Disciplina: Elementos de Microscopia e Microanálise
Discentes: Lilian Campos Pires Marina Curado Valsechi
Sistema Imune: Reações antígeno-
anticorpo
Células e tecidos
Reações químicas
Conjugação de distintos marcadores, com moléculas de imunoglobulina, que com auxílio de um substrato específico
localiza o antígeno tecidual
Conjugação de distintos marcadores, com moléculas de imunoglobulina, que com auxílio de um substrato específico
localiza o antígeno tecidual
Conjunto de métodos de detecção de antígenos em corte histológico
Processo de fixação
Detecção de estruturas bioquímicas;
Localização de antígenos em células utilizando anticorpos específicos;
Produto da reação é visível ao microscópio;
Antígeno: qualquer substância que sob condições apropriadas é capaz de estimular a formação de anticorpos.
Anticorpo: proteína que é formada em resposta à exposição de um antígeno e reage especificamente com esse formando imunocomplexos.
Determinante antigênico, o sítio exato de ligação do anticorpo na molécula do antígeno
Epítopo
Sítio de Ligação ao antígeno
Único clone de célula produtora de anticorpos
Possuem sítios de ligação ao antígeno idênticos
MonoclonalMonoclonal PoliclonalPoliclonal
Múltiplos clones de célula produtora de anticorpos
Possuem diversas especificidade antigênicas
Reconhecimento do antígeno pelo anticorpo
Substâncias são utilizadas para “tingirem” essa ligação
Mecanismo Básico
Métodos utilizados para marcar anticorpos:
Conjugação com composto fluorescente;
Conjugação com uma substância que não se deixa atravessar pela luz e que dispensa elétrons (ouro ou prata);
Conjugação com uma enzima;
Peroxidase
Px + H2O2 Px. H2O2 + doador de elétrons (cromogênico)
Molécula colorida + Px + H2O
Cromógeno, mas o mais utilizado é o diaminobenzidina (DAB):
Específico para Peroxidase;
Origina um precipitado marrom, visível ao microscópio óptico;
Carcinoma ductal
Direto
Anticorpo primário é marcado diretamente por
uma enzima
Indireto
Anticorpo primário serve como antígeno para o anticorpo secundário
Anticorpo marcado
Anticorpo secundárioAnticorpo
Primário
1. Método da Peroxidase-Antiperoxidase
Complexo Peroxidase-antiperoxidase: estáveis e sensíveis
Evitar a perda da peroxidase durante as lavagens com a solução tampão
Complexo PAP
Anticorpo secundário Produto final com DAB é
acastanhado
Produto final com DAB é
acastanhado
Sistema PAP contém anticorpos de alta afinidade para peroxidase
Aumento da eficiência
1. Método da Peroxidase-Antiperoxidase
2. Método Avidina-Biotina
Biotina Conjugada a anticorpo e enzimas
Anticorpo secundários
Complexo ABC
Biotina
Conjugados
Ligações entre o tecido ligados anticorpos primários e um complexo avidina-biotina-peroxidase
2. Método Avidina-Biotina
3. Método Streptavidina-Biotina
Anticorpo secudário biotinilado
Anticorpo primárioStreptavidina
conjugada com
peroxidase
Streptavidina conjugada
com peroxidase
Um anticorpo primário associado com múltiplas moléculas de peroxidase.
Grande razão enzima-anticorpo
Aumento de sensibilidade
3. Método Streptavidina-Biotina
Suspensões celulares
Procedimentos de imunohistoquímica:
Secções de parafina
Esfregaço
1. Coleta e fixação do material
Fixação
Preservar a morfologia e imunorreatividade;
Prevenir o deslocamento do antígeno durante as etapas que seguem a fixação;
Não interferir com as reações subseqüentes na localização do antígeno;
Preservar a morfologia e imunorreatividade;
Prevenir o deslocamento do antígeno durante as etapas que seguem a fixação;
Não interferir com as reações subseqüentes na localização do antígeno;
Características de um fixador
Formol
Soluções fixadoras
AldeídicasPontes Covalentes
Formaldeído 4-10%Paraformaldeído 4%PLP Periodato-lisina-formaldeídoGlutaraldeído
AldeídicasPontes Covalentes
Formaldeído 4-10%Paraformaldeído 4%PLP Periodato-lisina-formaldeídoGlutaraldeído
AlcóolicasCoagulação de
Proteínas
Carnoy 70% etanol 20% clorofórmio 10% ac. acético
Metacarn 70% metanol 20% clorofórmio 10% ac. acético glacial
AlcóolicasCoagulação de
Proteínas
Carnoy 70% etanol 20% clorofórmio 10% ac. acético
Metacarn 70% metanol 20% clorofórmio 10% ac. acético glacial
Com adição de Metais Pesados
Zinco: antígenos de membrana
Mercúrio-B5: Ig intracelulares
Com adição de Metais Pesados
Zinco: antígenos de membrana
Mercúrio-B5: Ig intracelulares
2. Corte e Identificação do Material
Corte
Cassete
Identificação
3. Desidratação
4. Clarificação
5. Inclusão
Pouco efeito na imunorreatividade da maioria dos antígenos.
1ª : álcool 70%2ª : álcool 80 %3ª : álcool 95 %
4ª : álcool absoluto (3X)
Xilol (2X)
Não se deve ultrapassar a temperatura de 60°C quando da inclusão em parafina.
Parafina (2X)
6. Corte histológico
Secagem na estufa
60°C por 24h
Desparafinização
Xilol IXilol IIEtanol absolutoEtanol 95%Etanol 70%
Xilol IXilol IIEtanol absolutoEtanol 95%Etanol 70%
Bloqueio da peroxidase endógena
Peróxido de hidrogênio 3%
Lavar as lâminas em água corrente e destilada e, em seguida, com solução salina tamponada (PBS) com pH de 7,4 à 7,6 por 30 minutos
Peróxido de hidrogênio 3%
Lavar as lâminas em água corrente e destilada e, em seguida, com solução salina tamponada (PBS) com pH de 7,4 à 7,6 por 30 minutos
Recuperação Antigênica
Solução de tripsina 0,1% por 10 minutos à 37ºC em câmara úmida
Lavar as laminas em água corrente e destilada e, em seguida, com solução salina tamponada (PBS)
Solução de tripsina 0,1% por 10 minutos à 37ºC em câmara úmida
Lavar as laminas em água corrente e destilada e, em seguida, com solução salina tamponada (PBS)
Necessárias reações para bloqueio destas moléculas.
Bloqueio da Peroxidase Endógena
Pode ocorrer interferências pela ação de enzimas endógenas;
Ligação inespecífica de anticorpos com as proteínas do tecido;
Principais causas de coloração de fundo sem especificidade e
indesejável em imunohistoquímica.
Principais causas de coloração de fundo sem especificidade e
indesejável em imunohistoquímica.
Recuperação Antigênica
Falhas nesse procedimento podem acarretar na total ausência de coloração específica.
Solução Tampão (Citrato) aquecida: 95°-99°C
30-40 min
Lâminas resfriarem
Incubação com anticorpo
Aplicação do Ac. Primário (1h à 37°C)
Aplicação do Ac. Secundário Biotinilado (30 min à 37°C)
Aplicação do Reagente Peroxidase (20min à 37°C)
Pinga o cromógeno, DAB, na lâmina
Contra-coloraçãoHematoxilina
Monta as Lâminas
Álcool 95%Álcool Absoluto
Xilol
Álcool 95%Álcool Absoluto
Xilol
Receptor de EstrogênioMarcação nuclear
Oncoproteína c-erbB-2Marcação de membrana
GFPAMarcação citoplasmática
Expressão de E-caderina na membrana e citoplasma
Expressão de E-caderina em carcinoma mamário
É uma proteína que confere aderência às células e é de grande
importância na diferenciação epitelial.
É um potente supressor de invasão nos tumores mamários
e a perda da sua expressão tem relação com um prognóstico
ruim
E-caderina
Marcadores de proliferação celular
Ki-67 PCNA
Presente nas fases G1, S, G2 e mitose;
Proteína associada à cromatina;
Correlação positiva com metástase;
Mostra células em replicação;
Quanto maior a proliferação, mais agressiva é a lesão;
Presente nas fases G1, S, G2 e mitose;
Proteína associada à cromatina;
Correlação positiva com metástase;
Mostra células em replicação;
Quanto maior a proliferação, mais agressiva é a lesão;
Maior síntese na Fase S;
Proteína associada ao reparo de DNA;
Célula está em processo ativo de divisão celular ou em processo de reparo do DNA;;
Maior síntese na Fase S;
Proteína associada ao reparo de DNA;
Célula está em processo ativo de divisão celular ou em processo de reparo do DNA;;
Ki-67 PCNA
Marcadores de proliferação celularMarcadores de proliferação celular
Actina de musculo liso Citoqueratinas 5-6
Anticorpos para camada basal mioepitelial em tumor de mama
Ausência ou menos de 10% de imunopositividade na membrana citoplasmática das células tumorais:= 0 = Negativo
Imunopositividade fraca em parte da membrana citoplasmática em mais de 10% das células tumorais:= 1+ = Negativo
Imunopositividade fraca a moderada em toda a membrana citoplasmática em mais de 10% das células tumorais:= 2+ = Fracamente positivo
Imunopositividade intensa em toda a membrana citoplasmática em mais de 10% das células tumorais:= 3+ = Fortemente positivo
Como considerar positivo e como relatar o resultado???
A
B C
A. 1+
B. 2+
C. 3+
Negativo
Positivo
Positivo
Oncoproteína c-erbB-2
Receptor para o fator de crescimento epitelial (EGF-R).
0
+1
+2
+3
Câncer de mama
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
“O Câncer é, em essência, uma doença genética”.
Kenneth W. Kinzler e Bert Vogelstein
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
Carcinógeno
Lesão ao DNA
Célula Normal
Apoptose
Luz solar
Radiação
Derivados de petróleo
Corantes e conservantes
Hormônios
Fumo
Poluição
Vírus, etc...
Reparo
ReparoX
Reparo e apoptose ineficientes
Mutações adicionais
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
Câncer
Células tumorais benignas crescem
localmente e não têm capacidade invasiva
Células tumorais agressivas invadem tecidos vizinhos, caem
na corrente sanguínea e colonizam diferentes sítios
Mutação inativa
supressor de tumor
Proliferação celular
Mutação inativa
genes do reparo
Proto-oncogene
Oncogene
Mais mutaçõesMais instabilidade
genética
Metástases
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
Aplicações em câncer
Diagnóstico de tumores indiferenciados;
Diagnóstico diferencial entre tumores e estados
reacionais a inflamações;
Determinação de fatores preditivos de neoplasias;
Determinação de fatores prognósticos de neoplasias;
Determinação de sítio primário de metástases;
Determinação de subtipos de leucemias e linfomas.
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
Imunohistoquímica no diagnóstico de câncer de pulmão
Carcinoma de células
escamosas
Carcinoma neuroendócrino
adenocarcinoma
Carcinoma de grandes células
Câncer de pulmão
Baixo grau
Alto grau
Cromogranina no citoplasma
Sinaptofisina no citoplasma
CK5 CK6 de alto peso
molecular 34βE12
CK5 CK6
Citoqueratinas de
baixo peso molecular
35βH11
Negativos para
p65
Positivos
CK5 CK6
CK7
SP-A
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
Imunohistoquímica no prognóstico de câncer de pulmão
p53 Adenocarcinoma
c-erbB-1 Carcinoma de células escamosas Expressão relacionada com pior prognóstico
C-erbB-2 Adenocarcinoma Expressão relacionada com prognóstico favorável
VEGF Carcinoma não-pequenas células
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
Adenocarcinoma – citoqueratinas de alto e baixo
peso molecular
Adenocarcinoma – citoqueratina CK7
Tumor carcinóide
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
Adenocarcinoma primário
Origem mesenquimal
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DOS MARCADORES PCNA,
Ki67 E P53 EM CARCINOMAS EPIDERMÓIDES DO TRATO
AERODIGESTIVO SUPERIOR
Revista do Colégio Brasileiro de Cirurgiões — Vol. 27 – no 5 — 327
Parâmetros usados para classificar este tipo de tumor são muito subjetivos e os tumores apresentam
comportamento muito heterogêneo
Necessidade de se encontrar novos
procedimentos capazes de melhor classificar este tipo
tumoral
IHQ para os genes
PCNA, Ki67 e P53
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
Correlacionar a expressão
IHQ dos marcadores de proliferação
PCNA e Ki67 e de supressão tumoral P53, com parâmetros
prognósticos clínicos e patológicos em carcinomas
epidermóides
do trato aerodigestivo superior.
Correlacionar a expressão
IHQ dos marcadores de proliferação
PCNA e Ki67 e de supressão tumoral P53, com parâmetros
prognósticos clínicos e patológicos em carcinomas
epidermóides
do trato aerodigestivo superior.
OBJETIVOOBJETIVO
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
MÉTODOMÉTODO
Controles negativosLâminas sem anticorpoControles negativosLâminas sem anticorpo
Controles positivos
Carcinoma de mamaKi67 e P53
Adenocarcinoma gástricoPCNA
Controles positivos
Carcinoma de mamaKi67 e P53
Adenocarcinoma gástricoPCNA
Correlação de PearsonCorrelação de Pearson
Grupo como um todo
Grupo A –laringe e hipofaringe
Grupo B – cavidade oral e orofaringe
Pesquisador único
Periferia do tumor
200 células núcleos positivos
Pesquisador único
Periferia do tumor
200 células núcleos positivos
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
RESULTADOSRESULTADOS
Ki67
Expressão em todos os tumores
5,5% a 95% dos núcleos positivos
46,5% Total
58,5 % Grupo A
35% Grupo B
P53
Expressão em 44 tumores (86.27%)
0,5% a 96,5% dos núcleos positivos
36,5% Total
37% Grupo A
35,5% Grupo B
PCNA
Expressão em todos os tumores
10,5% a 98% dos núcleos positivos
66,5% Total
69% Grupo A
64% Grupo B
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
CONCLUSÃOCONCLUSÃO
A determinação imunohistoquímica do Ki67 e
PCNA pode subsidiar as informações prognósticas do TNM
(AJCC) e do grau de malignidade histológico, como eficientes
indicadores de proliferação celular nestes tipos de tumores.
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
Impacto prognóstico da expressão imuno-histoquímica
do BRCA1 nos carcinomas mamários esporádicosJ Bras Patol Med Lab • v. 41 • n. 3 • p. 197-203 • junho 2005
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
BRCA1BRCA1
Gene supressor tumoral
Participa da regulação do ciclo celular nas células da glândula mamária
Mutações nesse gene levam a defeito no reparo do DNA e instabilidade
genética
Pacientes com mutações no BRCA1Pacientes com mutações no BRCA1
• Menor tempo de sobrevida livre de doença
• Perfil fenotípico característico Carcinoma pouco diferenciado
Alta taxa de proliferação
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
Analisar a expressão
IHQ do BRCA1 em carcinomas
mamários esporádicos e comparar os resultados obtidos
com dados clínicos e histopatológicos de importância prognóstica,
incluindo a expressão de receptores hormonais,
p53, c-erbB-2 e Ki67.
Analisar a expressão
IHQ do BRCA1 em carcinomas
mamários esporádicos e comparar os resultados obtidos
com dados clínicos e histopatológicos de importância prognóstica,
incluindo a expressão de receptores hormonais,
p53, c-erbB-2 e Ki67.
OBJETIVOOBJETIVO
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
MATERIAL E MÉTODOMATERIAL E MÉTODO
Amostras – Carcinomas ductais invasivos
Grau I bem diferenciado (34)
Grau II moderadamente diferenciado (39)
Grau III pouco diferenciado (29)
Sem qualquer outro tratamento adjuvante
Sem história familiar
Sem qualquer outro tratamento adjuvante
Sem história familiar
Método avidina-biotina-peroxidase
BRCA1, P53, c-erbB2, Ki67
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
RESULTADOSRESULTADOS
BRCA1
Epitélio normal - somente nuclear
Carcinomas - nuclear e citoplasmática
Expressão maior nos tumores bem diferenciados
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
51% dos carcinomas baixa expressão do BRCA1
• Alto grau histológico
• Alta taxa proliferativa alta expressão do Ki67
• Negativos para receptores de estrógeno e progesterona
• Positivos para c-erbB2
• Menor sobrevida global
• Menor tempo livre de doença ( metástases e recidiva)
• Alto grau histológico
• Alta taxa proliferativa alta expressão do Ki67
• Negativos para receptores de estrógeno e progesterona
• Positivos para c-erbB2
• Menor sobrevida global
• Menor tempo livre de doença ( metástases e recidiva)
A baixa expressão do BRCA1 está associada a ocorrência de metástases
Papel na progressão tumoral do carcinoma esporádico
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
CONCLUSÃOCONCLUSÃO
A IHQ do BRCA1 pode representar um método de
identificação deste gene que pode ser considerado um
marcador útil na identificação de mulheres portadoras
de carcinoma esporádico de mau prognóstico e alto
risco de recorrência precoce.
Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer
A baixa imunoexpressão desta proteína nesses tumores e
a sua correlação com fatores de mau prognóstico indicam
que o grau de expressão deste gene pode desempenhar
importante papel na tumorigênese mamária
CONCLUSÃOCONCLUSÃO
Versos negros (mas nem tanto...)Carlos Drummond de Andrade
“ Ao levantar, muito cuidado, amigo.Não ponha os pés no chão. Corre perigoSe há nylon no tapete: ele dá câncer.
Pise somente no ar, mas com cautela.Uma pesquisa nos revelaEsta triste verdade: o ar dá câncer.
À hora do café, não seja pato,Pois tanto açúcar como ciclamatoE xícara e colher, sorry: dão câncer.
O banho de chuveiro? Não tomá-lo.O de imersão, também. Sinto informa-loDo despacho londrino: água dá câncer.
Não se vista, meu caro ou minha caraUm cientista famoso eis que declara:Na roupa, qualquer roupa, dorme o câncer...”
Versos negros (mas nem tanto...)Carlos Drummond de Andrade
“ Ao levantar, muito cuidado, amigo.Não ponha os pés no chão. Corre perigoSe há nylon no tapete: ele dá câncer.
Pise somente no ar, mas com cautela.Uma pesquisa nos revelaEsta triste verdade: o ar dá câncer.
À hora do café, não seja pato,Pois tanto açúcar como ciclamatoE xícara e colher, sorry: dão câncer.
O banho de chuveiro? Não tomá-lo.O de imersão, também. Sinto informa-loDo despacho londrino: água dá câncer.
Não se vista, meu caro ou minha caraUm cientista famoso eis que declara:Na roupa, qualquer roupa, dorme o câncer...”
OBRIGADA !!OBRIGADA !!