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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE ZOOTECNIA E ENGENHARIA DE ALIMENTOS
MARIANA TRÉS CARDOSO
Comparação molecular entre células-tronco mesenquimais de membrana
amniótica de cão e de gato.
Pirassununga
2015
MARIANA TRÉS CARDOSO
Comparação molecular entre células-tronco mesenquimais de membrana
amniótica de cão e de gato.
Versão Corrigida
Dissertação apresentada Faculdade de Zootecnia e
Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo,
como parte dos requisitos para a obtenção do título de
mestre em Biociência Animal do programa de Pós-
Graduação em Medicina Veterinária.
Departamento:
Medicina Veterinária
Área de Concentração:
Células-tronco
Orientador:
Prof. Dr. Carlos Eduardo Ambrósio
Pirassununga
2015
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Serviço de Biblioteca e Informação da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da
Universidade de São Paulo
Cardoso, Mariana Trés
C268c Comparação molecular entre células-tronco
mesenquimais de membrana amniótica de cão e de gato /
Mariana Trés Cardoso. –- Pirassununga, 2015.
66 f.
Dissertação (Mestrado) -- Faculdade de Zootecnia e
Engenharia de Alimentos – Universidade de São Paulo.
Departamento de Medicina Veterinária.
Área de Concentração: Biociência Animal.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Eduardo Ambrósio.
1. Âmnio de cão 2. Âmnio de gato 3. Células-tronco
4. Potencial carcinogênico.
I. Título.
COMITÊ DE ÉTICA
FOLHA DE APROVAÇÃO
Nome: CARDOSO, Mariana Trés
Título: Comparação molecular entre células-tronco mesenquimais de membrana amniótica de
cão e de gato.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Biociência Animal da Faculdade de Zootecnia e
Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo
para a obtenção do título de Mestre em Ciências.
Data: 21/09/2015
Banca Examinadora
Prof.Dr. Felipe Perecin
Instituição: FZEA – USP Julgamento:______________________________________
Profa. Dra. Celina Almeida Furlanetto Mançanares
Instituição: UNIFEOB - Julgamento:____________________________________________
Prof.Dr. Carlos Eduardo Ambrósio
Instituição:FZEA – USP - Julgamento:__________________________________________
Agradecimentos
Primeiramente irei agradecer a Deus por mais uma vez me guiar na escolha de um
caminho entre tantos oferecidos pela vida motivada pela certeza de que tudo fará sentido no
futuro.
Ao meu orientador Dr. Carlos Eduardo Ambrósio pela oportunidade, confiança e
ensinamentos.
Aos meus queridos pais e irmã, Djalma, Edna e Marcela pelo apoio, paciência,
compreensão, mesmo parecendo não entender exatamente aonde quero chegar, sempre
depositaram confiança nas minhas escolhas.
Ao meu namorado e amigo, Bruno Viana, pelo companheirismo, apoio, estímulo e
muita paciência sempre instigando minha calma e foco.
A todos os colegas de laboratório pelo compartilhamento de aprendizado
fundamentais para o andamento de todos os trabalhos.
Especiais: Alessandra Oliveira, Atanásio Vidane e Vanessa Cristina de Oliveira devido ao
auxilio técnico, ensinamentos, apoio psicológico, compartilhamento de alegrias e tristezas,
choros e risos, que resultaram em horas imensuráveis de parceria e peculiaridades que
guardarei para sempre.
A Médica Veterinária Mr. Juliana B. Casals que devido as suas horas incansáveis em
proporcionar bem estar animal, foi fundamental para o andamento deste projeto e obtenção
das fontes de células tronco trabalhadas.
À Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos e o programa de pós-graduação
em Biociência animal, pela oportunidade de realização do curso de mestrado.
Á Coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior (CAPES), pela
concessão da bolsa emergencial de mestrado.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela concessão
da bolsa de mestrado e pelo apoio financeiro para a realização desta pesquisa (processo
2013/23850-0).
RESUMO
CARDOSO, M. T. Comparação molecular entre células-tronco mesenquimais de
membrana amniótica de cão e de gato. 2015. 66 f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de
Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2015.
As membranas amnióticas humana, felina e canina representam uma boa fonte de células-
tronco mesenquimais multipotentes. Sua obtenção não causa conflitos éticos, pois o âmnio é
comumente descartado após o nascimento do indivíduo. Devido à característica inovadora da
utilização de células-tronco na medicina regenerativa, diversos testes estão sendo realizados a
fim de sanar dúvidas sobre possíveis complicações de seu emprego, tais como: infecções no
ato da aplicação, deterioração da função tecidual e principalmente sobre o potencial
tumorigênico das linhagens celulares. O teste tumoral foi negativo nas espécies felina e
humana, viabilizando a utilização deste tipo de célula nestas espécies, porém, o mesmo teste
foi realizado em cães anteriormente com resultado positivo para formação tumoral. A
proposta deste estudo é traçar um perfil comparativo sobre as características de cultivo,
marcadores moleculares e ensaio tumoral na membrana amniótica canina e felina. Para a
obtenção das células, foram utilizadas placentas oriundas de 9 gestações caninas nas idades
entre 35 a 45 dias, 1 gestação canina de 25 dias e 3 gestações felinas nas idades de 35 a 45
dias por procedimento de cesariana seguida de castração em clínicas da região de
Pirassununga. O âmnio foi separado manualmente das outras membranas fetais e
acondicionado em placas de Petri, submetido à maceração manual, para posterior cultivo em
meio adequado para cultura de células mesenquimais. Após o estabelecimento do cultivo,
foram realizadas análises de imunocitoquímica para marcadores mesenquimais (CD73, CD90
e CD105) e tumoral (CD30) sendo que as células de origem canina mostraram-se positivas
para os marcadores mesenquimais CD73, CD90 e para o marcador tumoral CD30 e as de
origem felina mostraram-se positivas para os marcadores mesenquimais CD73, CD90 e
CD105. O ensaio in vivo realizado com a inoculação das CT’s canina e felina em
camundongos imunossuprimidos (Balb/c NUDE) pelas vias subcutânea, intramuscular e
intraperitoneal não demonstrando formação tumoral após 60 dias da inoculação. Foram
realizadas análises de citometria de fluxo onde as maiores quantificações nas células caninas
foram os marcadores de pluripotência (OCT-4 e SOX2, com 59,4% e 34,35%
respectivamente), e felinas foram os marcadores mesenquimais (CD73 e CD90, com 32,58%
e 23,48%). A análise de qPCR das células felinas demonstrou baixa, expressão de todos os
genes testados (mesenquimais, pluripotência, hematopoiético e teratogênico). Já as células de
origem canina, demonstraram expressão maior do gene mesenquimal (CD90) e do gene de
pluripotência (SOX2 e OCT4). Os achados deste estudo demonstraram por ambas as técnicas
(citometria e qPCR) que as células da membrana amniótica felina tem um potencial
mesenquimal mais evidente do que as caninas e ambas não apresentaram potencial
tumorigênico quando submetidas ao ensaio in vivo.
Palavras-chave: Âmnio de cão, âmnio de gato, células-tronco, potencial carcinogênico.
ABSTRACT
CARDOSO, M. T. Molecular comparison of mesenchymal stem cells from cat and dog
amniotic membrane. 2015. 66 f. Dissertation. (Master's degree) – Faculty of Animal Science
and Food Engineering, University of São Paulo, Pirassununga, 2015.
Human, feline and canine amniotic membranes are a good source of multipotent
mesenchymal stem cells. The obtaining does not cause ethical conflict because the amnion is
usually discarded after the birth. Due to the innovative feature of the use of stem cells in
regenerative medicine, several tests are being conducted to answer some questions about
possible complications of its use, such as infections during application, deterioration of tissue
function and particularly on the carcinogenic potential of amniotic stem cells. Teratoma
formation assays were proved negative in feline and human species, enabling the use of this
type of cell in these species, however, the same test was performed in dogs previously and
was positive for teratomas, condemning its application. The purpose of this study is to trace a
molecular profile and detailed teratogenic test, comparing the canine and feline amniotic
membrane model, since the experiments were favorable to the feline model, in order to find
out where they differ to justify the new data to counteract the results of previous studies using
canine amnion. To obtain cells, it were used placentas from 9 pregnant canines between 35 to
45 days of gestation, one placenta at 25 days from canine and 3 placentas from feline at 35 to
45 days. It was realized caesarean and followed ovarian salpingo hysterectomy at veterinarian
clinics on Pirassununga region. The amnion was manually separated from the other fetal
membranes and placed on Petri dishes. Then was made a manual maceration, later to be
cultivated. After culture establishment were performed immunocytochemical analyzes for
mesenchymal (CD73, CD90 and CD105) and teratogenic (CD30) markers. The canine cells
were positive to the following markers: CD73, CD90 and CD30 and the feline cells were
positive for CD73, CD90 and CD105. Teratogenic test was conducted by subcutaneous,
intramuscular and intraperitoneal inoculation of the canine and feline stem cells, in
immunosuppressed mice (Balb/c NUDE)and was not observed tumor formation after 60 days
of inoculation. Flow cytometry analyzes were performed where the largest quantifications in
canine cells were the genes of pluripotency (Oct-4 and Sox2, 59.4% and 34.35%
respectively), and the feline were performed at the mesenchymal genes (CD73 and CD90,
with 32.58% and 23.48%). PCR analysis of feline cells demonstrated low expression of all
markers tested (mesenchymal, pluripotency, hematopoietic and teratogenic). The cells of
canine origin, showed higher expression of mesenchymal gene (CD90) and pluripotencys
genes (SOX2 and OCT4). The findings of this study demonstrated for both techniques (flow
cytometry and qPCR) that feline amniotic membrane cells has a more potential than the
canine amniotic membrane cells. Both showed no tumorigenic potential when submitted to in
vivo test.
Keywords: Canine Amnion, feline amnion, stem cells, carcinogenic potential.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Coleta e separação da membrana amniótica.............................................................29
Figura 2: Cultivo de células-tronco canina e felina.................................................................36
Figura 3: Ensaio de imunocitoquimica das células-tronco de cães..........................................37
Figura 4: Ensaio de imunocitoquimica das células tronco de gato..........................................38
Figura 5: Figura 5: Gráficos representando as expressões dos genes mesenquimais (CD73 e
CD90) das células mesenquimais caninas (azul) e felinas (Vermelho), em unidades arbitrárias,
pela técnica de qPCR................................................................................................................41
Figura 6: Figura 6: Gráficos representando as expressões dos genes de pluripotência (OCT4 e
SOX2) das células mesenquimais caninas (Azul) e felinas (Vermelho), em unidades
arbitrárias, pela técnica de qPCR..............................................................................................42
Figura 7: Figura 7: Gráficos representando as expressões do gene tumoral (CD30) e
regulador endógeno (CD34) das células mesenquimais caninas (azul) e felinas (vermelho), em
unidades arbitrárias, pela técnica de qPCR...............................................................................42
Figura 8: Figura 8: Gráfico representando a expressão do gene hematopoiético (CD34) das
células mesenquimais caninas (azul) e felinas (vermelho), em unidades arbitrárias, pela
técnica de qPCR........................................................................................................................43
Figura 9: Inoculação de CT’s em camundongos imunossuprimidos.......................................44
Figura 10: Eutanásia e necropsia dos camundongos imunossuprimidos Balb/c NUDE após 60
dias de aplicação de CT’s de cão e de gato...............................................................................45
Figura 11: Corte histológico do fígado, cérebro, baço e intestino delgado de camundongos
imunossuprimidos inoculados com CT’s de cão, sendo controle (Ctr) e inoculado
(Inoc).........................................................................................................................................47
Figura 12 : Corte histológico dos rins, pâncreas, pulmões e intestino grosso de camundongos
imunossuprimidos inoculados com CT’s de cão sendo controle (Ctr) e inoculado
(Inoc).........................................................................................................................................48
Figura 13: Corte histológico do coração, bíceps femoral e estômago de camundongos
imunossuprimidos inoculados com CT’s de cão sendo controle (Ctr) e inoculado
(Inoc).........................................................................................................................................49
Figura 14: Corte histológico do fígado, cérebro, baço e intestino delgado de camundongos
imunossuprimidos inoculados com CT’s amnióticas de cão com 25dias de gestação, sendo
controle (Ctr) e inoculado (Inoc)..............................................................................................50
Figura 15: Corte histológico dos rins, pâncreas, pulmão e estômago de camundongos
imunossuprimidos inoculados com CT’s amnióticas de 25dias de gestação de cão sendo
controle (Ctr) e inoculado (Inoc)..............................................................................................51
Figura 16: Corte histológico do bíceps femoral, coração e intestino grosso de camundongos
imunossuprimidos inoculados com CT’s amnióticas de cão com 25dias de gestação, sendo
controle (Ctr) e inoculado (Inoc)..............................................................................................52
Figura 17: Corte histológico do fígado, cérebro, baço e intestino delgado de camundongos
imunossuprimidos inoculados com CT’s de gato, sendo controle (Ctr) e inoculado (Inoc)....53
Figura 18: Corte histológico dos rins, pâncreas, pulmões e estômago de camundongos
imunossuprimidos inoculados com CT’s de gato sendo controle (Ctr) e inoculado
(Inoc).).......................................................................................................................................54
Figura 19: Corte histológico do bíceps femoral e coração de camundongos imunossuprimidos
inoculados com CT’s de gato sendo controle (Ctr) e inoculado (Inoc)....................................55
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Especificação dos Anticorpos primários utilizados nas análises imunofenotípicas
das células-tronco canina e felina (Concentração
1:100)........................................................................................................................................32
Tabela 2: Especificação dos Anticorpos secundários utilizados nas análises imunofenotípicas
das células-tronco canina e felina.(Concentração
1:300)........................................................................................................................................33
Tabela 3: Especificação dos primers utilizados na avaliação de expressão de genes de
marcadores hematopoiéticos, mesenquimais, carcinogênicos e de pluripotência de CT’s de
cão.............................................................................................................................................34
Tabela 4: Especificação dos primers utilizados na avaliação de expressão de genes de
marcadores hematopoiéticos, mesenquimais, carcinogênicos e de pluripotência de CT’s de
gato............................................................................................................................................34
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 : Quantificação da expressão de marcadores hematopoiéticos, mesenquimais,
carcinogênico e de pluripotência de CT’s da membrana amniótica de origem felina(azul) e
canina(vermelha) por análise de citometria de
fluxo..........................................................................................................................................40
14
SUMÁRIO
1.0 INTRODUÇÃO ................................................................................................................16
2.0 JUSTIFICATIVA.............................................................................................................18
3.0 REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................19
3.1 Membranas Fetais.......... ....................................................................................................19
3.2 Células-Tronco ...................................................................................................................20
3.3 Células-tronco mesenquimais ............................................................................................20
3.4 Âmnio..................................................................................................................................22
3.5 Tumorigênese .....................................................................................................................25
4.0 HIPÓTESE........................................................................................................................26
5.0 OBJETIVOS .....................................................................................................................27
5.1 Objetivos Gerais .................................................................................................................27
5.2 Objetivos Específicos .........................................................................................................27
6.0 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................27
6.1Animais de estudo ...............................................................................................................27
6.2 Cultivo Celular....................................................................................................................28
6.2.1 Padronização do cultivo das células da membrana amniótica ........................................28
6.2.2 Criopreservação ..............................................................................................................29
6.3 Imunocitoquímica ..............................................................................................................31
6.4 Citometria de Fluxo............................................................................................................31
6.5 Expressão gênica.................................................................................................................33
6.5.1 Extração RNA..................................................................................................................33
6.5.2 Preparação do RNA total para amplificação e PCR quantitativo em tempo real.............33
6.6 Avaliação do potencial carcinogênico............................................................................... 35
7.0 RESULTADOS.................................................................................................................36
7.1 Coleta e cultivo celular.......................................................................................................36
7.2 Imunocitoquimica...............................................................................................................37
7.3 Citometria de Fluxo........................................................................................................................40
7.4 Expressão gênica.................................................................................................................41
7.5 Análise Estatística qPCR....................................................................................................44
7.6 Teste de potencial tumorigênico.........................................................................................45
7.6.1 Histologia.........................................................................................................................47
8.0 DISCUSSÃO.....................................................................................................................57
9.0 CONCLUSÃO...................................................................................................................62
10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................63
15
1.0 INTRODUÇÃO
As células-tronco são células progenitoras indiferenciadas que possuem capacidade de
proliferação, autorrenovação e diferenciação em múltiplos tipos celulares. Muitas pesquisas
estão em andamento com a intenção de explorar estas características visando finalidades
terapêuticas (BYDLOWSKI et al., 2009a; PARK et al., 2012; VIDANE et al., 2013). As CTs
podem ser totipotentes, pluripotentes ou multipotentes. As totipotentes apresentam capacidade
de gerar um indivíduo inteiro, pois, além de se diferenciarem nos três folhetos embrionários
(endoderma, mesoderma e ectoderma) são capazes de produzir os anexos fetais. As CTs
pluripotentes também se diferenciam nos três folhetos embrionários, porém não podem se
diferenciar nos anexos embrionários que compõem a placenta. As CTs multipotentes estão
presentes em tecidos totalmente formados ou adultos, são pré diferenciadas para reposição
fisiológica destes, mas ainda podem se diferenciar nos três folhetos embrionários quando
especificamente estimuladas (LAKSHMIPATHY et al., 2005).
As fontes de células- tronco são variadas. Podem ser obtidas de tecidos adultos, tecido
embrionário e anexos fetais (NISHIDA, et al., 2012). A obtenção em tecido adulto fornece
células com menor capacidade proliferativa proporcional a maior idade do indivíduo. Os
tecidos fetais representam uma boa fonte em termos de qualidade celular, porém, dependendo
da fase de sua obtenção implica em morte fetal colocando assim barreiras éticas em defesa
destas células (BYDLOWSKI et al., 2009b). Os anexos fetais representam uma fonte em
evidência, pois geralmente são descartados após o parto e fornecem células com excelentes
características proliferativas e regenerativas (URÂNIO et al., 2011).
Um tipo de célula-tronco (CT’s) que está sendo estudado e até já utilizada em terapia
celular são as células-tronco mesenquimais. Estas estão presentes em tecidos adultos como
repositoras fisiológica (JURGA et al., 2006; CAPLAN, 2009). São células multipotentes que
apresentam grande capacidade de proliferação em diversas linhagens celulares que quando
cultivadas em meios específicos, possuem a capacidade de se propagar e diferenciar em
multiplas linhagens de osteócitos, condrócitos, adipócitos e neurônios (URÂNIO et al., 2011).
A membrana amniótica está se revelando uma fonte produtiva de células-tronco
mesenquimais (BACENKOVÁ et al., 2011; URÂNIO et al., 2011). Ela já é utilizada há
algum tempo como enxerto para doenças ulcerativas corneanas em equinos, caninos, e seres
16
humanos com resultados favoráveis (MOREIRA et al., 2000; VITA et al., 2012). Esta que
geralmente é descartada logo após o parto, possui células-tronco já caracterizadas como do
tipo mesenquimal nas espécies felina, canina, equina e humana (BACENKOVÁ et al., 2011;
URÂNIO et al., 2011;PARK, et al., 2012; VIDANE, et al., 2014.; VITA et al., 2012).
Esta fonte está passando por diversos testes para assegurar a viabilidade de sua
aplicação clinica, porém, os artigos italianos, que muito contribuem para esta área, não
apresentam testes tumorigênicos, mas sugerem este tipo de investigação (RUTIGLIANO, et
al. 2013). A célula-tronco mesenquimal derivada da membrana amniótica felina, mostrou-se
segura sendo negativa para a formação tumoral quando aplicada em camundongos
imunossuprimidos (VIDANE et al., 2014). Esta mesma fonte foi testada com células de
origem humana mostrando os mesmos resultados após aplicação em camundongos
imunossuprimidos (HODGES et al., 2012). Estas células, quando testadas na espécie canina
demonstrou positividade no teste tumorigênico (LIMA et al., 2009).
O modelo experimental canino vem sendo estudado, pelo fato de diversas doenças
genéticas em cães apresentarem similiaridade genética em seres humanos (URÂNIO et al.,
2011). Um exemplo desta similaridade é a distrofia muscular do golden retriever e a distrofia
muscular humana de Duchenne (KERKIS, et al., 2008).
Atualmente, o mercado pet está conquistando um lugar importante na sociedade. As
famílias consideram seus animais como parte delas. A procura pela terapia regenerativa na
medicina veterinária já é uma realidade. Nossa proposta é explorar detalhes sobre a membrana
amniótica canina a fim de decifrar pontos que possam justificar o resultado tumorigênico
encontrado no trabalho de Lima et al. (2009), visto que julgamos uma fonte promissora que
mostrou características positivas em felinos e humanos. Todos os testes e procedimentos
realizados com a membrana amniótica canina, serão efetuados utilizando o modelo felino,
traçando uma comparação entre estas espécies.
17
2.0 JUSTIFICATIVA
Devido à escassez na literatura em relação às características moleculares da membrana
amniótica canina, o presente estudo pretende investigar a segurança biológica das células-
tronco amniótica desta espécie de uma forma comparativa com a membrana da espécie felina
a fim de contribuir e fornecer dados para uma possível aplicação clínica futura.
A escolha da fonte celular canina e felina relaciona-se com proximidade destas
espécies na rotina clínica veterinária e foco de campanhas de castração e, além disso, ao fato
de que a placenta é um órgão geralmente descartado após o parto e, devido a isto, não
existirem entraves éticos para estudo de seus tecidos.
De acordo com a literatura já publicada, as células da membrana amniótica canina
demonstraram positividade no teste tumorigênico, porém, este mesmo trabalho sugere a
continuidade de estudos com este tecido, devido às inúmeras vantagens desta fonte de células-
tronco. A medicina regenerativa em cães deve ser explorada, pois existe grande similaridade
de disfunções genéticas ocorridas entre esta espécie e a humana. A exploração de novos
recursos terapêuticos em cães traz benefícios, tanto para medicina humana, como para a
veterinária, já que os animais domésticos são importantes modelos de estudo para futuras
aplicações na terapia e medicina regenerativa.
18
3.0 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Membranas fetais
A placenta é um órgão temporário que desempenha funções metabólicas (síntese de
glicogênio, por exemplo), transporte de nutrientes e gases, produção hormonal, respiração,
proteção e excreção entre mãe e feto durante a gestação. A porção fetal é conhecida como
córion e a porção maternal como decídua basal e é derivada do endométrio (MOORE et al.,
2008b; JUNQUEIRA et al., 2011; ARALLA et al., 2013).
A placenta canina e felina é classificada de acordo com a organização das vilosidades
coriônicas como zonária, pois estas formam uma faixa equatorial que circunda os fetos. Sobre
sua relação circulatória com os tecidos maternos, ela é classificada como endotéliocoreal, ou
seja, durante o parto, o tecido uterino materno é perdido e o endotélio maternal mantém
íntimo contato com o córion (JAINUDEEN et al., 2004; WOODING et al., 2008; ARALLA
et al., 2013). A placenta da gata doméstica é classificada como zoonária incompleta, pois,
possui uma área de fissura placentária (AMBRÓSIO et al., 2004). A placenta é formada e
compartimentalizada pelas membranas fetais que ajudam na execução das diversas funções
atribuídas a este órgão, além de separar o embrião ou o feto do endométrio. As membranas
fetais são o córion, o âmnio, o saco vitelino e o alantóide (MOORE et al., 2008b). O cório
envolve o embrião e todas as outras membranas fetais e é a porção placentária que está
intimamente ligado a parede interna do útero (JAINUDEEN et al., 2004). O alantóide é o
precursor do sistema urinário. Esta vesícula é responsável por armazenar lixo metabólico
residual durante a gestação (WOODING et al., 2008). O cordão umbilical faz a ligação
vascular entre a mãe e o feto (JAINUDEEN et al., 2004).
Durante a fase de gastrulação, período em que se formam as três camadas
germinativas (endoderma, mesoderma e ectoderma), ocorre a dobra do trophectoderma sobre
o mesoderma extra embrionário revestindo o disco embrionário com uma delgada membrana
que se funde em uma região (mesamnion) dando origem a cavidade amniótica (VEJLSTED,
2010).
A membrana amniótica forma o revestimento epitelial do cordão umbilical e uma
cavidade delimitada por sua membrana onde contém liquido amniótico que envolve
diretamente o embrião/feto durante toda a gestação dos carnívoros. O liquido amniótico é
formado por secreção das próprias células amnióticas, fluido tecidual materno por difusão,
19
troca de fluidos através da pele do feto antes da sua queratinização, secreção do trato
respiratório, urina e mecôneo do feto (MOORE et al., 2008b). As funções do liquido
amniótico são: barreira contra agentes infecciosos, permite o crescimento simétrico do
embrião, bem como sua movimentação e desenvolvimento da musculatura dos membros,
hidratação, permite o desenvolvimento normal dos pulmões, impede a aderência entre o feto e
a membrana amniótica, envolve o feto absorvendo impactos oriundos de traumas externos,
auxilia no controle da temperatura além de homeostasia dos fluidos e eletrólitos fetais
(MOORE et al., 2008b; WOODING et al., 2008).
3.2 Células-Tronco
As células-tronco são células precursoras indiferenciadas com capacidade de
autorrenovação em estado ainda indiferenciado o que confere a elas a característica de
reposição de tecidos injuriados devido a sua capacidade de se diferenciar em diversos tipos
celulares (BYDLOWSKI et al., 2009a; PARK et al., 2012). Elas podem ser isoladas de
diversas fontes teciduais, como tecido adiposo, tecido de papila dental, placenta, e medula
óssea (NISHIDA, et al., 2012). A utilização de células tronco em reparo tecidual é uma
promessa em ascensão. Porém, estudos minuciosos ainda devem ser realizados a fim de tornar
o procedimento seguro e sanar dúvidas sobre reais complicações possíveis como infecções no
ato da aplicação, deterioração da função tecidual e principalmente sobre o potencial
carcinogênico da técnica. Por isso, diversos estudos estão sendo realizados em modelos
experimentais animais antes de se propor sua aplicação para seres humanos (NISHIDA, et al.,
2012).
3.3 Células-tronco mesenquimais
São células presentes em todos os tecidos do indivíduo adulto atuando como fonte
repositora fisiológica com o objetivo de reparação tecidual individual especifica (JURGA et
al., 2006; CAPLAN, 2009). Os primeiros estudos realizados foram feitos com sangue
coletado da medula óssea (URÂNIO, et al., 2011). Segundo Bydlowski et al. (2009b) e Vita et
al. (2012), as fontes de células-tronco mesenquimais adultas, como da medula óssea, por
20
exemplo, são escassas possuindo limitações na expansão contínua, já que sua proliferação, no
indivíduo adulto tem sua resposta diminuída conforme o envelhecimento. Por estes motivos,
tem se estimulado a pesquisa de novas fontes de células mesenquimais a partir de anexos
fetais (VITA et al., 2012). Elas apresentam grande capacidade de gerar diferentes tecidos
(ossos, cartilagens, músculo, neurônio, gordura) quando expostas a agentes indutores
específicos mesmo tratando-se de uma linhagem celular diferente de sua origem. Esta
capacidade é conhecida como plasticidade (BYDLOWSKI et al., 2009a; CAPLAN, 2009). As
células-tronco mesenquimais são definidas como células-tronco multipotentes, ou seja, sob
condições controladas podem se diferenciar em diversos tipos celulares in vitro e in vivo
(URÂNIO et al., 2011). Células multipotentes já apresentam um direcionamento a uma
linhagem específica para certo tipo celular, porém, ainda podem se diferenciar em tipos
celulares distintos dos tecidos relacionados (BYDLOWSKI et al., 2009a). Uma das
características particulares das células-tronco mesenquimais é que quando cultivadas in vitro,
apresentam característica de aderência ao plástico e formação de colônia mimetizando
fibroblastos (fibroblastóide) (BYDLOWSKI et al., 2009a).
De acordo com Dominici et al. (2006) que, baseado nos critérios da sociedade
internacional de terapia celular , descreve pontos característicos mínimos para a classificação
de uma célula em mesenquimal, estas células devem apresentar as seguintes características:
- positividade para os marcadores mesenquimais CD73, CD90 e CD105, negatividade
para os marcadores hematopoiéticos CD34, CD45 e CD14.
- formato fibroblastóide.
- aderência ao plástico.
- diferenciação em tecido adiposo, condroblasto, osteoblasto quando estimuladas in
vitro.
A aplicação clinica das CTs é bastante discutida e muitas vezes controvérsia. Questões
como a via de aplicação, compatibilidade, fonte, potencial tumorigênico, potencial
regenerativo, efeitos colaterais, resultados esperados de fato, são as mais abordadas e
colocadas em prova. A medicina humana coloca uma grande expectativa no potencial
regenerativo destas células, porém, a pesquisa em modelos animais precisa percorrer um bom
caminho a fim de responder todas as questões citadas acima como forma de garantir a
segurança da nova terapia (BYDLOWSKI et al., 2009a; BIANCO, et al.; 2013).
21
3.4 Âmnio
A placenta tem um papel importante no desenvolvimento embrionário dos mamíferos
proporcionando proteção, oxigenação e nutrição ao feto. Ela é constituída por três camadas, o
córion, âmnio e alantóide (PARK et al., 2012; ARALLA et al., 2013).
A origem do âmnio humano, ocorre após a implantação uterina do blastocisto e sua
divisão em epiblasto e hipoblasto. Ocorre a compartimentalização do epiblasto que libera
amnioblastos formando o assoalho da cavidade amniótica (MOORE e PERSAUD, 2008;
HODGES et al., 2012). Já em carnívoros e equinos, a membrana amniótica surge na fase de
gastrulação, período em que se formam as três camadas germinativas (endoderma, mesoderma
e ectoderma), após a dobra do trophectoderma sobre o mesoderma extra-embrionário
revestindo o disco embrionário com uma delgada membrana que se funde em uma região
(mesamnion) dando origem a cavidade amniótica. Esta membrana envolve o embrião e o feto
durante todo o seu desenvolvimento e deve ser removida pela mãe ou auxiliar veterinário, em
casos de cesariana, imediatamente após o nascimento nas espécies como carnívoro e eqüino
onde a região de encontro das membranas é extremamente intima promovendo a vedação da
cavidade, podendo causar asfixia fetal. O âmnio é ainda recoberto por outra membrana, o
alantóide (VEJLSTED, 2010).
Em análises histológicas em embriões caninos, aos 10 dias de gestação já é possível
detectar uma fina camada epitelial indicando o surgimento da membrana amniótica. Aos 14
dias, a detecção é mais clara, porém nota-se ainda, um íntimo contato e aderência da
membrana com o embrião além de quantidade mínima de liquido amniótico (ARALLA et al.,
2013). Segundo Miglino et al. (2006), aos 20 dias de gestação a membrana amniótica está
completamente formada porém mantém o intimo contato com o embrião. Aos 24 dias o
embrião está mais desenvolvido e as membranas placentárias já podem ser distinguidas mais
facilmente. O âmnio nesta fase mostra-se como uma membrana delgada, transparente,
contendo considerável quantidade de liquido amniótico em seu interior.
A membrana amniótica possui um estroma avascular, é composta por epitélio cúbico
simples, colágeno tipo IV, laminina e uma membrana basal espessa (MOREIRA et al., 2000;
PARK, et al.,2012). Porém, segundo Miglino et al.(2006), o âmnio de carnívoros domésticos
é avascular nos primeiros estágios de gestação, e, por volta dos 24 dias, diversos vasos
sanguíneos de pequeno calibre da membrana interna do alantóide projetam-se em direção ao
22
âmnio. Em um estudo histológico realizado por Aralla et al. (2013) aos 18 dias de gestação já
foi possível detectar projeções de micro capilares sanguíneos a partir do alantóide sobre o
âmnio. Miglino et al. (2006) afirma também que a partir dos 45 dias de gestação, a densidade
e calibre e complexidade dos vasos sanguineos placentários aumentam significativamente.
Este aumento é justificado, provavelmente devido ao período de maior demanda nutricional
fetal, pois a expansão corporal do feto nesta fase é maior. Na última semana de gestação, o
âmnio apresenta uma camada significativa de tecido conjuntivo interposto em seu epitélio
(ARALLA et al., 2013).
Estudos e aplicações clínicas da membrana amniótica humana propriamente dita são
realizados com resultados positivos para auxilio no tratamento de doenças corneanas, tais
como: defeitos epiteliais persistentes secundários a, por exemplo, queimaduras químicas,
lesões penfigóides cicatriciais e sídrome de Stevens Johnson, caracterizada, dentre outras
manifestações, por lesões ulcerativas em junções mucocutâneas de difícil cicatrização com
evolução rápida podendo ser fatal (RITTOLES, et al., 1997; MOREIRA et al., 2000). A
membrana amniótica apresenta características antiadesivas, antibacteriana, antiinflamatória,
proteção da ferida, ajuda na reepitelização por facilitar a adesão e migração das células
epiteliais basais e prevenir a apoptose e restaurar o fenótipo epitelial (MOREIRA et al., 2000).
Segundo Pontes et al. (2011) e Mahbod et al. (2014), a membrana amniótica se destaca como
importante opção estratégica em tratamento adjuvante de diversas afecções oculares, como
mostram alguns recentes estudos de Ghanavati et al. (2014) que utiliza a membrana amniótica
com resultados positivos como adjuvante no tratamento de pterígio, uma afecção
desenvolvida pela exposição crônica a raios UVA e UVB e consequente formação de uma
membrana vascularizada que pode atingir a córnea provocando dor e sensibilidade a
luminosidade e um estudo de Yang et al (2015) onde utiliza a membrana amniótica humana
como auxiliar em procedimentos de trabeculectomia, um procedimento realizado em afecções
oculares como glaucoma demonstrando boa influência na resolução dos casos.
A utilização de células tronco à partir da membrana amniótica, assim como de outros
anexos fetais apresenta vantagens éticas sobre outros métodos, pois sua obtenção não implica
em eutanásia de qualquer exemplar animal ou procedimento invasivo em um segundo
indivíduo, já que este anexo fetal é comumente descartado após o nascimento do animal
(URÂNIO et al., 2011;PARK, et al., 2012; VITA et al., 2012). Estas células apresentam alta
capacidade de diferenciação em tecido adiposo, ósseo, neuronal e cartilaginoso, in vitro, além
23
da capacidade regenerativa e proliferativa (PARK, et al., 2012). Elas representam uma
importante fonte de células-tronco mesenquimais (URÂNIO et al., 2011). Segundo Vita et al.
(2012), as células tronco derivadas de anexos fetais apresentam marcadores de
pluripotenciabilidade como o OCT 4 e o NANOG.
As células-tronco derivadas de epitélio amniótico humano já são caracterizadas, sendo
que estas não expressaram marcadores para células mesenquimais ou hematopoiéticas na
primeira metade da gestação. Já as células derivadas do liquido amniótico, apresentaram
positividade para tais marcadores. Isto ocorre, provavelmente, devido à maior pureza das
células derivadas da membrana amniótica diretamente, já que o liquido amniótico possui uma
mistura de tipos celulares indefinidos (HODGES et al., 2012). O epitélio amniótico humano
mostrou capacidade de diferenciação em musculatura cardíaca, miócito, osteócito, adipócito,
células pancreáticas, hepatócitos, pulmão, células neurais e astrócitos (BYDLOWSKI et al.,
2009b; HODGES et al., 2012). As células amnióticas humanas não induziram formação
tumoral após aplicação em camundongos nudes (HODGES et al., 2012).
Além dos interesses clínicos propriamente ditos, a avaliação dos resultados positivos
ou negativos em modelos experimentais caninos tem grande importância para a extrapolação
comparativa dos resultados para a espécie humana. A maioria das doenças genéticas em cães
apresentam similaridade com as disfunções ocorridas em seres humanos (URÂNIO et al.,
2011).
As células-tronco derivadas da placenta possuem características atrativas para a
medicina regenerativa como plasticidade e imunomodulação. As células derivadas do epitélio
amniótico humano são um exemplo desta fonte (HODGES et al., 2012). Elas expressam o
antígeno leucocitário G imunossupressivo (HLA-G) como proteção da apoptose e rejeição do
feto durante a gestação (HODGES et al., 2012). A ausência de expressão de antígenos
polimórficos como HLA-A, HLA-B, HLA-C(Classe IA) e HLA-DR(Classe II) na superfície
celular e a baixa expressão de moléculas coestimulatórias CD40, CD80 e CD86 sugerem que
o tecido da membrana amniótica apresenta baixas taxas de rejeição nas aplicações
terapêuticas nos casos de alotransplantes e xenotransplantes (MOREIRA et al., 2000;
URÂNIO et al., 2011).
O conhecimento do desenvolvimento da membrana amniótica nos dá suporte para
sugerir a melhor fase para análises com a mesma visando um tecido com quantidade aceitável
de capilares sanguíneos, por exemplo, mínima quantidade de tecido conjuntivo, além de uma
24
fase visível e palpável para obtenção da membrana. O intervalo intermediário dentre 35 e 45
dias foi escolhido por nós considerando todos os fatores morfológicos de desenvolvimento
citados acima.
3.5 Tumorigênese
O desenvolvimento e manutenção celular de um organismo são orquestrados por
mecanismos intrínsecos de controle. As células-tronco participam disto, principalmente no
que diz respeito à reposição celular desde a formação embrionária até a fase adulta do
indivíduo. Todo processo que envolve diferenciação celular é passível de desorganização e
rompimento destes mecanismos controladores podendo gerar erros de diferenciação
(mutações) a níveis celulares germinativos e somáticos culminando em problemas funcionais
e neoformações (BAPAT, 2007). A alteração de genes regulatórios da atividade celular é
fundamental no desencadeamento de uma desordem molecular que favorece o surgimento da
neoplasia (FARIA & ROBENHORST, 2005). Estudos in vivo e in vitro demonstram que uma
pequena quantidade de células contidas em uma neoplasia apresentam características tronco
demonstrando capacidade de autorenovação. Portanto, algumas células tumorais podem, a
partir de um estimulo externo iniciar diferenciação em qualquer outro tipo celular garantindo,
assim a perpetuação e autorenovação tumoral, enquanto outros tipos celulares presentes ali
acabam morrendo (HOUGHTON et al., 2007).
As características de autorenovação, organização seguindo uma hierarquia, resistência
a apoptose e a ação de fármaco, migração e intensa proliferação sugerem o envolvimento das
células tronco em processos tumorais. Mudanças no microambiente celular, alterações
metabólicas, disfunção no processo de divisão celular podem gerar mutações gênicas. A
amplificação destas alterações genéticas acarretam em neoplasias primária heterogênea
(BAPAT, 2007).
Uma questão preocupante que envolve as terapias com células-tronco é sobre o
mecanismo efetivo de controle da diferenciação destas células que garantam a não formação
de neoplasias (BAPAT, 2007). Por isso, os testes carcinogênicos são tão importantes antes de
se programar um estudo pré-clínico utilizando tais células.
O carcinoma embrionário é um tumor maligno derivado de células tronco que
apresenta características de máxima totipotenciabilidade sendo capaz de produzir distintos
25
tipos celulares tanto malignos quanto benignos. O marcador CD30 é o principal marcador
encontrado neste tipo de neoplasia (PREDA et al., 2012). Este marcador também é detectado
em outros tipos de câncer como linfoma anaplástico de células grandes e linfoma de Hodgkin
(JUNIOR et al., 2006; SANTOS, et al., 2008).
O gene C-MYC dá origem a fosfoproteínas nucleares altamente conservadas. Pertence
a família de oncogenes Myc juntamente com as derivações Myc-1, Myc-2 e Myc-3, N-Myc,
L-Myc. É apontado como um dos principais marcadores de processos tumorigênicos em
diversos tipos de cânceres como neuroblastomas e carcinoma de pulmão. Está envolvido na
regulação do ciclo celular, diferenciação, metabolismo, crescimento, apoptose, instabilidade
genômica, enfim, todo controle de proliferação celular, portanto, é associado a neoplasias
quando há uma ativação descontrolada deste gene, secundária a uma mutação, desregulando
totalmente sua atividade e permitindo uma neoformação tumoral (FARIA & ROBENHORST,
2005).
O gene P53 é considerado um gene de supressão tumoral, pois, assim como o gene C-
MYC, está envolvido nos processos regulatórios de metabolismo e diferenciação celular,
portanto, sua presença em processos tumorais também ocorre em casos de mutações que
predispõe a alterações citogenéticas e, consequentemente a formação tumoral. Estás mutações
podem estar presentes em inúmeros tipos de tumor, como bexiga, pulmão, mama, cérebro,
ovário, próstata, entre outros (VELDHOEN et al., 1999, HOLLSTEIN et al., 1999).
4.0 HIPÓTESE
A membrana amniótica canina representa uma fonte viável de células-tronco
mesenquimais apresentando resultados negativos para a formação tumoral quando aplicada
em camundongos imunossuprimidos demonstrando características moleculares semelhantes às
células-tronco mesenquimais derivadas da membrana amniótica felina.
26
5.0 OBJETIVOS
5.1 Objetivos Gerais
Obter dados comparativos entre a membrana amniótica canina e felina em relação ao
cultivo de células-tronco, identificação de marcadores mesenquimais, pluripotência,
hematopoiéticos, metabólicos e teratogênico, avaliando ainda o potencial tumorigênico das
mesmas, com intuito de viabilizar ou não a utilização da célula de origem canina para terapia
celular.
5.2 Objetivos Específicos
- Isolar células-tronco mesenquimais de membrana amniótica de fetos caninos e
felinos no intervalo gestacional de 35 a 45 dias.
- Identificar através da técnica de imunocitoquímica, citometria de fluxo e qPCR a
expressão de marcadores de origem mesenquimal (CD90, CD105 e CD73) marcador
tumorigênico (CD30), reguladores dos mecanismos de proliferação celular (P-53, C-MYC) e
marcadores hematopoiéticos (CD45 e CD34) nas culturas de células-tronco provenientes do
âmnio canino e felino na passagem P3.
- Inocular as células-tronco de membrana amniótica canina e felina em camundongos
imunossuprimidos (Nudes) na fase P3 pela via subcutânea, intramuscular e intraperitoneal
para ensaio tumoral.
6.0 MATERIAL E MÉTODOS
6.1 Animais de Estudo
O presente estudo foi realizado no Laboratório de Células tronco e Terapias Gênicas
do Grupo de Desenvolvimento de Tecnologias Inovadoras (GDTI) (www.gdti.fzea.com.br)
localizado na Unidade Didática Clínico Hospitalar (UDCH) na Faculdade de Zootecnia e
Engenharia de Alimentos (FZEA) da Universidade de São Paulo- Pirassununga sob a
concessão do comitê de ética (protocolo nº1312823742). As membranas amnióticas utilizadas
27
foram provenientes de úteros gravídicos de fêmeas sem raça definida oriundas de campanhas
de castrações da cidade de Pirassununga. Foram utilizados 9 gestações caninas nas faixas
etárias entre 35 a 45 dias, uma gestação canina de 25 dias e 3 gestações felinas na faixa etária
entre 35 e 45 dias totalizando 13 gestações e 28 membranas amnióticas como fonte de células-
tronco sendo que a partir dos cultivos, estas células foram divididas e destinadas as análises
propostas por este estudo. Todo o procedimento de coleta e separação da membrana foi
realizado em fluxo laminar. Os fetos foram mensurados baseados pela técnica de Crown-
Rump (CR) preconizada por Evans e Sack (1973) e recentemente por Martins et al. (2011) e
Pieri et al. (2015).
6. 2 Cultivo Celular
6.2.1 Padronização do cultivo das células da membrana amniótica
O método e protocolo de cultivo foi baseado nos trabalhos de caracterização de
células-tronco mesenquimais de membrana amniótica canina descritos por Lima et al. (2009),
Urânio et al. (2011), Park et al. (2012) e e felina descrito por Vidane et al. (2014).
Foram realizadas coletas de úteros gravídicos de acordo com a demanda de castração,
sendo 9 animais doadores da espécie canina, 3 doadores da espécie felina de idades
gestacionais variáveis (35 a 45 dias), além de 1 animal doador da espécie canina de idade
gestacional de 25 dias. A membrana amniótica de cão e gato foi separada dos outros anexos
fetais, coletada e colocada em placas de Petri (Figura 1). Estas foram lavadas em solução de
PBS, maceradas mecanicamente com auxílio de uma lâmina de bisturi até a obtenção de um
homogeneizado dos fragmentos de tecidos, em torno de 3mm de diâmetro. Estes fragmentos
foram colocados em placas de Petri de 35mm contendo meio Alpha MEM (gibco, Life
Technologies®) suplementado com 10% de soro fetal bovino (gibco, Life Technologies®) ) e
1% de antibiótico penicilina e estreptomicina (gibco, Life Technologies®) e após foram
mantidos em incubadora a 38oC com umidade relativa próxima de 80% e atmosfera gasosa de
5% de CO2.
Sobre a coleta e obtenção das células, deve-se ressaltar o cuidado minucioso da
separação da membrana amniótica propriamente dita e do alantóide devido ao íntimo contato
entre estas duas membranas, além dos cuidados de assepsia a fim de evitar contaminação. A
28
obtenção de úteros gravídicos de gatas prenhas foi mais escassa, provavelmente devido aos
hábitos livres e errantes das gatas que muitas vezes acabam emprenhando e parindo longe de
sua região domiciliar.
Figura 1: Coleta e separação da membrana amniótica.
Fonte: (CARDOSO, M. T., 2014)
Legenda: A: Placenta zoonária canina. B: Mensuração Crow-Rump de feto canino com 7cm, indicando a
idade de 42 dias de gestação. C: Separação da membrana amniótica dos demais anexos embrionários. D:
Obtenção da membrana amniótica propriamente dita.
Quando a cultura de células alcançou 60-75% de confluência, as células foram tripsinizadas (2
ml de tripsina a 0,25%, Tryple Express, Gibco) permanecendo encubada por 10 minutos a 37ºC.
Após isto, as células foram centrifugadas em rotação de 1000rpm durante 5 minutos. O
sobrenadante contendo a tripsina foi descartado e o “pellet” celular foi ressuspendido em meio
Alpha MEM suplementado.
6.2.2 Criopreservação
29
A cultura de células provenientes do âmnio foi centrifugada e o “pellet” celular
ressuspendido em meio de congelamento composto por 70% de Alpha MEM suplementado
com 20% de SFB e 10% de DMSO (Sigma, Saint Louis, USA). Este foi distribuído em
criotubos (1 ml para cada criotubo) posteriormente transferidos para o aparelho Mister Frost
(Nalgen) e mantidos em freezer -80°C overnight. Após 24 horas os criotubos foram
acondicionados em nitrogênio líquido, onde permaneceram armazenados em temperatura de -
196ºC para posterior utilização.
Os criotubos foram retirados cuidadosamente do tambor de nitrogênio líquido e
descongelados em banho Maria à temperatura de 37°C. Em seguida as células foram
transferidas para tubos tipo Falcon e adicionados meio de cultivo Alpha MEM.. As amostras
foram centrifugadas a 10000 rpm por 5 minutos, o sobrenadante descartado, o “pellet”
ressuspendido em 2 ml de meio de cultivo, e consequentemente transferido com o meio para
as placas de cultivo acondicionadas em estufa a 37,0o C.
30
6.3 Imunocitoquímica
As células provenientes do âmnio de cães e gatos foram cultivadas sobre lamínulas em
placas de cultivo de 6 poços com 35mm. Após atingirem confluência de aproximadamente
60%, estas foram fixadas com paraformaldeído 4% durante 30 minutos, lavadas com 1ml de
TBS (PBS+TWEEN) 0,1% por 3 vezes de 5 minutos cada, permeabilizadas com Triton – X –
100 a 1% durante 20 minutos em temperatura ambiente. Posteriormente as placas foram
lavadas novamente com solução TBS 0,1% e bloqueadas com BSA (Soro de albumina
bovina) 0,4% durante 30 minutos. Realizaram-se 3 novas lavagens com solução TBS 0,1%.
Em seguida, as células foram incubadas overnight a 4°C com 100 microlitros de solução com
BSA 0,2% e anticorpos primários em cada placa na diluição 1:100 (Tabela 1). Posteriormente,
as placas foram novamente lavadas por 3 vezes com solução de TBS0,1% e adicionado os
anticorpos secundários diluídos na concentração 1:200 em BSA 0,2% (Tabela 2). Após 1 hora
em temperatura ambiente e ao abrigo da luz, realizou-se 3 novas lavagens com solução de
TBS 0,1% e adicionou-se o revelador Hoeschst 33342 na diluição de 1:1000 durante 8
minutos. Em seguida, as placas foram novamente lavadas por 3 vezes com solução TBS 0,1%,
as lamínulas foram retiradas das placas e coladas em lâminas com cola citológica Prolong®
Antifade (Invitrogen, P36934) e avaliadas em microscópio de fluorescência.
Como controle negativo, as células foram incubadas apenas com os anticorpos
secundários na concentração 1:200 diluídos em 0,2% de BSA.
6.4 Citometria de Fluxo
Após atingirem 80% na passagem P3, as células do âmnio de cães e gatos foram
tripsinizadas, centrifugadas, ressuspendidas e distribuídas na quantidade de 105 células em
tubos para citometria de fluxo para cada um dos marcadores a serem analisados (Tabela 1).
Em cada tubo foi colocado 1 mL de solução tampão para lavagem (DBPS (Dubelco´s
Phosphate Buffer Solution) contendo 0,25% de BSA) centrifugadas 600 x g por 8 minutos
para lavagem. As células foram incubadas com o anticorpo primário (diluído a 1:50) e
incubadas em estufa a 37,5°C durante uma hora. Após a incubação estas foram lavadas uma
vez com 1 mL de solução tampão para a retirada do excesso de anticorpo e incubadas com
31
anticorpo secundário (diluído a 1:300) durante uma hora em temperatura ambiente (Tabela 2).
Após nova lavagem, foram fixadas com solução de paraformaldeído tamponado a 2%. Este
protocolo foi utilizado para quantificação de marcadores de membrana (CD34, CD45, CD73,
CD90, CD105, CD30). Para os marcadores nucleares (C-MYC, NANOG, SOX2, OCT-4)
(Tabela 1 e 2), a solução tamponada de lavagem continha PBS + 0,5% de Triton X + 0,1% de
BSA . As células foram submetidas a exposição com solução tamponada contendo 0,1% de
Citrato e 0,5% de Triton X durante 5 minutos. Após, foram submetidas à uma hora de
bloqueio em solução de BSA 10% e à partir desta etapa, passaram pela exposição aos
anticorpos primários e secundários como com os marcadores de membrana.
As amostras foram analisadas utilizando FACSAria (BD) a analise feita no programa
FCS Express V4 (DeNovo software). As populações foram estimadas pela porcentagem das
células expressando cada um de marcadores em relação ao total de células adquiridas
descontando a expressão do controle negativo quando foi o caso.
Tabela 1: Especificação dos Anticorpos primários utilizados nas análises imunofenotípicas das células-tronco
canina e felina (Concentração utilizada, 1:100).
Anticorpo Antígeno Empresa Código Espécie Mono/poli Especificidade
Endoglin (CD105) IgG2a Santa Cruz sc-71042 Rat Mono Mouse
CD34 IgG Santa Cruz sc-7045 Goat Poli Human/mouse/rat
Thy-1 (CD90) IgG Santa Cruz sc-6071 Goat Poli Human/mouse/equine/canine
CD45 IgG2a Santa Cruz sc-101839 Mouse Poli Cow
CD73 IgG Santa Cruz sc-14682 Goat Poli Human/mouse
CD30 IgG1 Santa Cruz sc-46683 Mouse Mono Human/mouse
Oct-4 IgG Abcam Ab18976 Rabbit Poli Mouse, rat, human
Cmyc IgG Santa Cruz sc-788 Rabbit Poli Human
Nanog Sox-2
IgG IgG
Abcam Abcam
Ab80892 Ab97959
Rabbit Rabbit
Poli Poli
Mouse, Monkey, Human,
Sheep, Horse, Cow, Pig
(CARDOSO, M. T., 2014)
32
Tabela 2: Especificação dos Anticorpos secundários utilizados nas análises imunofenotípicas das células tronco
canina e felina.(Concentração utilizada, 1:300).
Anticorpo Empresa Código Antígeno Espécie Mono/Poli Especificidade Goat anti- rabbit IgG (FICT)
Abcam
ab6717 IgG Goat Poli Rabbit
Goat anti- Mouse IgG2b (FICT)
Abcam ab97249
IgG2b Goat Poli Mouse
Alexa Flúor 488(FICT)
Invitrogen A21210 IgG Rabbit Poli Rat
Alexa Fluor 488 (FICT)
Invitrogen A11078 IgG Rabbit Poli Goat
(CARDOSO, M. T., 2014)
6.5 Expressão Gênica
6.5.1 Extração RNA
O RNA total foi extraído utilizando-se o kit TRIzol (Invitrogen), tratado com DNase I
(Invitrogen), a concentração de RNA total celular foi determinada através da utilização do
espectrofotômetro Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, Waltham, MA) e integridade determinada pela
Agilent 2100 Bioanalyzer 6000 Pico LabChip kit (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia,
EUA) . O RNA extraído foi armazenado a -80 °C até o momento da análise.
6.5.2 Preparação do RNA total para amplificação e PCR quantitativo em tempo real
Após a extração do RNA este foi convertido em cDNA com o kit Enzima
Trascriptase reversa superscript III (Invitrogen), segundo recomendações do fabricante. A
amplificação do cDNA foi realizada utilizando-se os seguintes pares de primers desenhados
para os transcritos CD34, CD73, CD90, P53, CD30,OCT4 e SOX2 (Tabela 3 e 4). As
reações de PCR em tempo real foram realizadas no termociclador ABI-7500 utilizando-se o
kit SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems). Todos os genes considerados para uma
dada amostra foram amplificados numa mesma placa de PCR. Previamente ao início das
análises, as condições de amplificação (e.g. concentração de primer, temperatura de
anelamento etc) foram testadas para se definir o melhor padrão de reação. Os valores de
expressão gênica foram expressos em relação à expressão do gene endógeno 18S. Foi
realizado o método ∆∆Ct utilizando o pool celular (3 animais) como calibrador.
33
Tabela 3: Especificação dos primers utilizados na avaliação de expressão de genes de marcadores
hematopoiéticos, mesenquimais, carcinogênicos e de pluripotência de CT’s de cão.
Gene Nome nº acesso Primer Sequência (5’-3’)
CD34 Hematopoiétic
progenitor antigen
NM_001003341.1 Forward
Reverse
CCAAGTACCATCAAGGGAGA
TTGGGTCAGTTTTTCTTCGT
CD73 NT5E-
5’Nucleotidase ecto
XM_532221.4 Forward
Reverse
CAACCTGATTTGTGATGCAA
TGGATTCCATTGTTGCGTTC
CD90 Thy-1 XM_844606.3 Forward
Reverse
CTGTGCTCAGAGACAAACTG
TTAGCCAACTCAGAGAAAGTA
GG
P53 Tumor protein NC_006587.3
Forward
Reverse
GAAGAAGCCACTAGATGGAG
TTCCTGAACATCTCATAGCG
CD30 TNFSRF8 XM_005617984.1 Forward
Reverse
GATTCAGCAGAAGCTGCAC
TCGACCACCGATATACTCTT
Oct -4 POU5F1 XM_538830.1
Forward
Reverse
GCAGTGACTATTCGCAACGA
ATTTGAATGCATGGGAGAGC
Sox2 SRY XM_005639752.1
Forward
Reverse
CCCACCTACAGCATGTCCTA
GGAGTGGGAGGAGGAGGTAA
18S 18S Ribossomal
RNA
XM_541299.4 Forward
Reverse
CCTGCGGCTTAATTTGACTC
CTGTCAATCCTGTCCGTGTC
Fonte: (CARDOSO, M. T., 2014)
Tabela 4: Especificação dos primers utilizados na avaliação de expressão de genes de marcadores
hematopoiéticos, mesenquimais, carcinogênicos e de pluripotência de CT’s de gato.
Gene Nome nºacesso Primer Sequência(5’-3’)
CD34 Hematopoiétic
progenitor
antigen
NC_018739.2 Forward
Reverse
ACCATCAAGGGAGAAATCA
GTCAGTTCCTCCCCATTAC
CD73 NT5E-
5’Nucleotidase
ecto
XM_011282497.1
Forward
Reverse AACCTGATTTGTGATGCCA
TAATTGTGCCGTTGTTCCG
CD90 Thy-1 XM_003992443.3
Forward
Reverse
CTGCAGCAGCAGAGGAC
CCTGCAAGACTGTCAGCAA
P53 Tumor protein NM_001009294.1 Forward
Reverse
CCGAACCTCACTTCCTAAAA
CAGGGAACAGACCTTGATAG
CD30 TNFSRF8 XM_011284600.1 Forward
Reverse
CCATCTCCTTCCTCCTGT
ATATGCAACTCCTCAAGGC
Oct -4 POU5F1 NC_018727.2
Forward
Reverse
TGACAACAACGAAAATCTGC
TCGGTTCTCGATACTTGTTC
Sox2 SRY NM_001173447.1
Forward
Reverse GAAACCAGAGGAAAGGGTG
GATTCTCTAGAGCCACCTG
18S 18S Ribossomal
RNA
XM_006939041.2 Forward
Reverse
CCTGCGGCTTAATTTGACTC
CTGTCAATCCTGTCCGTGTC
Fonte: (CARDOSO, M. T., 2014)
34
6.6 Avaliação do potencial carcinogênico
Para a análise do potencial carcinogênico das células tronco oriundas da membrana
amniótica canina e felina foram efetuadas aplicações de aproximadamente 1x106
células por
via subcutânea (região inter escapular dorsal), intramuscular (bíceps femoral esquerdo) e via
intraperitoneal em camundongos imunossuprimidos (Balb/c - Nude). O teste tumoral foi
realizado em 6 camundongos imunossuprimidos (Balb/c – Nude) que receberam uma injeção
com volume de 0,2 mililitro de solução fisiológica contendo CTM’s em cada via e um animal
controle que recebeu apenas a inoculação de solução fisiológica nas mesmas vias citadas
acima. A idade das membranas amnióticas que serviram de fonte para o teste tumorigênico foi
de 40 dias tanto para células caninas quanto para células felinas, e, uma amostra de CTM’s
oriundas de membrana amniótica de cão com 25 dias de gestação também foi inoculada em
mesma quantidade e vias em 2 camundongos imunossuprimidos (Balb/c – Nude) a fim de se
ter a avaliação teratogênica de células mais jovens com características mais primitivas. Os
animais foram inspecionados periodicamente e submetidos a eutanásia em câmara de CO2 de
acordo com as normas do Comitê de Bioética animal em vigência após 60 dias da data da
aplicação. Amostras de tecido muscular, encéfalo, fígado, rim, baço, pâncreas, pulmão,
intestino, coração, foram coletadas e fixadas em formaldeído tamponado a 4% para análise
histopatológica. Após 72 horas, este material foi processado em álcool e xilol, emblocados em
parafina, cortados com o auxílio do micrótomo LEICA® modelo 2165 na espessura de 5mm e
corados por métodos de rotina (hematoxilina e eosina) para análise histológica.
35
7.0 RESULTADOS
7.1 Coleta e Cultivo celular
A placenta zoonária canina e felina foi coletada, as membranas fetais separadas para
obtenção da membrana amniótica e seu processamento. Em cultivo, apresentaram morfologia
fibroblastóide e aderência a placa de cultivo. O período entre passagens foi de
aproximadamente 6 dias para as células caninas e 4 dias para as células felinas (Figura 2)
Figura 2: Cultivo de células-tronco canina e felina.
Fonte: (CARDOSO, M. T., 2014)
Legenda: Fotografia do cultivo das células potencialmente mesenquimais da membrana amniótica canina(A e B)
e felina(C e D). A: Explante celular da membrana amniótica canina em fase P zero com 72 horas de cultivo. B:
terceira passagem com 72horas de cultivo. C: Células-tronco da membrana amniótica felina em fase P-zero com
120 horas de cultivo. D: terceira passagem com 72 horas de cultivo. Notar em todas as fotos o formato fusiforme
das células semelhantes a fibroblastos e aderência a placa de acrílico, propriedade característica de células-tronco
mesenquimais. Barras de 50 micrômetros.
36
7.2 Imunocitoquimica
Na análise de imunocitoquimica das células caninas, foram observadas marcações positivas,
para os marcadores mesenquimais (CD90, CD73) (Figura 3A e 3B) e tumoral (CD30) (Figura 3C),
porém, marcação negativa para o marcador mesenquimal (CD105) (Figura 3D).
Figura 3: Ensaio de imunocitoquimica das células- tronco de cães.
Fonte: (CARDOSO, M. T., 2014)
Legenda figura 3: Expressão de marcadores de membrana em Ct’s de membrana amniótica canina: A, A’,
A’’(CD90): A: marcação nuclear com hoechst; A’ marcação de CD90(mesenquimal) na membrana celular;
A’’ Sobreposição de marcação nuclear e de membrana. B, B’, B’’: (CD73): B: marcação nuclear com
hoechst; B’ marcação de CD73(mesenquimal) na membrana celular; B’’ Sobreposição de marcação nuclear
e de membrana. C, C’, C’’(CD30): C: marcação nuclear com hoechst; C’ marcação de CD30(teratogênico)
na membrana celular; C’’ Sobreposição de marcação nuclear e de membrana D, D’(CD105): D: marcação
37
nuclear com hoechst; D’: marcação de membrana negativa para CD105(mesenquimal). Barras de 50
micrômetros.
Na análise de imunocitoquimica das células felinas, foram observadas marcação positiva, para
os marcadores mesenquimais (CD90, CD73 e 105) (Figuras 4A, 4B e 4C,) e marcação negativa
para o marcador tumoral (CD30) (Figura 4E) e hematopoiético (CD45)(Figura 4D).
Figura 4: Ensaio de imunocitoquimica das células-tronco de gato.
Fonte: (CARDOSO, M. T., 2014).
38
Legenda figura 4: Expressão de marcadores de membrana em Ct’s de membrana amniótica canina: A, A’,
A’’(CD90): A: marcação nuclear com hoechst; A’ marcação de CD90(mesenquimal) na membrana celular;
A’’ Sobreposição de marcação nuclear e de membrana. B, B’, B’’: (CD73): B: marcação nuclear com
hoechst; B’ marcação de CD73(mesenquimal) na membrana celular; B’’ Sobreposição de marcação nuclear
e de membrana. C, C’, C’’(CD105): C: marcação nuclear com hoechst; C’ marcação de
CD105(mesenquimal) na membrana celular; C’’ Sobreposição de marcação nuclear e de membrana D,
D’(CD45 - hematopoiético): D: marcação nuclear com hoechst; D’: marcação de membrana negativa para
CD45(hematopoiético). E, E’(CD30 -tumorigênico): E: marcação nuclear com hoechst; E’: marcação de
membrana negativa para CD30. Barras de 50 micrômetros.
39
7.3 Citometria de Fluxo
Na análise de citometria de fluxo, as CT’s de membrana amniótica canina mostraram
baixa expressão de marcadores mesenquimais (CD73, CD90, CD105), baixa expressão de
marcadores hematopoiéticos (CD34 e CD45), e não apresentaram expressão do marcador
teratogênico CD30, porém, alta expressão dos marcadores de pluripotência (OCT4 e
NANOG). Já as células de origem felina, demonstraram maior expressão de marcadores
mesenquimais (CD73 e CD90), baixa expressão de marcadores hematopoiéticos (CD34 e
CD45), baixa expressão de marcador tumoral (CD30), marcação negativa para o marcador de
pluripotência (OCT4) e baixa expressão para o marcador, também de pluripotência (SOX2)
(Gráfico 1).
Gráfico 1 : Quantificação da expressão de marcadores hematopoiéticos, mesenquimais, tumoral e de
pluripotência de CT’s da membrana amniótica de origem felina(azul) e canina(vermelha) por análise de
citometria de fluxo.
Fonte: (CARDOSO, M. T., 2014)
Legenda: Os marcadores quantificados em Ct’s de origem felina estão marcados na barra azul do gráfico:
Hematopoiético CD34 (11,29%), CD45 (2,4%), mesenquimais CD73 (32,58%), CD90 (23,48%) e CD105
(0,93%), teratogênico CD30 (1,47%), regulador endógeno de proliferação C-MYC (2,1%), pluripotência Oct4
(zero%), Nanog (3,97%) e Sox2 (4,55%). Os marcadores quantificados em Ct’s de origem canina estão
marcados na barra vermelha do gráfico: Hematopoiético CD34 (2,92%), CD45 (0,32%), mesenquimais CD73
(7,64%), CD90 (10,65%) e CD105 (0,43%), teratogênico CD30 (zero), regulador endógeno de proliferação C-
myc (57,27%), pluripotência Oct4 (59,4%), Nanog (2,26%) e Sox2 (34,35).
0,00%
10,00%
20,00%
30,00%
40,00%
50,00%
60,00%
70,00%
CT's felina
CT's canina
40
7.4 Expressão gênica
As análises de qPCR das células de origem canina e felina, foram realizadas em
grupos celulares de três exemplares de membrana amniótica (animal 1, animal2, animal3),
oriundas da mesma gestação (40 e 45 dias).
A análise estatística foi realizada utilizando a média ANOVA e testadas pelo teste t
student a fim de comparar os valores de significância entre as expressões dos genes das
células-tronco caninas e felinas. Houve diferença significativa apenas entre os genes CD90
(mesenquimal) e SOX2 (Pluripotência), havendo maior expressão dos mesmos em células
caninas, seguida por não expressão do gene OCT4 (Pluripotência) nas células de origem
felina. A expressão dos demais marcadores, apresentaram expressões sem diferença
significativa.
Figura 5: Gráficos representando as expressões dos genes mesenquimais (CD73 e CD90) das células
mesenquimais caninas (azul) e felinas (Vermelho), em unidades arbitrárias, pela técnica de qPCR.
Legenda: A diferença de expressão do marcador mesenquimal CD73 entre as células caninas e felinas não foi
significativa. Já a expressão do marcador mesenquimal CD90 demonstrou diferença significativa entre células
caninas e felinas, sendo sua maior expressão atribuída às células caninas.
8,5
10,5
12,5
14,5
16,5
18,5
20,5
22,5
24,5
CD73
Caninas
Felinas
Em u
nid
ades
arb
itrá
rias
6
11
16
21
CD90*
Caninas
Felinas
Em u
nid
ades
arb
itrá
rias
41
Figura 6: Gráficos representando as expressões dos genes de pluripotência (OCT4 e SOX2) das células
mesenquimais caninas (Azul) e felinas (Vermelho), em unidades arbitrárias, pela técnica de qPCR.
Legenda: A expressão do gene de pluripotência (OCT4) mostrou-se positiva nas células caninas e negativa nas
células felinas. Já a expressão do gene de pluripotência (SOX2) demonstrou diferença significativa entre células
caninas e felinas, sendo sua maior expressão atribuída às células caninas.
Figura 7: Gráficos representando as expressões do gene tumoral (CD30) e regulador endógeno (CD34) das
células mesenquimais caninas (azul) e felinas (vermelho), em unidades arbitrárias, pela técnica de qPCR.
Legenda: A diferença de expressão do gene tumoral (CD30) entre as células caninas e felinas não foi
significativa, assim como a expressão do gene de regulação endógena (P53) não demonstrou diferença
significativa entre células caninas e felinas.
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
OCT4
Canina
Felinas
Em u
nid
ades
arb
itrá
rias
5
10
15
20
25
SOX2*
Canina
Felinas
Em u
nid
ades
arb
itrá
rias
15
16
17
18
19
20
21
22
CD30
Canina
Felinas
Em u
nid
ades
arb
itrá
rias
8
9
10
11
12
13
14
P53
Canina
Felinas
Em u
nid
ades
arb
itrá
rias
42
Figura 8: Gráfico representando a expressão do gene hematopoiético (CD34) das células mesenquimais caninas
(azul) e felinas (vermelho), em unidades arbitrárias, pela técnica de qPCR.
Legenda: A diferença de expressão do gene hematopoiético (CD34) entre as células caninas e felinas não foi
significativa.
Fonte gráficos: (CARDOSO, M. T., 2015)
7.5 Análise Estatística qPCR
De acordo com as análises estatísticas utilizando ANOVA e teste T de student, houve
diferença significativa entre os genes CD90 (mesenquimal) e SOX2 (Pluripotência) caninos e
felinos, havendo maior expressão dos mesmos em células caninas, seguida por ausência de
expressão do gene OCT4 (Pluripotência) nas células de origem felina (Tabela 5).
Tabela 5: Média ± desvio padrão (M±DP) da expressão de genes mesenquimais, hematopoiéticos, pluripotentes,
tumorigênico e regulador endógeno de células-tronco derivadas da membrana amniótica canina e felina pela técnica
de qPCR calculados pela fórmula de 2-∆Ct
.
CD34 M±DP
CD73 M±DP
CD90 M±DP
OCT4 M±DP
SOX2 M±DP
CD30 M±DP
P53 M±DP
Caninas 1,28±0,40 1,22±0,75 1,33±0,19* 1,31±0,16 1,29±-0,09* 1,23±0,33 1,05±0,01
Felinas 1,31±0,14 1,03±0,08 1,12±0,14* 0 1,23±0,04* 1,30±0,07 1,07±0,15
*Diferença significativa
** Valores convertidos para base de LOG
15
17
19
21
23
25
CD34
Caninas
FelinasEm
un
idad
es a
rbit
rári
as
Grupos
43
7.6 Teste de potencial tumorigênico
Os camundongos imunossuprimidos receberam aplicações de 1x106
células-tronco da
membrana amniótica canina e felina diluídas em volume de 200 µL de solução fisiológica
(NaCl 0,9%) em cada via de aplicação (intra peritoneal, intra muscular e subcutânea) sendo
avaliados semanalmente, durante o período de 60 dias (Figura 13).
Figura 9: Inoculação de CT’s em camundongos imunossuprimidos.
Fonte: (CARDOSO, M. T., 2014).
Legenda: A) Aplicação CT’s pela via intraperitoneal. B) Camundongo imunossuprimido (Balb/c – Nude ). C)
Aplicação de CT’s por via intramuscular. D) Aplicação CT’s por via subcutânea.
Não foi observada formação tumoral macroscópica após 60 dias da inoculação celular.
Estes animais foram eutanasiados e seus órgãos submetidos a exame histológico a fim de
confirmar a ausência de neoformações (Figura 10).
44
Figura 10: Eutanásia e necropsia dos camundongos imunossuprimidos Balb/c NUDE após 60 dias de aplicação
de CT’s de cão e de gato.
Fonte: (CARDOSO, M. T., 2014).
Legenda: A)Avaliaçãoda região cervical dorsal onde foram aplicadas CT’s por via subcutânea. B)Avaliaçãoda
região de membro pélvico esquerdo onde foram aplicadas CT’s por via intramuscular. C)Avaliaçãoda cavidade
abdominal onde foram aplicadas CT’s por via intraperitoneal.
Apesar da marcação positiva para marcador tumoral, as células amnióticas de cães não
causaram formação tumoral nos camudongos imunossuprimidos. Repetimos a aplicação com
células do mesmo tipo, porém mais jovens (25 dias), pois apresenta características mais
primitivas da formação embrionária. Foram utilizadas a mesma quantidade de células (1x106
células diluídas em 200µL de solução fisiológica NaCl 0,9%) e aplicadas nas mesmas vias
(subcutâneo, intramuscular e intraperitoneal) não ocorrendo a formação tumoral macroscópica
em 60 dias, quando os animais foram submetidos a eutanásia e seus órgãos avaliados por
histopatologia.
45
7.6.1 Histologia
A análise histológica após 60 dias de inoculação de CT’s caninas e felinas de
fragmentos dos órgãos (fígado, cérebro, baço, intestino delgado, rim, pâncreas, pulmões,
intestino grosso, coração, bíceps femoral e estômago) dos camundongos imunossuprimidos
(Balb/c – Nude). Todos os órgãos apresentaram morfologia preservada. Após processamento e
avaliação histológica, os órgãos não apresentaram alterações morfológicas em seu parênquima
nem qualquer tipo de anomalia celular (Figuras. 11 a 19).
46
Figura 11: Corte histológico do fígado, cérebro, baço e intestino delgado de camundongos imunossuprimidos
inoculados com CT’s de cão, sendo controle (Ctr) e inoculado (Inoc).
Fonte: (CARDOSO, M. T., 2014).
Legenda: A) Fotomicrografia do fígado evidenciando o ramo da veia porta (RVP), ramo da artéria hepática
(RAH) envoltas por hepatócitos. B) Fotomicrografia do cérebro evidenciando a camada celular molecular (CM)
e a camada granulosa (CG) do córtex cerebral. C) Fotomicrografia do baço evidenciando a divisão de seu
parênquima em polpa Branca (PB) e polpa vermelha (PV). D) Fotomicrografia do Intestino delgado
evidenciando tecido glandular por toda área submucosa das vilosidades(V). Barras de 50µm. Coloração:
Hematoxilina e Eosina (He).
47
Figura 12: Corte histológico dos rins, pâncreas, pulmões e intestino grosso de camundongos imunossuprimidos
inoculados com CT’s de cão sendo controle (Ctr) e inoculado (Inoc).
Fonte: (CARDOSO, M. T., 2014).
Legenda: E) Fotomicrografia dôo córtex renal evidenciando vasos interlobulares (Vint) e corpúsculos
renais(CR). F) Fotomicrografia do pâncreas evidenciando células centro acinosas (C), ácinos serosos (Ac) e
ilhotas de Langerhans (IL). G) Fotomicrografia dos pulmões evidenciando os sacos alveolares (SA) e bronquíolo
(B). H) Fotomicrografia do intestino grosso evidenciando as criptas absortivas (CA). Barras de 50µm.
Coloração: Hematoxilina e Eosina (He).
48
Figura 13: Corte histológico do coração, bíceps femoral e estômago de camundongos imunossuprimidos
inoculados com CT’s de cão sendo controle (Ctr) e inoculado (Inoc).
Fonte: (CARDOSO, M. T., 2014).
Legenda: I ) Fotomicrografia do coração evidenciando as fibras de purkinje (FP) e musculatura cardíaca (MC)
em corte longitudinal com núcleos centralizados. J) Fotomicrografia do músculo bíceps femoral esquerdo
evidenciando as fibras musculares separadas em endomísio (En) e perimísio (Pr) com núcleo periférico nas
mesmas. K) Fotomicrografia do estômago evidenciando as células parietais (CP). Barras de 50µm. Coloração:
Hematoxilina e Eosina (He).
49
Figura 14: Corte histológico do fígado, cérebro, baço e intestino delgado de camundongos imunossuprimidos
inoculados com CT’s amnióticas de cão com 25dias de gestação, sendo controle (Ctr) e inoculado (Inoc).
Fonte: (CARDOSO, M. T., 2014).
Legenda: A) Fotomicrografia do fígado evidenciando o ramo da veia porta (RVP) envolta por hepatócitos (H).
B) Fotomicrografia do cérebro evidenciando a camada celular molecular (CM) e a camada granulosa (CG) do
córtex cerebral. C) Fotomicrografia do baço evidenciando a divisão de seu parênquima em polpa Branca (PB) e
polpa vermelha (PV). D) Fotomicrografia do Intestino delgado evidenciando as vilosidades(V), camada
muscular(CM) e criptas absortivas (CA). Barras de 50µm. Coloração: Hematoxilina e Eosina (He).
50
Figura 15: Corte histológico dos rins, pâncreas, pulmão e estômago de camundongos imunossuprimidos
inoculados com CT’s amnióticas de 25dias de gestação de cão sendo controle (Ctr) e inoculado (Inoc).
Fonte: (CARDOSO, M. T., 2014).
Legenda: A ) Fotomicrografia do córtex renal evidenciando vasos interlobulares (Vint) e corpúsculos renais(CR)
e vasos sanguíneos. B) Fotomicrografia do pâncreas evidenciando células centro acinosas (C), ácinos serosos
(Ac) e ilhotas de Langerhans (IL). C) Fotomicrografia dos pulmões evidenciando os sacos alveolares (SA) e
bronquíolos terminais (TB). D) Fotomicrografia do estômago evidenciando as células glandulares parietais (CP).
Barras de 50µm. Coloração: Hematoxilina e Eosina (He).
51
Figura 16: Corte histológico do bíceps femoral, coração e intestino grosso de camundongos imunossuprimidos
inoculados com CT’s amnióticas de cão com 25dias de gestação, sendo controle (Ctr) e inoculado (Inoc).
Fonte: (CARDOSO, M. T., 2014).
Legenda: A) Fotomicrografia do músculo bíceps femoral esquerdo evidenciando as fibras musculares separadas
em endomísio (En) e perimísio (Pr) com núcleo periférico nas mesmas. B) Fotomicrografia do coração
evidenciando as fibras de purkinje (FP) e musculatura cardíaca (MC) com núcleos centralizados. C) Estômago
evidenciando as células parietais (CP), camada muscular (CM), vaso sanguíneo (VS) e células caliciformes
(CC). Barras de 50µm. Coloração: Hematoxilina e Eosina (He).
52
Figura 17: Corte histológico do fígado, cérebro, baço e intestino delgado de camundongos imunossuprimidos
inoculados com CT’s de gato, sendo controle (Ctr) e inoculado (Inoc).
Fonte: (CARDOSO, M. T., 2014).
Legenda: A) Fotomicrografia do fígado evidenciando o ramo da veia porta (RVP) e ramo da artéria hepática
(RAH) e sinusóides hepáticos envolta por hepatócitos. B) Fotomicrografia do cérebro evidenciando a camada
celular molecular (CM) e astrócitos (A) do córtex cerebral. C) Fotomicrografia do baço evidenciando a divisão
de seu parênquima em polpa Branca (PB) e polpa vermelha (PV). D) Fotomicrografia do Intestino delgado
evidenciando as vilosidades(V), criptas absortivas(C) e camada muscular entérica (CM). Barras de 50µm.
Coloração: Hematoxilina e Eosina (He).
53
Figura 18: Corte histológico dos rins, pâncreas, pulmões e estômago de camundongos imunossuprimidos
inoculados com CT’s de gato sendo controle (Ctr) e inoculado (Inoc).
Fonte: (CARDOSO, M. T., 2014).
Legenda: A) Fotomicrografia dôo córtex renal evidenciando vasos interlobulares (Vint) e corpúsculos
renais(CR) B) Fotomicrografia do pâncreas evidenciando células centro acinosas (C), ácinos seroso (Ac) e
ilhotas de Langerhans (IL). C) Fotomicrografia dos pulmões evidenciando os sacos alveolares (SA). D)
Fotomicrografia do estômago evidenciando as células glandulares parietais (CP). Barras de 50µm. Coloração:
Hematoxilina e Eosina (He).
54
Figura 19: Corte histológico do bíceps femoral e coração de camundongos imunossuprimidos inoculados com
CT’s de gato sendo controle (Ctr) e inoculado (Inoc).
Fonte: (CARDOSO, M. T., 2014).
Legenda: A) Fotomicrografia do músculo bíceps femoral esquerdo evidenciando as fibras musculares separadas
em endomísio (En) e perimísio (Pr) com núcleo periférico nas mesmas. B) Fotomicrografia do coração
evidenciando as fibras de purkinje (FP) e musculatura cardíaca (MC/Cmc). Barras de 50µm. Coloração:
Hematoxilina e Eosina (He).
55
8 DISCUSSÃO
A obtenção de CT’s da membrana amniótica nas idades estudadas (35 a 45 dias de
idade) pode representar um desafio, já que é dependente totalmente de obtenção aleatória e
esporádica em campanhas de castrações onde não há exames prévios à cirurgia. A tendência é
a diminuição destes casos devido à disseminação da posse responsável entre os novos
proprietários de cães e gatos. Estes fatores reforçam os objetivos da prática da criação de
bancos celulares. Os bancos celulares são criados para preservação de materiais biológicos de
pouca disponibilidade com o objetivo de preservá-los para futuras utilizações e até
preservação de espécies. Bons exemplos disso, são os modelos de estudo com bancos de
sangue de cordão umbilical para posterior fonte de células-tronco hematopoiéticas (TAKAO,
et al., 2010) e preservação de recursos genéticos de fauna a longo prazo, através dos
chamados bancos de germoplasma que praticam a criopreservação de sêmen, embriões e
oocistos de espécies em extinção (MARIANTE et al., 2011).
Em nossos achados de imunocitoquimica de células caninas, relatamos a não
expressão do marcador CD105 corroborando com os resultados obtidos por Lima et al. (2009)
em células tronco mesenquimais de membrana amniótica canina. Em contrapartida, Trivedi et
al. (2008), avaliou a expressão de marcadores mesenquimais em células da membrana
amniótica humana e relatou a expressão de CD105 , assim como expresso nas espécies
domésticas como felina relatadas por Vidane et al. (2014), eqüina relatada por Violini et al
(2012) e bovina relatada por Corradeti et al. (2013). Já os marcadores CD73 e CD90, que
também são caracteristicos de CT’s mesenquimais mostraram-se positivos em nossas analises.
O marcador CD30 mostrou-se positivo nas células caninas. Esta marcação é de extrema
importância já que, segundo Preda et al. (2012), o marcador CD30 é especifico para a
neoplasia carcinoma embrionário, o mesmo tipo de neoplasia detectada no teste teratogênico
realizado por Lima et al. (2009) após aplicação de CT’s da membrana amniótica canina em
camundongos imunossuprimidos.
Já na análise de imunocitoquimica de células felinas, encontramos marcação positiva
para os marcadores CD90, CD73 (marcadores mesenquimal) e negativa para CD45 (marcador
hematopoiético) semelhante aos achados em células mesenquimais felinas relatada por
Vidane et al. (2014). O marcador CD105 (marcador mesenquimal) mostrou-se positivo,
corroborando com Iacono et al. (2012) (células epiteliais da membrana amniótica felina), o
que, segundo Dominice et al. (2006), que descreve os minimos critérios para classificação de
56
uma célula como tronco e mesenquimal, é esperado para células-tronco mesenquimais. Já o
marcador CD30 (carcinoma embrionário) mostrou-se negativo.
Na análise de citometria de fluxo de CT’s caninas, os marcadores mesenquimais
mostraram-se positivos, porém com baixa expressão, não corroborando com os relatos de
Park et al. (2012) onde este teve quantificações de marcadores mesenquimais CD90 e CD105
próximas de 100% em CTM’s da membrana amniótica canina. Já a marcação negativa das
proteinas hematopoiéticas CD34 e CD45 corroboraram com os dados de Park et al. (2012). O
marcador da proteína tumoral CD30 foi negativa na análise de citometria de fluxo porém, na
análise de imunocitoquímica o mesmo marcador demonstrou marcação positiva. O marcador
CD30 é importante, pois é encontrado em tumores do tipo carcinoma embrionário. Lima et al.
(2009) encontrou este tipo de formação tumoral em seu teste carcinogênico.
Em nossos achados as células mesenquimais expressaram a marcação positiva dos
marcadores de pluripotência Oct-4 e Sox-2 (59,4% e 34,35% respectivamente) corroborando
com o achado de Lima et al. (2009), porém no ensaio de imunocitoquimica.
Já na análise de citometria de Fluxo, as CT’s felinas demonstraram marcação
mesenquimal positiva para o marcador CD90 e marcação baixa para indicadores de proteínas
hematopoiéticas (CD34 e CD45) corroborando com Vidane et al. (2014) e Iacono et al.
(2012). que avaliaram os mesmos marcadores em células mesenquimais da membrana
amniotica felina.
O marcador mesenquimal (CD73) também foi positivo corroborando com Vidane et
al. (2014) e não corroborando com os achados de Iacono et al. (2012) cujo não encontrou
positividade para o mesmo marcador em CTM’s de membrana amniótica felina.
As proteínas indicadoras de pluripotência (OCT4, SOX2 E NANOG) demonstraram
baixa marcação corroborando com Rutigliano et al.(2013) quando testou estes marcadores em
células de membrana amniótica felina. O marcador característico de carcinoma embrionário
(CD30) demonstrou baixa marcação (próxima de 1%) o que era desejado e esperado já que
estas células não possuem histórico de formação tumoral.
Na análise de qPCR, as CT’s de origem canina, demonstrou expressão do gene
mesenquimal CD90 corroborando com os resultados de Park et al. (2012), porém em análise
de citometria de fluxo. Esta expressão foi significativamente maior quando comparada a
expressão do mesmo gene nas células felinas, que demonstrou expressão positiva,
corroborando com Rutigliano et al. (2013), porém estatisticamente esta expressão foi menor
57
em relação as células caninas. O mesmo ocorreu com o gene de pluripotência (SOX2), cujo
foi expresso nas células caninas corroborando com Park et al. (2012) e células felinas, porém
demonstrando maior expressão em células caninas com diferença estatística significativa
quando comparado sobre sua expressão em células felinas. O gene de pluripotência OCT4 foi
expresso apenas nas células de origem canina, corroborando com os achados de Urânio et al.
(2011) e Park et al. (2012) em qPCR de CTM’s da membrana amniótica canina. Os demais
genes testados, não demonstraram diferença significativa.
Apesar das baixas expressões encontradas dos genes nas células felinas, nota-se
similaridade entre as amostras (menores valores de desvio padrão) demonstrando que estas
células são estáveis quanto a variações de expressões gênicas entre indivíduos.
Diferentemente das células caninas, no qual foi observado variações significativas (Maiores
valores de desvio padrão) entre os genes comparados entre as membranas amnióticas de
diferentes animais (1, 2 e 3), porém da mesma coleta (mãe e idade iguais). Esta diferença
encontrada nas células de origem canina, não é esperada, considerando que a coleta foi
realizada de fetos de mesma idade gestacional (40 dias), da mesma mãe, e mesma gestação.
Isto demonstra que, apesar da similaridade entre os aspectos morfológicos (idade dos animais,
tamanho, gestação), existe uma grande heterogeneidade entre os indivíduos e seus respectivos
anexos embrionários podendo demonstrar variações a nível genético.
Esta característica encontrada em nosso trabalho, pode ser a chave para a explicação
de resultados variáveis em relação a formação teratogênica positiva descrita por Lima et al.
(2009) e negativa descrita por Wink et al. (2012). O marcador CD30 não foi testado
anteriormente em outros trabalhos de células provenientes de membrana amniótica de animais
domésticos. Este gene foi testado em espécies domésticas primeiramente nesta pesquisa,
baseado no trabalho de Preda et al. (2012) em neoplasias de tecidos humanos.
Estes fatores fisiológicos evidenciam como estas duas espécies estudadas são distintas,
e, portanto, o comportamento das células geradas por seus anexos fetais mostraram-se
diferentes.
A espécie canina e felina apresentam particularidades individuais no que diz respeito a
reprodução, como por exemplo o ciclo estral e o período de ovulação, sendo mais freqüente
geração de fetos de pais diferentes com idades diferentes na mesma gestação na espécie
canina do que na felina e, portanto, o comportamento das células geradas por seus anexos
fetais mostraram-se diferentes.
58
Após a cópula e ejaculação, os espermatozóides caninos podem permanecer viáveis
durante todo o estro. Este fenômeno é permitido devido às atividades de glândulas uterinas e
epitélio colunar que protegem as características de fecundação e motilidade dos mesmos
(KAWAKAMI, et al. 2000). Já o ovócito canino pode permanecer fertilizável por mais de
200horas (VERSTEGEN et al.,2001). Estas características peculiares da espécie canina,
permite que se tenha, em uma mesma gestação, fetos com idades e pais diferentes. Já em
gatas, a ovulação é estimulada pela cópula. A gata geralmente escolhe seu parceiro e pode
copular várias vezes em um período de 24 horas, e logo perde o estímulo, espantando o
macho. Ela pode rejeitar o parceiro imediatamente após a primeira cópula. Este fato pode
culminar em ciclo anovulatório, ou seja, aquela cópula não foi suficiente para gerar ovulação
e prenhes, ou ainda, ovulação e prenhes em uma única cópula (CONCANNON et al. 1980).
As chances de se ter filhos de pais diferentes é bem menor quando comparada a cadela. A
idade dos fetos pode variar em horas. Em nosso trabalho, no grupo de células caninas, foi
notado diferença de expressão gênica entre indivíduos da própria espécie.
Outro achado importante sobre as células caninas é a maior expressão dos genes de
pluripotência (SOX2 e OCT4) encontrada nestas células, sendo esta a diferença molecular
mais significante em relação as de origem felina. O principal fator que coloca em discussão a
segurança biológica da célula canina é devido à ótima capacidade de proliferação e
diferenciação nos três folhetos embrionários atribuída as células pluripotentes, pois, todo
processo que envolve proliferação e diferenciação celular é passível de falhas de mecanismos
de controle celular endógeno, secundários a mutações, por exemplo, culminando em
problemas funcionais e neoformações (LAKSHMIPATHY et al., 2005; BAPAT, 2007).
Segundo MIKI et al. (2005), as células epiteliais de membrana amniótica de origem humana
também demonstraram características de pluripotência (OCT4 e NANOG) e ausência de
formação teratogênica.
O teste carcinogênico com aplicação de CT’s caninas mostrou-se negativo, ou seja,
não houve formação tumoral em 60 dias após a aplicação das células. Este resultado corrobora
com o teste carcinogênico realizado por Winck (2012) que aplicou CTM’s em camundongos
imunossuprimidos da membrana amniótica canina e avaliou a formação macro e microscópica
após 60 dias. Porém, nossos resultados não corroboram com os resultados obtidos por Lima et
al. (2009), que detectou formação teratogênica do tipo carcinoma embrionário após 4 semanas
de inoculação das CT’s de membrana amniótica canina em camundongos imunossuprimidos
59
(Balb/c – Nude). As CT’s felinas também não geraram formação tumoral em 60 dias quando
aplicadas em camundongos imunossuprimidos corroborando com os dados de Vidane et al.
(2014).
60
9. CONCLUSÃO
- Nos testes imunológicos específicos para marcadores de membrana, as CT’s de
origem canina não demonstraram marcação mesenquimal, demonstraram marcação de
pluripotência e marcação tumoral em ensaio de imunocitoquimica. Nas análises de expressão
gênica qPCR, as células-tronco de origem canina expressaram maior expressão do marcador
mesenquimal CD90 quando comparada a expressão do mesmo em células felinas, maior
expressão do gene de pluripotência (SOX2) sugerindo que estas células apresentam potencial
mesenquimal, pluripotente e teratogênico.
- A CT’s de origem canina apresentam variações de expressões gênicas mesmo
quando falamos de grupos de origem e idade iguais, demonstrando heterogenicidade em seu
perfil gênico.
- As células felinas, como esperado, demonstraram características morfológicas
compatíveis com células-tronco mesenquimais bem como a marcações mesenquimal positiva
(CD73 e CD90).
- As células obtidas da membrana amniótica de caninos e felinos, não mostraram
formação tumoral 60 dias pós inoculação, porém, no caso dos canídeos, foi observada a
expressão de genes relacionados a pluripotência em ensaio de qPCR e expressão do marcador
tumoral em ensaio imunológico, impossibilitando a conclusão de sua segurança biológica para
testes terapêuticos.
61
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