Seleção genômica para resistência ao carrapato bovino nas raças Braford e Hereford
Fernando F. Cardoso, Méd. Vet., PhD
Workshop Internacional de Seleção Genômica em Bovinos de Corte
Porto Alegre, 09 de agosto de 2012
Sumário Introdução
Carrapato Projeto Embrapa/Conexão Delta G/Gensys
Estudo de desequilíbrio de ligação Conceito de r2 DL no Braford e Hereford Persistência de fase
Seleção genômica usando a metodologia de um passo Conceitos Estimação e predição no Braford e Hereford
Possíveis aplicações e benefícios dos resultados
O Carrapato bovino
Ácaros hematófago obrigatório
Distribuído por todo território nacional
Uma dos maiores causadores das perdas produtivas de bovinos no Brasil e no mundo US$ 2 bilhões/ano no Brasil
(GRISI et al., 2002).
Principais perdas com carrapato
Altos gastos com insumos Presença de resíduos na carne Resistência do parasito aos acaricidas
Transmissão dos agentes causadores da tristeza parasitária (TPB)
Atinge 40% das propriedades do RS com 5,7 bovinos mortos/ano (ANDRADE et al., 2007)
Desgaste do animal pelo hematofagismo Perda na reprodução, crescimento,
produção de leite, etc.
Desvalorização do couro
Uma limitação associada ao carrapato
Cruzamentos com raças britânicas e seus sintéticos na região tropical -> melhorar rapidamente a precocidade e qualidade da carne de populações zebuínas
Viabilidade em larga escala limitada pela maior susceptibilidade das raças britânicas ao carrapato
X
A boa notícia!
Existe variabilidade genética para resistência ao carrapato
Oliveira et al., 1989; Gomes, 1992; Frisch, 1999; Burrow, 2001
Potencial para o melhoramento dessa característica nos bovinos
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
-3 -2 -1 0 1 2 3
Genetic value
Culled
Selected
Threshold
Rota para seleção
Conhecimento do grau de resistência genética dos indivíduos dentro de uma mesma raça ou população
Requisitos da genética quantitativa Bons fenótipos (Contagem de carrapatos)
Informação de pedigree
Parâmetros genéticos (herdabilidade e correlações genéticas)
Ajuda da genética molecular (Seleção assistida por marcadores e seleção genômica)
O que são os marcadores moleculares?
Segmentos do código genético (DNA) Com sequência e posição no genoma conhecidas Têm pelo menos duas formas (alelos) distintas
(polimorfismo) Ligados a genes funcionais
Resistência a doenças Desempenho em características produtivas e de
qualidade dos animais
SNP -Single Nucleotide Polymorphism
Mudança de uma única base na sequência genética de um indivíduo em comparação com um genoma de referência
3 milhões na genoma
Menor custo e mão-de-obra (automação)
Seleção Assistida por Marcadores (MAS) e Seleção Genômica (GS)
Uso de marcadores genéticos na seleção
Características de difícil mensuração, de carcaça e da carne, limitadas a um sexo, baixa herdabilidade
Redução do intervalo entre gerações
Pré-seleção de touros jovens para testes de progênie
Diferença:
MAS = poucos marcadores
GS = milhares de marcadores, cobertura genômica
Pelos menos um marcador ligado a cada gene que afeta a característica de interesse
Produtos no Mercado para MAS e GS
Algumas questões
Quantos genes/marcadores?
% explicado das diferenças genéticas?
Acurácia das predições?
A implementação de SAM deve ser precedida pela validação dos marcadores na população alvo, quanto a fase de ligação e efeito
Constatação
Não existem paineis de marcadores confiáveis disponíveis para seleção assistida por marcadores ou seleção genômica para resistência ao carrapato
Unindo forças...
Apoio: Fontes financiadoras: EMBRAPA e Conexão Delta G
Objetivo geral:
Desenvolver estratégias combinando ferramentas de genética quantitativa e molecular para seleção genômica de animais mais resistentes à infestação natural por carrapatos
2010/11 • Obtenção qualificada de fenótipos (Claudia Gulias)
2011/12
• Caracterização da variabilidade genética para resistência a carrapatos (F. Cardoso e V. Roso)
2011/12
• Descoberta de marcadores genéticos e seleção genômica (Alexandre Caetano)
2012/13
• Prospecção de genes por todo o genoma (Luciana Regitano)
Planos de ação do projeto
1) Obtenção qualificada de fenótipos para resistência a carrapatos
Protocolo para contagem de carrapatos em nível de fazenda
Capacitação dos técnicos da Conexão Delta G
Obtenção e remessa de amostras de sangue em cartão FTA
3.114 animais avaliados entre 2010 e 2011 8.011 contagens (2 a 3/animal)
2) Caracterização da variabilidade genética para resistência a carrapatos
Banco de dados de fenótipos e genealógicos
Determinação de parâmetros e valores genéticos
Identificar animais geneticamente extremos para descoberta de genes
Entrepernas Lateral do corpo
Número de animais
3.413 3.114
Herdabilidade 0,14 0,24
Correlações genéticas
Entrepernas -- 0,68
Peso ao nascer 0,09 0,03
Peso ao desmame -0,02 0,07
Peso ao sobreano -0,03 0,15
Biegelmeyer, 2012
3) Descoberta de marcadores genéticos e seleção genômica
Extração de DNA e genotipagem 2160 animais Safra 2010 (50K) e 40 touros-pais
(777K) 310 amostras para 50K e 25 para 800K
contratadas (Safra 2011/12, touros-pais)
Desenvolvimento do banco de genótipos Controle de qualidade dos genótipos
Restaram 2.131 (97%) amostras e 41.001 (75%) SNPs
Caracterização da ligação entre marcadores haplótipos e desequilíbrio de ligação
Estudos de seleção genômica (GS) e de associação por todo o genôma (GWAS)
Illumina BovineSNP50
BeadChip
Desequilíbrio de ligação
Haplótipo é um conjunto de alelos ligados em um cromossoma que tendem a ser herdados em conjunto
Desequilíbrio de ligação (LD) é a associação não aleatória de alelos em dois ou mais loci
A B
Q
a B
q
Conhecimento de LD permite:
Estimar a acurácia para predizer o genótipo de um lócus observando outro lócus
Delinear estudos de associação e esquemas de seleção genômica mais efetivos
Desequilíbrio de ligação
c) Q q f(B)
B 0.11 (0.098)
0.30 (0.312)
0.41
b 0.13 (0.142)
0.46 (0.448)
0.59
f(Q) 0.24 0.76 1.00
b) Q q f(A)
A 0.22 (0.077)
0.10 (0.243)
0.32
a 0.02 (0.163)
0.66 (0.517)
0.68
f(Q) 0.24 0.76 1.00
a)
Como quantificar LD?
A B
Q
Par de Loci A-Q em LD
Par de Loci B-Q em
equilíbrio de ligação (LE)
Steibel & Badke, 2011
r2 como medida de DL
B b
A
a
D
Desequilíbrio de ligação
c) Q q f(B)
B 0.11 (0.098)
0.30 (0.312)
0.41
b 0.13 (0.142)
0.46 (0.448)
0.59
f(Q) 0.24 0.76 1.00
b) Q q f(A)
A 0.22 (0.077)
0.10 (0.243)
0.32
a 0.02 (0.163)
0.66 (0.517)
0. 68
f(Q) 0.24 0.76 1.00
a) A B
Q
Par de Loci A-Q em LD
r2= 0.52
Par de Loci B-Q em LE
r2= 0.01
Steibel & Badke, 2011
Determinação da fase de ligação (estimar os haplótipos)
ID Marcador Genótipo
1 1 Aa
1 2 Bb
1 3 Cc
2 1 AA
2 2 bb
2 3 Cc
3 1 Aa
3 2 Bb
3 3 CC
A C b
a c B
A
C
b c
A
C
b
a
c
B
A b
LD(r2) x cromossoma
LD(r2) x distância entre marcadores
Conclusão: • Necessitamos milhares de marcadores (35.000-45.000) • Distância média (~60000bp)
Persistência de fase entre populações População 1 População 2
r 2 = 0,81
r = +0,90
r 2 = 0,81
r = -0,90
Qual a importância do sinal de r?
Indica se um marcador descoberto em uma população pode ser usado para seleção em outra
A B
Q
a B
q
A B
q
a B
Q
Persistência de fase x distância
Conclusão: • Podemos utilizar os resultados da raça Braford para selecionar bovinos Hereford em distâncias genômicas próximas
Estudos envolvendo marcadores SNP por todo o genôma
Seleção genômica (GS) Estimar os efeitos de marcadores
por todo o genoma e utilizar essa informação para determinar o valor genético genômico dos animais para a seleção
Prospecção de genes (GWAS) Examinar diferenças em genótipos
(marcadores ou genes) por todo o genoma e determinar a associação dessas diferenças com variações fenotípicas (resistência a doenças, produção, etc.)
1
G
i ij j i
j
y x g e
Seleção Genômica
Modelo conceitual: modelo infinitesimal (muitos genes
de efeitos pequenos)
1
G
i ij i
j
y Q e
Observado
1
ˆ ˆ
G
i ij j
j
u x gVGG: valor genético genômico
Efeito do marcador em
estudos de associação
DEPG=VGG/2
Comparação entre BLUP tradicional e GBLUP
2~ ( , )i i i uy u e N u 0 A
1
G
i ij j i
j
y x g e. .
2~ (0, )i i d
j gg N
X =
x11
- 2 p1
… x1G
- 2pG
xij
- 2pj
xp1
- 2 p1
… xpG
- 2 pG
é
ë
êêêê
ù
û
úúúú
; G = X ¢X k
2~ ( , )i i i uy u e N u 0 G
0,
` 1,
2,
ij
aa
x Aa
AA
Matriz de parentesco
genômico (marcadores)
Matriz de parentesco
tradicional (pedigree)
Combinado pedigree e marcadores
Nenhum alelo IBD
cov=0
Um alelo IBD
Cov=1/2V(u)
Ambos alelos IBD
Cov=V(u)
Touro Vaca
IBD=Idêntico
por descendência Steibel & Badke, 2011
Corrigindo pedigrees…
Conflito de genôtipo
com Touro 1
Touro 1 Vaca Touro 2
Touro 2 poderá ser
o pai correto
Estratégia: Avaliar o percentual de conflitos (p.ex. < 0,5%) usando
milhares de marcadores para corrigir pedigrees 66 conflitos detectados e 15 corrigidos no pedigree da Conexão
Considerações sobre a estimação de valores genéticos genômicos (VGG)
Nem todos os animais são genotipados Não é possível construir uma matriz de parentesco
genômico (G) com todos os animais
Informação fenotípica histórica
Informação de pedigree
Metodologia usada nas avaliações genéticas de gado leiteiro envolve várias etapas Múltiplas estimativas dos valores genéticos
combinadas por índices
Desde 2009 implementado na avaliação genética oficial na América do Norte (EUA e Canadá)
Seleção Genômica em Uma Etapa – ssGBLUP (p.ex. Aguilar et al., 2010)
Registros “Y”
BLUP
Valores genéticos
Pedigree SNPs
Aguilar, 2011
X'X X'Z
Z'X Z'Z +a H -1
é
ëêê
ù
ûúú
b
u
é
ëêê
ù
ûúú
=X'y
Z'y
é
ë
êê
ù
û
úú
Avaliação Tradicional BLUP
Avaliação Genômica em Uma Etapa
Parentesco baseado no pedigree (A) ajustado pelos desvios devido a informação genômica (AΔ) (Misztal et
al. 2009)
Implementação da seleção genômica em uma única etapa
X'X X'Z
Z'X Z'Z +a A-1
é
ëêê
ù
ûúú
b
u
é
ëêê
ù
ûúú
=X'y
Z'y
é
ë
êê
ù
û
úú
H = A+ A
ssGBLUP herdabilidade e correlação genética (incluindo marcadores)
0,29 0,34 Lateral do corpo
0,13 Entrepernas
Lateral do corpo
N=3.114
(8.011 contagens)
Entrepernas
N= 3.413 Região de
contagem
20% superior à
avaliação tradicional
Avaliação genômica de touros Hereford e Braford
Característica Média±dp1 Número de
registros2
Média±dp1
da DEPG
Contagem de
Carrapatos
36,3±45,2 8.004 0,00±1,00
Peso ao
Nascer (Kg)
32,8±5,3 109.566 0,32±1,11
Peso ao
Desmame (Kg)
178,3±33,5 112.832 1,61±3,38
Maternal
(Kg)
178,3±33,5 112.832 -0,39±2,10
PS
(Kg)
300,3±67,1 58.893 2,59±4,94
PE
(cm)
30,5±3,6 14.987 0,11±0,39
Touros Braford
1Contagens=Número de filhos do touro com contagem de carrapatos , 2Genótipos= Filhos que foram genotipados; 3Estimativa da DEPG acompanhada do percentil; 4Acurácia da DEPG; NA= Não Avaliado.
Outras características a serem avaliadas
Crescimento
Ganho de peso pré-desmama
Ganho de peso pós-desmama
Altura à desmama
Altura ao sobreano
Reprodutivas
Facilidade de parto
Idade ao primeiro parto
Dias para parir
Duração da gestação
Escores visuais à desmama e ao sobreano Conformação Precocidade Musculatura Tamanho Umbigo Pigmentação ocular Pelame Caracterização racial
Carcaça por ultrassonografia Área de olho de lombo Espessura de gordura
subcutânea
Estudo de validação cruzada
é uma sub-amostra de animaisk
1. Amostra dividida: ao acaso por GC (n>200) em 7
sub-conjuntos de Braford (1831 genótipos) e
1 de Hereford (262 genótipos)
2. ssGBLUP análises (7) eliminando dados fenotípicos: 1 dos subconjuntos Braford Hereford (sempre eliminado)
3. Predição dos valores genômicos dos animais com dados eliminados Marcadores + pedigree
4. Correlação entre VGGs preditos na análise eliminando os dados com os da análise completa
5. Acurácia de predição (Legarra et al., 2008)
1–BO n=295 5–BO n=238
2–BO n=256 6–BO n=274
3–BO n=311 7–BO n=261
4–BO n=204 8–HH n=262
1–BO n=295 5–BO n=238
2–BO n=256 6–BO n=274
3–BO n=311 7–BO n=261
4–BO n=204 8–HH n=262
1–BO n=295 8–HH n=262
ˆ ˆ,k k red k fullr u u
ˆ ,k k kk red mar y hu x β
Correlações e acurácias na validação cruzada - predição de animais sem dados
Raça
Correlações Acurácias
VGG Média pais
Ganho %
VGG Média pais
Ganho %
Braford 0,71 0,27 163% 0,49 0,13 277%
Hereford 0,60 0,36 66% 0,39 0,22 77%
Considerações: Correlações e acurácias mais baixas no Hereford
Nenhum animal da raça participou do conjunto de estimação dos efeitos (treinamento) dos marcadores
Vantagens extremamente superiores dos VGGs em relação a média dos pais no Braford Expressiva quantidade de filhos de RM ou pais sem outros registros (MP=0,0) 60% no Braford vs. 12% Hereford
Predições genômicas úteis para selecionar por resistência ao carrapato
Predição genômica - Braford
Predição pela média dos pais- Braford
Efeitos dos SNPs para resistência por todo o genoma (GWAS)
/ kG XX 1( ) g X XX u
Identificação de extremos de resistência
Experimento de expressão gênica Infestação artificial de extremos de DEP
0
20
40
60
80
100
120
AI 1 AI 2 AI 3 AI 4
Artificial infestation
Tic
k c
ou
nt
Susceptible
Resistant
Correlação entre contagem média de carrapatos e DEPs = 0.97
Modelo atual de seleção genômica em gado de corte
População referência
(treinamento)
•Fenótipos + genótipos
•Estimativa dos efeitos dos marcadores
População de validação
População de seleção
•População independente relacionada geneticamente com a população referência
•Fenótipos + genótipos
•Acurácia dos efeitos dos marcadores
•Seleção de reprodutores com base em genótipos e efeitos dos marcadores
Serviços de grandes empresas Genótipos não são repassados aos produtores, somente VGGs
População de treinamento estática Animais selecionados não retroalimentam o sistema a medida que tem fenótipos
Acurácias vão decrescendo com o tempo
Coletar amostras
• Sangue, sêmen ou pêlos para extração de DNA genômico
Genoti-pagem
• Enviar para um laboratório que faça o serviço nos chips da alta densidade (Illumina® BovineSNP50 ou Bovine
HD BeadChip ou Affymetrix® High-Density Bovine Chip)
DEPG
• Enviar genótipos e pedigree ao Laboratório de Bioinformática e Estatística Genômica da Embrapa Pecuária Sul para cálculo da DEPG
Seleção
• Utilizar DEPGs para identificar e selecionar animais Hereford e Braford mais resistentes ao carrapato
Como podemos aplicar a SG hoje?
Próximos passos
Prospecção de genes por todo o genoma Mapeamento comparativo e sequenciamento Expressão gênica (RNASeq)
Desenvolvimento de ferramentas aplicadas para a seleção nos rebanhos Ampliação das avaliações genômica de touros-
pais (mais animais genotipados)
Avaliação genômica de touros jovens
Painel de marcadores de baixo custo (9K)
Imputação 9K→50K→770K
Vantagens potenciais para os produtores
Aumento do ganho genético nos seus rebanhos pela seleção combinando DEP tradicional e predições genômicas
Permitem selecionar sem contagem de carrapatos
Formação de linhagem geneticamente resistente ao carrapato
Participação na Inovação Tecnológica
Agradecimentos
Conexão Delta G Sul Alvorada Caty Guatambu Pitangueira São Bento São Manuel Silêncio
Gensys Fernanda V. Brito Mario L. Piccoli Vanerlei M. Roso
Ignacio Aguilar, INIA Ignacy Misztal, UGA Juan Steibel, MSU
Embrapa (Rede Genômica Animal) Adriana Ibelli Alexandre R. Caetano Ândrea P. Reis Claudia C. G. Gomes Elizângela Guedes Luciana C. A. Regitano Marcos V. B. Silva Maurício M. Oliveira Michel E. B. Yamagishi Poliana F. Giachetto Patricia Biegelmeyer Roberto H. Higa Samuel R. Paiva
Muito obrigado! [email protected]
[email protected] Senha: cursogenomicapoa
Controle de qualidade dos genótipos
Amostras (67 descartes) Call rate<0,90
Heterozigocidade>3DP
Trocas de sexo
Amostras duplicadas
SNPs (13.550 descartes) Call rate<0,90,
MAF<0,03,
MGF<0,
HWE>4DP:
Cromossoma X
Restaram 2.093 (97%) amostras e 41.059 (75%) SNPs