Karen Cristina de Sant’Anna Brunialti
Correlação entre osteopontina sérica e polimorfismos nos genes GSTT1, GSTP1,
ERCC1 (118), XPD (751) com prognóstico e sobrevida em pacientes com carcinoma
epidermóide de cabeça e pescoço
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências Área de concentração: Oncologia Orientadora: Profa. Dra. Miriam Hatsue
Honda Federico
São Paulo 2009
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
©reprodução autorizada pelo autor
Brunialti, Karen Cristina de Sant’Anna Correlação entre osteopontina sérica e polimorfismos nos genes GSTT1, GSTP1, ERCC1 (118), XPD (751) com prognóstico e sobrevida em pacientes com carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço / Karen Cristina de Sant’Anna Brunialti. -- São Paulo, 2009.
Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Departamento de Radiologia.
Área de concentração: Oncologia. Orientadora: Miriam Hatsue Honda Federico.
Descritores: 1.Carcinoma de células escamosas 2.Neoplasias de cabeça e pescoço 3.Reparo do DNA 4.Osteopontina 5.Cisplatino 6.Glutationa
USP/FM/SBD-317/09
Esta tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no
momento desta publicação:
Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals
Editors (Vancouver)
Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Serviço de
Biblioteca e Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e
monografias. Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de
A.L.Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos
Cardoso, Valéria Vilhena. 2ª Ed. São Paulo: Serviço de Biblioteca e
Documentação; 2005.
Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals
Indexed in Index Medicus.
Dedico esse trabalho a todos os pacientes com câncer, a
vontade de viver de vocês foi o que me inspirou.
AAGGRRAADDEECCIIMMEENNTTOOSS
Agradecimentos
Ao meu pai Helio Francisco Brunialti e à minha mãe Teresa
Cristina de Sant’anna, por todo o tempo e dinheiro gastos na minha
educação e por terem me mostrado o caminho a seguir sempre confiando
nas minhas escolhas. Vocês são responsáveis pela minha vitória, tenham
certeza disso.
À minha irmã Laisa Tatiana de Sant’Anna Brunialti, que me fez ter
uma nova visão da vida, repensar meus conceitos e valorizar a minha rotina.
Você é sem dúvida meu grande amor.
Ao meu namorado Rafael Dutra de Souza pelo amor incondicional
dado a mim, por estar ao meu lado nos meus piores e melhores momentos e
por sempre acreditar na minha capacidade.
Aos meus cães Jade, Snoopy, Fofo (em memória), Neguinho,
220, Gigante, Lola, Lili (em memória), Fox e Fred (em memória), obrigada
por toda alegria que vocês me proporcionam e por serem meus fiéis amigos.
Aos que já se foram, vocês foram os melhores cães do mundo.
À Dra. Miriam Hatsue Honda Federico pela oportunidade de
desenvolver esse trabalho e pela orientação.
À Dra. Mitzi Brentani por ter desenvolvido um grupo tão
consolidado e do qual tive orgulho de fazer parte. A senhora é mais do que
uma referência em pesquisa, é uma referência como pessoa.
Às Dras. Flávia Mangone e Fátima Pasini, um carinho especial,
por terem estado perto de mim em toda essa jornada de trabalho e por terem
feito sempre o papel de vocês.
Agradecimentos
Ao Dr. Igor Snitkovisky e Dr. Gilberto de Castro por todo o
empenho no desenvolvimento desse trabalho, pelo apoio, por ter estado ao
meu lado nos meus momentos de nervoso.
A todas da “casa grande”, Dra. Maria Lucia Hirata Katayama, Dra.
Rosimeire Roela e Dra. Patrícia Bortmam, pelo companheirismo e força
durante esses anos de trabalho.
Aos meus eternos companheiros de laboratório e da vida, Lilian
Pires Barbeta (Lilháá), Bruno Papp Cadima (Mezenga) e Karina Escobar
(Brocolita), não tenho palavras para descrever nossos momentos, sem
vocês eu teria enlouquecido sozinha, vocês são parte da minha tese e da
minha vida, obrigada não é o suficiente para vocês, saibam que os amo
muito e sempre.
A todos os amigos da “senzala”, Mateus Barros, Cíntia Milani,
Adriana Priscila Trapé (rasgatanga), Suzana Terumi Honda, Paulo Del
Valle, Laura Tojeiro Campos (gangola), Yuri Urata, Elen Bastos e Natalia
que ainda estão conosco e também aos que deixaram o laboratório Ticiana,
Renata, Cristina, Leonardo (Sagatiba), Juliana (a melhor das estagiárias),
Camila, Maira entre outros. Agradeço a vocês por agüentarem as minhas
piadas e por sempre me darem carinho e colo em todos meus momentos,
cada um de vocês me tornou uma pessoa melhor e vou levá-los para
sempre. Espero que a Gangola continue minha saga no laboratório já que
ela é minha versão loira e alta.
A todos do grupo do Dr. Roger Chammas, principalmente a Mara,
Andrea, Tarcísio e Luciana pelos momentos de descontração e amizade.
Agradecimentos
A Maria José Benevides (pessoa espetacular), Elizangela Dias,
Rosilene Arruda, Jair Cláudio, Willame Macedo (quero te ver na São
Silvestre) e Ivonete Lima, por sempre me ajudarem em tudo, desde a
limpeza do laboratório e preparação dos materiais até os trâmites
burocráticos, e também pelo carinho e amizade.
A todos os meus amados amigos que estiveram comigo desde o
início da minha jornada, Flávia Caputo, Rodrigo Duarte, Alex
Mantovanelli, Rosane Gomes, Gilvan Santos, Bruno Leonardo, Marcelo
Rulhand, Fabio Costa, Daiany Gomes, Renato Macedo, Alessandra da
Mota Oliveira, Vânia Turqui e Priscila Turqui agradeço cada segundo da
atenção de vocês, cada abraço e cada colo que me deram nos meus
momentos difíceis, agradeço pelo orgulho com que falam de mim e por toda
a honestidade dos nossos sentimentos, amo vocês.
Aos meus novos companheiros do LIM 56, principalmente Liã
Bárbara Arruda, Fernando Costa e Erika Fujihira, que agora irão me
suportar o dia todo. E finalmente quero agradecer imensamente ao Dr.
Jorge Casseb por ter me escolhido para trabalhar com seu grupo, apoiar-
me e acreditar em mim.
A Capes por todo apoio financeiro dado durante o desenvolvimento
deste trabalho, sem ele certamente não teria chegado até aqui.
“Se pude enxergar mais longe é porque me apoiei no ombro de
gigantes.” (Isaac Newton)
“Nessa vida nascemos e morremos sozinhos, porém só
conseguimos progredir juntos.”
Sumário
Lista de Figuras Lista de Tabelas Resumo Summary
Introdução 01 Osteopontina 07
Farmacogenética e câncer 11
Polimorfismos nos genes de reparo de DNA 13
Polimorfismos nos genes de detoxificação celular 16
Objetivos 21 Objetivo Geral 22
Objetivo Específico 22
Casuística e Métodos 23 Casuística 24
Seleção dos pacientes 24
Tratamento 24
Avaliação da resposta 25
Métodos 26
Coleta de sangue periférico 26
Determinação da osteopontina 26
Determinação dos polimorfismos 28
Estatística 33
Resultados 35 Osteopontina 36
Correlações com características tumorais 37
Avaliações com relação à resposta ao tratamento e sobrevida 38
Polimorfismos 41
Freqüências genotípicas 42
Avaliação dos genótipos e resposta ao tratamento 43
Correlações entre os genótipos e sobrevida global 45
Discussão 48
Referências Bibliográficas 55
Anexos
Lista de Figuras
Figura 01 – Estrutura molecular da cis-diaminocloroplatina II (cisplatina) .......03 Figura 02 – Mecanismo de ação da cisplatina .................................................04 Figura 03 – Representação das diversas interações da cisplatina com o
DNA.............................................................................................05 Figura 04 – Mecanismo de ação da via de excisão de nucleotídeos ...............14 Figura 05 – Gel polimorfismo GSTT1 e GSTM1 ..............................................29 Figura 06 – Gel polimorfismo XPD (751) .........................................................31 Figura 07 – Gel polimorfismo ERCC1 (118).....................................................32 Figura 08 – Gel polimorfismo GSTP1 ..............................................................33 Figura 09 – Análise de sobrevida global dos pacientes portadores de
carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço. .......................46 Figura 10 – Análise de sobrevida global dos pacientes portadores de
carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço. .......................47
Lista de Tabelas
Tabela 01 – PCR – RFLP: oligonucleotídeos, enzimas de restrição e
tamanho dos fragmentos. ..............................................................................30
Tabela 02 – Características dos pacientes em que foi realizada a
quantificação da osteopontina .......................................................................36
Tabela 03 – Níveis séricos da OPN e variáveis clínico-patológicas em
pacientes com carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço .....................38
Tabela 04 – Níveis de osteopontina em pacientes com carcinoma
espinocelular de cabeça e pescoço, de acordo com a resposta ao tratamento39
Tabela 05 – Análise por regressão logística para fatores associados com
resposta completa em 32 pacientes com CECCP submetidos a
quimioradioterapia exclusiva..........................................................................40
Tabela 06 – Características dos pacientes em que foi realizado o estudo dos
polimorfismos.................................................................................................41
Tabela 07 – Freqüência genotípicas dos genes em pacientes com carcinoma
espinocelular de cabeça e pescoço... ............................................................42
Tabela 08 – Avaliação de resposta ao tratamento em pacientes com
carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço..............................................43
Tabela 09 – Resposta ao tratamento em 89 pacientes com carcinoma
espinocelular de cabeça e pescoço de acordo com seus genótipos.... .........44
Correlação entre osteopontina sérica e polimorfismos nos genes GSTT1, GSTP1, ERCC1 (118), XPD (751) com prognóstico e sobrevida em pacientes com carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço. INTRODUÇÃO: A resposta ao tratamento no carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECCP) varia significantemente em diferentes casos e muitos pacientes não respondem ao tratamento e são expostos aos seus efeitos. A cisplatina é o quimioterápico mais utilizado no tratamento de CECCP e a quimioradioterapia é o método terapêutico usado nos carcinomas localmente avançado. Neste trabalho foram estudados possíveis marcadores de resposta a quimioradioterapia e sobrevida em pacientes portadores de CECCP, dentre eles a osteopontina (OPN) que tem sido associada à agressividade tumoral em vários cânceres e também tem sido relacionada a sobrevida, formam estudados também alguns polimorfismos em genes que estão relacionados com a cisplatina, seja na detoxificação deste fármaco, Glutationas – S – transferase (GSTP1, GSTT1 e GSTM1), seja no reparo dos danos causados no DNA pela via de excisão de nucleotídeos (XPD -751 e ERCC – 118). CASUÍSTICA E MÉTODOS: Amostras de 69 pacientes localmente avançados submetidos à quimioterapia adjuvante ou exclusiva com cisplatina tiveram a sua OPN dosada pelo imunoensaio elisa em coletas realizadas antes e depois do término do tratamento. Para a análise dos polimorfismos, amostras de 95 pacientes localmente avançados tratados com quimioradioterapia com cisplatina exclusiva foram analisadas por PCR – RFLP. RESULTADOS: Com relação à OPN, dos 69 pacientes estudados, a concentração da OPN antes do início da quimioradioterapia no grupo como um todo, foi de 102,5 ng/mL com uma mediana de 82,1 ng/mL. O correspondente valor da OPN após o tratamento n=46 foi de 104,0 ng/mL e mediana de 92,9 ng/mL. A OPN se mostrou mais elevada nos pacientes com maior tamanho tumoral, p=0,009 (ANOVA). Em análises correlacionado reposta ao tratamento e concentração de OPN, observamos que os pacientes que obtiveram resposta completa apresentaram menores níveis de OPN do que aqueles que não responderam ao tratamento. Quando realizamos uma análise multivariada notamos correlação entre baixa OPN antes do tratamento e uma melhor sobrevida global. Na análise dos polimorfismos (n=95), observamos que para os genes de reparo de DNA, XPD e ERCC, o genótipo mais freqüente foi C/T (n=43) e A/A (n=44), respectivamente. Para a GSTP1 a maior freqüência foi de A/G (47,4%) e para a GSTT1 e M1, vimos que a maioria dos pacientes, 83,2% mostrou ter GSTT1 funcional, enquanto 58,9% tiveram GSTM1 não funcional. Neste grupo de pacientes, não notamos nenhuma associação significante entre os genótipos dos pacientes e a resposta a quimioradioterapia, assim como não foi possível uma correlação entre a sobrevida global e os genótipos. CONCLUSÃO: Em síntese, a OPN após o término do tratamento pareceu estar associada com a resposta ao tratamento e com uma melhor sobrevida no grupo estudado e em relação aos polimorfismos, um aumento do número de amostras possa talvez mostrar alguma associação com resposta ao
tratamento e a sobrevida global em pacientes com CECCP localmente avançados. DESCRITORES: carcinoma de células escamosas, neoplasias de cabeça pescoço, cisplatino, osteopontina, reparo de DNA e glutationa.
Relationship between plasma osteopontin and polymorphisms in the GSTT1, GSTP1, ERCC1 (118), XPD (751) genes with the prognosis and survival in patients with head and neck carcinoma. INTRODUCTION: The response to treatment in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) varies significantly in different cases and many patients do not respond to treatment and are exposed collateral effects. Cisplatin is a chemotherapeutic used to treat HNSCC and chemoradioterapy is the major strategy used in locally advanced carcinomas. In this work, we studied potential markers for chemoradioterapy response and survival in HNSCC patients, such as osteopontin (OPN), which has been associated with tumor aggressiveness and survival. Furthermore, it was studied some genetic polymorphisms related to cisplatin detoxification (glutathione - S – transferase, subtypes GSTP1, GSTT1 and GSTM1), as well genes involved in the repair of DNA damage by nucleotide excision (ERCC and XPD -751 - 118). METHODS: Plasmatic OPN levels, before and end of treatment, were measured in 69 patients with locally advanced tumors submitted to adjuvant chemotherapy with cisplatin only by ELISA. For polymorphism analysis, samples from 95 patients with locally advanced tumors treated with cisplatin alone were analyzed by PCR - RFLP. RESULTS: The OPN levels before the chemoradioterapy in the group (n=69) was 102.5 ng/mL with a median of 82.1 ng/mL. The corresponding value of OPN after treatment (n= 46) was 104.0 ng/mL and a median of 92.9 ng/mL. The OPN was higher in patients with larger tumor size, p = 0.009 (ANOVA). In tests correlated to treatment response and concentration of OPN, we observed that patients who achieved complete response had lower levels of OPN than those who did not respond to treatment. The multivariate analysis revealed that lower OPN levels before treatment significant a better overall survival. In the analysis of the polymorphisms (n = 95) the frequency of genotype for the DNA repair genes (XPD and ERCC), was C / T (n = 43) and A / A (n = 44), respectively. The most frequent genotype for GSTP1 was A/ G (47.4%), in 83.2% of the patients, the GSTT1 was functional, while in 58.9% of patients presented GSTM1 non-functional. In this group of patients, there was no any significant association between the genotypes and chemoradiotherapy response nor overall survival. CONCLUSION: In summary, plasmatic OPN levels after treatment cisplatin seemed to be associated with treatment response and better survival. However, larger sample size would be demonstrating some association with treatment response and overall survival in patients with locally advanced HNSCC. DESCRIPTORS: 1. Carcinoma, squamous cell 2. Head neck neoplasm 3. DNA repair 4. Osteopontin 5. Cisplatin 6. Glutathione
IINNTTRROODDUUÇÇÃÃOO
Introdução 2
O carcinoma de cabeça e pescoço é representado na sua imensa
maioria por neoplasias epiteliais do tipo epidermóide que acometem as vias
aerodigestivas superiores. O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço
(CE) é a quinta doença mais freqüente no mundo (Parkin et al. 2001) e tem
grande importância em nosso meio devido a sua alta mortalidade relativa.
No Brasil, as estimativas do Instituto Nacional do Câncer (INCA) indicam que
em 2009 deve ocorrer cerca de 14.160 casos de câncer na cavidade oral,
sendo considerado o 5º mais freqüente entre os homens e o 7º mais
freqüente entre as mulheres.
Os fatores de risco que estão comumente associados a esse tipo de
neoplasia são: o consumo excessivo de álcool e tabaco. Além disso, está
aumentando o número de evidências que relatam o papiloma vírus (HPV)
como agente causador de subtipos específicos do CE (Argiris et al., 2008).
Cerca de dois terços dos pacientes apresentam doença localmente
avançada, comumente com o comprometimento linfonodal e a presença de
metástases nos estágios iniciais não são comuns, acontecendo somente em
cerca de 10% dos pacientes (Argiris et al., 2008). Pesquisas indicam que em
São Paulo mais de 50% dos CE na cavidade oral são diagnosticados com
estádio IV (FOSP, 2006).
A abordagem terapêutica depende do estadiamento da doença. O
tratamento para os carcinomas localmente avançados são desafiadores e
muitas vezes um tratamento agressivo é necessário para alcançar a cura
(Seiwert et al., 2007). Em nosso serviço o tratamento de escolha para os
Introdução 3
pacientes com CE localmente avançado é a quimioradioterapia com
cisplatina, com uma taxa de resposta de 60% (Castro et al.,2007).
A cisplatina (figura 01) é um potente radiosensibilizador e é a droga
comumente utilizada para a quimioradioterapia em CE. Apresenta dois
radicais lábeis de cloro em configuração cis (Johnson et al., 2001).
Figura 01 - Estrutura molecular da cis-diaminocloroplatina II (cisplatina), complexo inorgânico, divalente e hidrossolúvel.
Atualmente, a dose padrão utilizada é de 100mg/m2 de cisplatina por
três semanas, combinada com radioterapia de aproximadamente 70 grays
(Gy), que são dadas em frações de 1,8 a 2,0 Gy por dia (Seiwert et al.,
2007).
A cisplatina é muito eficiente no tratamento de vários carcinomas
como o testicular, ovário, bexiga, cervical, cabeça e pescoço, esôfago e
células não pequenas de pulmão (Giaccone et al.,2000). Desde a introdução
da cisplatina como agente quimioterápico muitos estudos sobre seus efeitos
citotóxicos na célula foram desenvolvidos. O mecanismo de ação deste
quimioterápico (figura 02) mostra que para exercer efeito citotóxico, a
cisplatina é ativada, de forma não enzimática, havendo uma troca dos
grupos de cloro por moléculas de água. O produto liga-se de forma
Introdução 4
covalente a posição N7 de resíduos de guanina ou adenina, formando
pontes na mesma fita ou nas fitas complementares do DNA. Estas
alterações levam a erros na síntese do DNA, com acúmulo das células na
fase G2 do ciclo celular e indução da apoptose (Johnson et al., 2001).
Sangue [Cl-] = 100 mM
Citoplasma [Cl-] = 4 mM
RNA polimerase Bloqueio da
transcrição
Parada do ciclo celularApoptose
Bloqueio da replicação
Figura 02 – Mecanismo de ação da cisplatina – A entrada da droga na célula ocorre por difusão passiva, no citoplasma a molécula de platina perde seus cloros e passa então a interagir com a molécula de DNA, promovendo o bloqueio da transcrição e da replicação e assim a parada do ciclo celular e conseqüente apoptose (Modificado de Kartalou et al., 2001).
Muitos componentes celulares que possuem sítios nucleofílicos, como
o DNA, RNA, proteínas, membranas fosfolipídicas, microfilamentos do
Introdução 5
citoesqueleto, podem reagir com a cisplatina, cerca de aproximadamente 1%
da cisplatina intracelular reage com DNA nuclear formando diversos adutos
(figura 03) que podem ser ligações cruzadas interfilamento ou intrafilamento
e monoadutos com a ligação de proteína (Gonzalez et al., 2001). A interação
que acontece com maior freqüência é a ligação cruzada intrafilamento entre
guaninas adjacentes (Perez et al., 1998).
Figura 03 – Representação das diversas interações da cisplatina com o DNA: a) ligação cruzada intrafilamento; b) ligação cruzada interfilamento, c) monoaduto, d) monoaduto, com uma molécula de glutationa ligada (Retirado de Cepeda et al., 2007).
Apesar do sucesso, a cisplatina apresenta muitas desvantagens,
como seus efeitos colaterais, incluindo neurotoxicidade, nefrotoxicidade,
ototoxicidade, náuseas e vômitos Giaccone et al.,2000. Esses efeitos tóxicos
limitam a dose que deve ser ministrada ao paciente (Cepeda et al., 2007).
Introdução 6
Embora tenham ocorrido muitos avanços no tratamento, a taxa de
sobrevida de 5 anos do CE melhorou muito pouco na última década
(Greenlee et al., 2001) seja porque, de acordo com metanálise, cerca de
50% dos pacientes apresentam recidiva da doença (Takes et al., 1997), seja
porque 20% dos pacientes estadio I/II, curados com cirurgia/ radioterapia
desenvolvem um segundo tumor primário de trato aerodigestivo superior.
Essa falha ao tratamento inicial seja cirurgia, radioterapia ou
quimioradioterapia pode ser atribuída a vários fatores, tais como idade, sexo,
localização do tumor primário, estágio TNM e grau histológico; que embora
possam auxiliar na decisão terapêutica, não tem valor prognóstico absoluto
(Piccirillo et al., 1996). O mais acurado dado prognóstico para recidiva, no
momento, é o estágio nodal.
Muitos pacientes, infelizmente, apresentam estágio avançado, e,
nestes casos, o comprometimento linfonodal não é discriminante. Isto levou
a procura de biomarcadores como indicadores de prognóstico em CE. Entre
os vários estudados, podemos citar a expressão de p53 e ciclina D1 foi
comparada em carcinoma verrugoso, hiperplasia verrugosa e carcinoma
epidermóide da região de cabeça e pescoço (Wu et al., 2002), e em CEC de
laringe (Vielba et al., 2003). Além da expressão destes marcadores Wu et al.
em 2002, avaliaram a expressão de EGFR e TGF-alfa. O valor prognóstico
da expressão do transportador 1 de glicose foi estudado em pacientes com
carcinoma de hipofaringe (Mineta et al., 2002); o valor prognóstico da
expressão de sete marcadores foi determinado em análise multivariada, no
Introdução 7
CEC de língua, onde c-myc, cliclina D1 e p21ras apresentaram-se como
marcadores de prognóstico independente (Vora et al., 2003).
Além de não se definir nenhum marcador ótimo, muitos destes
estudos requerem amostra tumoral, tecidos normais, lugares especializados
em processamento de tecidos, estudos imunohistoquímicos e análise
citogenética. O tempo gasto na realização desses marcadores pode ainda
não ser prático para uso clínico de rotina.
Uma alternativa de marcadores de melhor aplicabilidade são aquelas
substâncias presentes no soro ou plasma tais como o fragmento de
citoqueratina cyfra 121-1 e a molécula de adesão osteopontina. Estas foram
avaliadas e correlacionadas com a transformação e invasão tumoral em
inúmeros estudos avaliando prognóstico e monitorização de resposta ao
tratamento em pacientes portadores de CE (Ho et al., 1996; Lin et al., 1998;
Yen et al., 1998; Ogawa et al., 1999; Gonzalez et al., 1999; Maass et al.,
2000; Doweck et al., 2000; Furger et al., 2001; Weber, 2001; Lee et al.,
2001; Pauli et al., 2002; Kuropkat et al., 2002; Pradier et al., 2002; Deng et
al., 2003; Le et al., 2003), sendo que, a osteopontina (OPN) parece ser o
marcador mais promissor.
Osteopontina
Trata-se de uma glicoproteína fosforilada ligadora de cálcio, que é
capaz de se ligar às integrinas na superfície celular. OPN é expressa
constitutivamente em um número limitado de tecidos normais tais como rim
(Wuthrich et al., 1998), estando também presente nos fluidos do corpo, e é
Introdução 8
abundante nos ossos e outros tecidos mineralizados (Denhardt et al., 1998).
Sua expressão encontra-se também elevada em vários tecidos em um
número de patologias como: câncer, respostas imune e inflamatória (Weber
et al., 1996; Giachelli et al., 2000), remodelação vascular (Ramos et al.,
1999), doenças renais, lactação, calcificação e remodelação de tecidos
mineralizados, bem como em algumas situações fisiológicas de resposta ao
stress. Apesar desta diversidade de expressão tecidual, sua função em
muitos destes contextos permanece obscura sendo este assunto propósito
de muitos estudos.
Os possíveis papéis da osteopontina em câncer foram discutidos por
muitos autores e sugeriu-se que a OPN poderia ter um papel funcional na
doença uma vez que a inibição da OPN através do cDNA antisense ou
riboenzima atenuaram as propriedades tumorigênicas ou metastáticas de
vários tipos de células (Behrend et al., 1994; Gardner et al., 1994; Su et al.,
1995; Feng et al., 1995). Além disso, a expressão da OPN através da
transfecção do cDNA em células epiteliais mamárias normais de rato, foi
responsável pelo aumento da habilidade metastática destas células (Oates
et al., 1996). Estes estudos sugerem que OPN não esteja apenas associada
ao comportamento das células cancerosas, mas também ao
estabelecimento do câncer.
Em tumores humanos, a expressão de OPN foi pela primeira vez
demonstrada numa variedade de carcinomas por Brown et al.,1994. Estes
autores encontraram níveis substancialmente maiores do RNA mensageiro
(RNAm) de OPN em 14 tumores analisados (seis tumores de cólon, três de
Introdução 9
mama, dois de pulmão, um de estômago, um de endométrio e um de
tireóide) quando comparados com o correspondente tecido normal. Em
contraste, dois tipos de tumores benignos (adenomas de cólon de pacientes
com polipose familiar e um leiomioma uterino) tiveram níveis de mRNA de
OPN comparáveis àqueles dos tecidos normais correspondentes. Viu-se que
nos tumores, as células positivas para OPN localizavam-se
preferencialmente no limite da extensão tumoral e nas áreas próximas de
necrose.
A positividade tanto para o RNAm de OPN como para sua proteína
foram vistas em outros tipos de câncer, incluindo pulmão (Chambers et al.,
1996), mama (Tuck et al., 1998) e câncer de esôfago (Casson et al., 1997),
câncer gástrico (Ue et al., 1998), lesões benignas pré-malignas e malignas
da cavidade oral (Devoll et al., 1999), câncer de próstata (Thalmann et al.,
1999) e gliomas (Saitoh et al., 1995). Usando a imunohistoquímica, a
proteína da OPN, foi localizada apenas nos macrófagos de alguns tumores,
porém em outros a imunoreatividade foi presente tanto nos macrófagos
como nas células. Da mesma forma, a expressão do mRNA de OPN foi
localizada em células tumorais bem como em macrófagos infiltrando o tumor
(Tuck et al., 1998; Casson et al., 1997).
No sangue, a OPN foi detectada em pacientes com uma variedade de
cânceres, incluindo carcinoma de pulmão (Chambers et al., 1996), hepático
(Senger. et al., 1989), de mama (Tuck. et al., 1997) e próstata (Tozawa . et
al. 1999).
Introdução 10
Em um trabalho publicado em 2003, Le.et al., investigaram o
relacionamento entre a osteopontina plasmática, hipóxia e prognóstico em
pacientes com CE, os autores concluem que os níveis de OPN podem ser
correlacionados com hipóxia além de poder ser usada como um teste não
invasivo para identificar pacientes com risco de recorrência, uma vez que a
OPN pode ser detectada em lesões pré-malignas e malignas.
Outro trabalho realizado também em pacientes com CE, foi o de
Petrik. Et al., 2006, onde os autores mostram a correlação entre os níveis
plasmáticos de OPN e a resposta ao tratamento, além de identificarem a
OPN como um marcador prognóstico independe, esse trabalho foi na
verdade uma expansão do trabalho descrito anteriormente (Le. et al., 2003),
e um viés desse estudo é a heterogeneidade no tratamento aos pacientes.
Um trabalho recente, de Chien. et al., 2009, realizado em pacientes
com CE na cavidade oral, mostrou que altos níveis de OPN, tanto
plasmáticos quanto no tumor, podem ser associados a progressão tumoral,
sugerindo que a expressão de OPN possa ser um importante fator
prognóstico em pacientes com CE na cavidade oral.
Como se pode concluir deste pequeno resumo da literatura, não
existem dados publicados até o momento que possam afirmar que a OPN é
um marcador prognóstico importante de resposta à quimioterapia com
platina. Caso isso possa ser confirmado, a OPN pode representar um
adequado foco para intervenção terapêutica no futuro.
Introdução 11
Farmacogenética e câncer
A farmacogenética, definida como o estudo da constituição genética
do indivíduo no contexto da resposta aos medicamentos, é outra área em
desenvolvimento que parece promissora em câncer de forma geral. No caso
da quimioterapia anti-neoplásica, tem-se analisado polimorfismos dos genes
de enzimas que servem como alvo dos agentes quimioterápicos, que
participam da sua metabolização ou de reparo do dano do DNA. Estas
análises podem ser feitas a partir de DNA extraído de sangue periférico,
prescindindo de amostra tumoral, nem sempre de fácil obtenção
(Lindpaintner, K. 2002).
A farmacogenômica estuda a função do genoma (especialmente do
genoma tumoral) na atividade das drogas anticancer. Envolve a avaliação
sistemática de como compostos químicos modifica amplo padrão de
expressão nos tecidos de interesse, em contraste com a farmacogenética, a
farmacogenômica não foca as diferenças de uma pessoa para outra com
relação aos efeitos das drogas, mas antes examina as diferenças
relacionadas com efeitos das drogas e a mudança do padrão de expressão
dos genes (Lindpaintner, K. 2002).
O objetivo da farmacogenética no tratamento do câncer é
proporcionar a individualização do tratamento, minimização dos efeitos
tóxicos, maximizando assim a eficiência. Assim, é esperado da
farmacogenética a estratificação dos indivíduos de acordo com seu perfil
genético em grupos de resposta ao tratamento (Abraham et al., 2006).
Introdução 12
No caso do CE, como dito anteriormente, o agente quimioterápico
mais usado é a cisplatina. Este agente é adotado no tratamento de rotina no
nosso serviço, associado à radioterapia nos casos da doença localmente
avançada, ou em esquemas de quimioterapia exclusiva na doença
metastática. Como a taxa de resposta é de 50%, seria altamente desejável a
pré-seleção de pacientes com maior chance de resposta. A identificação de
mecanismos biológicos que conferem sensibilidade a agentes
quimioterápicos poderia permitir a correta seleção de pacientes evitando
expor os não respondedores aos efeitos tóxicos (Quintela-Fadino et
al.,2008).
Os genes polimórficos apresentam variantes alélicas com freqüência
superior a 1%, entretanto o uso comum deste termo se refere às mudanças
na seqüência do DNA que não afetam ou tem efeito menor na função e
produção de uma proteína. O tipo mais comum de polimorfismo é a
substituição de um único nucleotídeo (SNP – single nucleotide
polymorphism). Esses SNPs em um determinado gene podem afetar a
função da proteína (Quintela-Fandino et al., 2008), esteja ela diretamente
envolvidas na ação das drogas, ou mesmo quando ela é o alvo ou então
quando a proteína participa do reparo ao dano causado pela droga, com isso
sua eficácia pode ser comprometida e/ou sua toxicidade aumentada. A
identificação de polimorfismos funcionais em pacientes antes da
quimioterapia pode ajudar a prescrição de uma combinação ótima de drogas
(Robert et al., 2005). Alguns polimorfismos nos genes da via de reparo por
excisão de nucleotídeo (NER – nucleotide excision repair) parecem estar
Introdução 13
ligados à resposta a cisplatina, assim como polimorfismos em enzimas de
detoxificação celular como as glutationas.
Polimorfismos nos genes de reparo do DNA
Os danos no DNA induzidos pela cisplatina interferem na replicação e
a via chave para correção dos erros é a via de reparo por excisão de
nucleotídeos (NER) (Suk et al., 2005). A NER processa os danos volumosos
que levam a distorção da dupla hélice de DNA (Leibeling et al., 2006).
Em humanos, pelo menos três doenças estão relacionadas a defeitos
genéticos hereditários na NER, xeroderma pigmentosa (XP), síndrome de
Cockayne (CS) e tricotiodistrofia (TTD). Contudo, somente os pacientes com
XP são predispostos a desenvolver câncer de pele causado pelos
ultravioleta (UV) solares. Sendo assim, XP tornou-se um modelo único para
estudos de lesões não reparadas do DNA e mutações causadas por
diferentes carinógenos. Apesar de CS e TTD não apresentarem
predisposição ao câncer de pele, apresentam muitas alterações nos genes
da NER e em outros genes de reparo do DNA, possuindo assim fenótipos
muito diferentes (Saldivar et al., 2007).
O mecanismo de reparo da NER é constituído de múltiplas etapas.
Cerca de 20 a 30 proteínas estão envolvidas nesse processo em uma ordem
definida. Em primeiro lugar ocorre o reconhecimento do erro, depois sua
demarcação, seguida por uma dupla incisão nos dois lados da lesão, com
Introdução 14
subseqüente remoção do fragmento lesionado e por fim a síntese de uma
nova fita intacta (figura 04) (Leibeling et al., 2006).
A) Da interação das proteínas...
B) ... até a reconstituição do sistema...
A) Da interação das proteínas...
B) ... até a reconstituição do sistema...
Figura 04 – Mecanismo de ação da via de excisão de nucleotídeos: (A) Ação
individual das proteínas da NER: XPA, RPA, XPC e R23B interagem com o local danificado do DNA (box 1); TFIIH desempenhando sua função de helicase (XPB: 3’ - 5’, XPD: 5’ - 3’) (box 2); ERCC1-XPF (box 3); e XPG (box 4) tem uma atividade endonuclease específica. (B) Interação das proteínas, removendo o local danificado e promovendo a reconstrução do sistema. (Modificado de Gillet et al., 2006)
O XPD (xeroderma pigmentosum group D) é uma proteína que
desempenha papel fundamental na NER, sua função é abrir a dupla fita de
DNA em torno do local com o defeito. (Benhamou et al., 2005). Além disso, o
XPD atua na transcrição, uma vez que é uma subunidade do fator
transcricional TFIIH, que é requerido nas atividades de transcrição pela RNA
polimerase II (Schaeffer et al., 1994). Sendo assim, em 1998, de Boer em
Introdução 15
um estudo com ratos, mostrou que uma inativação do gene XPD leva a uma
letalidade embrionária nos estágios de pré-implantação. Sete polimorfismos
foram encontrados no gene XPD, destes três são silenciosos, e os outros
quatro resultam em troca de aminoácidos.
Os polimorfismos dos códons 312 e 751 de XPD são muito estudados
na carcinogenese e, além disso, eles podem influenciar a atividade
enzimática in vitro (Spitz et al., 2001). Estudo recente envolvendo 39
pacientes portadores de câncer de pulmão de células não pequenas,
correlacionou o polimorfismo dos códons 751 (Lys751Gln) e 312
(Asp312Asn) do gene XPD com a resposta a quimioterapia cisplatina/
gemcitabina. O DNA foi isolado do sangue periférico e, como resultado,
encontrou-se uma tendência estatística de melhor resposta nos pacientes
portadores de polimorfismo do códon 312 (Camps et al., 2003). Desta forma,
o polimorfismo de XPD poderia ser considerado um candidato promissor a
fator preditivo de resposta a cisplatina.
ERCC1 (Excision Repair Cross-Complementation Group 1) é uma
enzima altamente conservada, específica da via de reparo de excisão de
nucleotídeos e ela atua removendo o dano no DNA. O aumento do mRNA do
ERCC1, está relacionado com a resistência a cisplatina em vários cânceres
(Zhou, W et al.. 2004).
Dois comuns polimorfismos do gene ERCC1, nos códons 118 C/T e
C8092A têm sido reportados. O polimorfismo do códon 118 é associado com
diferentes níveis de mRNA e tem sido relacionado com uma baixa sobrevida
Introdução 16
global para pacientes com câncer de cólon avançado tratados com
quimioterapia baseada em platina. O polimorfismo do códon C8092A,
localizado na extremidade 3’ não traduzida do gene, pode afetar a
estabilidade do mRNA do ERCC1 e tem sido associado com o risco de
glioma.
Um estudo com 62 pacientes com câncer de pulmão de células não
pequenas, tratados com cisplatina e docetaxel comparou os SNPs (single
nucleotide polymorphisms) dos genes ERCC1, XPD, RRM1 e MDR. Os
resultados mostraram que os pacientes com o tipo selvagem (C/C) para o
polimorfismo do códon 118 (C/T), apresentou uma melhor sobrevida
significante quando comparada aos pacientes portadores os outros tipos C/T
e T/T com p=0.03, os polimorfismos dos demais genes analisados não
tiveram significância estatística (Isla et al., 2004).
Polimorfismos nos genes de detoxificação celular
Assim como os polimorfismos dos genes de reparo do DNA, os
polimorfismos encontrados nos genes responsáveis pela detoxificação
celular tem sido muito estudados e correlacionados com a susceptibilidade
ao câncer e também a resposta à quimioterapia.
A Glutationa S Transferase (GST) é uma família de isoenzimas de
que catalisam o conjugado de glutationa em uma variedade de componentes
eletrofílicos, incluindo carcinógenos, agentes mutagênicos, drogas
Introdução 17
citotóxicas e seus metabólitos, e promove detoxificação de produtos da
reação oxidativa (Hayes et al., 1995; Mannervik et al., 1988).
Em mamíferos existem sete classes de GST são conhecidas, Alpha,
Mu, Pi, Sigma, Theta, Omega e Zeta. Muitas destas enzimas apresentam
polimorfismos que contribuem para as diferentes respostas a xenobióticos.
Um dos primeiros estudos a esse respeito foi com indivíduos que possuíam
genótipo nulo (não produzia a enzima) para GSTT1 e GSTM1, eles
apresentavam uma alta incidência de câncer de bexiga, mama, colonretal,
cabeça e pescoço e pulmão (Hayes et al.,2004).
O polimorfismo nas subclasses GSTM1 e GSTT1 são caracterizados
pela completa perda da atividade da enzima em cerca de 20% da população
caucasiana (Pemble et al., 1994). A isoforma GSTM1 é responsável, em
particular, pela detoxificação de nitrosuréia e mostarda nitrogenada. A
isoenzimas GSTT1 está envolvida na conjugação de pequenos
componentes como diclorometano e óxido de etileno. A variante nula de
GSTT1 parece, no entanto, estar envolvida na perda de proteção contra
esses agentes tóxicos ambientais. O genótipo nulo do GSTM1 e GSTT1 é
devido a muitos tipos de alterações na estrutura do gene, além disso, as
SNPs variantes ocorrem tanto na seqüência codificadora, como na região
promotora do gene, o que deve ser responsável por uma diminuição da
atividade da enzima ou de sua expressão (Alexandrie et al., 2002).
Muitos estudos têm tentado relacionar os genótipos GSTM1 e GSTT1
nulos e a terapia contra o câncer. Um estudo em pacientes com câncer de
Introdução 18
mama, tratados inicialmente com radiação ou quimioterapia, mostraram que
indivíduos portadores do genótipo nulo para GSTM1 e GSTT1 tiveram uma
vantagem na sobrevida (Ambrosone et al., 2001). No entanto, em crianças
com leucemia linfoblástica aguda, este genótipo, não mostrou nenhuma
relação com resposta ao tratamento (Chen et al.,1997; Krajinovic et al., 2002
e Davies et al., 2002).
A isoenzima GSTP1 apresenta dois polimorfismos funcionais, um
deles, com uma alta freqüência (0,30) consiste em uma SNP (A313G) com a
substituição do aminoácido (ile105val) acarretando em uma substancial
redução da atividade da enzima (Watson et al., 1998) para muitas classes de
substratos (Ali - Osman et al., 1997) e uma perda efetiva na capacidade de
detoxificação (Kimura et al., 2004). O outro polimorfismo que é muito menos
freqüente (0,10) e é uma SNP (C341T), também com uma substituição de
aminoácido (ala114val). Muitos estudos têm tentado correlacionar a
presença do polimorfismo A313G com o tratamento de pacientes que
recebem agentes alquilantes e platina. Em um estudo 183 pacientes com
câncer colorretal metastático, foi investigado associações entre os mais
comuns polimorfismos em genes das subclasses de GST (GSTP1, GSTM1 e
GSTT1) e a sobrevida dos pacientes que receberam 5-fluoro-uracil (5FU) e
oxaliplatina e os pacientes que possuíam o polimorfismo ile105cal no gene
GSTP1 tinham uma melhor sobrevida em relação aos pacientes com o tipo
selvagem (Stoehlmacher, J. et al. 2002). Vários outros estudos mostram que
o polimorfismo ile105val do gene GSTP1 parece estar envolvido no risco de
Introdução 19
desenvolvimento secundário de uma leucemia mielóide aguda em pacientes
tratados com agentes alquilantes ou platina (Allan, JM. et al. 2001).
Geisler et al. em 2005, avaliou o valor prognóstico dos polimorfismos
GSTT1, GSTM1 e GSTP1, em um estudo com 190 pacientes com carcinoma
epidermóide de cabeça e pescoço e demonstrou que pacientes com o
GSTT1 funcional possui duas vezes mais chances de morrer por qualquer
causa e três vezes mais chances de morrer por CE (hazard ratio HR:2,4 e
95%Cl: 1,13-4,97).
Em um estudo de cultura de células de CE tratadas com cisplatina, foi
observado que as células que possuíam genótipo heterozigoto, o que
diminui a capacidade de detoxificação, obtiveram uma boa resposta ao
tratamento com cisplatina (Kimura et al., 2004). No entanto, os resultados
contraditórios são encontrados na literatura, Booton em 2006, em um estudo
com câncer de pulmão de células não pequenas, mostrou que não havia
nenhuma associação entre polimorfismos em GSTP1 e resposta a
quimioterapia com cisplatina.
Em um imunoensaio com pacientes com CE localmente avançado,
tratados com radioterapia somente ou quimioradioterapia com cisplatina, foi
avaliada a expressão de p53 e GSTP1 e mostrou-se que uma alta expressão
de ambas confere aos pacientes um pior prognóstico (Schumaker et al.,
2008).
Apesar, de vários estudos relacionando polimorfismos e resistência a
cisplatina já terem sido realizados, há uma grande discordância entre os
Introdução 20
grupos, o que justifica a investigação do polimorfismo destes vários genes
(XPD, ERCC1 e GST) em outros grupos de pacientes tratados com
cisplatina
OOBBJJEETTIIVVOOSS
Objetivos 22
Objetivo Geral
Avaliar, prospectivamente, o valor preditivo da osteopontina sérica e
do polimorfismo dos genes XPD, ERCC1, GSTM1, GSTT1 e GSTP1 para a
resposta ao tratamento de rotina que inclua cisplatina, nos pacientes
portadores de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço localmente
avançado ou metastático.
Objetivos Específicos
Determinar o nível da osteopontina sérica em pacientes com
carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço antes e depois do
término da quimioradioterapia e correlacionar com as características
clínico-patológicas, resposta ao tratamento e sobrevida global;
Genotipar os pacientes com CE para os polimorfismos de XPD (751),
ERCC1 (118), GSTM1, GSTT1 e GSTP1 e relacionar com a resposta
ao tratamento e sobrevida global.
CCAASSUUÍÍSSTTIICCAA EE MMÉÉTTOODDOOSS
Casuística e Métodos 24
Casuística
Todos os pacientes incluídos neste estudo assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido e este trabalho obteve a aprovação da
Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa (CAPPesq) do
Hospital da Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo (HC-FMUSP), sob o número 487/06 em 27 de julho de 2006 (anexo).
Seleção dos pacientes
Os pacientes incluídos neste estudo são todos do ambulatório de
cabeça e pescoço e os critérios de inclusão foram: (a) diagnóstico
histológico ou citológico confirmado de carcinoma epidermóide de cabeça e
pescoço, (b) idade mínima de 18 anos, (c) indicação de rotina de tratamento
combinado de cisplatina com radioterapia ou quimioterapia exclusiva que
inclua a cisplatina, no Serviço de Oncologia do INRAD-HCFMUSP, (d) aptos
e desejosos a assinarem o termo de consentimento pós-informação do
Hospital das Clínicas da FMUSP.
Tratamento
Os pacientes incluídos neste que eram inoperáveis foram tratados
com quimioradioterapia baseada em cisplatina e a dose dada foi de
Casuística e Métodos 25
100mg/m2, nos dias 1, 22 e 43, concomitantes com a radioterapia em que a
dose foi de 70 Gy, fracionados em 7 semanas. Já os pacientes que eram
operáveis, receberam quimioradioterapia adjuvante após a cirurgia.
Avaliação da resposta
A avaliação da resposta ao tratamento foi definida segundo os
critérios de avaliação de resposta em tumores sólidos (RECIST), onde se
comparou os resultados da tomografia computadorizada antes e após o
tratamento.
Foi definido como resposta completa (RC) ao tratamento o
desaparecimento total de toda evidência clínica e imageológica da
neoplasia, quando mantida por pelo menos quatro semanas; resposta parcial
(RP) sendo aquela onde houve uma diminuição de pelo menos 30% do
tamanho do maior diâmetro da lesão mensurável à avaliação inicial,
confirmada em quatro semanas; progressão da doença (PD) como um
aumento do tamanho da lesão em pelo menos 20%, ou aparecimento de
novas lesões; doença estável (DE), quando os critérios acima não são
alcançados. Estes critérios foram aplicados na tomografia computadorizada
realizada após um mês do término do tratamento.
Casuística e Métodos 26
Métodos
Coleta do sangue periférico
Foram coletados 10mL de sangue periférico por punção de veia de
membro superior em tubos com anticoagulante EDTA. A primeira amostra foi
coletada em aproximadamente 15 dias antes do tratamento e a segunda em
aproximadamente 15 dias após o término.
Após a coleta as amostras de sangue foram centrifugadas a 3000 rpm
(rotor SS34 – Sorvall RC2-B), a 4ºC por 10 minutos. O plasma coletado foi
estocado a 70ºC negativos até a análise de imunoensaio. Além disso, os
leucócitos foram separados através de lavagens sucessivas com TE (Tris
HCl 10mM – pH 8.0, EDTA 1mM) centrifugados a temperatura ambiente a
1.100rpm (centrífuga LS-3 – Celm) por 8 minutos. O sobrenadante foi
desprezado deixando-se 5mL para diluição do pellet e distribuídos em 5
tubos plásticos de 1,5mL devidamente identificados. Esse material foi
submetido a centrifugação a 13.000g por 30 segundos e o sobrenadante foi
desprezado. O material foi estocado a 70ºC negativos.
Para o imunoensaio, foi utilizado o plasma ao invés de soro uma vez
que OPN é clivada em soro como resultado da digestão por trombina
(Bautista et al., 1994).
Determinação da Osteopontina
A osteopontina sérica foi quantificada por ELISA. Foi utilizado o
imunoensaio Human Osteopontin Assay kit (IBL, Gunma, Japão).
Casuística e Métodos 27
O ELISA utilizado é um ensaio sanduíche que usa dois anticorpos
marcados, um desses anticorpos está imobilizado na placa (anti - OPN
humana O-17 Rabbitt IgG) e o outro anticorpo foi colocado em uma das
etapas do ensaio (HRP conjugado Anti-OPN humana mouse IGg).
Para o ensaio todas as amostras foram diluídas 10 vezes em tampão
EIA (1% BSA, 0,05% Tween 20 em PBS) fornecido pelo kit e acondicionadas
em gelo até a realização do ensaio.
O anticorpo marcado foi diluído 30 vezes de acordo com as
recomendações do kit e o padrão (osteopontina humana) fornecido pelo kit
foi diluído em série, ficando com as seguintes concentrações 320, 160, 80,
40, 20, 10, 5 ng/mL.
Após todas as preparações iniciais com as diluições das amostras,
anticorpo e padrão, a placa foi montada para o ensaio, o primeiro poço da
placa foi destinado ao branco, seguido pelas diferentes concentrações do
padrão e subseqüentemente pelas amostras dos pacientes, já diluídas, que
foram analisadas em duplicata. Uma das amostras foi escolhida para ser
analisada em todos os ensaios realizados.
Após a montagem, a placa foi incubada a 37ºC por uma hora,
passado esse período lavou-se a placa 7 vezes com a solução de lavagem
(0,05% Tween 20 em tampão fosfato). Depois das lavagens, colocou-se
100µL de anticorpo marcado em cada poço e após 30 minutos a 4ºC a placa
foi lavada novamente por 9 vezes. Em seguida foi adicionada a solução
corante (tetra metil benzidina), o conteúdo dos poços se tornou azul com a
adição, a placa foi colocada no escuro por 30 minutos, com subseqüente
Casuística e Métodos 28
adição da solução de parada (1N H2SO4), nesta etapa o conteúdo dos poços
tornou-se amarela e a leitura da placa foi realizada imediatamente em um
comprimento de onda de 450nm. Os dados obtidos formam analisados no
programa Graphpad Prism 4.0.
Determinação de polimorfismos
O DNA genômico foi extraído dos leucócitos do sangue periférico com
o auxílio do kit Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA). Os
genótipos dos genes XPD, ERCC1 e GSTP1 foram determinados por análise
de PCR-RFLP. E os genótipos dos genes GSTT1 e GSTM1 foram
identificados por PCR multiplex.
A identificação do polimorfismo em GSTM1 e GSTT1 foi realizada por
PCR multiplex, segundo a descrição de Arand et al., 1996 os
oligonucleotídeos iniciadores utilizados estão descritos abaixo e foi utilizado
o gene da albumina como controle interno da reação.
GSTM1: sense 5’ – GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C – 3’
antisense: 5’ – GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G –3’
GSTT1: sense 5’: - TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC-3’
antisense 5’: - TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA-3’
Albumina: sense 5’: GCC CTC TGC TAA CAA GTC CTA C3’
Antisense: 5’: - GCC CTA AAA AGA AAA TCG CCA ATC 3’
A reação de PCR foi realizada em um volume final de 50 µL, foram
utilizados para a reação 80 ng de DNA, a concentração final de cada
reagente utilizado foi de 50mM de KCl, 2,5 mM de Mg Cl2, 20mM tris, 3
Casuística e Métodos 29
µg/mL de oligonucleotídeos iniciadores para GSTM1; 1 µg/mL de
oligonucleotídeos iniciadores para GSTT1, 600 ng/mL de oligonucleotídeos
iniciadores de albumina e 50 U/ mL de taq polimerase. Ao término da reação
as amostras foram aplicadas em gel de agarose 1,5% corado com brometo
de etídeo (figura 05).
b 1 3
Figura 05 – Gel dereaçãoGSTT1pares ao genalbumi1 temoe M1 num paamostr
Para a identi
(118) e GSTP1, fo
digestão por enzima
oligonucleotídeos e
genes estão descrit
100p
agarose 1, de PCR mu e GSTM1.
de bases (pbe da GSTT
na e a bandas um pacienegativo; emciente negatas as banda
ficação dos
i utilizada
de restriçã
as enzima
as na tabela
5% corado com brltiplex para a deterFoi utilizado o pad) da Invitrogen. A
1, a banda de 35 de 215pb corresp
te T1 / M1positivo 3 um paciente T1 ivo tanto para T1 s do gene da album
polimorfismos do
a técnica de P
o de um produto
s de restrição u
01.
2
ometo deminação drão de pe banda de0pb correonde ao
; em 2 umnegativo equanto paina foram
s genes
CR-RFLP
de uma
tilizadas
4
etídeo mostrando a os polimorfismos de
so molecular de 100 480pb corresponde sponde ao gene da
gene da GSTM1. Em paciente T1 positivo M1 positivo e em 4 ra M1. Em todas as visualizadas.
XPD (751), ERCC1
, que consiste na
reação de PCR. Os
para cada um dos
Casuística e Métodos 30
Tabela 01 PCR – RFLP: oligonucleotídeos, enzimas de restrição e tamanho dos fragmentos.
XPD (751) ERCC1 (118) GSTP1
Oligonucleotídeos iniciadores
Sense 5’ - GCC CGC TCT GGA TTA TAC G -
3’
5’ GAGGTGCAAGAAG
AGGTGGA - 3’
5’ - ACC CCA GGG CTC TAT GGG AA
- 3’
Anti-sense 5’ - CTA TCA TCT CCT GGC CCC C -
3’
5’ - GTTCCTCAGGTGA
GCTCTGC -3’
5’ - TGA GGG GAC AAG AAG CCC CT
- 3’
Tamanho do produto da PCR 324pb 208pb 176pb
Enzima de restrição PstI BseDI Alw261
Tamanho dos fragmentos de
restrição
A/A: 224 e 100pb
A/C: 224, 158, 100 e 66pb
C/C: 158, 100 e 66 pb
C/C: 208pb
T/T: 128 e 80pb
C/T: 208,128 e 80pb
Ile/Ile: 176pb
Ile/Val: 176, 91 e 85pb
Val/Val: 91, 85pb
Referência Dybdahl et al., 1999 Zhou et al.; 2004 Beeghly et al.,
2006
A reação de PCR para a identificação do genótipo do gene XPD (751)
usou 100 ng de DNA, em uma reação de 25 µL, contendo 20mM de trisHCl,
50mM de KCl, 1mM de MgCl2, 0,2mM de dNTPs, 1µM de cada oligo
iniciador (Invitrogen, USA)e 0,5 U de Taq polimerase (Invitrogen, USA). A
reação ocorreu nas seguintes condições de temperatura: 96ºC por 1 minuto,
trinta ciclos de 94ºC por 30 segundos, 60ºC por 30 segundos e 72ºC por 1
minuto, seguido de uma extensão final de 72ºC por 2 minutos. Ao final da
reação, uma alíquota de 3µL foi submetida à eletrofore em um gel de
Casuística e Métodos 31
agarose 1,5% corado com brometo de etídeo. As amostras em que a reação
ocorreu de forma satisfatória foram levadas para a digestão com a enzima
de restrição PstI (Providencia stuarti) (Fermentas, USA), sob as seguintes
condições, 15µL da reação de PCR foram digeridos em 15U da enzima, por
2 horas a 37ºC, após a digestão o produto foi aplicado em gel de agarose
3% corado com brometo de etídeo e o gel foi submetido a eletrofore. (figura
06)
b 1 3
Figura 06 – Gel dprodufoi o caracde 22158, 1
Para a gen
utilizados 50 ng d
trisHCl, 50mM de
iniciador (Invitroge
reação ocorreu n
segundos, trinta c
72ºC por 45 seg
25p
e agarose 3,0to da digestãode 25pb; emteriza o genót4, 158, 100 e00 e 66 pb, g
otipagem do
e DNA, em
KCl, 1mM de
n, USA)e 2,
as seguinte
iclos de 95ºC
undos, segu
% corado com brome por PstI, o marcador d 1 temos as bandas
ipo A/A (selvagem); em 66pb, genótipo A/C e eenótipo C/C (polimórfico
polimorfismo do gen
uma reação de 50
MgCl2, 0,2mM de dN
5 U de Taq polimera
s condições de tem
por 45 segundos, 6
ido de uma extensã
2
to de etídeo, mostrando o e peso molecular utilizado de 224 e 100pb, o que2, visualizados as bandas m 3 vemos as bandas de ).
e ERCC1 (118), foram
µL, contendo 20mM de
TPs, 5µM de cada oligo
se (Invitrogen, USA). A
peratura: 95ºC por 15
0ºC por 45 segundos e
o final de 72ºC por 5
Casuística e Métodos 32
minutos. Ao final da reação, uma alíquota de 5µL foi submetida à eletrofore
em um gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídeo. As amostras em
que a reação ocorreu de forma satisfatória foram levadas para a digestão
com a enzima de restrição Bse MI (Bacillus stearothermophilus ISL 15-111)
(Fermentas, USA), 45µL da reação de PCR foram digeridos em 2,5U da
enzima, por 2 horas a 55ºC, após a digestão o produto foi aplicado em gel
de agarose 3% corado com brometo de etídeo e o gel foi submetido a
eletrofore. (figura 07)
Figura 07 – b
Para
80ng de DNA
20mM de tris
de cada oli
polimerase (
minutos, seg
72ºC por 1 m
25p
Gel de agarose 3produto da digesutilizado foi o de pb, C/C(selvagem80pb, genótipo Cgenótipo T/T (polia caracterizaçã
para a reação d
HCl, 50mM de K
go iniciador (Inv
Invitrogen, USA)
uido por 35 ciclo
inuto e uma exte
1
,0% corado com brometo detão por BseMI, o marcador25pb; em 1 visualizamos som); em 2, visualizados as ban/T e em 3 vemos as band
mórfico).
o do polimorfismo de GST
e PCR em um volume final
Cl, 1,5mM de MgCl2, 0,3mM
itrogen, USA), 3% DMSO
. As condições da reação
s de 94ºC por 30 segundos,
nsão final de 5 minutos. Ao
3
2 etídeo, mostrando o de peso molecular ente a banda de 208 das de 208, 128, e as de 128 e 80pb,P1 foram utilizados
de 40µL, contendo
de dNTPs, 7,5µM
e 2,5 U de Taq
foram, 94ºC por 5
55ºC por 1 minuto,
final da reação 5µL
Casuística e Métodos 33
da PCR foram visualizados em gel de agarose 1,5% corado com brometo de
etídeo e após a confirmação da amplificação, 30µL do produto da PCR
foram digeridos em 20U da enzima Alw26I (Acinetobacter Iwoffi RFL26) a
37ºC por 16 horas e ao final do tempo de digestão o produto foi levado a
eletroforese em gel de agarose 3% corado com brometo de etídeo.(figura
08)
Figura 08 – Gel de agarose 3,0% corado com brometo de etídeo, mostrando o produto da digestão por Alw26I, o marcador de peso molecular utilizado foi o de 25pb; em 1 visualizamos as bandas de 91 e 85pb G/G (polimórfico); em 2, visualizados a banda de 176pb, genótipo A/A (selvagem) e em 3 vemos as bandas de176, 91 e 85pb, genótipo A/G.
Estatística
O valor das variáveis categóricas OPN e dos polimorfismos
estudados, como determinante de resposta à cisplatina, foram analisados
pelo método de regressão logística. As curvas de sobrevivência serão
construídas segundo o método de Kaplan-Meir e a importância prognóstica
de OPN e dos polimorfismos estudados foi determinada pelo teste de log
Casuística e Métodos 34
rank. A significância estatística será considerada com p< 0,05. Todas as
análises serão realizadas com o auxilio do programa SPSS 15.0.
RREESSUULLTTAADDOOSS
Resultados 36
Osteopontina
Os resultados apresentados nesta tese foram submetidos e aceitos
para a publicação na Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery
(anexo). A quantificação da OPN foi realizada em amostras de plasma 69
pacientes com carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (tabela 02).
Tabela 02 – Características dos pacientes em que foi realizada a quantificação da osteopontina
Número de pacientes N=69 (%) Idade mediana (variação) 57 anos (29-76) Gênero
Masculino 64 (92,7) Feminino 5 (7,3)
Mediana da hemoglobina (variação)
12.8 g/dL (9,0-15,9)
Hábitos Tabagismo 63 (91,3) Etilismo 50 (72,4)
Localização do tumor primário Cavidade oral 19 (29,6) Orofaringe 19 (29,6) Hipofaringe 6 (8,6) Laringe 23 (33,3) Outros 2 (2,8)
Grau de diferenciação Muito diferenciado 19 (29,6) Moderadamente diferenciado 33 (47,8) Pouco diferenciado 8 (11,5) Desconhecido 9 (13,0)
Status T T1 1 (1,4) T2 10 (14,4) T3 12 (17,3) T4 45 (65,2) Tx 1 (1,4)
Status N N0 16 (23,1) N1 8 (11,5) N2 28 (40,5) N3 17 (24,6)
Resultados 37
A maioria dos pacientes eram homens com uma idade mediana de 57
anos em sua maioria tabagistas e etilistas. O sítio tumoral mais afetado foi a
laringe (33,3 %), seguida pela cavidade oral e orofaringe. Muitos dos
pacientes eram T4 (65,2%) e N2 (40,5%). Do total de pacientes 52 foram
tratados exclusivamente com quimioradioterapia e o restante foi tratado com
cirurgia seguida por quimioradioterapia adjuvante.
Correlações com características tumorais
A concentração da OPN (ng/mL) antes do início da quimioradioterapia
no grupo como um todo, foi de 102,5±68,1 (média ± desvio padrão) com
uma mediana de 82,1 (3,9 - 333,8). O correspondente valor da OPN após o
tratamento (n=46) foi de 104,0±53,6 e mediana de 92,9 (19,4 – 247,8).
Nenhuma diferença foi encontrada entre a osteopontina antes e depois do
tratamento. (p=0.18, teste T pareado), assim como entre os pacientes
submetidos a quimioradioterapia exclusiva e ou a adjuvancia.
Com relação aos parâmetros clínicos - patológicos, foi observado que
a OPN apresentou níveis mais elevados em pacientes com maior tamanho
tumoral e status linfonodal, quando comparado aos estágios menores
(p=0,009 e 0,07, respectivamente, ANOVA). A localização tumoral não se
mostrou como um fator importante na expressão da OPN, muito embora a
hipofaringe tenha apresentado maiores níveis de OPN. (tabela 3)
Resultados 38
Tabela 03 – Níveis séricos da OPN e variáveis clínico-patológicas em pacientes com carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço.
Variável N° de pacientes
Osteopontina (ng/ml) média ±DP
valor de p
Status T
T1+ T2 11 60.6 ± 23.5 T3 14 80.2 ± 50.5 T4 43 121.9 ± 74.2 Tx 1 ---
.009
Status N N0 + N1 24 79.0 ± 43.2 N2 28 108.1 ± 69.6 N3 17 127.2± 86.2
.07
Grau de diferenciação Muito diferenciado 19 97.4 ± 75.3 Moderadamente diferenciado 33 102.5 ± 62.7
Pouco diferenciado 8 118.8 ± 95.2 Desconhecido 9 ---
.77
Localização do tumor
Orofaringe 19 115.0 ± 82.9 Laringe 23 84.5 ± 43.3 Cavidade oral 19 100.5 ± 64.4 Hipofaringe 6 152.6 ± 96.3 outros 2 60.5 ± 29.6
.18
Tipo de tratamento
Exclusivo 52 107.5 ± 73.5 Adjuvante 17 87.4 ±46.9 .29
Avaliações com relação a resposta ao tratamento e sobrevida
Quando comparamos os dados da OPN com a resposta ao
tratamento, observamos que em pacientes submetidos à exclusiva
quimioradioterapia, os pacientes que obtiveram resposta completa
Resultados 39
apresentaram menores níveis de OPN do que aqueles que não responderam
ao tratamento (tabela 04).
Tabela 04 - Níveis de osteopontina em pacientes com carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço, de acordo com a resposta ao tratamento.
Resposta completa (No.) Osteopontina (ng/ml) média ±DP valor de p
Antes do tratamento
sim(22) 75.0 ± 41.5 não(30) 131.2 ± 82.9 .005
Depois do tratamento
sim (17) 86.8 ± 40.5 não (15) 141.6 ± 58.4 .004
Outros fatores foram analisados com resposta completa através do
teste de chi-quadrado, entre eles o status T (p=0,007), N (p=0,002), OPN
antes da quimiradioterapia (82,1 ng/mL; p=0,007), OPN após a
quimiradioterapia (92,9 ng/mL; p= 0,016), localização tumoral, categorizada
como cavidade oral versus outros (p=0,018). Usando o modelo de regressão
logística observamos que entre os pacientes com alta OPN após
quimioradioterapia houve um menor número de respostas completas (tabela
05). Tanto os valores de OPN antes do tratamento como os valores
pareados da OPN não se mostraram como marcadores de resposta.
Resultados 40
Tabela 05 – Análise por regressão logística para fatores associados com resposta completa em 32 pacientes com CE submetidos a quimioradioterapia exclusiva.
95.0% C.I. valor de p
Odds ratio para a resposta completa menor maior
Osteopontina depois do tratamento .043 .978 .958 .999
Status T T4 vs T1-T3 .511 .453 .043 4.818
Status N N3 vs N0 - N2 .091 .120 .010 1.402
Localização tumoral Oral cavity vs outros
.999 .000 .000 --
Nas análises entre osteopontina e sobrevida, temos que a mediana
de seguimento dos pacientes foi de 23,5 meses (8 -37 meses) e 30
pacientes morreram. Em uma análise univariada, o teste de log rank mostrou
que o status T, N e o tamanho tumoral foram associados à sobrevida global,
com p=0,014; 0,007 e 0,001, respectivamente.
Resultados 41
Polimorfismos
A genotipagem foi realizada em 95 pacientes com carcinoma
epidermóide de cabeça e pescoço (tabela 06). A idade mediana dos
pacientes foi de 59 anos (intervalo: 29 – 81 anos), a maioria dos pacientes
(91,6%) era do sexo masculino e apenas 6,3% dos pacientes não eram
tabagistas e 15,8% não eram etilistas. Quase a totalidade dos pacientes
apresentou doença localmente avançada (estadiamento IV, 87,4%; T4,
69,5% e N2, 44,2%) sendo a orofaringe o sítio mais freqüente, seguido por
cavidade oral e laringe (37%, 24,2% e 21%, respectivamente).
Tabela 06 – Características dos pacientes em que foi realizado o estudo dos polimorfismos
Número de pacientes N=95 (%) Idade mediana (variação) 59 anos (29-81) Gênero
Masculino 87 (91,6) Feminino 8 (8,4)
Hábitos Tabagismo 89 (93,7) Etilismo 80 (84,2)
Localização do tumor primário Cavidade oral 23 (24,2) Orofaringe 35 (37,0) Hipofaringe 12 (12,6) Laringe 20 (21,0) Língua 1 (1,0) Outros 4 (4,2)
Estadiamento II 6 (6,3) III 6 (6,3) IV 83 (87,4)
Status T T2 12 (12,6) T3 9 (9,5) T4 66 (69,5) Tx 8 (8,4)
Status N N0 18 (18,9) N1 7 (7,4) N2 42 (44,2) N3 28 (29,5)
Resultados 42
Freqüências Genotípicas
A freqüência dos diferentes polimorfismos está mostrada na tabela
07. Para o gene ERCC1 (118), o genótipo mais freqüente foi o heterozigoto
(C/T) com 45,3%, no gene XPD (751) 44 pacientes (46,3%) foram
genotipados como homozigoto selvagem (A/A), para o gene GSTP1
observamos que 47,4% dos pacientes eram heterozigotos (A/G).
Em relação as GSTT1 e GSTM1 determinamos que os genótipos que
o gene fosse nulo, este seria chamado de não funcional, uma vez que não
produz a proteína e de funcional quando o gene estivesse presente. Assim,
83,2 % dos pacientes apresentaram GSTT1 funcional e 58,9 % dos
pacientes se mostraram como tendo o gene GSTM1 não funcional. (tabela
07)
Tabela 07 – Freqüência genotípicas dos genes em pacientes com carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço.
Homozigoto Selvagem Heterozigoto Homozigoto
polimórfico
Genes N° % N° % N° %
ERCC1 (118) 29 30,5 43 45,3 23 24,2
XPD (751) 44 46,3 40 42,1 11 11,6
GSTP1 35 36,8 45 47,4 15 15,8
Funcional Não funcional
Genes N° % N° %
GSTT1 79 83,2 16 16,8
GSTM1 39 41,1 56 58,9
Resultados 43
Avaliação dos genótipos e resposta ao tratamento
Os 95 pacientes incluídos no estudo eram inoperáveis e foram
tratados com quimioradioterapia exclusiva, em apenas 06 pacientes não foi
possível a avaliação da resposta. A taxa de resposta global (parcial e
completa) foi de 61,8%. A tabela 08 mostra que 30,3% dos pacientes
apresentaram resposta completa, 31,5% reposta parcial, enquanto 38,2 %
dos pacientes não responderam ao tratamento (progressão da doença e
doença estável).
Tabela 08 – Avaliação de resposta ao tratamento em pacientes com carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço.
Tipo de resposta Nº de pacientes %
Resposta completa (RC) 27 30,3
Resposta parcial (RP) 28 31,5
Progressão da doença (PD) 29 32,6
Doença estável (DE) 05 5,6
Não encontramos correlações entre os genótipos e a resposta a
quimioradioterapia (tabela 09). O único gene que parece estar relacionado
com tratamento é a GSTP1, em que um maior número de pacientes
respondedores ao tratamento foi identificado com o genótipo heterozigoto
polimórfico (A/G; p=0,04, χ2 Pearson teste).
Resultados 44
Tabela 09 – Resposta ao tratamento em 89 pacientes com carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço de acordo com seus genótipos.
Respondedores Não
respondedores
Genes Nº % Nº % P(χ2)
ERCC (118)
C/C 19 65,5 10 34,5
C/T 23 57,5 17 42,5
T/T 13 65,0 07 35,0
,752
XPD (751)
A/A 25 59,5 17 40,5
A/C 23 62,2 14 37,8
C/C 07 70,0 03 30,0
,827
GSTP1
A/A 22 68,8 10 31,2
A/G 28 66,7 14 33,3
G/G 05 61,8 10 38,2
,044
GSTT1
Funcional 45 61,6 28 38,4
Não funcional 10 62,5 06 37,5 1,00
GSTT1
Funcional 23 59,0 16 41,0
Não funcional 32 64,0 18 36,0 ,66
Resultados 45
Correlações entre os genótipos e sobrevida global
A mediana de segmento dos pacientes foi de 11,2 meses (intervalo:
0,6 -37 meses), ao final do tratamento 39 pacientes estavam vivos e houve
uma perda de segmento de 13 pacientes.
Em uma correlação entre resposta ao tratamento e sobrevida global,
notamos que os pacientes que foram respondedores (completa e
parcialmente) ao tratamento obtiveram uma melhor sobrevida global (média:
26,9 meses, 95%CI: 22,4 -31,3 meses; log rank=0,000).
A análise das curvas de Kaplan Meier dos pacientes portadores de
CE mostrou não haver associação entre os genótipos dos genes de reparo
de DNA, ERCC (118) e XPD (751) com a sobrevida global dos pacientes.
Embora, possamos notar que em relação ao gene XPD, o genótipo
homozigoto polimórfico (C/C) tenha apresentado uma vantagem na
sobrevida quando comparado aos demais perfis, A/A e A/C, sendo a
sobrevida mediana de 27,9 meses; 18,7 e 12,4, respectivamente (figura 09).
Resultados 46
n=25
n=18n=39
Log rank=0,65
n=35
n=37
n=10
Log rank=0,33
Sobr
evid
a ac
umul
ada
Tempo em meses
n=25
n=18n=39
Log rank=0,65
n=35
n=37
n=10
Log rank=0,33
Sobr
evid
a ac
umul
ada
Tempo em meses
n=25
n=18n=39
Log rank=0,65
n=25
n=18n=39
Log rank=0,65
n=35
n=37
n=10
Log rank=0,33
n=35
n=37
n=10n=35
n=37
n=10
Log rank=0,33
Sobr
evid
a ac
umul
ada
Tempo em meses
Figura 09 – Análise de sobrevida global em pacientes portadores de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço. Na figura vemos as curvas de sobrevida dos pacientes de acordo com seus genótipos para os genes ERCC (118) e XPD (751). A análise de sobrevivência foi realizada segundo o teste do Log Rank e os valores estão representados ao lado de cada curva. Foi considerado significativo p≤0,05.
Mantendo a mesma análise das curvas de sobrevida, observamos
que com relação os genes de detoxificação celular as GSTP1, M1 e T1,
nenhuma associação com sobrevida global também foi possível, mas
podemos notar uma evidente melhor vantagem na sobrevida para os
pacientes que possuem GSTT1 não funcional, com uma mediana de 27,9
meses em relação aos que possuem o gene funcional com uma mediana de
14,5 meses. O mesmo resultado não é observado com a GSTM1, onde
percebemos uma relação inversa, em que os pacientes que apresentam a
GSTM1 não funcional têm uma menor sobrevida do que os funcionais, 12,4
e 18,7 meses, respectivamente (figura 10).
Resultados 47
Sobr
evid
a ac
umul
ada
Tempo em meses
n=29
n=41
n=12 Log rank=0,52
n=12
n=70
Log rank=0,43Log rank=0,30
n=45
n=37
Sobr
evid
a ac
umul
ada
Tempo em meses
Sobr
evid
a ac
umul
ada
Tempo em meses
n=29
n=41
n=12 Log rank=0,52
n=12
n=70
Log rank=0,43Log rank=0,30
n=45
n=37
Figura 10 – Análise de sobrevida global em pacientes portadores de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço. Na figura vemos as curvas de sobrevida dos pacientes de acordo com seus genótipos para os genes GSTP1, GSTM1 e GSTT1. A análise de sobrevivência foi realizada segundo o teste do Log Rank e os valores estão representados ao lado de cada curva. Foi considerado significativo p≤0,05.
DDIISSCCUUSSSSÃÃOO
Discussão 49
O propósito deste estudo foi a busca por um marcador de resposta a
quimioterapia e sobrevida dos pacientes com carcinoma epidermóide de
cabeça e pescoço tratados com quimioradioterapia.
Muitos trabalhos têm avaliado o uso de biomarcadores e o entrego de
técnicas de seqüênciamento gênico na busca por determinantes
prognósticos evitando que pacientes não respondedores ao tratamento
sofram com os efeitos tóxicos de muitos quimioterápicos.
No presente estudo, trabalhamos com duas linhas distintas, em uma
delas avaliamos os níveis da OPN sérica em pacientes com CE antes e
depois do término da quimioradioterapia E, além disso, traçamos o perfil dos
polimorfismos dos genes de reparo de DNA (ERCC e XPD) e detoxificação
celular (glutationas), também em pacientes com CE, apesar destas duas
frentes distintas, a idéia central era a mesma: a busca por uma correlação
entre a resposta a quimioradioterapia e a sobrevida destes pacientes.
Em relação à OPN, nós não encontramos nenhuma significância
estatística entre as amostras coletas antes e depois do tratamento, também
não nenhuma associação entre resposta e alterações individuais nos níveis
de OPN, talvez devido ao pequeno número de amostras, a ampla variação
dos valores ou mesmo pela avaliação em somente um dos momentos. Em
um estudo anterior em pacientes com câncer de mama metastático foi
mostrado que o aumento da OPN no plasma estava relacionado com o pior
prognóstico (Bramwell et al., 2006), embora em um outro estudo com
Discussão 50
mieloma múltiplo o mesmo resultado não tenha sido encontrado (Kang et al.,
2007).
Em nossos achados, nós encontrados associação entre os altos
níveis de OPN no plasma em pacientes com avançados status T e N,
quando comparado aos estágios iniciais, o que está de acordo com outras
publicações em câncer de língua (Chien et al., 2008), laringe e hipofaringe
(Eto et al., 2007). No primeiro estudo, a OPN foi mensurada por
imunohistoquímica e no segundo por elisa, e em ambos os valores altos
estavam associados com alto risco de complicações patológicas.
Uma associação entre a baixa osteopontina antes do tratamento e a
resposta completa a quimioradioterapia foi encontrada em uma análise
univariada, estando de acordo com uma publicação de Overgaard em 2005,
em que há uma correlação entre altos níveis de OPN no plasma e o grupo
de pacientes não respondedores. Um achado interessante foi o fato de a
OPN estar inversamente correlacionada com os níveis de hemoglobina, o
que reforça a ligação entre a osteopontina e a hipóxia (Overgaard et al.,
2005; Bache et al., 2006 e Nordsmark et al., 2004). Além disso, um aumento
da OPN depois do tratamento foi independentemente relacionado com a
resposta completa do tumor, sugerindo uma ligação entre tamanho tumoral e
os níveis de OPN no plasma.
Observamos uma correlação entre baixa OPN antes do tratamento e
uma melhor sobrevida global, quando realizada uma análise multivariada, o
mesmo foi encontrado em estudos anteriores com pacientes de CE
Discussão 51
submetidos a diferentes modalidades de tratamento (Bache et al., 2006 e
Petrik et al., 2006).
Polimorfismos em genes de reparo de DNA ou mesmo em enzimas
de detoxificação celular têm sido muito estudados, mas seu significado
biológico ainda não é muito compreendido. Muitas evidências
epidemiológicas têm associado essas variações individuais à resposta à
quimioterapia. Essas variações podem incluir, alterações no metabolismo
das drogas, no caso das enzimas de detoxificação e na forma como as
lesões causadas ao DNA são reparadas, no caso das enzimas de reparo de
DNA.
A via de reparo mais importante para os danos causados ao DNA
pela cisplatina é a NER (Suk et al., 2005) e polimorfismos nas enzimas que
atuam nesta via de reparo tem sido amplamente estudada.
No gene XPD (751) há uma troca de uma adenina por uma citosina
levando a uma substituição de uma lisina por uma glicina na posição 751 da
cadeia de aminoácidos o que afeta os níveis da proteína (Yu et al., 1997).
Em um estudo funcional Spitz et al., mostraram que a variante homozigota
polimórfica (C/C) possui uma capacidade sub-ótima de reparo. No caso do
gene ERCC (118), há uma substituição de uma citosina por uma timina, que
codifica para o mesmo aminoácido: asparagina (Yu et al., 1997). Em um
trabalho com células de ovário Yu et al. em 2000, mostrou que a transição
de uma citosina para uma timina leva a diminuição da expressão do RNAm
do gene ERCC.
Discussão 52
Em nosso estudo, encontramos o genótipo selvagem (aquele que não
apresenta a substituição da base nitrogenada), como sendo o mais
freqüente para o gene XPD (751) e o heterozigoto polimórfico o mais
freqüente para o gene ERCC (118), esses dados variam de acordo com o
grupo étnico estudado, na Europa e na América do Norte aproximadamente
50% da população possui genótipo polimórfico para o gene XPD, enquanto o
genótipo selvagem é encontrado na maior parte da população chinesa,
japonesa e coreana (Benhamou et al., 2005).
Após as análises das freqüências, passamos a correlacionar os
genótipos dos pacientes com a resposta a quimioradioterapia, através do
teste estatístico de Pearson e nenhuma relação foi encontrada, o que é
semelhante aos resultados encontrados por Isla et al. em 2004 com
carcinoma de pulmão de células não pequenas. No entanto, Quintela-
Fandino em 2006, mostraram correlação entre os genes de reparo e a
resposta a quimioradioterapia em pacientes com CE. Essa discrepância nos
dados pode ser explicada pelo fato de que muitos em muitos estudos os
pacientes recebem vários esquemas de tratamento.
A respeito das análises de sobrevivência global, não foi possível uma
correlação significativa entre os genótipos encontrados e a sobrevida dos
pacientes. Embora tenha sido interessante notar que os pacientes que
possuíam o genótipo homozigoto polimórfico (C/C) no gene XPD (751)
apresentaram uma melhor sobrevida em relação ao selvagem e ao
heterozigoto, isso pode estar relacionado ao fato de que o pacientes com
Discussão 53
genótipo C/C tem uma capacidade menor de reparo no DNA, e assim, a
cisplatina causaria mais danos ao DNA levando a célula a apoptose.
Outro fator que pode estar relacionado a resposta ao tratamento e
sobrevida em pacientes tratados com cisplatina são os polimorfismos em
enzimas de detoxificação celular e as glutationas estão particularmente
envolvidas no efluxo deste quimioterápico.
Nos nossos pacientes incluídos neste estudo, observamos que a
maioria dos pacientes apresentaram o genótipo polimórfico heterozigoto
para o gene GSTP1 (A/G). Este polimorfismo se caracteriza pela troca de
uma adenina por uma guanina o que leva a substituição de uma isoleucina
por uma valina na posição 115 da cadeia de aminoácidos, essa mudança
torna faz com que a enzima tenha uma perda da atividade catalítica e
redução na capacidade de detoxificação celular.
Para os genes GSTT1 e GSTM1, notamos que a maioria dos
pacientes possuía uma deleção no gene GSTT1 e formam assim chamados
de não funcionais e o inverso ocorreu para o genótipo GSTM1. A deleção
desses genes pode ser resultado de uma falha durante o crossing-over (Xu
et al., 1998), o resultado dessas deleções é caracterizado pela deficiência na
atividade enzimática, e isso tem sido amplamente associado a resposta a
quimioterapia e o aumento de risco para doenças malignas (McIlwain et al.,
2006).
Nas análises realizadas entre a resposta ao tratamento e os
genótipos, vimos que não houve uma correlação entre resposta ao
Discussão 54
tratamento e as glutationas, esse resultado também é observado em outros
estudos entre eles, Beeghly et al. em 2006, com pacientes com câncer de
ovário.
As análises da curva de sobrevida mostraram um resultado
interessante, embora não ter sido um resultado estatisticamente significante,
os pacientes que apresentaram a GSTT1 não funcional obtiveram uma
vantagem na sobrevida com relação aos pacientes que possuíam a GSTT1
funcional, fator que era previsto uma vez que se o gene não está presente
não haverá a produção da enzima e consequentemente a droga não será
expulsa, assim muitos danos serão causados e a célula será encaminhada
para apoptose.
Apesar dos dados apresentados não indicarem correlações entre os
polimorfismos estudados e a resposta ao tratamento e sobrevida global dos
pacientes, mais análises estatísticas ainda serão realizadas entre elas as
análises multivariadas e univariadas, fazendo assim uma melhor análise de
todos os dados.
RREEFFEERRÊÊNNCCIIAASS
Referências 56
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AANNEEXXOOSS
Anexo I
Anexo I
Plasma Osteopontin in Head and Neck Cancer Patients
Submitted to Chemoradiotherapy
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
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13
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18
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20
21
22
23
24
25
Igor Snitcovsky, MD1; Glauber Moreira Leitão, MD1; Fátima Solange
Pasini, PhD1; Karen Cristina Sant’Anna Brunialti, BS1; Flavia Regina
Rotea Mangone, PhD1; Simone Maistro, PhD1; Gilberto de Castro Jr,
MD2; Rosangela Correia Villar, MD3; Miriam Hatsue Honda Federico, MD,
PhD1.
Author Affiliations:
1Departamento de Radiologia e Cancerologia, Disciplina de Oncologia,
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (LIM24), Av. Dr.
Arnaldo, 455 sala 4123, CEP 01246-903, São Paulo, SP, Brasil.
2Departamento de Oncologia Clinica, INRAD, Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
3Departamento de Radioterapia, INRAD, Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Anexo I
ABSTRACT 26
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Background: Osteopontin (OPN), a phosphoglycoprotein with adhesive
properties, has been proposed as a prognostic factor in several
malignancies. Objectives: The aim of this study was to explore the
prognostic role of plasma OPN levels in head and neck squamous cell
carcinoma (HNSCC) patients submitted to concomitant
chemoradiotherapy. Design: Prospective analysis of plasma OPN levels,
before and within 12 weeks after treatment, was done in a cohort of
HNSCC patients submitted to platinum based chemoradiotherapy at our
center. Setting: Academic center. Patients and methods: OPN was
assessed in the plasma of 69 patients with a diagnosis of HNSCC, before
the start and after chemoradiotherapy, using a commercially available
ELISA kit (IBL, Japan). Chemoradiotherapy was either exclusive (n=52)
or adjuvant to surgery. OPN levels were correlated with
clinocopathological characteristics, response to treatment and overall
survival. Results: Plasma OPN levels, assessed before treatment, were
higher in patients with advanced T and N stages, as compared to early
stages ( P=.009 and .07, respectively). OPN plasma values (ng/mL,
mean ± SD) did not differ, as assessed before (102.5 ± 68.1) or after
treatment (104.0 ± 53.6; P = .18, paired t test). OPN levels, as measured
either before or after treatment , were lower in those patients who
achieved a complete response, as compared to non responding patients:
75.0 ± 41.5 vs 131.2 ± 82.9 (P= .005) and 86.8 ± 40.5 vs 141.6 ± 58.4
Anexo I
(P= .004), respectively. Patients with high pre treatment OPN , above
82.1, had shorter survival (P < .001). Post treatment OPN was marginally
(P = .10) associated with survival at univariate analysis. Conclusions: In
HNSCC patients submitted to chemoradiotherapy, low pre treatment
plasma OPN was associated with treatment response and better survival.
OPN modulation by chemoradiotherapy may also be associated with
outcome. Further studies with serial OPN measurements are warranted in
these patients.
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Anexo I
INTRODUCTION 58 59
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Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), a common
cancer in the developing world, usually presents with advanced disease
with resulting poor survival rates.1 In this group of patients, concomitant
chemoradiotherapy with high dose platinum is thought to confer a five to
eight percent five year survival benefit, as compared to radiotherapy
alone.2-5 For this reason, concomitant chemoradiotherapy has been
increasingly used in the routine treatment of these high risk subgroups of
HNSCC patients, both as an exclusive treatment modality or as an
adjuvant to surgery. However, several investigators, including ourselves,
have observed a marked toxicity with these aggressive regimens and
discussed on the need of candidate markers for appropriate patient
selection.2,6
One such marker is Osteopontin (OPN), a secreted
phosphoglycoprotein that binds ανβ3 integrins and some CD44 isoforms. 7
Though the molecular mechanisms are not entirely clear, OPN action in
carcinogenesis and metastasis formation seems to occur through changes
in cell migration, angiogenesis and apoptosis. 8 In tumors such as breast,
prostate and stomach, OPN was described in the tumor tissue and in the
body fluids, and higher expression associated with poor prognosis. 9-12
In head and neck cancer, OPN expression, as assessed by
immunohistochemistry, was progressively higher from normal tissue to
epithelial hyperplasia, dysplasia and carcinoma in situ,13 suggesting its
role in the carcinogenetic process. In tongue squamous cell carcinoma,
Anexo I
immunohistochemical expression of OPN was also described as
associated with aggressive features of T1 and T2 tumors.
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14
Plasma OPN expression was described as an independent marker
of shorter survival in a cohort of 140 HNSCC patients submitted to various
treatment modalities.15 In a small series of Japanese HNSCC patients,
higher serum OPN levels were associated with advanced stage tumors.16
In the only published study on the interaction of OPN expression and
response to a radiosensitizer, high OPN expression seemed to select for
patients who benefited from treatment.17
For these reasons, the aim of this study was to explore the prognostic role of plasma OPN levels in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) patients submitted to concomitant chemoradiotherapy.
Anexo I
PATIENTS AND METHODS 96
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STUDY POPULATION
Criteria for patients participating in the study included: (a)
histologically confirmed HNSCC (b) no prior radiation or chemotherapy
treatment (c) indication, by the treating surgeon, for chemoradiotherapy,
either as an exclusive treatment or as an adjuvant after surgery. Exclusive
chemoradiotherapy was indicated in patients with unresectable or
medically inoperable tumors. Unresectability criteria included invasion of
the base of skull, prevertebral fascia, cervical spine or carotid artery.
Adjuvant chemoradiotherapy was indicated in patient whose resected
tumors presented any high risk feature, defined as more than two
compromised lymph nodes, extracapsular extension in compromised
lymph nodes and close or microscopically compromised tumor margins.
(d) willing to sign an informed consent approved by the institutional review
board of our institution, in accordance with the guidelines of good clinical
practices and the Brazilian law. Between January 2005 and December
2006, sixty nine patients who fit the above criteria were enrolled in the
study, conducted at the Hospital das Clínicas da USP, in Brazil. Tumor
staging was performed according to the 1998 American Joint Committee
on Cancer system and treatment followed the routine guidelines of our
institution. The intended treatment included radiotherapy 70 or 60-66Gy
for exclusive or adjuvant purposes, respectively, in daily 2 Gy fractions
and chemotherapy (cisplatin 100mg/m2), concomitant with radiotherapy,
Anexo I
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on days 1, 21 and 43. Treatment response evaluation was performed
within 4 weeks of treatment completion. A complete tumor response was
defined as no tumor detection by clinical and imaging studies. Overall
survival was defined as the interval between the start of
chemoradiotherapy and death, with the last follow-up in February 2008.
SAMPLE COLLECTION AND OSTEOPONTIN PLASMA ASSAY
Blood samples were collected before the start of
chemoradiotherapy (n=69) and within 12 weeks of treatment completion
(n=46). Blood aliquots were withdrawn into tubes with EDTA
anticoagulant, kept at 4οC for a maximum of 16 hours and subsequently
centrifuged at 3,000 rpm for 15 minutes. The resulting plasma was
divided into aliquots and stored at -70ο C. Osteopontin levels were
determined by a commercially available ELISA assay kit (IBL, Japan),
following the manufacturer’s instructions. Samples were tested in
duplicate, and the results determined by a standard curve, which was built
using the human OPN control supplied by the kit.
STATISTICAL ANALYSIS
ANOVA was used to test for differences in OPN across the various
clinicopathological categories. A paired t test was used to determine the
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significance of differences of pre and post treatment OPN levels. Linear
regression and chi square tests were used when appropriate.
To test for factors associated with tumor response and survival,
patients were categorized as OPN negative or positive, according to the
median value. Survival analysis was performed by Kaplan Meier method
and differences between groups were assessed by the log-rank test. A P
value less than .05 was considered significant. All analysis were
performed by using SSPS 10.0 software.
Anexo I
RESULTS 151
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STUDY POPULATION
A total of 69 patients were included in this study. The great majority were male, with a median age of 57 years, and a history of tobacco and alcohol consumption. Mild anemia was present in most patients. Hystopathological analysis confirmed the diagnosis of squamous cell carcinoma in all patients, the majority with a moderately differentiated grade. The most commonly affected site was the larynx, followed by the oral cavity and oropharynx. The most frequent T and N stages were T4 and N2, respectively. 52 patients were treated exclusively with chemoradiotherapy and the remaining with surgery followed by adjuvant chemoradiotherapy. Median radiation and cisplatin doses were 70Gy and 260 mg/m2, respectively, delivered in a median of 58 days (range : 49-90 days) (Table 1).
OSTEOPONTIN AND
CLINICOPATHOLOGICAL CHARACTERISTICS
The plasma OPN concentration (ng/mL) in the group as a whole (n
= 69) before the start of chemoradiotherapy was: 102.5 ± 68.1 (mean
±SD), 82.1(median) and 3.9-333.8 (range). Correspondent post treatment
values (n= 46) were: 104.0 ± 53.6, 92.9 and 19.4-247.8. No difference
was found between OPN values before and after treatment (P = .18,
paired t- test) or between the subgroups submitted to exclusive or
adjuvant chemoradiotherapy. When measured in a individual patient level,
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the magnitude of the difference between post and pre treatment OPN
levels (ng/mL) varied widely, from minus 157.7 to plus 128.6, with a
median of plus 11.7.
Concerning clinical pathological parameters, OPN levels were
higher in patients with advanced T and N stages, as compared to earlier
stages, P values of .009 and .07 (ANOVA), respectively. Undifferentiated
tumors were associated with numerically higher, although not statistically
different, values of OPN. Tumor site seemed not to influence OPN levels,
although hypopharynx tumor patients presented numerically higher OPN
levels (Table 2). Hemoglobin levels, which presumably influence the
degree of tumor hypoxia, were inversely correlated with OPN levels (R = -
0.387; P = .04).
OSTEOPONTIN VARIATION AND TUMOR RESPONSE
Out of the 52 patients submitted to exclusive chemoradiotherapy,
22 (42.3%) had a complete response and 30 were classified as treatment
failures. The latter were subclassified as: progressive disease 11 (
21.2%), stable disease 3 (5.8%) and partial response 16 (30.8 %). Mean
plasma OPN levels, as measured either before or after treatment , were
lower in those patients who achieved a complete response, as compared
to non responding patients: 75.0 ± 41.5 vs 131.2 ± 82.9 (P= .005) and
86.8 ± 40.5 vs 141.6 ± 58.4 (P= .004), respectively (Figure 1).
In the subgroup of patients submitted to exclusive
chemoradiotherapy who had a complete response and both pre and post
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treatment OPN measurements available (n=17/22), the paired OPN
values did not differ: 70.1 ± 44.2 vs 86.8 ± 40.5, respectively (P=.14),
although, numerically, the OPN levels decreased in 7 patients and
increased in 10 patients.
Factors associated with complete response, as determined by chi
square test, included T status (P = .007), N status (P = .002), pre
chemoradiotherapy OPN, categorized by the median value 82.1 ng/ml (P
= .007), post chemoradiotherapy OPN, categorized by the median value
92.9 ng/ml (P = .016), tumor site, categorized as oral cavity vs others (P =
.018) but not radiotherapy and chemotherapy dose or treatment duration.
OSTEOPONTIN AND SURVIVAL
After a median follow up of 23.5 months (range 8.0 – 37.0) for living
patients, 30 of 69 patients had died. In univariate analysis, the log rank-
test showed that T stage, N stage and tumor site were predictive of
overall survival, with P values of .014, .007 and .001, respectively.
Positivity for OPN, defined as pre chemoradiotherapy plasma OPN above
median value (82.1 ng/ml) of the whole group, was a negative predictor
of overall survival at univariate analysis with 9.3 month median survival
versus not reached for the negative OPN patients (P < .001, log-rank
test), with a total of 22/35 and 8/34 deaths, respectively. Post
chemoradiotherapy OPN, categorized by the median value (92.9 ng/ml)
was marginally predictive of survival by the log-rank test (P = .10)
(Figure2 ).
Anexo I
DISCUSSION 227
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In the present study, we evaluated OPN levels is the plasma of
HNSCC patients before the start and after the completion of
chemoradiotherapy. We did not find any statistically significant difference
between the paired values and no association between response and
OPN changes in a individual patient level, perhaps due to the wide range
of values, small sample size, and evaluation in only two time points.
Based on the hypothesis that serial measurements would possibly be
more informative, only two studies have previously evaluated changes in
plasma OPN levels over time. The first one reported data in metastatic
breast cancer patients, and showed that increases in plasma OPN over
time were strongly associated with a poor survival,9 in contrast, a multiple
myeloma study did not find any association.18
In our study, we have found higher pre treatment plasma OPN
levels in patients with advanced T and N stages, as compared to early
stages, which is in agreement with previous published data in tongue
cancer,14 and in a cohort of 37 patients with larynx and hypopharynx
tumors.16 In these studies OPN was assessed by immunohistochemistry
and in the patient’s sera, respectively, and higher values were also
associated with high risk pathological features.
Here we show that high pre treatment plasma OPN was associated
with a lack of response to chemoradiotherapy, which agrees with the
results from another study, in which patients were treated with exclusive
radiotherapy.17 Interestingly, in our patients, we found that OPN and
Anexo I
hemoglobin levels were inversely correlated, which is in agreement with
previous works, reinforcing the link between osteopontin and tissue
hypoxia.
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17,19-20 In addition, lower post treatment OPN was also associated
with a complete tumor response, suggesting a link between tumor bulk
and plasma OPN levels.
We were surprised, however, to find that OPN levels did not
decrease in the small subgroup of responding patients who had both pre
and post treatment measurements. A possibility is that tumor destruction
could cause a transient increase in plasma OPN, liberated by dying cells
or tumor stroma. Since the timing of our post treatment collection differed
among patients, serial post treatment OPN measurements would be
useful to clarify the issue, as previously shown in breast cancer and
multiple myeloma9,18. Another possibility is the existence of residual
disease in some complete responders, as determined by conventional
methods. In this situation, survival analysis may be a better indicator of
treatment result.
In terms of survival, low pre-treatment OPN (below the
median 82.1 ng/mL) was associated, in univariate analysis, with a
better overall survival. This is in agreement with previous data on
HNSCC patients submitted to different treatment modalities.15,19
Interestingly, positivity for post treatment OPN, (with patients
categorized by the median 92.9 ng/mL), was only a marginally
significant predictor of survival at univariate analysis, perhaps
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related to a reduced tumor mass, but taking in consideration the
confounding factors discussed above.
There are limitations of our study that warrant some comments.
Distinct commercially available ELISA kits yield different OPN values,
which make it difficult to compare studies and define clinically useful cut-
off values.21 In this regard, our absolute values are similar to the ones
reported in the only study employing the same kit in HNSCC patients.16
Although patients with missing OPN values did not differ from the whole
group, regarding T/ N stage and tumor site (not shown), missing values
could bias our results.
In summary, in this group of high risk HNSCC patients, low pre
treatment plasma OPN levels were associated with tumor response and
better survival. In addition, OPN modulation by chemoradiotherapy may
also be associated with outcome. Thus, further work with serial
measurements may be warranted in these patients.
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Anexo I
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Anexo I
FIGURE LEGENDS 359
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Figure 1 Plasma OPN levels in ng/ml, before (A) or after (B)
chemoradiotherapy, according to response status: complete response
(Yes) and not a complete response (No).
Figure 2 Overall survival curves of patients with head and neck squamous
cell carcinoma submitted to chemoradiotherapy, according to plasma
osteopontin Patients were categorized as OPN positive or negative,
according to values above or equal/ below the median (ng/ml),
respectively. (A) pre treatment (median 82.1) or (B) post treatment
(median 92.9).
Anexo I
373
Table 1. HNSCC Patients and Tumor Characteristics
Variable N=69 (%)
Median Age (range) 57 years (29-76)
Gender
Male 64 (92.7)
Female 5 (7.3)
Median Hemoglobin (range) 12.8 g/dL (9.0-15.9)
Habits
Tobacco 63 (91.3)
Alcohol 50 (72.4)
Primary tumor site
Oral cavity 19 (29.6)
Oropharynx 19 (29.6)
Hypopharynx 6 (8.6)
Larynx 23 (33.3)
Other 2 (2.8)
Differentiation grade
well 19 (29.6)
moderately 33 (47.8)
poorly 8 (11.5)
Unknown 9 (13.0)
T stage
T1 1 (1.4)
T2 10 (14.4)
T3 12 (17.3)
T4 45 (65.2)
Tx 1 (1.4)
N stage
N0 16 (23.1)
N1 8 (11.5)
N2 28 (40.5)
N3 17 (24.6)
Abbreviation: HNSCC, head and neck squamous cell carcinoma. 374
Anexo I
375
Table 2. Plasma Osteopontin Levels and Clinicopathological Variables from HNSCC Patients
Variable No. of patients
Osteopontin (ng/ml) mean±SD
P value
T stage
T1+ T2 11 60.6 ± 23.5 .009
T3 14 80.2 ± 50.5
T4 43 121.9 ± 74.2
Tx 1 ---
N stage
N0 + N1 24 79.0 ± 43.2 .07
N2 28 108.1 ± 69.6
N3 17 127.2± 86.2
Differentiation grade
well 19 97.4 ± 75.3 .77
moderately 33 102.5 ± 62.7
poorly 8 118.8 ± 95.2
unknown 9 ---
Tumor site
Oropharynx 19 115.0 ± 82.9 .18
Larynx 23 84.5 ± 43.3
Oral cavity 19 100.5 ± 64.4
Hypopharynx 6 152.6 ± 96.3
Other 2 60.5 ± 29.6
Type of treatment
Exclusive 52 107.5 ± 73.5 .29
Adjuvant 17 87.4 ±46.9
376 377
Abbreviation: HNSCC, head and neck squamous cell carcinoma.