10E5 2 x 10E6 2 x 10E7

CMN plaqueadas / cm2

UF

C-F

Resultados

Outra etapa importante para o cultivo das CTM foi a determinação da

concentração ideal de células para o plaqueamento secundário das culturas,

isto é, qual a quantidade mais adequada para a distribuição em novas placas

de células obtidas da tripsinização de culturas primárias. Pela análise da

literatura e experiência no cultivo das células, estabelecemos o número de 500

a 1.000 células/cm2 como ideal para o plaqueamento secundário das CTM.

Logo após o primeiro repique, a morfologia das culturas passou a ser mais

homogênea, apesar de ainda serem observados alguns tipos celulares

diferentes entre si: células fibroblastóides retas e compridas, células

fibroblastóides com mais de 2 prolongamentos, células com corpo celular mais

espraiado, células arredondadas (Figura 3).

As culturas foram observadas diariamente ao microscópio ótico e

fotografadas (Figura 4). Podemos observar que, na passagem zero (culturas

primárias), havia células de diversos tipos e origens, uma vez que se tratavam

de todas as células mononucleares presentes na medula óssea, tais como

células hematopoéticas, tanto células mais diferenciadas quanto progenitores e

precursores, células de gordura, fibroblastos do estroma, entre outros

elementos presentes no ambiente da medula óssea.

Os resultados iniciais deste trabalho levaram ao desenvolvimento de um

protocolo de estabelecimento de culturas de CTM a partir de células da medula

óssea (Quadro 1), o que constitui uma etapa fundamental para o

desenvolvimento de futuros protocolos terapêuticos utilizando tais células.

Figura 3: Análise ao microscópio ótico de culturas de CTM coradas em May-Grünwald/Giemsa; (A), (B), (C) e (D) CTM 26 P1; (E) e (F) CTM24 P5 (aumento de 100X).

A C B

F E D

Figura 4: Análise ao microscópio ótico de culturas de células mononucleares da medula óssea para o estabelecimento de CTM (CTM16 P0);(A) e (C) 5 dias de cultivo, (B) 8 dias de cultivo; (A e B em aumento de 100X, C em aumento de 200X).

Resultados

Protocolo de Estabelecimento de CTM a partir da medula óssea

� Separar as células mononucleares da amostra de medula óssea, por

extração em Ficoll-HypaqueTM;

� Lavar as células mononucleares em PBS 1x ;

� Distribuir em placas de cultura 2 x 106 células/cm2 em meio DMEM

com baixa glicose (1g/L), 15% de SBF, 2mM de glutamina, 100U/mL de

penicilina e 100µg/mL de estreptomicina (passagem 0); incubar em

estufa a 37oC em 5% de CO2;

� Observar diariamente as culturas, para a presença de células

aderentes;

� Após 12 horas, lavar vigorosamente as culturas em PBS 1x, a fim de

retirar as células não aderidas, e adicionar meio novo;

� Quando as culturas atingirem de 80-90% da confluência (cerca de 7-10

dias após o plaqueamento inicial), submeter as culturas à tripsinização

com solução de tripsina 0,05%-EDTA;

� Distribuir cerca de 500-1000 células/cm2 por placa de cultura

(passagem 1);

� Observar as culturas diariamente, e submetê-las à expansão, ou outros

ensaios específicos, quando a confluência for alcançada. O tempo

médio para o subcultivo é de 7-10 dias. Em passagens posteriores (a

partir da 5 ou 6), o subcultivo deve ser feito utilizando-se acima de

1.000 células/cm2, a fim de otimizar o tempo para confluência, uma vez

que as células parecem ter sua capacidade de proliferação diminuída à

medida em que são subcultivadas (observações feitas durante o

cultivo).

Quadro 1: Protocolo para o estabelecimento e cultivo de CTM a partir de amostras de medula óssea de doadores saudáveis.

Resultados

Devido à ausência de marcadores específicos e ensaios de repopulação

in vivo, a capacidade de uma população em se diferenciar em células da

linhagem adipogênica, osteogênica e condrogênica tem sido utilizada como

ensaio para identificação das CTMs (ensaios funcionais). Neste trabalho,

desenvolvemos protocolos de diferenciação para corroborar a identificação das

células estabelecidas a partir da medula óssea para as linhagens osteogênicas

e adipogênicas, e garantir que nosso protocolo de estabelecimento é confiável.

Na Figura 5, observamos ensaios de diferenciação adipogênica e

osteogênica realizados com células na passagem 1. Em 5A, as células foram

cultivadas em meio indutor adipogênico, suplementado com insulina e

dexametasona, e coradas em Oil Red O, corante que evidencia gotículas de

gordura, acumuladas em células adiposas. Em 5B, pode ser observada a

diferenciação osteogênica das células, após o cultivo em meio suplementado

com dexametasona, β-glicerol fosfato e ácido ascórbico, e demonstração dos

depósitos de Cálcio pela coloração com corante Vermelho de Alizarina. Em 5C,

observamos células cultivadas em meio DMEM + 15% SBF, na ausência de

indutores de diferenciação.

As culturas foram também analisadas por citometria de fluxo para os

marcadores CD34, CD45 e HLADR, que são conhecidos marcadores negativos

de culturas de CTM. Na Figura 6, podemos observar a ausência dos

marcadores hematopoéticos CD34 e CD45, e a baixa expressão de HLA-DR,

em uma das culturas estabelecidas na passagem 3, e esse padrão estava

presente em todas as outras culturas. Esse padrão está de acordo com a

literatura.

Resultados

Figura 5: Diferenciação in vitro de culturas de CTM na passagem 1. A e C) Células cultivadas em meio DMEM baixa glicose + 15% SBF; B) Células cultivadas em meio indutor adipogênico, e coradas em corante Oil Red, evidenciando o acúmulo de gotículas lipidícas; e D) Células cultivadas em meio indutor osteogênico, e coradas em Vermelho de Alizarina, que mostra os depósitos de Cálcio nas células.

Figura 6: Perfil imunofenotípico de uma cultura na passagem 3 (CTM50 P3). Os histogramas mostram a expressão das moléculas CD34, CD45 e HLA-DR (pico vermelho), comparados ao controle isotípico (pico verde). Como podemos observar, as células analisadas não expressam os marcadores negativos CD34 e CD45, e expressam baixos níveis de HLA-DR.

CD34 HLA-DR CD45

M1 M2

A

D C

B

Resultados

2. Caracterização Molecular das Culturas

2.1 Análise Protéica Global

Para a utilização de CTM em protocolos terapêuticos, alguns parâmetros

precisam ser estabelecidos, como por exemplo se células de diferentes

doadores apresentam as mesmas características e podem ser empregadas em

protocolos terapêuticos independentemente da compatibilidade imunológica, ou

se existe uma variabilidade importante entre as células derivadas de diferentes

passagens. Essas definições são necessárias para avaliarmos a equivalência

entre células derivadas de diferentes doadores e até qual passagem uma

cultura poderia ser utilizada em protocolos clínicos, ou se mais de uma

passagem poderia ser utilizada. Nesse trabalho, foi realizado um estudo do

perfil de expressão protéica e de RNA de culturas de CTM, utilizando-se o

proteoma e o PCR em tempo real como ferramentas de análise.

Extratos proteicos totais foram obtidos a partir das células em cultura, e a

quantidade obtida de proteínas foi determinada pelo método de Bradford

(1976). Na figura 7, podemos observar um exemplo de curva padrão (A), e a

análise da integridade das proteínas em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10%

de 2 amostras (B).

Resultados

Figura 7: (A) Curva Padrão de proteína determinada pelo método de Bradford; (B) Gel unidimensional SDS-PAGE 10% de duas amostras de CTM na passagem 1.

Os extratos protéicos foram submetidas à eletroforese bidimensional. Na

primeira dimensão, as amostras foram submetidas à IEF, que é um método

eletroforético que separa as proteínas de acordo com seu pI. Nessa análise, a

primeira dimensão foi realizada em tiras de 11cm de comprimento com

gradientes de pH lineares de 4 a 7.

Posteriormente, as tiras foram submetidas a uma eletroforese em gel de

gradiente de 8 a 18% de poliacrilamida desnaturante, onde as proteínas foram

separadas por peso molecular. Os géis de poliacrilamida foram então

escaneados, e podemos observar na Figura 8, 1 gel bidimensional

representativo de amostras de CTM.

Os spots protéicos separados no gel da segunda dimensão foram então

coletados, descorados e submetidos à digestão tríptica in gel. A mistura de

peptídeos gerados foi então ionizada pela técnica de MALDI, onde feixes de

laser foram incididos sobre os peptídeos imobilizados em uma matriz cristalina,

e analisada por espectrometria de massas. Em nossa análise, foram utilizados

dois analisadores TOF acoplados ao MALDI, o que permitiu a identificação

Curva Padrão de Proteína (BSA) y = 0,0209x

R2 = 0,9961

00,050,1

0,150,2

0,250,3

0,35

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Concentração (ug)

AB

S (

595n

m)

A B

1 2

Resultados

mais específica das proteínas analisadas. As proteínas foram identificadas pelo

mapeamento das massas dos peptídeos gerados (peptide-mass fingerprinting),

e pelo sequenciamento posterior desses peptídeos. Os espectros adquiridos

permitiram a identificação das proteínas através do programa Mascot Daemon

contra a base de dados de sequências protéicas IPI.

Figura 8: Gel bidimensional de proteínas totais extraídas de culturas de CTM na passagem 1. A primeira dimensão foi realizada em tiras de 11cm de comprimento com gradientes de pH lineares de 4 a 7, que foram então submetidas a uma eletroforese em gel de gradiente de 8 a 18% de poliacrilamida desnaturante

Dezoito amostras protéicas foram submetidas à análise proteômica na

primeira etapa deste trabalho. Dos géis bidimensionais, foram obtidos em

média 181±±±±10 spots protéicos por gel, dos quais 132 puderam ser

identificados, e correspondiam a 84 proteínas distintas (vários spots

representam isoformas da mesma proteína). Na Tabela 2, estão listadas as

proteínas identificadas com seus respectivos números de identificação, o

220 KDa

10 KDa

pH 7.0 pH 4.0

Resultados

número no IPI, a razão, que corresponde à média dos volumes normalizados

de cada spot, o peso molecular e o pI teóricos, o score no programa Mascot,

que descreve a significância do resultado na análise, e a porcentagem de

cobertura da sequência identificada em relação à seqüência total da proteína

(Cob).

A identificação dessa lista revelou 40 novas proteínas nunca antes

descritas em análises proteômicas de CTM, permitindo a expansão do perfil

proteômico descrito de CTM (Park et al 2007). Dentre elas, a proteína

Galectina-1, que nunca havia sido descrita em análises proteômicas de CTM

em larga escala, e que tem sido relacionada à prevenção da DECH em

modelos animais (Baum et al 2003).

Resultados

Tabela 2: Proteínas identificadas nas análises de CTM na passagem 1, utilizando tampão de reidratação 1. Razão é a média dos volumes dos spots normalizados, IPI é a identificação na base de dados do IPI, PM é o peso molecular, pI é o ponto isoelétrico da proteína, Sc é o score no programa Mascot, que descreve a significância do resultado na análise, e Cob é a porcentagem de cobertura da sequência identificada.

SPOT RAZÃO IPI NOME DA PROTEÍNA PM

(DA)

PI SC

COB

1 1.341±0.054 IPI00008603 ACTA2 Actin, aortic smooth muscle 42381 5.23 74 10%

2 1.036±0.017 IPI00021439 ACTB Actin, cytoplasmic 1 42052 5.29 245 20%

3 1.128±0.060 IPI00022434 ALB Serum albumin 73753 6.33 68 3%

4 1.41±0.12 IPI00465439 ALDOA Fructose-bisphosphate aldolase A 39851 8.30 100 12%

5 1.14±0.12 IPI00418262 ALDOC Fructose-bisphosphate aldolase C 39830 6.41 68 6%

6 1.372±0.157 IPI00218918 ANXA1 Annexin A1 38918 6.57 138 11%

7 1.689±0256 IPI00418169 ANXA2 annexin A2 isoform 1 40671 8.53 122 16%

8 1.225±0.101 IPI00329801 ANXA5 Annexin A5 35971 4.94 130 8%

9 1.082±0.039 IPI00003815 ARHGDIA Rho GDP-dissociation inhibitor 1 23250 5.02 79 14%

10 1.119±0.056 IPI00412792 BTF3L4 Transcription factor BTF3 homolog 4 17260 5.95 57 5%

11 1.159±0.073 IPI00014516 CALD1 Isoform 1 of Caldesmon 93251 5.63 132 7%

12 1.139±0.050 IPI00075248 CALM1;CALM3;CALM2 Calmodulin 16827 4.09 97 20%

13 1.088±0.014 IPI00020599 CALR Calreticulin precursor 48283 4.29 38 2%

14 1.087±0.032 IPI00014537 CALU Isoform 1 of Calumenin precursor 37198 4.47 155 20%

15 1.011±0.005 IPI00027341 CAPG Macrophage-capping protein 38779 5.88 134 12%

16 1.022±0.011 IPI00297779 CCT2 T-complex protein 1 subunit beta 57794 6.01 40 7%

17 1.061±0.030 IPI00012011 CFL1 Cofilin-1 18719 8.22 90 18%

18 1.850±0.298 IPI00027487 CKM Creatine kinase M-type 43302 6.77 106 11%

19 1.429±0.176 IPI00010896 CLIC1 Chloride intracellular channel protein 1 27248 5.09 47 14%

20 1.225±0.12 PI00219953 CMPK cytidylate kinase 26180 8.14 51 9%

21 1.061±0.029 IPI00011229 CTSD Cathepsin D precursor 45037 6.10 175 13%

22 1.055±0.026 IPI00220503 DCTN2 dynactin 2 44906 5.06 38 7%

23 1.751±0.273 IPI00000760 DDAH2 NG,NG-dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2 29911 5.66 68 12%

24 1.036±0.017 IPI00003269 DKFZp686D0972 hypothetical protein LOC345651 42318 5.39 153 9%

25 0.354±0.144 IPI00024993 ECHS1 Enoyl-CoA hydratase, mitochondrial precursor 31823 8.34 77 11%

26* 2.241±0.382 IPI00376005 EIF5A Isoform 2 of Eukaryotic translation initiation factor 5A-1 20442 6.52 118 25%

27 1.067±0.032 IPI00465248 ENO1 Isoform alpha-enolase of Alpha-enolase 47481 7.01 196 15%

28 1.053±0.026 IPI00013769 ENO1B Alpha-enolase, lung specific 49845 5.78 36 2%

29 1.121±0.057 IPI00216171 ENO2 Gamma-enolase 47581 4.91 112 7%

30 1.262±0.116 IPI00024911 ERP29 Endoplasmic reticulum protein ERp29 precursor 29032 6.77 125 25%

31 1.131±0.077 IPI00219018 GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 36201 8.57 105 8%

32 1.000±0.001 IPI00412987 GMFB Glia maturation factor beta 16874 5.19 60 21%

Resultados

33 1.225±0.120 IPI00219757 GSTP1 Glutathione S-transferase P 23569 5.43 82 12%

34 1.482±0.194 IPI00148063 HEBP1 Heme-binding protein 1 21198 5.71 58 8%

35 1.412±0.170 IPI00013881 HNRPH1 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H 49484 5.89 136 15%

36 1.032±0.015 IPI00003362 HSPA5 HSPA5 protein 72492 5.07 221 11%

37 1.088±0.042 IPI00003865 HSPA8 Isoform 1 of Heat shock cognate 71 kDa protein 71082 5.37 88 6%

38 1.109±0.052 IPI00007765 HSPA9 Stress-70 protein, mitochondrial precursor 73920 5.87 67 7%

39 1.289±0.126 IPI00025512 HSPB1 Heat shock protein beta-1 22826 5.98 256 20%

40 1.326±0.140 IPI00022433 HSPB6 Heat-shock protein beta-6 18886 7.90 92 21%

41 1.463±0.187 IPI00472102 HSPD1 61 kDa protein 61346 5.70 230 15%

42 1.651±0.245 IPI00219219 LGALS1 Galectin-1 15048 5.34 286 37%

43 1.055±0.026 IPI00303882 M6PRBP1 Iso BofMannose-6-phosphate receptor-binding protein1 47189 5.30 87 7%

44 1.188±0.086 IPI00219301 MARCKS Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate 31707 4.47 36 15%

45 1.072±0.034 IPI00179589 MTPN Myotrophin 13058 5.27 154 32%

46 1.619±0.196 IPI00335168 MYL6 Isoform Non-muscle of Myosin light polypeptide 6 17090 4.56 92 25%

47 1.072±0.035 IPI00012048 NME1 Nucleoside diphosphate kinase A 17309 5.83 108 31%

48 1.474±0.191 IPI00171664 NUP43 48 kDa protein 49082 5.75 34 2%

49 1.194±0.088 IPI00298547 PARK7 Protein DJ-1 20050 6.33 141 26%

50 1.648±0.244 IPI00025252 PDIA3 Protein disulfide-isomerase A3 precursor 57146 5.98 292 14%

51 1.332±0.142 IPI00014850 PEA15 Astrocytic phosphoprotein PEA-15 15088 4.93 83 22%

52 1.486±0.195 IPI00000051 PFDN1 Prefoldin subunit 1 14202 6.32 45 9%

53 1.738±0.269 IPI00006052 PFDN2 Prefoldin subunit 2 16695 6.20 72 9%

54 1.044±0.021 IPI00015361 PFDN5 Prefoldin subunit 5 17374 5.93 181 33%

55 1.502±0.160 IPI00216691 PFN1 Profilin-1 15216 8.44 38 20%

56 1.069±0.033 IPI00029997 PGLS 6-phosphogluconolactonase 27815 5.70 91 22%

57 1.738±0.269 IPI00419585 PPIA;PPIAL3;LOC654188 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A 18229 7.68 66 20%

58 1.136±0.063 IPI00027350 PRDX2 Peroxiredoxin-2 22049 5.66 192 14%

59 1.101±0.047 IPI00023788 PRSS7 Enteropeptidase precursor 114905 4.90 35 1%

60 1.306±0.132 IPI00016832 PSMA1 Isoform Short of Proteasome subunit alpha type 1 29822 6.15 63 16%

61 1.850±0.298 IPI00008223 RAD23B UV excision repair protein RAD23 homolog B 43202 4.79 43 5%

62 1.468±0.189 IPI00015842 RCN1 Reticulocalbin-1 precursor 38866 4.86 119 16%

63* 4.495±0.636 IPI00101037 RCN3 Reticulocalbin-3 precursor 37470 4.74 139 9%

64 1.709±0.261 IPI00335280 RPE Isoform 1 of Ribulose-phosphate 3-epimerase 25139 5.33 44 8%

65 0.094±0.366 IPI00013895 S100A11 Protein S100-A11 11847 6.56 100 23%

66 1.293±0.128 IPI00025318 SH3BGRL SH3 domain-binding glutamic acid-rich-like protein 12766 5.22 72 8%

67 1.853±0.299 IPI00010402 SH3BGRL3 Hypothetical protein 24108 9.27 125 12%

68 1.926±0.316 IPI00745465 Similar to Checkpoint protein HUS1 15655 8.96 65 54%

69 1.026±0.013 IPI00218733 SOD1 16 kDa protein 16340 5.87 86 8%

70 1.438±0.179 IPI00479946 STIP1 STIP1 protein 68687 7.81 38 3%

71 1.009±0.004 IPI00479997 STMN1 Stathmin 17292 5.76 90 23%

72 1.215±0.097 IPI00217236 TBCA Tubulin-specific chaperone A 12904 5.25 93 10%

Resultados

73 1.060±0.029 IPI00451401 TPI1 Isoform 2 of Triosephosphate isomerase 27451 8.48 218 22%

74 1.066±0.032 IPI00000230 TPM1 tropomyosin 1 alpha chain isoform 2 32715 4.70 178 14%

75 1.458±0.186 IPI00178083 TPM3 29 kDa protein 29346 4.75 94 10%

76 1.364±0.154 IPI00010779 TPM4 Isoform 1 of Tropomyosin alpha-4 chain 28619 4.67 246 14%

77 1.129±0.060 IPI00009943 TPT1 Tumor protein, translationally-controlled 1 21626 5.34 107 19%

78 1.669±0.250 IPI00216298 TXN Thioredoxin 12015 4.82 98 34%

79 1.293±0.128 IPI00646689 TXNL5 Thioredoxin-like protein 5 14217 5.40 37 11%

80 1.119±0.045 IPI00003949 UBE2N Ubiquitin-conjugating enzyme E2 N 17184 6.13 43 2%

81 1.403±0.167 IPI00071180 UBQLN1 Isoform 2 of Ubiquilin-1 59183 5.01 46 9%

82 1.192±0.087 IPI00024502 UBQLN4 Ubiquilin-4 63869 5.14 43 2%

83 1.077±0.037 IPI00018352 UCHL1 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1 25151 5.33 131 26%

84* 2.320±0.397 IPI00291175 VCL Isoform 1 of Vinculin 117220 5.83 36 3%

Resultados

2.2 Comparação entre culturas derivadas de diferentes doadores numa

mesma passagem

2.2.1 Análise do Perfil Proteômico

A análise visual preliminar de géis bidimensionais sugeriu que o perfil

protéico global é muito semelhante entre amostras de CTM na passagem 1

derivadas de diferentes doadores (Figura 9). A comparação visual mais

minuciosa foi realizada entre pequenos pedaços do gel, como pode ser

observado nas Figuras 10 e 11, mostrando mais uma vez o alto grau de

semelhança entre géis de diferentes culturas na passagem 1. Nessas figuras,

está mostrada também a identificação das bandas evidenciadas. A análise

comparativa dos géis foi também realizada no software Image Master 2D

Platinium 6.0 (GE Healthcare, Suécia), após normalização dos spots. Como

observado no scatter plotter (Figura 12), a comparação entre os diferentes

doadores revelou um alto grau de similaridade (de 94,4%) e de

reprodutibilidade, com diferenças quantitativas maiores que 2x em apenas três

proteínas (Tabela 2). Esses resultados sugerem que o perfil proteômico de

culturas de CTM humanas derivadas de diferentes doadores é similar nesta

janela de análise, mesmo em uma passagem tão precoce (passagem 1). No

entanto, a similaridade do perfil proteômico isoladamente não representa uma

informação importante do ponto de vista da utilização clínica das CTM. Para

isso, ensaios independentes de imunomodulação in vitro foram realizados

utilizando-se culturas de CTM na passagem 1 derivadas de diferentes

doadores.

Resultados

Figura 9: Géis representativos do perfil proteômico de amostras de CTM, derivadas de 2 doadores diferentes, na passagem 1, mostrando um padrão bastante semelhante entre as culturas. Os eixos horizontais representam o valor de pI, e os eixos verticais representam o peso molecular.

Figura 10: Comparação visual entre pequenos pedaços dos géis de 4 diferentes doadores, com a respectiva identificação das bandas envolvidas, mostrando a grande semelhança entre os perfis proteômicos.

Figura 11: Comparação visual entre pequenos pedaços dos géis de 4 diferentes doadores, com a respectiva identificação das bandas envolvidas, mostrando a grande semelhança entre os perfis proteômicos.

Resultados

Figura 12: Comparação entre 2 géis representativos de amostras de CTM na passagem 1 derivadas de 2 doadores diferentes, realizada no software Image Master 2D Platinium 6.0 (GE Healthcare, Suécia), após normalização dos spots. A análise revelou o alto grau de similaridade entre os géis (94,4%). mostrando a grande semelhança entre os perfis proteômicos de CTM derivadas de diferentes doadores.

2.2.2 Inibição In vitro de Células T Mediada por CTM de um terceiro

indivíduo (Third-Party)

Para testar a habilidade de culturas de CTM derivadas de diferentes

doadores de inibir a proliferação de linfócitos dirigida por aloantígenos, foram

realizados ensaios de CML na presença e ausência de CTM. CTM foram

adicionadas a CML no dia 0, e as culturas foram analisadas após 7 dias. Como

demonstrado na Figura 13A, CTM thirdy-party na passagem 1, derivadas de 5

doadores diferentes, foram capazes de inibir a proliferação de linfócitos em

resposta a aloantígenos em 12 experimentos independentes (p<0,0001). O

resultado de um ensaio representativo pode ser observado na Figura 13B. A

Resultados

análise indica uma diminuição de aproximadamente 6X na proliferação

linfocitária, quando CTM estavam presentes na cultura. Esses resultados

confirmam as propriedades imunomodulatórias de culturas de CTM derivadas

de doadores diferentes, e portanto demonstram que a similaridade observada

ao nível proteômico entre doadores diferentes, é também observada em seu

potencial imunomodulatório in vitro.

Os resultados dessa primeira etapa do trabalho foram reunidos em um

manuscrito, submetido e aceito para publicação na revista Cytotherapy (Anexo

1).

Figura 13: A) A proliferação de linfócitos foi avaliada em CML na ausência (ctrl-CML) ou presença de 5 x 104 CTM (CML-10%MSC) após 6 dias de cultivo. A análise foi realizada dentro da região de células vivas e CFSE+. Os resultados estão expressos na forma de média ± desvio padrão para 12 experimentos independentes (p<0,0001). B) Ensaio representativo de um experimento. O pico M1 representa as células que não proliferaram, e o pico M2 representam as células que proliferaram. Neste ensaio, observa-se que M2 diminui de forma significativa na presença de 10% de CTM na passagem 1. Todas as culturas analisadas (derivadas de diferentes doadores na passagem 1) apresentaram o mesmo perfil imunomodulatório.

Resultados

2.3 Comparação entre Culturas de um Mesmo Doador em Diferentes

Passagens

Foi realizada também análise do perfil proteômico e transcriptômico de

culturas derivadas de um mesmo doador em diferentes passagens, com o

objetivo de se verificar se CTM submetidas a mais passagens in vitro

preservam as características das CTM de passagens mais precoces. Esse tipo

de análise é de fundamental importância para a utilização clínica das CTM,

devido à necessidade de seu cultivo ex vivo antes de sua aplicação

terapêutica. Assim, mais conhecimento a respeito da influência do cultivo in

vitro sobre a biologia básica das CTM, e sobre seu potencial terapêutico, é

ainda imprescindível.

Culturas de CTM derivadas de um mesmo doador foram estabelecidas e,

em cada passagem (da passagem 1 até 10), foi realizada extração de

proteínas e de RNA das células para análise proteômica e transcriptômica.

Células em diferentes passagens foram também submetidas à análise

citogenética, com o objetivo de verificar se o cultivo in vitro é capaz de induzir a

aquisição de anomalias cromossômicas. Foi também realizada análise do

potencial imunomodulatório das CTM em diversas passagens, através da

realização de CML na ausência ou presença de CTM.

Durante o cultivo, sinais de senescência nas células, tais como aumento

no tamanho celular, achatamento da célula e aumento no número de vacúolos

intracelulares, começaram a ser observados a partir da passagem 9 (Figura

14), quando seu potencial de proliferação diminuiu em relação ao de

passagens mais precoces (dados não mostrados).

Resultados

Figura 14: Análise ao microscópio ótico de uma cultura de CTM na passagem 9, mostrando sinais morfológicos de senescência, tais como aumento no tamanho celular e no número de vacúolos intracelulares.

2.3.1 Análise do Perfil de Expressão de RNA

Em cada passagem da cultura, as células tiveram seu conteúdo de RNA

extraído, quantificado, e submetido à análise por PCR em tempo real, para

determinação da variação da expressão de alguns genes marcadores de

indiferenciação das CTM, segundo Park e colaboradores (Park et al 2007).

Na Figura 15, observamos a análise por PCR em tempo real da

expressão dos genes CD44, SCF e BMPR1, de culturas derivadas de um

doador da passagem 1 até a passagem 5. Essa análise nos mostrou que o

perfil de expressão para esses genes se manteve constante da passagem 1

Resultados

até a passagem 5, sugerindo que as células encontravam-se em um estado

indiferenciado. A partir da passagem 6, algumas análises indicam um perfil não

uniforme para a expressão destes genes .

Figura 15: Análise por PCR em tempo real da expressão dos genes CD44 (A), SCF (B) e BMPR-I (C) em culturas de CTM da passagem 1 até a passagem 5. Os gráficos mostram que o perfil de expressão dos genes se mantém constante ao longo do subcultivo in vitro.

CD44

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

1,1

P1 P2 P3 P4 P5

PASSAGENS

SCF

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

1,1

P1 P2 P3 P4 P5

PASSAGENS

BMPRI

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

P1 P2 P3 P4 P5

PASSAGENS

Resultados

2.3.2 Análise do Perfil Proteômico

Nessa segunda parte do trabalho, os extratos protéicos foram dissolvidos

no tampão de reidratação 2. Essa mudança permitiu a visualização de um

maior número de spots protéicos visualizados no gel 2D (de 181±±±±10 spots

obtidos com o tampão 1 para 271±±±±8 spots obtidos com o tampão 2), o que

pode ser atribuído à maior solubilização das proteínas pelo tampão 2, devido à

sua composição específica, como a presença do sal caotrópico tiouréia, e a

substituição do detergente zwitteriônico de NP40 por ASB14 (Hebert 1999).

Assim, foi gerada uma nova lista de proteínas identificadas em culturas de

CTM. Foram identificadas 149 proteínas, das quais 107 não haviam sido

identificadas em nossas análises anteriores. Na Tabela 3, estão relacionadas

as 107 novas proteínas identificadas nessa etapa do trabalho, e dessas 79

nunca haviam sido descritas em análises proteômicas de culturas de CTM

(Park et al 2007). A análise comparativa (visual e por scatter plotter) entre géis

bidimensionais de diferentes doadores na passagem 1 mostrou que a

similaridade entre doadores se manteve com a utilização do tampão de

reidratação 2

A comparação visual entre os géis das diversas passagens mostrou que

as culturas mantêm um perfil proteômico bastante constante ao longo do

subcultivo in vitro, com poucas diferenças quantitativas. A partir da passagem

9, porém, observa-se uma mudança importante nesse padrão, com uma

redução geral na expressão protéica, conforme pode ser observado na figura

16, onde estão os géis de culturas de CTM de um mesmo doador na passagem

1 e culturas na passagem 9. Vale lembrar que a quantidade de proteína

aplicada nos dois géis é a mesma. Algumas proteínas diferencialmente

Resultados

expressas entre as duas populações foram identificadas, como a proteína

Eif5A (isoforma 2 do fator eucariótico de iniciação da tradução 5A-1), Wdr1

(Isoforma 2 da proteína 1 contendo repetição WD), CapG (proteína macrófago-

capping), UCHL (Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1), ACTB

(actina citoplasmática 1 ou β-actina), ACTBL2 (proteína 2 tipo β-actina ou κ-

actina) e VCL (isoforma 1 da vinculina), todas com expressão bastante

diminuída em P9. Outras proteínas diferencialmente expressas ainda

necessitam ser identificadas.

Resultados

Tabela 3: Proteínas identificadas nas análises de CTM na passagem 1, utilizando tampão de reidratação 2. As proteínas listadas não foram identificadas nas análises com o tampão 1 (Tabela 2). IPI é a identificação na base de dados do IPI, PM é o peso molecular, pI é o ponto isoelétrico da proteína, Sc é o score no programa Mascot, que descreve a significância do resultado na análise, e Cob é a porcentagem de cobertura da sequência analisada.

SPOT IPI NOME DA PROTEÍNA PM

(Da) pI Sc Cob

1 IPI00063827 ABHD14B Isoform 1 of Abhydrolase domain-containing protein 14B 22446 5.94 83 11%

2 IPI00003269 ACTBL2 Beta-actin-like protein 2

42318 5.39 173 9% 3 IPI00013808 ACTN4 Alpha-actinin-4 105245 5.27 172 12% 4 IPI00029468 ACTR1A Alpha-centractin

42701 6.19 85 14% 5 IPI00028091 ACTR3 Actin-related protein 3 47797 5.61 95 15% 6 IPI00216773 ALB protein

46442 5.77 38 3% 7 IPI00103467 ALDH1B1 Aldehyde dehydrogenase X, mitochondrial precursor 57658 6.36 68 9% 8 IPI00002459 ANXA6 annexin VI isoform 2 75571 5.46 207 14% 9 IPI00002460 ANXA7 Isoform 1 of Annexin A7 53078 5.52 36 2%

10 IPI00005161 ARPC2 Actin-related protein 2/3 complex subunit 2 34426 6.84 234 23% 11 IPI00303476 ATP5B ATP synthase subunit beta, mitochondrial precursor 56525 5.26 69 14% 12 IPI00007812 ATP6V1B2 Vacuolar ATP synthase subunit B, brain isoform 56807 5.57 38 4% 13 IPI00301434 BOLA2;BOLA2B BolA-like protein 2 17150 8.42 63 16% 14 IPI00410226 BOLA2;BOLA2B Isoform 2 of BolA-like protein 2 7008 5.65 58 43% 15 IPI00056357 C19orf10 UPF0556 protein C19orf10 precursor 18897 6.20 34 13%

16 IPI00014230 C1QBP Complement component 1 Q subcomponent-binding protein, mitochondrial 31742 4.74 49 4%

17 IPI00218694 CALD1 Isoform 2 of Caldesmon 65725 6.37 179 13% 18 IPI00789155 CALU Calumenin precursor 38141 4.47 308 23% 19 IPI00025084 CAPNS1 Calpain small subunit 1 28469 5.05 76 21% 20 IPI00026185 CAPZB Isoform 1 of F-actin-capping protein subunit beta 31616 5.36 91 8% 21 IPI00010720 CCT5 T-complex protein 1 subunit epsilon 60089 5.45 41 4% 22 IPI00027626 CCT6A T-complex protein 1 subunit zeta 58444 6.23 51 4% 23 IPI00001560 CDKN2A Cyclin-dependent kinase inhibitor 17986 6.37 33 24% 24 IPI00001960 CLIC4 Chloride intracellular channel protein 4 28982 5.45 140 33% 25 IPI00216393 CLTA Isoform Non-brain of Clathrin light chain A 23704 4.45 44 13% 26 IPI00291136 COL6A1 Collagen alpha-1(VI) chain precursor 109602 5.26 50 3% 27 IPI00017704 COTL1 Coactosin-like protein 16049 5.54 126 38% 28 IPI00295741 CTSB Cathepsin B precursor 38766 5.88 75 5% 29 IPI00010182 DBI Isoform a 1 of Acyl-CoA-binding protein 10038 6.12 46 12% 30 IPI00473014 DSTN Destrin 18950 8.06 141 16% 31 IPI00412497 DYNLRB1 Dynein, light chain, roadblock-type 1 16527 6.58 100 18%

Resultados

32 IPI00023048 EEF1D Elongation factor 1-delta 31217 4.90 84 16% 33 IPI00186290 EEF2 Elongation factor 2 96246 6.41 99 6% 34 IPI00328328 EIF4A2 Isoform 1 of Eukaryotic initiation factor 4A-II 46601 5.33 155 14% 35 IPI00003766 ETHE1 protein, mitochondrial precursor 28368 6.35 44 6% 36 IPI00219684 FABP3 Fatty acid-binding protein, heart 14906 6.29 183 40% 37 IPI00007797 FABP5;FABP5L7 Fatty acid-binding protein, epidermal 15497 6.60 84 47% 38 IPI00303300 FKBP10 FK506-binding protein 10 precursor 64717 5.36 35 4% 39 IPI00182126 FKBP9 FK506-binding protein 9 precursor 63500 4.91 59 4% 40 IPI00382931 FTH1 Ferritin 19649 8.78 38 13% 41 IPI00554521 FTH1 Ferritin heavy chain 21383 5.30 41 18% 42 IPI00375676 FTL Ferritin light polypeptide variant 21340 5.70 60 8% 43 IPI00026314 GSN Isoform 1 of Gelsolin precursor 86043 5.90 35 1% 44 IPI00018246 HK1 Isoform 1 of Hexokinase-1 103561 6.36 33 3% 45 IPI00219344 HPCAL1 Hippocalcin-like protein 1 22413 5.21 44 12%

46 IPI00382470 HSP90AA1 heat shock protein 90kDa alpha (cytosolic), class A member 1 isofo 98670 5.07 193 7%

47 IPI00414676 HSP90AB1 Heat shock protein HSP 90-beta 83554 4.97 229 11% 48 IPI00027230 HSP90B1 Endoplasmin precursor 92696 4.76 149 10% 49 IPI00556538 HSP90B2P Heat shock protein 94b 46343 5.14 48 7% 50 IPI00784154 HSPD1 60 kDa heat shock protein, mitochondrial precursor 61187 5.70 175 12%

51 IPI00030702 IDH3A Isoform 1 of Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit alpha, mitochondrial 40022 6.47 40 2%

52 IPI00021405 LMNA Isoform A of Lamin-A/C 74380 6.57 72 10% 53 IPI00886929 LOC100131813 similar to hCG2041218 26501 8.48 67 5% 54 IPI00869284 LOC171220 Pseudogene candidate 16866 8.78 95 11% 55 IPI00017596 MAPRE1 Microtubule-associated protein RP/EB family member 1 30151 5.02 34 13% 56 IPI00033494 MRLC2 Myosin regulatory light chain 19824 4.71 92 29% 57 IPI00219365 MSN Moesin 67892 6.08 85 3% 58 IPI00000105 MVP Major vault protein 99551 5.34 134 8% 59 IPI00019502 MYH9 Myosin-9 227646 5.50 59 3% 60 IPI00027681 NNMT Nicotinamide N-methyltransferase 30011 5.56 75 3%

61 IPI00017672 NP CDNA FLJ25678 fis, clone TST04067, highly similar to PURINE NUCLEOSIDE P 32758 6.71 115 20%

62 IPI00220740 NPM1 Isoform 2 of Nucleophosmin 29617 4.47 104 20% 63 IPI00010796 P4HB Protein disulfide-isomerase precursor 57480 4.76 384 18% 64 IPI00246058 PDCD6IP PDCD6IP protein 97385 6.13 36 3% 65 IPI00893541 PDIA3 14 kDa protein 13739 6.78 78 21% 66 IPI00299571 PDIA6 Isoform 2 of Protein disulfide-isomerase A6 precursor 54380 5.17 115 7% 67 IPI00107555 PFN2 Isoform IIb of Profilin-2 15421 5.78 51 7% 68 IPI00220644 PKM2 Isoform M1 of Pyruvate kinase isozymes M1/M2 58538 7.60 50 4%

Resultados

69 IPI00024919 PRDX3 Thioredoxin-dependent peroxide reductase, mitochondrial precursor 28017 7.67 74 10%

70 IPI00011937 PRDX4 Peroxiredoxin-4 30749 5.86 54 4% 71 IPI00220301 PRDX6 Peroxiredoxin-6 25133 6.00 134 26% 72 IPI00026154 PRKCSH Glucosidase 2 subunit beta precursor 60357 4.33 59 7% 73 IPI00555956 PSMB4 Proteasome subunit beta type-4 precursor 29242 5.72 133 30% 74 IPI00018398 PSMC3 26S protease regulatory subunit 6A 49458 5.13 39 3% 75 IPI00384051 PSME2 Uncharacterized protein PSME2 28755 6.05 170 29% 76 IPI00004358 PYGB Glycogen phosphorylase, brain form 97319 6.40 49 4% 77 IPI00017367 RDX Radixin isoform b 71176 6.30 42 1% 78 IPI00550069 RNH1 Ribonuclease inhibitor 51766 4.71 142 14% 79 IPI00179330 RPS27A;UBC;UBB ubiquitin and ribosomal protein S27a precursor 18296 9.68 78 21% 80 IPI00021187 RUVBL1 Isoform 1 of RuvB-like 1 50538 6.02 59 7% 81 IPI00009104 RUVBL2 RuvB-like 2 51296 5.49 84 10% 82 IPI00016179 S100A13 Protein S100-A13 11464 5.91 86 29% 83 IPI00027463 S100A6 Protein S100-A6 10230 5.33 39 8% 84 IPI00014177 SEPT2 Septin-2 41689 6.15 118 10% 85 IPI00032140 SERPINH1 Serpin H1 precursor 46525 8.75 46 3% 86 IPI00290566 TCP1 T-complex protein 1 subunit alpha 60819 5.80 138 11% 87 IPI00014581 TPM1 Isoform 1 of Tropomyosin alpha-1 chain 32746 4.69 92 15% 88 IPI00018853 TPM1 Tropomyosin isoform 28517 4.89 163 15% 89 IPI00013991 TPM2 Isoform 1 of Tropomyosin beta chain 32945 4.66 110 11% 90 IPI00218319 TPM3 Isoform 2 of Tropomyosin alpha-3 chain 29243 4.75 277 14% 91 IPI00030275 TRAP1 Heat shock protein 75 kDa, mitochondrial precursor 80345 8.30 46 1% 92 IPI00180675 TUBA1A Tubulin alpha-1A chain 50788 4.94 256 21% 93 IPI00166768 TUBA1C protein 37403 8.76 38 4% 94 IPI00218343 TUBA1C Tubulin alpha-1C chain 50548 4.96 122 12% 95 IPI00017454 TUBA4B Putative tubulin-like protein alpha-4B 27819 7.71 66 10% 96 IPI00011654 TUBB Tubulin beta chain 50095 4.78 244 24% 97 IPI00013475 TUBB2A Tubulin beta-2A chain 50274 4.78 203 21% 98 IPI00007752 TUBB2C Tubulin beta-2C chain 50255 4.79 298 19% 99 IPI00013683 TUBB3 Tubulin beta-3 chain 50856 4.83 343 24%

100 IPI00023598 TUBB4 Tubulin beta-4 chain 50010 4.78 73 8% 101 IPI00027107 TUFM Tu translation elongation factor, mitochondrial precursor 50185 7.26 40 5% 102 IPI00418471 VIM Vimentin 53676 5.06 313 13% 103 IPI00216256 WDR1 Isoform 2 of WD repeat-containing protein 1 58593 6.41 46 8% 104 IPI00216318 YWHAB Isoform Long of 14-3-3 protein beta/alpha 28179 4.76 39 11% 105 IPI00000816 YWHAE 14-3-3 protein epsilon 29326 4.63 82 11% 106 IPI00018146 YWHAQ 14-3-3 protein theta 28032 4.68 38 9%

Resultados

107 IPI00021263 YWHAZ 14-3-3 protein zeta/delta 27899 4.73 131 17%

Figura 16: Géis representativos do perfil proteômico de culturas de CTM derivadas de um doador em várias passagens. (A) passagem 1, (B) passagem 9. Os spots envolvidos estão diferencialmente expressos entre as duas passagens, com expressão diminuída na passagem 9. 1) VCL, 2) CALD1, 3) ACTB e ACTBL2, 4) Wdr1, 5) CapG, 6) UCHL1, 7) eIF5A Os eixos horizontais representam o valor de pI, e os eixos verticais representam o peso molecular.

Resultados

2.3.3 Análise do Perfil Citogenético

Devido à necessidade de expansão in vitro das CTM, é importante

examinar a estabilidade citogenética antes de seu uso terapêutico. O cariótipo

é um indicador confiável para avaliar a estabilidade genética e transformação

de células cultivadas in vitro (Zhang et al 2007), como é o caso das CTM.

Nesse trabalho, culturas de CTM derivadas de um mesmo doador foram

analisadas citogeneticamente ao longo de várias passagens in vitro, com o

objetivo de se avaliar até que passagem as culturas mantêm o perfil

citogenético inicial. Na Tabela 3, observamos o padrão cromossômico em

várias passagens de uma dessas culturas. Notamos que a partir da passagem

6 foi detectada uma alteração cromossômica, a pseudodiploidia, levando à

trissomia do 6 e à perda do cromossomo sexual X. Foi observado também, em

algumas células, perda cromossômica. Essas alterações cromossômicas se

mantiveram até a passagem 8. Na passagem 10, o índice mitótico foi

extremamente baixo, não apresentando condições para definição do padrão

cromossômico. Na Figura 17, podem ser observados cariótipos representativos

de culturas na passagem 3 (46, XX) e na passagem 6 (46,X-X+16).

Resultados

Passagem Análise Citogenética P1 Sem mitose

P3 46, XX [21]

P5 46, XX [20]

P6 46, XX[17] / 46,X-X+16 [2] / 36~42,XX,-3,-7,-11,-12,-13,-14,-14,-16,-

16,-19[1] / -5,-8,-11,-14,-20[1] / -4,-7,-10,-13[1]

P8 46,XX[6] / 46,X,-X,+16[5] / 40~42,X,-X,-3,-5,-8,-10,-13

P10 Sem mitose

Tabela 4: Perfil citogenético de uma cultura de CTM ao longo de várias passagens.

Figura 17: Análise citogenética de culturas de CTM ao longo de seu subcultivo in vitro. Em (A), observa-se um cariótipo normal (46, XX), refernte à cultura na passagem 3. A partir da passagem 6, algumas células tornaram-se pseudodiplóides, com trissomia do cromossomo 6 e perda do cromossomo X, conforme mostrado em (B).

A

B

Resultados

2.3.4 Análise do Potencial de Inibição In Vitro de Células T

Com intuito de verificar se o potencial de imunomodulação observado com

culturas de CTM em passagens iniciais se mantém em passagens mais tardias,

foram realizados ensaios de CML com culturas de CTM de um doador em

diversas passagens. Na Figura 18, pode ser observado o perfil de

imunomodulação de culturas derivadas de um mesmo doador em passagens

precoces (passagem 3) e em passagens mais tardias (passagem 8). Estas

análises indicam uma diminuição de aproximadamente 6X na proliferação

linfocitária, quando CTM, tanto na passagem 3 quanto na passagem 8,

estavam presentes na cultura. Portanto, até a última passagem analisada

(passagem 8), as culturas de CTM foram capazes de manter seu potencial de

inibição da proliferação in vitro de linfócitos em resposta a aloantígenos.

Figura 18: A) A proliferação de linfócitos foi avaliada em CML na ausência (ctrl-CML) ou presença de 5 x 104 CTM em diferentes passagens (CML-10%CTM P3 e CML-10%CTM P8) após 6 dias de cultivo. A análise foi realizada dentro da região de células vivas e CFSE+. Os resultados estão expressos na forma de média ± desvio padrão para 2 experimentos independentes. B) Ensaio representativo de um experimento. O pico M1 representa as células que não proliferaram, e o pico M2 representa as células que proliferaram. Observa-se que M2 diminui de forma significativa na presença de 10% de CTM, e que o perfil imunomodulatório verificado para CTM em passagens mais tardias (passagem 8) é similar ao verificado em passagens mais precoces (passagem 3).

Resultados

2.4 Comparação entre culturas submetidas à diferenciação e culturas não

diferenciadas

Com o objetivo de estudar o padrão proteômico das CTM após sua

diferenciação in vitro, e identificar proteínas diferencialmente expressas durante

esse processo, foi realizada análise proteômica das culturas após sua

diferenciação para as linhagens osteogênica e adipogênica.

Para a diferenciação osteogênica, CTM na passagem 3 foram cultivadas

em meio de diferenciação osteogênico, que continha 10% SBF, 0,01µM

dexametasona, 10mM β-glicerol fosfato e 0,2mM ácido ascórbico, em DMEM

de alta glicose, durante 3 semanas. As células foram então tripsinizadas, sendo

preparados seus extratos protéicos totais. Os extratos foram quantificados e

submetidos à eletroforese bidimensional, para análise do perfil proteômico das

células diferenciadas.

Para a diferenciação adipogênica, CTM na passagem 3 foram cultivadas

em meio de diferenciação adipogênico, que continha 10%SBF, 0,01µM

dexametasona, 5µg/mL insulina em DMEM de alta glicose, durante 3 semanas.

Após esse período, as culturas foram tripsinizadas, e foi preparado extrato

protéico total delas. Após quantificação pelo método de Bradford, os extratos

foram submetidos à eletroforese bidimensional para análise do perfil

proteômico das células após diferenciação.

Os ensaios de diferenciação realizados em paralelo confirmaram o

fenótipo diferenciado das células, tanto para a linhagem osteogênica, quanto

para a linhagem adipogênica.

Resultados

Foi também realizada, através de ensaios de PCR em tempo real, a

análise da expressão de genes marcadores de diferenciação das CTM, tais

como LPL (LipoProteína Lipase) para a diferenciação adipogênica, e Runx2

para a diferenciação osteogênica. Na figura 19, pode ser observado o perfil de

expressão dos genes em células diferenciadas para o fenótipo adipogênico e

em células diferenciadas para o fenótipo osteogênico, mostrando aumento

considerável dos genes marcadores de diferenciação (mais de 7.000 vezes

para o RNAm de LPL após a diferenciação adipogênica, e quase 5 vezes para

o RNAm de Runx2 após a diferenciação osteogênica). Essa análise confirmou

que as culturas de CTM sofreram diferenciação no meio indutor específico.

DIFERENCIAÇÃO OSTEOGÊNICA

1,10

5,42

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

CTRL OSTEO DIF OSTEO

ng

DE

mR

NA

DE

RU

NX

2/B

2M

Figura 19: Análise por PCR em tempo real dos genes Runx2 e LPL em culturas de CTM submetidas à diferenciação in vitro para as linhagens osteogênica e adipogênica, respectivamente.

DIFERENCIAÇÃO ADIPOGÊNICA

5,1E-04

9,0E+00

0,0E+00

1,0E+00

2,0E+00

3,0E+00

4,0E+00

5,0E+00

6,0E+00

7,0E+00

8,0E+00

9,0E+00

1,0E+01

CTRL ADIPO DIF ADIPO

ng

DE

mR

NA

DE

LP

L/B

2M

Resultados

Na figura 20, podemos observar o padrão proteômico de CTM não

diferenciadas, de células após a diferenciação osteogênica e após a

diferenciação adipogênica.

As imagens dos géis foram comparadas visualmente, e os spots

expressos exclusivamente em amostras diferenciadas, ou nas não

diferenciadas, foram retirados, processados e estão sendo identificados por

espectrometria de massas. Conforme demonstrado na figura, podemos

observar a modificação do perfil de expressão protéica das culturas após a

diferenciação in vitro. Algumas proteínas encontravam-se diferencialmente

expressas, como por exemplo, a proteína Caldesmon (CALD1), que aparece

no gel em diversos spots, que representam suas diversas isoformas,

decorrentes de modificações pós-traducionais. Esse conjunto de proteínas

desaparece nos géis das culturas após a diferenciação. As proteínas TUBA4B

(α-TUBulina 4B), TUBA1A (cadeia α-1A da TUBulina), TUBB (cadeia β-1β-2

da TUBulina), TUBB2A (cadeia β-2A da TUBulina), TUBB3 (cadeia β-3 da

TUBulina) também estão ausentes nas culturas após a diferenciação (tanto

osteo como adipo). Outras proteínas diferencialmente expressas ainda estão

sendo identificadas por espectrometria de massas.

Figura 20: Géis representativos do perfil proteômico de culturas de CTM, na passagem 3, após diferenciação adipogênica (A) e osteogênica (B). Em C, o perfil proteômico de uma cultura de CTM não diferenciada na também na passagem 3. Os spots envolvidos estão diferencialmente expressos entre as culturas diferenciadas e as não diferenciadas. 1) Várias isoformas da proteína CALD1, 2) TUBA4B, TUBA1A, TUBB, TUBB2A, TUBB3. Os spots envolvidos, mas sem numeração, ainda não foram identificados, mas apresentam variações importantes de expressão entre as células diferenciadas e não diferenciadas. Os eixos horizontais representam o valor de pI, e os eixos verticais representam o peso molecular.

Discussão

DISCUSSÃO

CTM são definidas como progenitores multipotentes descritos in vitro como

populacões heterogêneas de células estromais. Devido ao seu potencial de originar

diferentes linhagens mesodermais, como osteócitos, condrócitos e adipócitos, sua

função imunomodulatória in vitro e in vivo, e sua relativa facilidade de expansão e

manipulação ex vivo, tais células representam ferramentas promissoras para

terapia celular. O uso clínico das CTM é um campo em ascensão para o tratamento

de diversas doenças, incluindo defeitos ósseos e fraturas, artrite inflamatória,

desordens cardiovasculares (Abdallah & Kassem 2009), DECH (Ringden et al

2006), e na melhora da reconstituição hematopoética após o transplante de medula

óssea (Giordano et al 2007). Como as CTM se popularizaram em cima de sua

promissora aplicação terapêutica, existe ainda pouco conhecimento acerca de

marcadores moleculares específicos para essa população, e do impacto dos

métodos utilizados para sua expansão em cultura (Wagner et al 2008b).

Desde a descoberta de seu potencial para terapias celulares, algumas

questões relacionadas à natureza dessas células surgiram como possíveis

problemas em sua aplicação terapêutica. As CTM são derivadas ex vivo por

adesão à placa de cultura, e sua definição está baseada em ensaios funcionais,

especialmente porque essas células nunca foram isoladas de seu nicho natural.

Culturas de CTM são uma mistura de progenitores com diferentes potenciais

(Muraglia et al 2000). A amplificação ex vivo, necessária para obtenção de número

suficiente de células para terapia, leva inevitavelmente à senescência celular,

acumulando risco de alterações genéticas e epigenéticas. Todas essas questões

poderiam ser melhor entendidas se as características moleculares envolvidas em

Discussão sua função terapêutica e em sua biologia básica em cultura pudessem ser

definidas.

O rápido desenvolvimento das tecnologias de análise molecular em larga

escala nas últimas décadas, em particular a tecnologia proteômica, permitiu a

comparação entre o perfil molecular de diferentes tipos de células tronco. Em

relação ao estudo das CTM, abordagens proteômicas têm sido aplicadas na

identificação de moléculas regulatórias e potenciais biomarcadores. Devido à

ausência de marcadores prospectivos para se isolar e identificar as CTM, parte da

pesquisa nesse campo tem se concentrado no estabelecimento de um painel de

características moleculares para delinear os padrões para o controle de qualidade

das preparações de CTM (Wagner et al. 2006). Ferramentas proteômicas são

também importantes para a elucidação dos mecanismos moleculares envolvidos na

diferenciação das CTM. Diversos estudos têm identificado o proteoma de CTM,

conforme revisado por Park e colaboradores (2007). No entanto, nenhuma das

proteínas identificadas parece ser específica para essa população, sugerindo

novamente a ausência de marcadores únicos para as CTM. Os estudos

proteômicos realizados nessa área compararam CTM derivadas de diferentes

tecidos humanos (Li et al. 2009, Noël et al. 2008, Feldmann et al. 2005), CTM

submetidas a diferentes condições de cultivo (Wagner et al. 2006, Wang et al.

2004), CTM induzidas à diferenciação in vitro (Lee et al. 2006, Sun et al. 2006),

mas em nenhum deles foram analisadas as diferenças entre culturas derivadas de

diferentes doadores de medula óssea, ou entre células de diversas passagens em

cultura.

Nesse estudo, estabelecemos inicialmente um perfil de proteínas expressas

em culturas de CTM na passagem 1, numa janela de análise que cobre proteínas

Discussão com pI de 4 a 7, e com peso molecular de 10 a 220kDa. Quarenta novas proteínas

foram identificadas além das proteínas já descritas em estudos proteômicos de

CTM (Park et al. 2007), provavelmente porque os parâmetros experimentais

utilizados para esta análise por eletroforese bidimensional foram diferentes dos

utilizados anteriormente. Dentre elas, identificamos a proteína Galectina-1 (Gal-1),

membro de uma família evolutivamente conservada de lecitinas com afinidade por

β-galactosídeos. A lecitina está envolvida em uma variedade de processos normais

e patológicos, como adesão celular, regulação do crescimento celular,

imunomodulação, inflamação, apoptose, embriogênese e progressão do câncer

(Vas et al. 2005). A expressão de Gal-1 foi identificada em órgãos linfóides e em

sítios imunoprivilegiados, como placenta e córnea, sugerindo um papel importante

na geração e manutenção da tolerância imune (Kiss et al. 2007). O papel de Gal-1

como regulador efetivo das respostas imunológicas foi demonstrado em modelos

animais de doenças auto-imunes, tais como ratos Lewis suscetíveis à

encefalomielite (Offner et al. 1990), coelhos com miastenia autoimune (Levi et al.

1983), e modelos experimentais de artrite reumatóide (Rabinovich et al. 2000). Em

um modelo animal, o tratamento com Gal-1 foi capaz de prevenir eficientemente o

desenvolvimento de DECH (Baum et al. 2003). Kiss e colaboradores demonstraram

ainda que Gal-1 afeta a mobilização de Células Progenitoras Hematopoéticas

(CPH) induzida por drogas como a ciclofosfamida, e citocinas como G-CSF

(Granulocyte-Colony Stimulating Factor). A expressão de Gal-1 em CTM foi

recentemente detectada e implicada na diferenciação das células da medula óssea

(Panepucci et al. 2004, Kadri et al. 2005). Devido às suas propriedades

imunomodulatórias, seu possível envolvimento nas funções imunológicas das CTM

pode ser sugerido.

Discussão

Este é o primeiro estudo proteômico em larga escala a identificar Gal-1 em

CTM, embora ela já tenha sido anteriormente associada às CTM (Kadri et al.

2005). Essa proteína, assim como a grande maioria das proteínas identificadas,

estava expressa em níveis quase idênticos em todas as amostras de CTM na

passagem 1 analisadas, o que demonstra que CTM derivadas de diferentes

doadores têm um padrão de expressão protéica muito similar.

A semelhança observada no perfil proteômico de culturas de CTM em

passagens tão precoces é de fato muito interessante, uma vez que tem sido

demonstrada uma grande variabilidade no perfil proteômico de células

mononucleares da medula óssea, do sangue periférico, ou do sangue de cordão

umbilical (Zenzmaier et al. 2003, 2005), derivadas de diferentes doadores. Nossas

análises sugerem que o cultivo in vitro, mesmo por apenas uma passagem, é

capaz de uniformizar o perfil proteômico das células entre diferentes indivíduos, e

que sua capacidade de inibir a proliferação de linfócitos in vitro é similar entre eles,

confirmando a similaridade do potencial imunomodulatório entre os indivíduos.

Diversos estudos têm demonstrado que as CTM apresentam propriedades

imunossupressoras in vitro e in vivo (Rasmusson 2006), produzem citocinas que

dão suporte à hematopoese e são capazes de potencialmente melhorar a

recuperação medular após quimio ou radioterapia (Ball et al. 2007, Le Blanc et al.

2004, 2007, Le Blanc & Pittenger 2005, Lee et al. 2002, Koç et al. 2000). Assim, as

CTM têm sido utilizadas em associação ao transplante alogeneico de medula óssea

com o objetivo de facilitar a “pega” da CTH e diminuir o desenvolvimento da DECH

(Le Blanc et al. 2004, 2007, Lee et al. 2002, Koç et al. 2000).

Todos os estudos mencionados anteriormente avaliaram o uso de infusões

de CTM derivadas de um terceiro doador, diferente do doador de medula óssea.

Discussão Além disso, Le Blanc e colaboradores (2003) demonstraram, através de ensaios in

vitro, que o efeito supressor sobre a proliferação de linfócitos, exercido pelas CTM,

independe da compatibilidade de HLA. Uma maior atividade supressora foi

demonstrada por Maccario e colaboradores (2005), quando CTM eram de um

terceiro doador, mais do que quando as células eram autólogas. Em um estudo

piloto utilizando CTM para tratar pacientes com DECH severa após TCTH,

Ringdén e colaboradores (2006) demonstraram que a infusão de CTM alogeneicas

derivadas tanto de doadores gêmeos idênticos, de doadores haploidênticos

relacionados, ou mesmo de doadores totalmente incompatíveis, tem efeito positivo

na imunossupressão da DECH, e na melhora do epitélio intestinal. Essas

evidências sugerem que a fonte das CTM de medula óssea não é um fator crucial

para seu uso em terapias celulares. Assim, é importante estabelecer

molecularmente as diferenças relevantes entre culturas de CTM derivadas de

diferentes indivíduos, corroborando os dados in vitro e in vivo, e demonstrar que,

mesmo CTM derivadas de um terceiro indivíduo, são capazes de diminuir

respostas imunológicas. Isto encoraja o uso dessas células como doadores

universais, independentemente do complexo de histocompatibilidade principal.

Esse é o primeiro estudo a demonstrar a similaridade do perfil proteômico de

CTM derivadas de diferentes indivíduos, mesmo em células da primeira passagem

em cultura. Esses resultados encorajam o uso de CTM third-party em terapias

celulares. Além disso, nossas análises in vitro mostram que CTM third-party na

primeira passagem são capazes de inibir a proliferação de linfócitos de forma

similar. Nossa hipótese, porém, ainda precisa ser corroborada por análises

proteômicas adicionais realizadas com proteínas de membrana, e proteínas

Discussão secretadas, que são os verdadeiros efetores das respostas imunes disparadas por

células no organismo hospedeiro.

Outras análises do perfil proteômico foram realizadas nesse trabalho,

utilizando-se um tampão de reidratação para as amostras protéicas diferente do

utilizado nas análises anteriores (tampão 2), sendo assim obtido um maior número

de spots protéicos no gel bidimensional. Mais proteínas foram identificadas nas

novas análises, provavelmente devido à melhor capacidade de solubilização

proteica pelo tampão 2, que contém o detergente ASB14 e o sal caotrópico

tiouréia. Nesta nova análise, 107 novas proteínas foram identificadas em culturas

de CTM na passagem 1, e dessas 79 nunca haviam sido descritas em análises

proteômicas de culturas de CTM (Park et al. 2007), expandindo portanto o perfil de

proteínas descritas no proteoma de CTM.

Em nossa análise do perfil molecular de culturas de CTM ao longo de suas

passagens, pôde-se observar que o padrão proteômico determinado para células

na passagem 1 se manteve até a passagem 8. Numa análise visual minuciosa,

observou-se que os géis bidimensionais de passagens posteriores apresentaram

diferenças qualitativas e quantitativas em relação às passagens anteriores. A partir

da passagem 9, sinais de senescência foram observados nas células, com

diminuição de seu potencial de proliferação, sugerindo que a mudança do perfil

proteômico das passagens iniciais acompanhou a progressão das células para um

estado de senescência. Wagner e colaboradores (Wagner et al 2008b) mostraram,

através da análise da expressão gênica global, que mudanças nesse padrão não

estão restritas a passagens tardias, mas são adquiridas ao longo do subcultivo das

CTM, sugerindo que a senescência replicativa das preparações de CTM é um

Discussão processo contínuo, que se inicia logo nas primeiras passagens. Nossos métodos

de análise, porém, não foram capazes de detectar o processo descrito pelo grupo

do Wagner, provavelmente porque alterações nos níveis de RNA ocorrem

anteriormente às dos níveis de proteínas. Além disso, nossa análise in vitro do

perfil imunomodulatório das CTM mostrou que mesmo células em passagens

tardias preservam seu potencial de inibição da proliferação de linfócitos, de

maneira semelhante ao observado em nossas análises anteriores com células na

passagem 1.

A partir da passagem 9, foi observada uma redução global da expressão

protéica, que se manteve na passagem 10. A comparação visual dos géis permitiu

a observação de algumas proteínas com diferenças de expressão entre as

populações de diferentes passagens. As proteínas identificadas (eIF5A, Wdr1,

CapG, UCHL, ACTB, CALD1 e VCL) apresentavam expressão diminuída em

relação às passagens anteriores. Essas proteínas apresentam papéis relacionados

principalmente à motilidade e forma celular, à proliferação e controle do ciclo celular

e à síntese protéica, processos que provavelmente sofrem redução com o cultivo

celular prolongado.

A proteína eIF5A foi originalmente identificada como um fator de tradução

altamente conservado de arqueobactérias a mamíferos. O fator é a única proteína

celular que sofre uma modificação pós-traducional chamada hiposinação, que está

envolvida no controle do ciclo celular e da proliferação em vários organismos

(Zanelli et al 2007). eIF5A foi recentemente relacionada à diferenciação do músculo

esquelético, uma vez que concentrações aumentadas da proteína foram

encontradas em células satélites em diferenciação (Luchessi et al 2009). Seu papel

Discussão como mediador das ações neurotróficas e neuroprotetoras de NGF (Neural Growth

Factor) foi também demonstrado (Huang et al 2007).

A proteína Wdr1, também conhecida como Aip1 (proteína 1 de interação com

actina), é uma proteína com repetições WD altamente conservada em eucariotos, e

que promove a desmontagem dos filamentos de actina mediada por cofilina. A

proteína parece ter um papel fundamental na conclusão da citocinese, por

promover a desmontagem dos filamentos de actina na telófase, além de funcionar

na migração celular direcionada restringindo as protusões de membrana em uma

direção via cofilina (Kato et al 2008). Fujibuchi e colaboradores mostraram que a

supressão de AIP1/Wdr1 induz o achatamento de células mitóticas, o que sugere

que a atividade de desmontagem dos filamentos de actina seja necessária para

induzir alterações morfológicas das células, especialmente seu arredondamento

durante a mitose (Fujibuchi et al 2005). Um dos sinais de senescência observados

em células em cultura é seu achatamento. A função de Wdr1em células

hematopoéticas, especificamente em megacariócitos e neutrófilos, foi demonstrada

pelo grupo de Kile. O grupo mostrou que enquanto a perda de função do locus

Wdr1 causa letalidade embrionária e macrotrombocitopenia (resultado de defeitos

na maturação de megacariócitos), camundongos com alelos hipomórficos

desenvolvem uma doença autoinflamatória, caracterizada por infiltração massiva de

neutrófilos (Kile et al 2007). Esses achados indicam que a dinâmica dos filamento

de actina, mediada por cofilina e Wdr1, é crítica no desenvolvimento e função de

ambas as células.

CapG (proteína reguladora de actina) é uma proteína sensível ao Cálcio, da

família da gelsolina, que bloqueia reversivelmente as terminações barbed de

filamentos de actina. O grupo de Hubert propôs um papel para a proteína como

Discussão mediador da interação entre o citoesqueleto de actina e organelas ligadas aos

microtúbulos que regulam a divisão celular (Hubert et al 2009). Foi demonstrada a

expressão aumentada de CapG em câncer de mama, especialmente durante a

metástase, e o gene que codifica CapG tem sido considerado como um putativo

oncogene (Renz et al 2008). Além disso, o aumento na expressão de CapG induz

a motilidade celular (Renz et al 2008).

A enzima UCHL (Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1) é uma tiol

protease que reconhece e hidroliza a ligação peptídica no C-terminal da glicina da

ubiquitina, estando envolvida tanto no processamento de precursores de ubiquitina,

quanto de proteínas ubiquitiniladas. A proteína UCHL é responsável por desmontar

cadeias de poliubiquitina, para aumentar a disponibilidade de ubiquitinas

monoméricas livres para o sistema proteassomo/ubiquitina, favorecendo a

degradação protéica. Mutações no gene UCHL-1 têm sido associadas à doença de

Parkinson (Barrachina et al 2006).

As actinas são proteínas altamente conservadas que estão envolvidas em

vários tipos de mobilidade celular e são expressas ubiquitariamente em todas as

células eucarióticas. A proteína ACTBL2, ou κ-actina, foi encontrada em níveis

aumentados em carcinoma hepatocelular, possivelmente substituindo as β-actinas

do tecido como maiores constituintes do citoesqueleto celular (Chang et al 2006).

A proteína VCL (vinculina), também conhecida como metavinculina, está

presente em complexos de adesão focal, que conectam a matriz extracelular ao

citoesqueleto de actina da célula. Esses complexos são essenciais para a

morfologia e locomoção celular (Schäfer et al 2008).

Discussão

A proteína CALD1 (Caldesmon 1) é uma proteína regulatória envolvida na

contração actina-miosina e na estabilidade dos filamento de actina (Mayanagi et al

2008).

Todas essas proteínas apresentam funções relacionadas principalmente à

motilidade e forma celular, proliferação e ciclo celular, processos cujo controle

diminui em células senescentes. Nesta passagem em cultura, a quantidade de

células senescentes é provavelmente bem alta, contribuindo para a mudança no

perfil de expressão protéica observado.

Neste trabalho, foi observada a aquisição de alterações citogenéticas nas

culturas de CTM a partir da passagem 6, que se mantiveram até a última

passagem analisada (P10). O desenvolvimento de alterações cromossômicas em

culturas de CTM foi observado por alguns grupos, mas não por outros,

provavelmente devido a diferenças nas metodologias de cultivo das células. O

grupo de Bochkov mostrou uma incidência aumentada de alterações citogenéticas

em culturas de CTM humanas quando comparadas com culturas de linfócitos de

sangue periférico. O papel dessas alterações não foi esclarecido, mas os autores

sugerem que seja pouco provável que elas não sejam importantes para atestar a

qualidade das células para terapias celulares, mostrando a necessidade de um

controle citogenético das células para tal fim (Bochkov et al. 2007). Já o grupo de

Izadpanah mostrou que CTM humanas cultivadas in vitro não desenvolvem

alterações cromossômicas, apesar de ter sido detectada uma alta frequência de

aneuploidias cromossômicas em CTM de macacos Rhesus em passagens mais

avançadas (Izadpanah et al. 2008). O grupo de Bernardo também mostrou que

CTM humanas cultivadas in vitro não desenvolvem anormalidades cromossômicas

Discussão (Bernardo et al. 2007). CTM de camundongos, porém, apresentam uma alta taxa

de instabilidade cromossômica, conforme demonstrado pelo desenvolvimento de

aberrações estruturais e numéricas mesmo nas primeiras passagens em cultura

(Miura et al. 2006).

Alguns genes marcadores, embora não exclusivos de CTM, foram escolhidos

para a análise molecular das células ao longo das passagens em cultura. O RNAm

da citocina SCF é constitutivamente expresso por CTM indiferenciadas, e seus

níveis de expressão são mantidos após diferenciação em meio osteogênico. Tanto

CTM pré-cultivadas em meio controle quanto em meio osteogênico apresentam

capacidade similar de dar suporte a culturas de longa duração (Majumdar et al.

2000). Vacanti e colaboradores mostraram em culturas de CTM porcinas que a

expressão de SCF, assim como de outras citocinas hematopoéticas como G-CSF

e LIF, diminui em células submetidas a mais passagens em cultura (Vacanti et al.

2005). CD44 é uma glicoproteína de adesão envolvida no contato de HPC com

CTM humanas, conforme demonstrado por Wagner e colaboradores, e que é

expressa em culturas indiferenciadas de CTM (Wagner et al. 2008a). As proteínas

BMP 2/4 desempenham papéis fundamentais na embriogênese e no

desenvolvimento esquelético. Elas agem em suas células alvo através de dois

tipos de receptores serina/treonina quinase, BMPR-I e BMPR-II (Watanabe et al.

2007). Nossas análises para a expressão dos três genes, SCF, CD44 e BMPR-IA,

em culturas de CTM ao longo de suas passagens mostram que as células mantêm

um perfil constante até a passagem 5. Tais genes são conhecidamente expressos

em células indiferenciadas, e nossos resultados sugerem que, até a passagem 5,

as culturas apresentam células em estado indiferenciado.

Discussão

Nossos resultados da segunda parte do trabalho sugerem que o procedimento

de cultivo in vitro de células estromais é capaz de uniformizar a população em

cultura, pelo menos no que diz respeito a seu perfil molecular, tanto em relação ao

padrão de expressão de genes de indiferenciação, quanto em relação ao padrão

proteômico. Apesar de o cultivo in vitro induzir a senescência de células em cultura,

nossos dados mostram que o padrão molecular observado em passagens iniciais

se mantém até passagens mais avançadas. As alterações observadas no perfil

proteômico a partir da passagem 9 sugerem ainda modificações em proteínas

relacionadas principalmente às funções do citoesqueleto de actina. No entanto,

alterações cromossômicas foram detectadas mesmo em passagens em que o perfil

molecular e de modulação do sistema imune das culturas de CTM se manteve,

indicando que a análise citogenética é a metodologia mais adequada para o

controle de qualidade das preparações de CTM, e que a utilização dessas

preparações em protocolos de terapia celular deve ser realizada com cautela e

associada a um rigoroso controle citogenético.

Neste trabalho, foi realizado também o estudo proteômico de CTM

submetidas à diferenciação in vitro para as linhagens osteogênica e adipogênica. A

identificação de proteínas diferencialmente expressas entre CTM não diferenciadas

e células submetidas à diferenciação in vitro através de abordagens proteômicas já

foi realizada por alguns grupos nesta área. Foster e colaboradores (2005) utilizaram

a cromatografia líquida associada à espectrometria de massas tandem (LC-MS/MS)

para identificar variações de proteínas de membrana após a indução da

diferenciação osteogênica de CTM estabelecidas em cultura pela superexpressão

da telomerase humana. Neste trabalho, foi possível a identificação de 463

proteínas, incluindo os marcadores conhecidos de CTM, como SH3 (CD71), SH2

Discussão (CD105), CD166, CD44, Thy1, CD29 e CD63 (HOP26). Dentre essas proteínas,

estão também incluídas proteínas integrais, ancoradas ou associadas à membrana,

integrinas e moléculas de adesão celular, receptores e GTPases relacionadas a

Ras. Após a diferenciação osteogênica, proteínas como fosfatase alcalina (ALP),

proteína versican core e tenascina tiveram um aumento de expressão de pelo

menos 2 vezes, enquanto outras diminuíram sua expressão na proporção inversa.

Entretanto, esse estudo tem certas limitações, como a utilização de uma célula que

superexpressa hTERT, o que poderia afetar as funções fisiológicas da célula; o

método para diferenciação das CTM foi o tratamento a curto prazo com calcitriol (4

dias), que induziu a expressão de vários RNA marcadores de diferenciação

osteoblástica, mas que a coloração para fosfatase alcalina revelou

heterogeneidade, sugerindo que nem todas as células estavam sincronizadas no

fenótipo diferenciado.

Outro trabalho que estudou os perfis de expressão protéica de CTM

submetidas à diferenciação osteogênica foi realizado por Zhang e colaboradores

(2007), utilizando eletroforese bidimensional e MALDI-TOF-MS. Mapas proteômicos

foram gerados de células não diferenciadas e de células induzidas em meio

osteogênico após 3 e 7 dias de cultivo. Cinqüenta e duas proteínas foram

identificadas como diferencialmente expressas entre as células não diferenciadas e

as diferenciadas, a maioria envolvida no metabolismo celular, como ciclo de Krebs,

metabolismo de aminoácidos, glicólise e biossíntese de proteínas. Apesar de terem

sido identificadas proteínas de conhecido papel na osteogênese, como Anexina A1,

Anexina A2, Anexina V e OSPBL7, o período de indução osteogênica das CTM foi

curto, de apenas 7 dias, e não foi realizado nenhum ensaio para demonstrar a

diferenciação das células no momento da extração de proteínas. As proteínas

Discussão identificadas como diferencialmente expressas provavelmente estão envolvidas no

início do comprometimento osteogênico das CTM.

O proteoma de membrana de CTM submetidas à diferenciação adipogênica foi

analisado por Jeong e colaboradores (2007), utilizando cromatografia líquida (LC) e

eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massas. Setecentos e

sete proteínas foram identificadas nas culturas não diferenciadas pela metodologia

de cromatografia líquida, das quais metade estava associada direta ou

indiretamente ao sistema de membrana celular. A análise de proteínas de

membrana contendo ectodomínio revelou uma série de novos marcadores de

membrana para as CTM da medula óssea, adequados para o desenvolvimento de

anticorpos para isolamento e identificação celular. Análises por cromatografia

líquida mostraram grandes diferenças na constituição da membrana celular entre a

população de células diferenciadas e não diferenciadas, tais como a emergência de

várias enzimas do metabolismo lipídico.

Em nossa análise, identificamos dois grupos de proteínas cuja expressão

aparece bastante reduzida nos géis bidimensionais de culturas de CTM após a

diferenciação: as várias isoformas das cadeias da proteína Tubulina (TUB) e da

proteína Caldesmon (CALD1). TUB é o maior constituinte dos microtúbulos. Liga-se

à actina e à miosina, e está implicada na regulação da interação entre as duas

proteínas, em células musculares e não musculares, enquanto que CALD1 é uma

proteína regulatória envolvida na contração actina-miosina e na estabilidade dos

filamento de actina (Mayanagi et al 2008). Nossos dados sugerem que a

diferenciação das CTM afeta a estrutura do esqueleto de actina das células, e que

este seja um evento importante durante o processo.

Discussão

Mais análises ainda precisam ser realizadas para identificar novas proteínas

envolvidas na diferenciação in vitro das CTM. No entanto, a metodologia

proteômica se mostrou uma ferramenta bastante promissora neste sentido,

revelando novos mecanismos, e permitindo o estudo de proteínas envolvidas nesse

processo.

Conclusões

CONCLUSÕES

� Esse trabalho mostrou que culturas de CTM podem ser obtidas a partir de

amostras de medula óssea de doadores saudáveis através de protocolos

padrão de processamento, cultivo e caracterização in vitro.

� A comparação entre o perfil proteômico e de inibição in vitro da proliferação

de linfócitos de culturas de CTM derivadas de diferentes doadores mostrou

a uniformização da expressão de proteínas majoritárias, mesmo após

somente uma passagem em cultura. Essa similaridade encoraja o uso de

CTM em protocolos terapêuticos de forma independente da compatibilidade

de seu HLA com o do receptor.

� Nossas análises do perfil citogenético sugerem que as células primárias em

cultura apresentam instabilidade genética, levando a alterações

citogenéticas após várias passagens. Mesmo apesar das anormalidades

cromossômicas adquiridas, as culturas continuam a apresentar o potencial

in vitro de inibição da proliferação de linfócitos. A mudança no perfil

proteômico das culturas ocorreu também posteriormente à aquisição da

anomalia cromossômica, indicando que tal ferramenta ainda não está

adequada para o controle de qualidade das preparações de CTM para

utilização em protocolos clínicos. Os dados desse trabalho sugerem que

culturas de CTM devem ser submetidas a poucos subcultivos ex vivo, e

devem passar por um rigoroso controle citogenético prévio à infusão em

pacientes.

� Nossas análises do perfil proteômico e molecular de culturas não

diferenciadas e culturas submetidas à diferenciação osteogênica e

Conclusões

adipogênica mostram que este perfil se altera de forma importante com a

diferenciação das células. No entanto mais análises são ainda necessárias

para melhor definir essas alterações, e estudar seu papel neste processo.

� Esse trabalho mostrou também que mesmo metodologias proteômicas

pouco sensíveis, como a eletroforese bidimensional associada à

espectrometria de massas in tandem, são importantes para o estudo de

células tronco, e capazes de fornecer pistas para a elucidação dos

mecanismos pelos quais as CTM exercem seus efeitos biológicos.

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Anexos

ANEXOS

Artigo publicado na revista Cytotherapy

Lazzarotto-Silva C, Binato R, Rocher BD, Costa JA, Pizzatti L, Bouzas LF, Abdelhay E. Similar proteomic profiles of human mesenchymal stromal cells from different donors. Cytotherapy. 2009;11(3):268-77.