Cromatografia–Noções gerais e Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência:
Vitória Berg Cattani
Universidade Federal de Santa MariaCentro de Educação Superior Norte - RS
CROMATOGRAFIA
Michael Tswett - 1906
éter depetróleo
CaCO3
mistura depigmentos
pigmentosseparados
CROMATOGRAFIA
Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou
sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).
Princípio Básico
TIPOS DE MECANISMOS Depende do tipo de fase estacionária.
Transferência dos componentes da fase móvel para a fase estacionária.
ADSORÇÃO
Na superfície das partículas sólidas.
PARTIÇÃO
Entre os líquidos da fase móvel e da fase estacionária que fica nos poros de um suporte sólido inerte.
BIOAFINIDADE
TIPOS DE MECANISMOS
TROCA IÔNICA
Com componentes iônicos da fase estacionária;
Inclui resinas trocadoras de cátions e de ânions.
EXCLUSÃO
Processo mecânico
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA
CROMATOGRAFIACROMATOGRAFIA
Planar Em coluna
Gasosa Fluidosupercrítico
LíquidaLíquido
Centrífuga (chromatotrom)
CCD CP CG ClássicaCGAR CLAE
ou HPLC
Técnica
Fase Móvel
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 1. PLANAR
padrões amostras
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 1. PLANAR
Aplicações:
•separação de substâncias;
•identificação de substâncias.Rf = ds/dmdm
ds1
ds2
CHROMATOTRON®
Aplicações:
•separação de substâncias.
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 1. PLANAR
Eluente
CROMATOGRAFIA EM COLUNA CLÁSSICA
Aplicações:
•separação de substâncias.
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 2. EM COLUNA
Solvente
Fase estacionária
Algodão
CROMATOGRAFIA EM COLUNA CLÁSSICA
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 2. EM COLUNA
CROMATOGRAFIA GASOSA
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
Usada para separar compostos orgânicos voláteis;Separação ocorre devido a partição entre:
fase móvel (gás inerte);fase estacionária (sílica da coluna).
Aplicações:
Separação de substâncias;
Identificação de substâncias:
tempo de retenção;
espectro de massas (CG-MS);
Quantificação de substâncias (padrão).
AU
ME
NT
O D
A
TE
MP
ER
AT
UR
A D
A C
OL
UN
A
CROMATOGRAFIA GASOSA
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 2. EM COLUNA
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) OU
HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 2. EM COLUNA
HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
COLUNA CROMATOGRÁFICA
HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
COLUNA CROMATOGRÁFICA
Solvente (fase móvel)
HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
FASE ESTACIONÁRIA
FASE NORMAL
Superfície da sílica com característica POLAR.
FASE REVERSA
Superfície da sílica com revestimento APOLAR.
Ex.: C18 (ODS), C8 – fase ligada;
Ex.: poliestireno, poliacrilato – polímeros adsorvidos.
HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
FASE ESTACIONÁRIA
CH3O
CHCH3
COOH
Si O Si O
Si O Si O
OH OHPontes de hidrogênio
Si O O
Si O Si O
Fase normal (sílica gel) Fase reversa (sílica ODS)
COOH
CHCH3
CH3OInteração Van der Waals
OC18H37 OC18H37
Si
Figura 1- Interação do naproxeno com a superfície da sílica gel e sílica gel ODS
HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
ESTRUTURA DO HPLC
fase móvel
descarte
HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
ESTRUTURA DO HPLC
fase móvel
descarte
bomba
HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
ESTRUTURA DO HPLC
fase móvel
descarte
bomba injetor
detector
HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
ESTRUTURA DO HPLC
fase móvel
descarte
bomba injetor
detector
mistura
degasser
HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
ESTRUTURA DO HPLC
fase móvel
descarte
bomba injetor
detector
mistura
degasser
ELUIÇÃO ISOCRTÁTICAOU ELUIÇÃO EM GRADIENTE
HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
ESTRUTURA DO HPLC
fase móvel
descarte
bomba injetor
detector
Degas-ser
HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
ESTRUTURA DO HPLC
fase móvel
descarte
bomba injetor
detector
Degas-ser
HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
ESTRUTURA DO HPLC
fase móvel
descarte
bomba injetor
detector
Degas-ser
HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
ESTRUTURA DO HPLC
fase móvel
descarte
bomba injetor
detector
Degas-ser
HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
ESTRUTURA DO HPLC
fase móvel
descarte
bomba injetor
detector
Degas-ser
HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
ESTRUTURA DO HPLC
fase móvel
descarte
bomba injetor
detector
Degas-ser
HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
DETECTORES:
UV/vis – baseado na absorção de luz pelo analito. Boa sensibilidade (0,01-100µg)
DAD (diode array detector) – tipo avançado de UV
Fluorescência
Eletroquímico
Massa
HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
APLICAÇÕES:
Separação de substâncias;
Identificação de substâncias:
tempo de retenção;
espectro de absorção no UV-VIS( HPLC-UV/VIS);
Quantificação de substâncias (padrão).
HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
VANTAGENS:
Versatilidade (compostos orgânicos, inorgânicos, sólidos, líquidos) e variedade de colunas e detectores;
Seletividade;
Menor risco de degradação da amostra (CG);
Boa sensibilidade (nanogramas).
HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
LIMITAÇÕES:
Alto custo do equipamento;
Alto custo da operação (colunas e solventes);
Experiência do analista no manuseio do equipamento;
Necessidade de extração antes do uso;
Grande quantidade de resíduo formado.
CLAE – PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS
•Retenção ou Fator de Capacidade (k’)•Mede o tempo de permanência do composto na fase estacionária comparado com o tempo de permanência na fase móvel durante a corrida.
•Indica o grau de afinidade que a fase estacionária e a fase móvel possuem pelo composto.
0
01
0
01'V
VV
T
TTK
T0: tempo de retenção de um composto não retido pela coluna
•Seletividade ()•Compara a retenção de um componente com a retenção de outro componente, indicando até que ponto o sistema químico (coluna e fase móvel) os diferencia.
01
02
1'
2'
VV
VV
K
K
CLAE – PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS
•Resolução (R)•Avalia a qualidade da separação entre dois componentes de acordo com uma determinada condição cromatográfica.
)( 122
12
WW
TTR
•Eficiência (N)•Indica o quanto o sistema de CLAE permite que a banda de um componente se dilua durante a corrida cromatográfica.
•Avalia o alargamento da banda de um pico de um componente causados por fatores ligados ao injetor, coluna, fase móvel, detector.
2
1
116
W
TN
CLAE – PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS
•Influência da geometria da coluna na separação Influência da geometria da coluna na separação cromatográficacromatográfica
•Comprimento (maior)
•Maior eficiência (no de pratos teóricos);
•Maior tempo de análise e consumo de solventes;
•Maior resolução;
•Maior capacidade;
•Maior pressão de trabalho.
•Diâmetro interno (menor)
•Maior seletividade (picos mais finos);
•Maior eficiência (menor diluição do pico);
•Menor capacidade;
•Análise mais rápida, menor consumo de solventes e menor pressão.
SPE NH2
SPE C18
Benomyl
Tebuthiuron
Simazine
Atrazine
Diuroion
Ametryn
Coluna C18, FM: ACN:0,01% NH4OH (35:65, v/v), fluxo 0,7 mL/min.
Triazine
Simazine
Atrazine
FM: ACN:H2O: CH3COOH (50:50:0,01, v/v)
Coluna C18; fluxo: 0,3 mL/mi); detecção: 220nm
Folpet
Chlorothalonil
Quinomethionat
Tetradifon
Trifluralin
FM (gradiente côncavo): ACN:H2O (40:60 a 90:10 em 20 min; permaneceu 90:10 por 5 min; retornou a 40:60 em 5 min).
Coluna C18; fluxo: 1,0 mL/min; detecção: 220 e 260 nm