PRESERVAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS
Ivano de Filippis [email protected]
Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZInstituto Nacional de Controle
de Qualidade em Saúde – INCQS
Utilização frequente de culturas para pesquisa, produção de biológicos ou ensaios
• Contaminação
• Diminuição da viabilidade
• Mutações
Porque preservar microrganismos?
Criopreservação
- Congelamento e preservação na fase líquida
ou gasosa de N2 líquido.
- Congelamento e preservação abaixo de -70°C.
Dessecação
- Preservação por liofilização
- Preservação por centrifugação
- Preservação por “L-drying”
Metodologias de preservação metabolicamente inativas:
- Repiques periódicos em ágar ou meio líquido
- Manutenção de culturas em “slant” com óleo mineral
- Preservação em água (Castellani)
Metodologias de preservação metabolicamente ativas:
Congelamento:
-20° C:Vantagens: barato, equip.simples, contam. reduzida, necessidade de pouco espaço.Desvantagens: monitoração do equip., manutenção frequente dos mos., estruturas biológicas instáveis.
-70° C:Vantagens: estabilidade, armazenamento por longos períodos.Desvantagens: custo equip./manutenção constante.
Metodologias de preservação metabolicamente inativas:
Liofilização
Vantagens:
- Produção, distribuição e armazenamento de lotes
- Alta viabilidade durante a estocagem (50 anos)
- Produção de grande número de ampolas/lote
- Armazenamento simples/pouco espaço
Desvantagens:
- Alto custo inicial
- Utilização de diversos reagentes/mat. laboratório
Metodologias de preservação metabolicamente inativas:
Liofilização em ampolas
Ampola estrangulada:
Vantagens:
- Maior durabilidade
- Menor espaço p/estocagem
- Menor custo
Desvantagens:
- Dois ciclos de liofilização
- Menor resistência a impactos
- Menor durabilidade
Metodologias de preservação metabolicamente inativas:
Liofilização em ampolas
Frasco-ampola:
Vantagens:
- Apenas um ciclo para liofilização
- Menor tempo de liofilização
- Maior resistência a impactos
Desvantagens:
- Menor durabilidade
- Maior custo
- Necessidade de equipamento p/fechamento das ampolas
Metodologias de preservação metabolicamente inativas:
Liquid-drying
• Preservação de mo sensíveis ao estágio inicial de congelamento no processo de liofilização convencional.
• As culturas não são previamente congeladas e a dessecação ocorre a partir da fase líquida.
• Criopreservador submetido ao processo de liofilização convencional.
Metodologias de preservação metabolicamente inativas:
Liquid-drying
• Suspensão do microrganismo no mesmo criopreservador égotejada sobre o liófilo.
• Ampolas são novamente submetidas ao processo de lioflização
• O liófilo está apenas úmido com a suspensão do mo � não háborbulhamento (fervura) do material durante o vácuo.
Metodologias de preservação metabolicamente inativas:
Repiques periódicos:Vantagens: barato, não requer equipamentos especiais.
Desvantagens: mutações, contaminações, manutenção
frequente, espaço.
Óleo mineral: Repiques menos frequentes, menor taxa de
contaminação/mutações.
Metodologias de preservação Metabolicamente ativas:
“Skim Milk”: mais utilizado para liofilização, baixo custo, boa recuperação.
Carbohidratos: bastante utilizados, necessitam meio de cultura, resultados variáveis.
Soro e sangue: específicos para alguns mo; podem inibir alguns mo.
DMSO: congelamento de céls., tóxico p/alguns mo.
Glicerol: procedimento simples, método de congelamento mais utilizado.
Criopreservadores
Dois tipos básicos
Proteção intra-celular:
glicerol e DMSO ���� congelamento -20 a -196ºC
Proteção extra-celular:
“Skim Milk”, glicose, lactose, manitol, sacarose,
sorbitol, inositol, (apenas liofilização)
Criopreservadores
Congelamento: gêlo � dano à célula � congelamento do soluto (mistura eutética) � temperatura eutética (Ex.: NaCl = -21.8° C)
Criopreservador: componente não-iônico � substituição da água reduzindo o aumento da concentração iônica. Ex. glicerol, DMSO.
Criopreservadores
Criopreservação
Preparo do criopreservador
• Sol. aquosa a 5% � DMSO
• Sol. aquosa a 10% - 20% � glicerol
Congelamento
• Ressuspender o crescimento no criopreservador
• Congelar segundo metodologia específica.
CriopreservaçãoNitrogênio Líquido
1. Crescimento fase log em meio líquido
2. Criotubo de poliestireno com ou sem pérolas de vidro/plástico
3. Transferir a cultura para 100-200µl de meio líquido + glicerol estéril [C] final de 15-20%
• Células � Congelar a 1-2ºC/min ou -20ºC-70ºC/30´
• Microrganismos � Colocar em -70ºC/1 hora
• Imergir as ampolas na fase líquida do LN2
PRESERVAÇÃO DE ANAERÓBIOS
Manter a atmosfera anaeróbica das ampolas ou criotubos “lavando” com mistura de N2/CO2
Selar as ampolas ou criotubos com a mistura gasosa apropriada para o gênero.
Utilizar criopreservador reduzido
CRIOPRESERVAÇÃO
Considerações finais
• Durante o congelamento, quanto maior a temperatura, maior o tamanho dos cristais de gelo formados.
• Cristais de gelo grandes em temperaturas próximas de zero, causam maiores danos.
• Mesmo após congelamento perfeito, a recristalização do gelo (a partir de –120C), pode causar danos à célula (thawing damage).
• O descongelamento rápido evita a recristalização e diminui o tempo de contato de grandes cristais com estruturas celulares.
• Microrganismos Gram positivos são mais resistentes pela presença de peptideoglicana na parede.
Escolha do método de preservação
• Manutenção da viabilidade
• Frequência de mutações
• Pureza
• Custo de manutenção
• Número de culturas/espaço
• Valor das culturas
• Fornecimento e transporte
• Frequência de uso
• Disponibilidade de Recursos
Vida média de alguns gêneros bacterianos preservados por diferentes métodos
Gênero Repiquesa Óleo mineral -70C LN2 Liofilização(meses) (anos) (anos) (anos) (anos)
Acetobacter 1-2 1 1-3 >40 >40
Achromobacter 1 1-2 1-3 >40 >40
Agrobacterium 1-2 1-2 -- >40 >40
Bacillus 2-12 1 2-3 >40 >40
Erwinia 1-4 1-2 -- >40 >40
Gluconobacter 1 -- -- >40 >40
Lactobacillus 1 semana -- -- >40 >40
Methanobacteriuma 1 -- -- >40 5
Methanomonasa 1 -- -- >40 5
Xanthomonas -- -- 1-2 >40 >40
aDepende do meio utilizado e da espécie.(adapatado de Murray, 1994)
Teste acelerado de viabilidade após preservação
A viabilidade de mo preservados por liofilização ou L-drying é
diretamente afetada pela temperatura durante a estocagem.
Ex.: 8 anos a 5°C = 2 semanas a 37°C.
log St = log S0 – (logS0 – logSac) . t/8
Onde: St = viabilidade após t anos a 5°C
S0 = viabiliadade imediatamente após liofilização/L-drying
Sac = viabilidade após estoque a 37°C por 2 semanas
Sendo: S0 = 107 UFC/ml, Sac = 105 UFC/ml e t = 8 anos
Temos: St = 7 – (7 – 5) 8/8 � St = 7-2 � St = 105 UFC/ml
Teste acelerado de viabilidade após preservação
O tempo no qual os mo perdem totalmente sua viabilidade
durante a preservação a 5°C pode ser calculado por:
t = 8 . log S0 / (logS0 – logSac)
Onde: t = anos necessários p/perda total da viabilidade
S0 = viabiliadade imediatamente após liofilização/L-drying
Sac = viabilidade após estoque a 37°C por 2 semanas
Sendo: S0 = 108 UFC/ml e Sac = 105 UFC/ml
Temos: t = 8.8 / (8 – 5) � t = 64 / 3 � t = 21 anos e 3 meses
TESTES PRÉ E PÓS-LIOFILIZAÇÃO
• Viabilidade (pré e pós):Diluições seriadas ou alça calibrada
• Pureza (pré e pós):Meio rico / 37°C / aerobioseIsoenzimas
• Identidade (pré e pós):Provas bioquímicasPCR-16SPCR genes funcionais específicosRAPD-PCR, Pulse-field
• Umidade (pós):Carl Fisher
• Vácuo (pós):Spart Tester
Freeze-drying and cryopreservation of bacteria.(Perry, S.F. Molecular Biotechnology, 9:59-64, 1998)
• Congelamento e liofilização são os métodos mais usados para a conservação de microrganismos.
• Nenhum método é capaz de alcançar uma taxa de recuperação de 100%.
• Se a preservação de 100% das células for imprescindível, aconselha-se utilizar os dois métodos em paralelo.
• Na temperatura alcançada pelo Nitrogênio líquido (-160 a -190 C), a viabilidade celular não tem praticamente nenhuma relação com o período de armazenamento, e os sistemas biológicos estão geneticamente estáveis.
Freeze-drying and cryopreservation of bacteria. (Perry, S.F. Molecular Biotechnology, 9:59-64, 1998)
• A criopreservação a -60/-80C, permite boa recuperação e pode ser usado quando não houver disponibilidade de N2 líq., onde uma pequena perda da viabilidade étolerada.
• De um modo geral temperaturas acima de -30 C não apresentam bons resultados devido à formação de misturas eutéticas.
• O método das contas ou pérolas de vidro, é aconselhado para diminuir espaço e evitar os constantes descongelamentos das amostras.
� Criada em 1983 ���� 1a cultura: Bacillus subtilis INCQS 00001 (ATCC 6633) lote 1083001
� Coleção de Referência Nacional (Farmacopéia brasileira)
� 1989 ���� inscrita na World Federation of Culture Collection (WFCC), INCQS-WDCM 575.
� 2008 ���� Credenciamento - fiel depositário
HISTÓRICO
� 2009 – ANVISA deposita cepa Mycobacterium massiliense
INCQS 00594
“Ensaio de avaliação da atividade micobactericida de desinfetantes hospitalares para artigos semi-críticos”RDC no. 75 de 23/10/08.
HISTÓRICO
4. Direitos de distribuição (marcar apenas uma opção)
� O depositante transfere os direitos de propriedade da cepa para
o INCQS.
� O depositante não transfere os direitos de propriedade da cepa
para o INCQS, mas permite sua distribuição irrestrita.
� O depositante não transfere os direitos de propriedade da cepa
para o INCQS, mas permite sua distribuição restrita somente às
instituições designadas pelo depositante.
� O depositante não transfere os direitos de propriedade da cepa
para o INCQS, e não permite sua distribuição.
Depósito
� Aplicações: controle microbiológico de produtos farmacêuticos, vacinas, medicamentos, referências para pesquisa, etc.
� Serviços: preservação, fornecimento, identificação fenotípica/molecular, depósito, consultorias, etc.
� INCQS ���� Sistema de Gestão da QualidadeNorma ABNT NBR ISO/IEC 17025 - 2004
CARACTERÍSTICAS
69,30%3,80%
3,20%
2,20%
2,00%
19,50%ATCCCCTDSMZCDCNCTCOthers*
Origem das linhagens
*Outros: (FDA, NIH, CIP, CCUG, SSI, UFRJ, UERJ, UFF, UFPE, LFB, IAL, etc.)
ACERVO� Bacterias
– 630 linhagens (69 gêneros)
� Fungos– 277 linhagens (36 gêneros)
� Archaea– 29 linhagens (19 gêneros)
� TOTAL = 936 cepas de referência
SEGURANÇA E BIOSSEGURANÇA
� Segurança do acervo/dados– Acesso físico– Sistema de memória– Serviço de Informática centralizado ����Backup diário
� Envio de amostras – Normas internacionais - IATA
� Biossegurança– 99% ���� NB-2– NB-3 ���� mantidas em condições NB-3
� Bacterias:� Criopreservação ���� 5% do acervo, backup
� -70°C, N2 líquido� Liofilização ���� 95% do acervo
� Fungos e leveduras:� Repiques periódicos� Óleo mineral� Criopreservação ���� 5% do acervo, backup
� -70°C, N2 líquido� Liofilização ���� 95% do acervo
� Archaea:� Liquid-Drying (L-Drying) ���� 90% do acervo� Cultura ativa ���� 10% do acervo� Criopreservação ���� backup
Métodos de preservação
Fornecimento de microrganismos
Depto. Microbiologia - Lab. Microrganismos de Referência09*=até set/2009
16 119187
259317
476
719
434
918
789
670
468
692
570
721
10101097
895 886
11641110 1148
1332
1003901
1314
1013
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02 03 04 05 06 07 08 09*
Solicitações Ampolas fornecidas
Controle da Qualidade
• Vácuo ���� Spart Tester
• Umidade ���� Carl Fisher
• Viabilidade
• Pureza
• Identidade
• Métodos convencionais
• Métodos moleculares
• 16S, tDNA-PCR, PCR genes funcionais,
ERIC-PCR, RAPD, etc.
� Linhas de pesquisa vinculadas às atividades da coleção� Epidemiologia molecular de isolados clínicos
� Desenvolvimento de métodos rápidos de Diagnóstico molecular
� Taxonomia e Filogenia molecular de isolados clínicos e ambientais
� Diversidade Molecular Ambiental – recursos hídricos, solo, sedimentos
� Isolamento e descrição de novas espécies e/ou gêneros de isolados brasileiros
� Micorremediação
� Treinamento (externo e interno) da equipe para as atividades da coleção � ABNT NBR ISO/IEC 17025:2005
� Normas de Biossegurança
� Treinamento em centros nacionais e internacionais
Pesquisa e Treinamento
Coleção de Microrganismos de Referência Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZ
Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde – INCQS Av. Brasil, 4365 – Manguinhos
Rio de Janeiro – RJ21045-900
Tel.: 21-3865-5236FAX: 21-2290-0915
Ivano de Filippis [email protected]