DETERIORAO MICROBIANA DE ALIMENTOS

FONTE: TRBOLI, E. Grupos de Bactrias Importantes em Microbiologia de Alimentos. So Caetano do Sul , Escola De Engenharia Mau, Departamento de Engenharia Qumica e de Alimentos, Fevereiro de 1997 (notas de aulas)

GRUPOS DE BACTRIAS IMPORTANTES EM MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS. Agrupamentos Funcionais (no sistemticos) por semelhana de ao sobre os alimentos. VANDERZANT, Carl e SPLITTSTOESSER, Don F. (ed.). Co mpe nd i u m o f me t ho ds fo r th e m ic r o b io lo g yc a l e xam i n a t io n o f foo ds . 3.e. Washington, American Public Health Association (APHA), 1992. (62 captulos) 1 - Produtoras de cidos(captulo 15) : Acticas Propinicas Butricas Lcticas 2 - Produtoras de enzimas: Proteolticas (captulo 12) Lipolticas (captulo 11) Sacarolticas Pectinolticas (captulo 14) 3 - Grupos relacionados com a temperatura: Termfilas Termodricas (captulo 10) Psicrotrfilas (captulo 9) 4 - Grupos relacionados com a concentrao do meio: Haloflicas (captulo 13) Osmoflicas (captulo 13) 5 - Produtoras de pigmentos 6 - Produtoras de gs 7 - Produtoras de limo 8 - Esporuladas: Mesfilas aerbias (captulo 18) Mesfilas anaerbias (captulo 19) Acidricas tipo "Flat Sour" (captulo 20) Termoflicas tipo "Flat Sour" (captulo 21) Produtoras da deteriorao sulfdrica (captulo 23) Termoflicas anaerbias (captulo 22)

9 - Grupos coliforme e coliformes fecais. (captulo 24) 10 - Bolores e leveduras (captulo 16) 11 - Bolores termorresistentes (captulo 17)

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12 - Microrganismos indicadores e patognicos Salmonella (captulo 25) Shigella (captulo 26) Yersinia (captulo 27) Vibrio (captulo 28) Campylobacter (captulo 29) Grupo da Aeromonas hydrophila (captulo 30) Plesiomonas shigelloides ( captulo 31) Enterococos (captulo 32) Staphylococcus aureus e suas enterotoxinas (captulo 33 e 34) Bacillus cereus (captulo 35) Clostridium botulinum e suas toxinas (captulo 36) Clostridium perfringens (captulo 37) Listeria (captulo 38) Viroses alimentares (captulo 41) Parasitas transmitidos pela gua e pelos alimentos (captulo 42) Bolores toxignicos e toxinas fngicas (captulo 43)

13 - Qualidade e segurana de grupos de alimentos Produtos crneos (captulo 44) Leite e lacticnios (captulo 45) Ovos e derivados (captulo 46) Peixes, crustceos e derivados pr-cozidos (captulo 47) Moluscos com conchas: ostras, mariscos e mexilhes (captulo 48) Frutas e vegetais (captulo 49) Vegetais fermentados e acidificados (captulo 50) Bebidas a base de frutas (captulo 51) Temperos e gomas (captulo 52) Molhos para saladas industrializados (captulo 53) Adoantes e amidos (captulo 54) Cereais e derivados (captulo 55) Produtos de confeitaria (captulo 56) Nozes, sementes e derivados (captulo 57) Refrigerantes (captulo 58) gua em garrafas (captulo 59) Alimentos enlatados (captulos 60 e 61)

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1 - PRODUTORAS DE CIDOS 1.1. Bactrias produtoras de cido actico ou ACTICAS A ce to ba ct e r e G l u c o n o ba ct e r Etanol cido actico [CO2 (A ce to ba ct e r )] Importncia: a) tecnologia de fabricao do vinagre e defeitos em bebidas alcolicas b) forte poder de oxidao D-sorbitol [fermentao] L-sorbose [sntese] cido ascrbico (vitamina C) c) Limo: grande produo (entupimentos em tubulaes) A ce to ba ct e r ace t i subsp. s ubo xy da ns 1.2. Bactrias produtoras de cido propinico ou PROPINICAS Pr o pio ni ba c te r i u m (aroma e buracos - queijo(tipo) suo 1.3. Bactrias produtoras de cido butrico ou BUTRICAS Esporuladas anaerbias do gnero C lo s tr i d i u m Deteriorao de enlatados 1.4. Bactrias produtoras de cido Lctico ou LCTICAS Acares cido Lctico (homofermentativas) Importncia: tecnologia de fabricao de chucrute, queijos, silagem, salames; deteriorao de vinhos, suco de laranja e outras frutas O cido lctico produzido rapidamente e em grande quantidade, reduzindo o pH e impedindo o desenvolvimento de organismos competidores Gneros principais: L e uco no s to c , L acto ba ci l l u s , S tr e p t o co c cu s , Pe d io co cc us 2 - PRODUTORAS DE ENZIMAS 2.1. Proteolticas Produzem proteinases extracelulares (enzimas que difudem para fora das clulas) Tipos respiratrios: - Aerbias e anaerbias facultativas formadoras de esporos (B aci l l u s ce r e us ) no formadoras de esporos (Pse u do mo na s fl u o r e sc e n s )4

- Anaerbias formadoras de esporos (C lo s tr i d i u m spo ro ge ne s ) Gneros caracteristicamente proteolticos: C lo st r id i u m , B ac i l l u s , Pse u do mo na s, Pro te us (vrias espcies) Bactrias "cido-proteolticas": fermentao e protelise simultneas S tr e p t o co c cu s fae ca l i s var. l iq u e f ac i e n s M ic r o co ccu s case o ly t i c u s Bactrias putrefativas: Protenas [anaerobicamente] compostos mal-cheirosos aminas, indol, mercaptanas,) Gneros: C lo s tr i d i u m (maioria das proteolticas so putrefativas) Pr o te u s, Pse u do mo na s (algumas das proteolticas so putrefativas) Algumas espcies do gnero Pse u do mo na s produzem proteinases que resistem aos tratamentos U.H.T. (ultra high temperature). Problemas causados por bactrias proteolticas: Defeitos de odor e sabor Deteriorao PSICROTRFICA: em alimentos com armazenamento prolongado sob refrigerao: lacticnios, carnes, aves, produtos marinhos. Importncia tecnolgica: Maturao de queijos - aroma, sabor e textura. Quantidade de microrganismos proteolticos til para a previso vida de prateleira e avaliao do processamento (H2S, cidos graxos,

2.2. LIPOLTICAS Produzem lipases: Gorduras [lipases] cidos graxos + glicerol Apresentam espcies produtoras de enzimas lipolticas: Pse udo mo n as , A lc a l i ge n e s , S ta p h y lo co c c us , S e r r at i a , M ic r o co ccu s Pse udo mo n as f l uo r e s ce ns (proteoltica + lipoltica) Muitas lipases so resistentes ao processamento Tipos de liplise: oxidativa e hidroltica (as bactrias produtoras de liplise hidroltica podem ser quantificadas atravs de contagem em placas) Problemas causados: mudanas de sabor e aroma (desejvel na produo de vrios queijos) Alimentos normalmente envolvidos: creme, manteiga, margarina, molhos para saladas,5

carcaas de animais, sementes oleaginosas. 2.3.SACAROLTICAS Dissacardeos e polissacardeos so desdobrados em acares mais simples Amido [amilases] glicose Amilases extracelulares so produzidas por pequeno nmero de espcies, exemplos: B ac i l l u s su bt i l i s , C lo st r id i u m b ut y r i c u m Poucas espcies de bactrias produzem celulases 2.4. PECTINOLTICAS Pectina: carboidrato complexo formado por polmeros do cido poligalacturnico (peso molecular variando de 30.000 a 120.000), responsvel pela rigidez da parede celular de frutas e vegetais Pectina: Fonte: frutos ctricos e mas Uso: agente gelificante Pectinases: Ao: amolecem tecidos vegetais Uso: Sucos frutas, gelias, geleiadas Gneros: E r w i n i a , B ac i l l u s , C lo st r id i u m , A ch r o mo bac te r , Ae r o mo n as , Ar t h r o bac te r , Fl avo ba ct e r i u m , (muitos bolores tambm) 3. GRUPOS RELACIONADOS COM A TEMPERATURA 3.1. Bactrias TERMOFLICAS ou TERMFILAS Temperatura tima de crescimento superior a 45C; normalmente 55C ou mais. Importncia: Alimentos mantidos em temperaturas elevadas Problemas em enlatados: - acidez plana (flat sour) termoflica (B aci l l u s st e ar o th e r mo ph i l u s ) - estufamento termoflico (C lo st r id i u m th e r mo sa cc h ar o ly t i c u m )

3.2. Bactrias TERMODRICAS Sobrevivem a tratamentos trmicos (pasteurizao)

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Gneros de bactrias: C lo s tr i d i u m , B aci l u s , M ic r o co ccu s , S tr e p to co cc u s, L acto ba ci l l u s e M ic r o bact e r i u m Bolores: B y sso ch l a m y s f u l va , As pe r gi l l u s , Pe n ic i l l i u m B aci l l u s e enterococcos (estreptococos fecais) podem ser tambm psicrotrfilos. Importncia: leite e lacticnios sanitariedade de equipamentos em lacticnios e indstria de alimentos ovo pasteurizado embutidos: deteriorao salsichas e presuntos (S tr e p t o co c cu s fae ci u m ) 3.3. Bactrias PSICROTRFILAS Crescem em temperaturas de refrigerao comercial Temperaturas timas de crescimento: 25 a 30C Gneros tpicos: Pse udo mo n as , F la vo bac te r i u m , Ac h r o mo bac te r , A lc a l i ge n e s Alm desses: M ic r o co ccu s , L acto ba ci l l u s , E n te r o bac te r , A r t h r o bac te r , vrios bolores e leveduras. Importncia: Responsveis pela perda de qualidade da maioria dos alimentos refrigerados no-estreis, exceto frutos-do-mar. Quantificao informa sobre o potencial de deteriorao para armazenamento prolongado Velocidade de deteriorao diminui com a diminuio da temperatura. Normalmente destrudas com tratamento trmico suave (pasteurizao). A presena de grande nmero em alimentos congelados (frango, peru) descongelados (e reprocessados) para venda em partes indicador de manuseio inadequado. 4. GRUPOS RELACIONADOS COM A CONCENTRAO DO MEIO 4.1. Bactrias HALOFLICAS Bactrias halfilas verdadeiras necessitam de uma concentrao mnima de cloreto de sdio (NaCl) para crescerem.7

Grupos: Levemente halfilas: - crescem em concentraes de 0,5 a 3,0% de NaCl - importncia: peixes, moluscos - gneros: Pse udo mo n as , Mor axe l la , F lavo ba ct e r i u m , Ac i n e to ba c te r , Vi br i o Halfilas moderadas: - crescem em concentraes de 3,0 a 15,0% de NaCl - importncia: peixes salgados, carne salgada, vegetais em salmoura. - gneros: B ac i l l u s , Mic r o co cc us , V ib r io , Mor axe l la , Ac i n e to ba c te r Halfilas extremas: - crescem em concentraes de 15 a 30% de NaCl - importncia: alimentos conservados em salmouras concentradas - gneros: H alo bac te r i u m , Ha lo co cc u s (produzem pigmentos rosa ou vermelho) Bactrias halotolerantes: - crescem na presena ou ausncia de NaCl - importncia: alimentos com 5% ou mais de NaCl. - gneros: B ac i l l u s , Mic r o co cc us , C or y ne bac t e r i u m , St r e p to co cc u s, C lo st r id i u m .

Gneros haloflicos ou halotolerantes mais importantes: Pse u do mo na s, Sar ci n a, Pe dio co c cu s, Al c a l i ge n e s . 4.2. Bactrias OSMOFLICAS ou sacaroflicas Bactrias osmoflicas - crescem em altas concentraes de acares. Gnero importante: Le u co no sto c Microrganismos osmoflicos mais encontrados em alimentos: leveduras (vrias espcies). 5 - BACTRIAS PRODUTORAS DE PIGMENTOS Muitas espcies produzem pigmentos de cores que incluem todo o espectro visvel mais o branco e o preto. Gneros e cores dos pigmentos: F la vo bac te r i u m (amarelo a laranja) Se r r at i a (vermelho) M ic r o co ccu s (algumas espcies, rosa a vermelho) L acto ba ci l l u s p lan t a r u m (ferrugem: descolore queijos) H alo bac te r i u m (rosa, vermelho, laranja) H alo co cc u s (vermelho a laranja)

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6 - BACTRIAS PRODUTORAS DE GS Gases produzidos: CO2 :L e uco no s to c , L acto ba ci l l u s (heterofermentativos), Pro p io n ib ac t e r i u m CO2 + H2 : Es c he r i c h i a, E n t e r o bac te r , Pr o te u s, B aci l l u s (aerbios), C lo s tr i d i u m

7 - BACTRIAS FORMADORAS DE LIMO ("ROPE") Rope (ingls): corda, fio Problemas causados: Leite "filamentoso": A lc a l i ge n e s v is co l ac t i s , E n t e r o bac t e r ae r o ge ne s, K le bs ie l l a o xy to c a Canjiquinha (solues de sacarose): L e uco no s to c Superfcie limosa de vrios alimentos: vrias bactrias Leite "viscoso": variedades de L acto ba ci l l u s e S tr e p t o co c cu s . Po "filamentoso": algumas espcies de B aci l l u s Estirpes de L acto ba ci l l u s p lan t a r u m e outros lactobacilos pode causar "filamentos" em vrios frutos, vegetais e produtos de cereais (cidra, chucrute, cerveja).

8. MICRORGANISMOS ESPORULADOS 8.1 - Esporulados mesfilos anaerbios Dois grupos de importncia: 1 grupo - Anaerbios putrefativos (C lo s tr i d i u m spo ro ge ne s ) e clostrdios termorresistentes. - Cepas proteoltcas e no-proteolticas de C lo st r id i u m bo t u l i n u m 2 grupo - Clostrdios de resistncia trmica relativamente baixa (C lo s tr i d i u m pe r fr i n g e n s ) - Anaerbios butricos Alteraes causadas nos alimentos pelos anaerbios mesfilos putrefativos: Protenas, peptdeos, amino-cidos H2S, sulfeto de metila, sulfeto de etila, mercaptanos, amnia, aminas, putrescina, cadaverina, indol, CO2 + H2 Caractersticas: bastonetes grandes, Gram-positivos, mveis, temperatura de crescimento:10 a 50C, (exceo: C lo s tr i d i u m pu tr e f ac i e n s - imvel, 0 a 30C)9

Relao com o pH: alimentos com pH 6,0 germinam e crescem fcil enlatados com pH 4,8 (germinam, se sobreviveram ao calor) alimentos com pH < 4,6 NO CRESCEM Causadores de problemas em alimentos com pH > 4,8: C lo s tr i d i u m spo ro ge ne s , C lo s tr i d i u m p ut r e fa c ie n s , C lo s tr i d i u m hi s t o l y t i c u m , C lo s tr i d i u m bo t u l i n u m A e B , C lo st r id i u m l e n t o p u t r e sc e n s, C lo s tr i d i u m bo t u l i n u m tipo F, P.A. 3679 (anaerbio putrefativo), Organismo importante para a sade pblica: C lo s tr i d i u m bo t u l i n u m tipos A e B (produz neurotoxina de efeito letal) Importncia para a tecnologia de alimentos: Espcies no toxignicas mais resistentes esto relacionadas com o processamento trmico de alimentos de baixa acidez (tratamento trmico inadequado causar perdas econmicas) Rota da contaminao: Solo vegetais intestino e fezes de animais leite, carne Indstria: superfcies porosas, cantos mortos de tubulaes Ingredientes: cereais, amido, temperos, ovos desidratados, leite em p, vegetais desidratados, alho, cebolas 8.2. Esporulados termfilos anaerbios (no produtores de H2S) Espcie tipo: C lo st r id i u m t he r m o s sa car o ly t i c u m Alteraes causadas nos alimentos: Glicose, Lactose, Sacarose, Amido gs (em abundncia) e cidos Caractersticas: No atacam protenas Anaerbios obrigatrios Bastonetes Gram-negativos Esporos terminais e deformantes No produzem toxinas ou infeces Deterioradores tpicos Temperatura de crescimento: 55C (raramente < 32C) pH timo = 6,2 a 7,2 (crescem fcil em pH 4,7)

Importncia em tecnologia de alimentos: Espaquetes com molho de tomate, batata doce, abbora, vagens, aspargos Produtos altamente cidos como: frutas, tomates, misturas farmacuticas. Organismo do solo: cogumelos, cebola, cereais, farinha, amido,10

massas, acar, leite desnatado, caldos de galinha e carne (durante processo de concentrao) Raramente em equipamentos.

8.3 - Esporulados acidricos produtores da acidez plana (flat sour) Histrico: 1933, suco de tomate enlatado, lata no estufada (flat), gosto fenlico, medicinal, pH reduzido (sour) Organismo responsvel: B ac i l l u s co ag ul a n s Aerbio, mvel (cerca de 10 flagelos por clula) Gram positivo com cepas Gram variveis Termfilo facultativo: temperatura tima, de 37 a 45C Faixa de temperaturas para produzir sabor desagradvel: de 21 a 38C, temperatura tima: 37C. Faixa tima de pH para crescimento: 5 a 7, mas cresce em pH > 4,02 Importncia em tecnologia de alimentos: Bactria do solo: tomates enlatados, creme, queijos Leite evaporado, forma cogulos, da o nome coagulans, Produtos de tomates: suco, pur, sopa e outros produtos Multiplicam-se em lavadores de tomates com pouca gua e em temperaturas de 27 a 32C Encontrados em linhas de enlatamento e esterias transportadoras de latas. Risco de deteriorao (perdas econmicas) em produtos enlatados com pH entre 4,1 e 5,0 Pesquisa de organismos tipo "flat-sour" quantifica a carga de esporos em ingredientes e equipamentos

8.4. Esporulados produtores da deteriorao sulfdrica Histrico: 1927, milho enlatado. Odor a sulfeto. Lata no estufada. produto escurecido, salmoura cinza-azulada. Ausncia de outros odores putrefativos. Organismo responsvel: D e s ul f o t o m ac u l u m n ig r i f i c a n s No patognico para o homem nem para animais Manchas na parede interna da lata: H2S + Fe FeS Temperatura tima: 55C (maioria das cepas cresce a 43C e no cresce a 37C) Bastonetes ligeiramente curvos, esporulados, Gram-negativos pH timo: 6,8-7,3 (limites 6,2-7,8) Ataca somente alimentos de baixa acidez: milho enlatado, ervilhas, cogumelos (maioria dos vegetais tem pH < 5,8 11

defeito raro) Importncia em tecnologia de alimentos: Causa da deteriorao: alto nmero de esporos e manuteno do produto acabado em temperaturas elevadas Fonte na industria: acar e amido.

9 - GRUPO COLIFORME E COLIFORME FECAL Caractersticas do grupo coliforme: Bastonetes curtos Gram-negativos Aerbios ou anaerbios facultativos. No formadores de esporos Fermentam a lactose com produo de gs. Denominao no tem valor taxonmico, apenas indica grupos de bactrias capazes de crescer sob determinadas condies. Espcies principais: E sc h e r i c h i a co li E n t e r o bac te r ae r o ge ne s Cerca de 20 espcies atendem a definio acima incluindo espcies de outros gneros das En t e r o ba ct e r i ac e a e e tambm espcies do gnero Ae r o mo na s Coliformes fecais: so os coliformes capazes de crescer em temperaturas elevadas de 44,5 ou 45C Contagens Coliformes totais, Coliformes fecais, E . co l i Amplamente utilzados em anlise de alimentos Microrganismos indicadores Comeo: E. co li substituindo Sal m o n e l l a ty p h i em anlise de gua. Shardingen (1892) - E. coli mais fcil de se recuperar (isolar). Outros indicadores sugeridos: - Estreptococos ou enterococos - Enterobactericeas - S ta p h y lo co c c u s (sugerindo a presena da toxina do St ap h y l o co cc u s au r e u s ou manuseio excessivo e/ou inadequado) - G e o tr i c h u m ca nd id u m - mofo de equipamento (sugere equipamento contaminado ou instalao mal sanitizada). Importncia dos coliformes e coliformes fecais na deteriorao de alimentos: (1) crescem facilmente em vrios substratos, utilizando uma grande variedade de carboidratos e outros compostos orgnicos como fonte de energia e um nmero de compostos nitrogenados, relativamente simples, como fonte de nitrognio. (2) conseguem sintetizar a maioria da vitaminas que necessitam.12

(3) crescem em temperaturas desde inferiores a 10C at 46C. (4) produzem quantidades razoveis de gs e cidos a partir de carboidratos. (5) produzem maus odores (que lembram sujeira, estbulo) (6) En t e r o ba ct e r ae ro ge ne s causa limosidade nos alimentos ou "filamentos".

Aspectos Microbiolgicos do Acar Cristal13

Termfilas No Produtoras de H2S:

o

Origem: So bactrias encontradas no solo e portanto, pelo fato da cana carregar consigo grandes quantidades de terra, estas bactrias podem contaminar o acar, se a temperatura de aquecimento no for suficiente para a inativao dos esporos.

o

Especificao:

o

Tipo 1, 2 e 3: Mximo 03 N (+) Tipo 4: mximo 04 N (+)

Problemas: Produzem gs em abundncia, sendo que os produtos enlatados que mais sofrem esse tipo de deteriorao so molhos de tomate, conservas de abbora, batata-doce, vagens e aspargos.

Termfilas Produtoras de H2S (Bactrias de Deteriorao Sulfdrica):

o

Origem: So bactrias encontradas no solo e portanto, pelo fato da cana carregar consigo grandes quantidades de terra, estas bactrias podem contaminar o acar, se a temperatura de aquecimento no for suficiente para a inativao dos esporos.

o

Especificao:

o

Tipos 1 a 4: Mximo 05 esporos/10 g

Problemas: Os alimentos com esse tipo de deteriorao, normalmente produtos enlatados, no mostram sinais de estufamento, porm tornam-se enegrecidos, com odor caracterstico de sulfeto de hidrognio (semelhante a ovo podre). Ocorrem tambm manchas na parede interna das latas, devido a reao do H2S produzido pelas bactrias com o ferro da lata.

Termfilas Produtoras de Flat-Sour (Acidez Plana):

o

Origem: So bactrias encontradas no solo e portanto, pelo fato da cana carregar consigo grandes quantidades de terra, estas bactrias podem contaminar o acar. Os esporos de flat-Sour possuem extrema resistncia a elevadas temperaturas.

o

Especificao:

o

Tipos 1 a 4: mximo 50 esporos/10 g

Problemas: Reduz significativamente o pH do produto. Esta deteriorao chamada de flat-sour (acidez plana), em virtude deste microorganismo praticamente no produzir gs, o que consequente-mente no altera a aparncia das embalagens.

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Mesfilas:

o

Origem: So microorganismos amplamente distribudos nos diferentes ambientes, principalmente em regies de clima tropical. As espcies mais freqentemente encontradas so provenientes do solo. Os esporos so muito mais resistentes as condies adversas (antibiticos, radiaes, elevadas temperaturas, etc.) do que os esporos de clulas vegetativas, sendo esse o motivo de serem freqentemente encontrados em acares, amido, frutas secas, cereais, etc.

o

Especificao:

o

Tipos 1 a 4: mximo 50 UFC/g

Problemas: Podem causar deteriorao em conservas de vegetais enlatados.

Leveduras e Bolores:

o

Origem: So microorganismos amplamente distribudos no meio ambiente, e se desenvolvem em meios menos favorveis ao desenvolvimento bacteriano, como baixos valores de pH, altas concentraes de sal ou de acar, baixa temperatura de armazenagem, presena de antibiticos, e exposio a irradiao.

o

Especificao:

o

Tipos 1 a 4: mximo 50 UFC/g.

Problemas: Podem alterar o sabor , causar perda de odores e provocar descolorao da superfcie dos alimentos. Provocam deteriorao dos sucos de frutas e de bebidas carbonatadas (refrigerantes). Geralmente as bebidas que foram contaminadas por leveduras apresentam um sedimento visvel, turbidez e tambm alterao no sabor. Tambm podem causar danos em bombons recheados com licores, j que as leveduras utilizam o licor como substrato e ao produzirem gs (CO2), racham a parede do bombom, fazendo com que todo o contedo extravase. Podem causar deteriorao em conservas de vegetais enlatados.

Coliformes:

o

Origem: So bastonetes, freqentemente encontrados no trato intestinal de animais, e algumas espcies so encontradas em vegetais. Crescem em vrios substratos e utilizam carbohidratos ou outros compostos orgnicos como fonte de energia.

o

Especificao:

o

Tipos 1 a 4: ausente

Problemas: Causam sabores e odores desagradveis nos alimentos, tornando-os imprprios para o consumo humano.

Salmonella:

o

Origem: So bastonetes gram negativos e apresentam alta motilidade. So15

encontradas no trato intestinal, do mesmo modo que os coliformes. Geralmente so encontrados como saprfitas em materiais ricos em carbohidratos de plantas em decomposio, crescem bem em meios comuns na presena de oxignio livre.

o

Especificao:

o

Tipos 1 a 4: ausente

Problemas: So responsveis por vrias infeces no organismo humano.

Bacillus cereus:

o

Origem: Esto amplamente distribudos na natureza e podem ser isolados de uma grande diversidade de alimentos.

o

Especificao:

o

Tipos 1 a 4: ausente

Problemas: Dois tipos de intoxicao so atribudas ao consumo de alimentos contaminados por Bacillus cereus. O primeiro e mais comum caracterizado por dores abdominais e diarria, compreendendo um perodo de incubao de 4 a 16 horas. O segundo tipo caracterizado por nusea aguda, seguida de vmito, e ocorre geralmente de 1 a 5 horas aps a ingesto do alimento contaminado.

Staphylococcus aureus:

o

Origem: So encontrados em uma extensa variedade de mamferos e pssaros, bem como em muitas superfcies. Esta bactria est presente no nariz, garganta e cabelo de pessoas saudveis. So abundantes em cortes, espinhas e abcessos e podem resistir a altas concentraes de sal e acar.

o

Especificao:

o

Tipos 1 a 4: 103 UFC / g

Problemas: Os sintomas da contaminao por S. aureus podem ocorrer entre 1 e 8 horas aps a ingesto do alimento contaminado. Os sintomas mais comuns incluem nuseas, vmitos, dores abdominais e exausto.

ISOLAMENTO E CULTIVO DE MICRORGANISMOS

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ALGUMAS REGRAS GERAIS PARA A APLICAO DE ABORDAGENS ECOLGICAS PARA O ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS Obs: Podem ser microrganismo. aplicadas no isolamento de qualquer grupo de

1. Listar os grupos de microrganismos que sero isolados. 2. Descrever as caractersticas do ambiente ou habitat do qual as amostras sero coletadas. 3. Agrupar as amostrar em tipos, por exemplo, partes vegetais, solo (tipos e horizontes), gua, insetos... 4. Listar os parmetros ambientais a serem considerados e medidos, tais como: pH, salinidade e temperatura. 5. Listar os substratos naturais disponveis no ecossistema ex: Folhas (celulose, lignina), insetos (quitina)... 6. Escolher as tcnicas de isolamento, isto : diluentes, substratos, extratos naturais e condies de incubao. 7. Avaliar os mtodos de isolamento ecolgicos, usando mtodo padro como controle. 8. Modificar os procedimentos conhecidos com base nos parmetros ecolgicos do material a ser analisado. 9. Empregar procedimentos de enriquecimento especficos para grupos microbianos que possam ser de interesse na seleo.

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TIPOS DE CULTURA: 1. Cultura Mista: mais de um microorganismo crescendo (natureza). 2. Cultura Pura: aquela que se origina do crescimento de uma nica clula (pureza gentica). 3. Cultura Axnica: constituda por uma nica espcie de microrganismo, independente do nmero de indivduos, num ambiente livre de outros microrganismos (no implica em pureza gentica) CLASSIFICAO DOS MICRORGANISMOS DIVERSIDADE METABLICA DE ACORDO COM SUA

Os microrganismos necessitam de uma fonte de carbono (gs carbnico (CO2) ou carbono orgnico) e de uma fonte de energia (luz ou energia derivada da oxidao de compostos orgnicos ou inorgnicos). Os microrganismos que usam a luz como fonte de energia podem ser: Fotoautotrficos ou fotolitotrficos: so organismos que usam a luz como fonte de energia e o carbono inorgnico (CO2) como fonte de carbono. So representados pelas bactrias fotossintetizantes (cianobactrias), bactrias sulfurosas prpura (exemplo: Chromatium) e bactrias sulfurosas verdes (exemplo: Chlorobium), algas e plantas verdes. Existem cerca de 60 espcies de bactrias fotoautotrficas. Fotoheterotrficos ou fotorganotrficos: usam luz como fonte de energia e compostos orgnicos (lcool, carboidratos, cidos orgnicos, etc.) como fonte de carbono. So as bactrias verdes no sulfurosas (exemplo: Chloroflexus) e as bactrias prpuras no sulfurosas (exemplo: Rhodopseudomonas ). Os microrganismos que obtm energia atravs da oxidao de compostos orgnicos ou inorgnicos podem ser classificados em: Quimioautotrficos ou quimiolitotrficos: usam os compostos qumicos (gs sulfdrico (H2S), enxofre elementar (S), amnia (NH3), gs hidrognio (H2), nitrato (NO3-), nitrito (NO2-) e ferro (Fe2+) como fonte de energia e usam o CO2 como fonte de carbono. Quimioheterotrficos ou quimiorganotrficos: so organismos que usam compostos orgnicos como fonte de energia e de carbono. Este grupo inclui a maioria das bactrias, fungos e protozorios.

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Principais tipos nutritivos das bactrias

MEIOS DE CULTURA Meios Sintticos: so meios de composio qumica definida (pouco uso). gar ou caldo nutritivos: meios com adio de extrato de carne, peptona, agar, extrato de levedura. Promovem o desenvolvimento de uma ampla gama de microrganismos. Escolha do meio: Envolve: tipo/grupo microbiano (bactrias, fungos, algas) Ex.: Escherichia coli / tipo selvagem prototrfico (autosuficientes). Mutantes so auxotrficos (nutricionais) Fungos de maneira geral exigem pouco nitrognio para crescer.

Tipos de meios: Considerando que alguns microrganismos hetertrofos apresentam exigncias nutricionais especficas hetertrofos fastidiosos -, as quais no so supridas pelo caldo nutritivo/ou agar, existem meios especiais que permitem o estudo destes hetertrofos.19

1. Meios enriquecidos: so adicionados: sangue, soro ou extratos de tecidos animais ou vegetais ao caldo/ou gar nutritivos, o que proporciona nutrientes acessrios. 2. Meios seletivos: (Figura 1) - certas substncias adicionadas ao meio selecionam um grupo, impedindo o crescimento de outro. 2.1. Ex: O cristal violeta 1:200.000 a 1:300.000 Impede o crescimento das bactrias Gram-positivas, enquanto a Escherichia coli (Gram-negativa) sensvel a uma concentrao 10 x maior. 2.2. Ex: Sendo a maltose a nica fonte de carbono no meio. A ausncia de outras fontes de carbono ir selecionar aqueles microrganismos que utilizam a maltose como fonte de energia. 3. Meios Diferenciais: (Figura 2) - servem para diferenciar tipos especficos de microrganismos; as substncias incorporadas ao meio, resultam num tipo de crescimento ou modificao do meio. Ex: Inoculando-se uma mistura de bactrias no meio de gar-sangue verificase: Zonas claras ao redor da colnia Bactrias hemolticas (causam hemlise). Pode-se diferenciar bactrias hemolticas das no-hemolticas. OBS.: gar-sangue serve como meio enriquecido e diferencial. 4. Meios de dosagem: de composio definida, so empregados para dosagem de vitaminas, aminocidos e antibiticos. Podem ser utilizados para avaliar a eficincia de desinfetantes. 5. Meios para contagem de bactrias: sua composio obedece a recomendaes prescritas. So meios especficos indicados para determinar o contedo bacteriano da gua e o leite. 6. Meios para a identificao: existe uma grande variedade de meios para bactrias e fungos, cuja finalidade auxiliar na identificao. Seguindo-se as recomendaes e as condies de cultivo, pode-se determinar o crescimento, caractersticas da colnia e alteraes no meio. 7. Meios de estocagem ou manuteno: A manuteno adequada da viabilidade e das caractersticas fisiolgicas de uma cultura pode exigir um meio diferente daquele que recomendado para o seu crescimento timo. Por exemplo: 1) o rpido e luxuriante desenvolvimento pode estar associado morte de clulas; 2) glicose no meio favorece o crescimento, mas libera cidos. Em meios de estocagem deve-se evitar o seu uso.

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Figura 1. Fotografias das placas contendo os meios seletivos WLD, gar-Lisina, LWYM, (amostras sem diluio) e do meio de contagem geral WLN (diluio 10-10). Nos 3 primeiros meios, so isoladas leveduras no Saccharomyces (Lisina) ou Saccharomyces no cerevisiae (LWYM e WLD), pela adio de substncias como cristal-violeta (LWYM) e actidione (WLD), s quais S. cerevisiae sensvel, e lisina como nica fonte de carbono (meio de Lisina), a qual linhagens de Saccharomyces no so capazes de utilizar. Desta forma, pode-se avaliar o nvel de contaminao por outras leveduras que no a do processo fermentativo para produo de etanol (S. cerevisiae). As fotos so pertencentes profa. Sandra R.C.Antonini.

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Figura 2. Fotografia de placa com meio diferencial YEPD-azul de metileno, tamponado com tampo citrato, pH 4,3-4,5 e inoculado com uma linhagem sensvel para verificao de atividade killer de leveduras selecionadas. As colnias de leveduras que apresentam halo de inibio e zona azul ao redor do halo (primeira e segunda, primeira linha, da esquerda para a direita; e a primeira, ltima fila, da esquerda para direita) so consideradas killer enquanto as outras no apresentam atividade killer . A toxina killer uma protena de baixo peso molecular que txica para algumas leveduras. A fotografia foi retirada da dissertao de mestrado de Christiann D. Tosta.

CONDIES FSICAS NECESSRIAS AO CRESCIMENTO 1. TEMPERATURA i. Psicrfilos crescem a 0C ou menos - timo pode ser 15 20C ii. Mesfilas faixa: 25 40C iii. Termfilos faixa: 45 60C Euritermfilos (facultativas) faixa ampla Estenotermfilos (termfilos verdadeiras, obrigatrias) faixa estreita. A temperatura pode ser utilizada como fator seletivo. Ex: Calor 85C elimina as formas vegetativas e no elimina esporos de bactrias. Temperatura tima: permite rpido desenvolvimento num curto espao de tempo. - a temperatura tima, como foi definida, pode no ser a ideal para outras atividades. 2. EXIGNCIAS ATMOSFRICAS: CO2 e O2 Os microrganismos podem crescer na presena ou ausncia de oxignio e, neste aspecto, podem ser classificados em: Aerbios: so os microrganismos que normalmente requerem oxignio para crescer. Facultativos: so os microrganismos que crescem na presena de oxignio ou na ausncia dele (anaerobiose). Anaerbios: so os microrganismos que ou crescem na presena de baixas concentraes de oxignio, os chamados de anaerbios facultativos, ou morrem quando esto na presena deste gs; estes so os chamados de anaerbios estritos. Microaerfilos: so organismos aerbios, porm somente crescem em concentraes de oxignio menores que a do ar (entre 1% e 15%).

3. pH ACIDEZ E ALCALINIDADE Bactrias: pH timo 6,5 e 7,5 (neutro)22

Fungos: pH timo ao redor de 5,0 (cido) O uso de tampes ajuda a impedir variaes bruscas do pH durante o perodo de incubao. A combinao KH2PO4 e K2HPO4 largamente empregada em meios de cultura bacteriolgicos.

MANUTENO E CONSERVAO DE CULTURAS PURAS As colees de culturas de estoque visam: Aulas prticas de laboratrio Trabalhos de pesquisa Reagentes em determinados processos.

Obs.: As culturas puras devem ser mantidas em condies adequadas, que mantenham as caractersticas culturais e identificadas, permitindo assim o seu uso facilmente. MTODOS DE CONSERVAO 1. Transferncia para novos meios periodicamente. Cuidados: i) verificar os meios adequados para cada espcie ii) temperatura de estocagem iii) perodo de transferncia do repique iv) cuidar para que no haja contaminao da cultura 2. Conservao de culturas sob camada de leo mineral . i) cobrir o meio com leo mineral estril (1 cm) Consideraes: Tempo varia conforme a espcie, algumas mantm-se viveis por anos. Uma parte da cultura pode ser retirada para repique sem prejudicar o material conservado. 3. Liofilizao: Processo que consiste na remoo da gua de uma suspenso de microrganismos congelados por sublimao sob presso reduzida. Consideraes: Longa estabilidade (viabilidade) Fcil estocagem (pequeno volume) 4. Estocagem a baixas temperaturas Nitrognio lquido (-196 C) agente protetor (glicerol ou dimetil sulfxido) Consideraes: um processo eficaz e pode substituir a liofilizao, quando as amostras no podem ser liofilizadas. COLEES DE CULTURAS23

Maryland - EUA Inglaterra

American Type Culture Collection (ATCC) Rockville Instituto Pasteur Paris National Collection of Type Cultures Londres Japanese Type Culture Collection Tkio. Nacional Collection of Yeast Cultures (NCYC) Norwich,

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