Niterói
2/2016
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
ESCOLA DE ENGENHARIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA E DE PETRÓLEO
VICTOR DE MELLO SANTOS
WESLEY CANDIDO ALVES
“DESENVOLVIMENTO DE COMPÓSITOS A BASE DE
NANOCELULOSE IMPREGNADA EM NANOPARTÍCULAS DE
PRATA VISANDO SUA APLICAÇÃO EM BIOSSENSORES
ELETROQUÍMICOS”
Niterói
2/2016
VICTOR DE MELLO SANTOS
WESLEY CANDIDO ALVES
“DESENVOLVIMENTO DE COMPÓSITOS A BASE DE
NANOCELULOSE IMPREGNADA EM NANOPARTÍCULAS DE
PRATA VISANDO SUA APLICAÇÃO EM BIOSSENSORES
ELETROQUÍMICOS”
Projeto Final apresentado ao Curso de Graduação em Engenharia Química, oferecido pelo departamento de Engenharia Química e de Petróleo da Escola de Engenharia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Bacharel em Engenharia Química.
ORIENTADORA
Profa. Dra. Ninoska Isabel Bojorge Ramirez
Ficha Catalográfica elaborada pela Biblioteca da Escola de Engenharia e Instituto de Computação da UFF
S237 Santos, Victor de Mello
Desenvolvimento de compósitos a base de nanocelulose
impregnada em nanopartículas de prata visando sua aplicação em
biossensores eletroquímicos / Victor de Mello Santos, Wesley
Candido Alves. – Niterói, RJ : [s.n.], 2016.
60 f.
Trabalho (Conclusão de Curso) – Departamento de Engenharia
Química e de Petróleo – Universidade Federal Fluminense, 2016.
Orientador: Ninoska Isabel Bojorge Ramirez.
1. Biossensor. 2. Nanopartícula. 3. Prata. I. Alves, Wesley
Candido. II. Título.
CDD 572.36
RESUMO
As nanopartículas de prata (AgNPs) estão presentes em numerosas aplicações
tecnológicas. A síntese de nanopartículas de prata usando métodos químicos sustentáveis tem
atraído interesses significativos. Neste trabalho, uma nova proposta de utilização de AgNPs em
conjunto com nanocelulose comercial a fim de agregar vantagens na detecção do sinal a ser
medido é apresentada. A síntese é feita utilizando borohidreto de sódio como agente redutor e
é empregado a baixa temperatura na redução do precursor da prata (AgNO3) promovendo assim
uma melhor distribuição das nanopartículas em meio aquoso. Neste âmbito, o sal inorgânico
possui a função de evitar a aglomeração das nanopartículas e agregar maior estabilidade aos
íons Ag+. Os eletrodos base foram constituídos tendo como base o compósito Grafite/Epóxi
(GEC) 65/35% (p/p) e foram agregados com nanocompósitos de nanopartículas de Prata e
Nanocelulose. Estes foram testados por meio de voltametrias cíclicas em uma solução de
K4Fe(CN)6 10 mM, pH 7.0 a diferentes velocidades de varredura com a finalidade de detecção
do analíto de interesse. A incorporação dos nanomateriais aos eletrodos base GEC apresentaram
resultados significativos na condutividade do sensor garantindo sua aplicabilidade.
Palavras-Chave: Biossensor, Nanopartículas, Nanocelulose.
ABSTRACT
Silver nanoparticles (AgNPs) are present in numerous technological applications. The
synthesis of silver nanoparticles using sustainable chemical methods has attracted significant
interests. In this work, a new proposal to use AgNPs in conjunction with commercial
nanocellulose in order to add advantages in detecting the signal to be measured is presented.
The synthesis is made using sodium borohydride as the reducing agent and at low temperature
in reducing the silver precursor (AgNO3) thus promoting a better distribution of nanoparticles
in aqueous solution. In this context, the inorganic salt has the function of avoiding the
agglomeration of the nanoparticles and adding greater stability to the Ag+ ions. The base
electrodes were composed based on the graphite/epoxy (GEC) 65/35% (w/w) composite and
were aggregated with nanocomposites of silver and nanocellulose nanoparticles. These
electrodes were tested by cyclic voltammetry in a solution of 10mM K4Fe(CN)6, pH 7.0 at
different scanning rates for the purpose of detecting the analyte of interest. The incorporation
of the nanomaterials to the GEC base electrodes presented significant results in the conductivity
of the sensor, ensuring its applicability.
Key-Words: Biosensor, Nanoparticles, Nanocellulose.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura básica de um biosensor ............................................................................ 16
Figura 2: Representação da enzima glicose oxidase pelo modelo de fitas.............................. 21
Figura 3: Representação dos métodos de imobilização mais empregados. (A) Adsorção; (B)
Ligação covalente; (C) Aprisionamento; (D) Encapsulamento; (E) Ligação cruzada. ............ 23
Figura 4: Mecanismo de encapsulamento das AgNPs pelo Borohidreto de sódio .................. 26
Figura 5: Aglomeração de uma solução coloidal de nanopartículas de prata ao longo do tempo
.................................................................................................................................................. 27
Figura 6: Estruturas química básicas dos nanotubos de carbono: (a) planar (b) nanotubo de
carbono de simples parede (SWCNT) (c) nanotubos de paredes múltiplas (MWCNT) .......... 28
Figura 7: Estrutura química da celulose .................................................................................. 30
Figura 8: Esquema Eletroquímico da reação da Glicose Oxidase .......................................... 33
Figura 9: Representação esquemática de três a geração de biossensores (a) Primeira geração
(b) Segunda geração e (c) Terceira geração ............................................................................. 37
Figura 10: Etapas da síntese e incorporação das NP’sAg a mistura de Grafite/Epóxi............ 39
Figura 11: Eletrodo GEC. A) Montagem inicial com fio de cobre e tubo de teflon; B)
Incorporação do compósito no sensor com um excesso da mistura C) Aspecto final após cura e
polimento. ................................................................................................................................. 40
Figura 12: Espectros UV-Vis de AgNPs em tempos diferentes desde recentemente preparado
até cinco dias depois ................................................................................................................. 43
Figura 13: Voltamogramas cíclicos de sensor GEC em uma solução de K4Fe(CN)6, pH 7.0 a
diferentes velocidades de varredura (10, 30, 40, 75, 100 mV/s). ............................................. 44
Figura 14: Voltamogramas cíclicos obtidos com os eletrodos sem e com nanocelulose
impregnada com AgNPs em solução contendo K3[Fe(CN)6] 10mM em KCl 0,01M vs. Ag/AgCl
a velocidade de varredura de 100mV/s. ................................................................................... 45
Figura 15: Relação da corrente de pico anódico e catódico em função da raiz quadrada da
velocidade de varredura ............................................................................................................ 47
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Transdutores empregados em biossensores ................................................. 18
Tabela 2: Classificação das enzimas ........................................................................... 22
Tabela 3: História dos Biossensores de Glicose .......................................................... 34
Tabela 4: Análise EDX de solução de AgNPs ............................................................ 43
Tabela 5: Comparação entre as correntes de pico dos eletrodos sem e com a aplicação
Nanocelulose. ................................................................................................................ 46
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
Ag Prata
AgNP Nanopartícula de Prata
AuNP Nanopartícula de Ouro
CB Celulose Bacteriana
CLEA Crosslinking Enzyme Aggregates
CLEC Crosslinking Enzyme Crystals
CNTs Nanotubos de carbono
DDP Diferença de Potencial
Ep Potencial de pico
Epa Potencial de pico anódico
Epc Potencial de pico catódico
FAD Flavina Adenina Dinucleotídeo
FADH2 Dinucleótido de flavina e adenina
Fe(CN)6 Ferrocianeto de Potássio
GEC Grafite-Epóxi
GEC/AgNP Compósito Grafite Epóxi e Nanopartículas prata
GEC/Nafion/GOx Compósito Grafite Epóxi / Nafion e Enzima Glicose Oxidase
GEC/NC/AgNPs Compósito Grafite Epóxi / Nanocelulose e Nanopartículas de prata
GOx Glicose Oxidase
H2O2 Peroxido de Hidrogênio
Ipa Corrente de pico Anódico (A)
Ipc Corrente de pico Catódico (A)
IUPAC União Internacional de Química Pura e Aplicada
mV Milivolts
MWCNT Nanotubos de paredes múltiplas
N Número de elétrons
NC Nanocelulose
Nm Nanômetros
NP Nanopartícula
O2 Oxigênio
QCM Quartz-Crystal Microbalance
SWCNT Nanotubo de carbono de simples parede
ʋ Velocidade de varredura (V/s)
ΔEp Diferença de Potencial (V)
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO E OBJETIVOS ....................................................................................... 13
1.1. Introdução ...................................................................................................................... 13
1.2. Objetivo ......................................................................................................................... 15
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................................... 16
2.1. Biossensores ................................................................................................................... 16
2.2. Tipos de Biossensores .................................................................................................... 17
2.2.1. Calorimétricos ............................................................................................................. 18
2.2.2. Ópticos ........................................................................................................................ 18
2.2.3. Piezoelétricos .............................................................................................................. 19
2.2.4. Eletroquímicos ............................................................................................................ 19
2.2.4.1. Amperométricos ....................................................................................................... 19
2.2.4.2. Potenciométricos ...................................................................................................... 20
2.3. Bioreceptores ................................................................................................................. 20
2.3.1. Enzimas ....................................................................................................................... 21
2.3.2. Aplicação das enzimas aos biossensores .................................................................... 22
2.3.3. Métodos de imobilização de enzimas ......................................................................... 22
2.3.3.1. Imobilização por adsorção ....................................................................................... 23
2.3.3.2. Imobilização por ligação covalente ......................................................................... 23
2.3.3.3. Imobilização por aprisionamento ou encapsulamento ............................................. 24
2.3.3.4. Imobilização por ligação cruzada ............................................................................ 24
2.4. Nanomateriais aplicados aos biossensores .................................................................... 24
2.4.1. Nanopartículas metálicas ............................................................................................ 25
2.4.2. Nanotubos de carbono ................................................................................................ 28
2.4.3. Nanocelulose ............................................................................................................... 29
2.5. Métodos de controle glicêmico ...................................................................................... 32
2.5.1. Biossensores na medição do nível de glicose ............................................................. 33
2.6. Geração dos Biossensores .............................................................................................. 34
2.6.1. Biossensores de primeira geração ............................................................................... 34
2.6.2. Biossensores de segunda geração ............................................................................... 35
2.6.3. Biossensores de terceira geração ................................................................................ 36
3. METODOLOGIA ............................................................................................................. 38
3.1. Reagentes e Materiais .................................................................................................... 38
3.2. Síntese das nanopartículas de prata ............................................................................... 38
3.2.1. Impregnação de nanocelulose com nanopartículas de prata ....................................... 39
3.3. Confecção dos eletrodos ................................................................................................ 40
3.4. Caracterização das nanopartículas de prata ................................................................... 41
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 42
4.1. Caracterização da dispersão coloidal da solução de AgNPs .......................................... 42
4.1.1. Caracterização por espectrometria de absorção atômica ............................................ 42
4.1.2. Caracterização por espectrometria por energia dispersiva de raios X (EDX) ............ 43
4.2. Caracterização eletroquímica dos eletrodos de trabalho por voltametria cíclica ........... 44
4.2.1. Eletrodo grafite/epóxi com incorporação de nanopartículas de prata ......................... 44
4.2.2. Eletrodo grafite/epóxi/AgNps com incorporação de nanocelulose ............................ 44
5. CONCLUSÕES .................................................................................................................... 48
5.1. Perspectivas e Sugestões para Trabalhos Futuros .......................................................... 48
6. BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................. 49
13
1. INTRODUÇÃO E OBJETIVOS
Neste capítulo será abordado as razões nas quais motivaram o estudo da importância do
uso de biossensores na atualidade, mostrando as vantagens do uso de matérias nanoestruturados
para construção dos mesmos. Além disso, ressalta-se também a relevância do uso da
nanocelulose e a tecnologia de imobilização enzimática na construção de biossensores.
1.1. Introdução
Nos últimos anos, o desenvolvimento de materiais nanoestruturados tem sido alvo de
intenso estudo de muitos pesquisadores devido a sua enorme gama de aplicações em diversas
áreas, como biologia, medicina, agroindústria e outras (HARRIS E GRAFFAGNINI, 2007;
JOHNSTON, et al., 2005).
A nanotecnologia traz novas possibilidades para a construção de biossensores
auxiliando no desenvolvimento de sensores eletroquímicos. Estes novos materiais tornaram-se
muito interessantes porque as suas propriedades diferenciam das exibidas pelos seus
precursores (FILHO e FAGAN, 2007). Dessa maneira, obtém-se a otimização de propriedades
como: melhorias na capacidade de transferência de elétrons, biocompatibilidade, boa
estabilidade e a possibilidade de imobilização de enzimas aliadas a dimensões reduzidas
(GOPALAN, et al., 2009; WANG, et al., 2009). Diferentes tipos de nanocompósitos têm sido
sintetizados como matrizes para a imobilização de enzimas, tais como nanocompósitos
baseados em grafite, nanocompósitos à base de nanotubos, nanocompósitos à base de
nanopartículas metálicas e assim por diante (CUI, et al., 2008; KANG, et al., 2009; AJEET,
2010; VIMAL, 2015; WANG, et al., 2009).
A integração dos nanomateriais em dispositivos eletroquímicos oferece uma fácil
portabilidade aliado ao seu baixo custo, devido à facilidade de miniaturização tanto do material
quanto ao sistema de transdução. A síntese de nanopartículas de prata é empregada para ter um
melhor controle sobre o tamanho das partículas, distribuição, morfologia, pureza, quantidade e
qualidade (AHMAD, et al., 2007).
A tecnologia de imobilização enzimática tem desempenhado um papel importante neste
sentido, não só possibilita na fixação do componente para o transdutor, mas também favorece
a estabilizá-lo para reutilização. O material biológico pode ser imobilizado diretamente sobre o
transdutor ou em membranas, que podem ser subsequentemente montadas no transdutor
(GARCIA, 2010). A escolha do método de imobilização depende de muitos fatores, tais como
a natureza do elemento biológico, o tipo de transdutor utilizado, as propriedades físico-químicas
14
da substância a analisar e as condições de funcionamento do biossensor. Os reagentes
consumidos ou produtos formados podem ser detectados ou medidos através de transdutores.
A enzima álcool-oxidase é geralmente utilizada imobilizada para confecção dos biossensores
eletroquímicos, monitorando o consumo de O2 ou a produção de H2O2. Esta enzima oxida
álcoois de baixo peso molecular aos seus aldeídos correspondentes utilizando como receptor de
elétrons o oxigênio molecular (HERZENHAUT, 2013).
É bem conhecido que as propriedades dos nanomateriais dependem não só dos
propriedades dos seus componentes individuais, mas também das suas características
morfológicas e interfaciais resultantes da combinação de materiais distintos (SANCHEZ,
2010). Por conseguinte, a utilização de polímeros, tais como celulose, amido, alginato,
dextrano, carragenano e quitosano, entre outros, apresenta grande relevância não só devido à
sua natureza renovável e biodegradabilidade, mas também devido a uma grande variedade de
formulações que pode ser explorada dependendo da funcionalidade desejada (TRINDADE,
2011; BELGACEM, 2008).
A nanocelulose (NC) vem se destacando no mundo dos materiais e da nanotecnologia
devido sua propriedade química e mecânica. Em temperatura ambiente o material se apresenta
em forma de pasta espessa e é obtida através do processamento da polpa de madeira (SOUZA,
2014). Quando se está entrelaçada, a nanocelulose pode formar materiais porosos e
mecanicamente fortes, tais como papéis de nanocelulose, filmes ou aerogel. Estes materiais
porosos podem ser utilizados como substratos para a impregnação de uma gama de diferentes
nanomateriais (WEI, 2014). Além disso, na área de engenharia e meio ambiente a nanocelulose
tem demonstrado grande potencial de aplicação em sensores eletroquímicos melhorando suas
propriedades de condutividade elétrica, óptica e catalítica.
Neste trabalho, um compósito baseado em nanopartículas de prata impregnadas em
nanocelulose foi utilizado para fabricação do sensor eletroquímico devido às suas propriedades
únicas, tais como satisfatória biocompatibilidade, boa condutividade e extensa área de
superfície que foram adquiridas devido as nanopartículas de prata (AgNPs) e nanocelulose.
15
1.2. Objetivo
O objetivo deste estudo é apresentar um eletrodo-compósito a base de grafite e epóxi
baseado em nanopartículas de prata e nanocelulose comercial visando sua aplicação em
detecção de analitos de interesse.
16
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Neste Capítulo apresenta-se o estudo dos biossensores e suas aplicações. Também se
apresenta a aplicação da nanocelulose com base na literatura cientifica. Nele são apresentados
os conteúdos de apoio e referências da literatura para estudo, aplicação e elaboração das práticas
experimentais realizadas no laboratório.
2.1. Biossensores
Um biossensor é um dispositivo analítico utilizado para a detecção de um analito de
interesse, que combina um componente biológico com um detector físico-químico. Este é
composto por 3 componentes básicos:
Elemento sensor biológico
Transdutor
Dispositivo de processamento do sinal eletrônico
Diversos esforços e pesquisas na área científica e tecnológica têm sido feitas para obter
avanços nos campos da engenharia de biotecnologia, a fim de atender as necessidades exigidas,
seja pela complexidade de análise ou medição de por exemplo um analito numa solução e etc.
Entende-se, por biossensoriamento o processo segundo o qual emprega-se materiais de origem
biológica (enzimas, células, tecido animal ou vegetal, etc.) que combinado aos transdutores,
que são dispositivos que convertem o que foi aferido em um tipo de sinal elétrico mensurável,
sendo este proporcionalmente equivalente a magnitude ou frequência do analito alvo (FILHO,
1992; PATHAK, et al., 2007; WANG, 2000). Na figura 1 observa-se a estrutura básica de um
biossensor.
Figura 1: Estrutura básica de um biossensor.
Fonte: (CALIL e SILVA, 2011).
17
Os biossensores empregados nos processos de interação biológica podem também ser
subdivididos em duas grandes categorias de sensores: sistemas de medição direta e indireta.
Nos casos onde é feita diretamente, o biossensor se baseia numa medição direta de um
fenômeno físico que ocorre durante uma reação bioquímica na superfície do transdutor.
Enquanto que quando realizada indiretamente o biossensor necessita de um analito alvo, por
exemplo a enzima. A nível de escolha sobre qual utilizar, o primeiro é de utilização simples e
possui uma maior estabilidade ao passo, que o segundo é mais sensível, possui baixo custo e
tempo de operação simplificado, logo a opção por um ou outro acaba sendo dependente das
características do sistema que será empregado (MEHRVAR e ABDI, 2004; PATHAK, et al.,
2007; LIU, et al., 2009).
As exigências e condições impostas pelos diferentes tipos de processos e objetivos de
interesse no que se diz respeito as medições do analito, determinará qual o melhor sensor que
será utilizado (SCHULTZ, 2001).
2.2. Tipos de Biossensores
O emprego de cada tipo de biossensor depende do fenômeno ou características que se
deseja avaliar. Para cada amostra tem-se a combinação do material biológico a ser empregado
e o transmissor mais apropriado para tal (FILHO e CAPELATO, 1992). Contudo, cada tipo de
biossensor possui uma vantagem com relação aos demais, porém estudos comprovam que ainda
não se obteve um transmissor característico para cada analito de interesse (KAMPRFATH e
HINTSCHE, 2009).
Os biossensores podem ser classificados de acordo com o tipo de sistema em que este é
constituído, e o elemento de transmissão que é empregado e utilizado acoplado ao componente
biológico (MALHOTRA e TURNER, 2003; NAKAMURA e KARUBE, 2003). O emprego de
cada tipo de transdutor vai depender do tipo de material que se deseja avaliar. Devido a suas
características únicas como alta sensibilidade a variação da concentração do meio e facilidade
de operação no presente trabalho, optou-se pela utilização da técnica de potenciometria como
sistema de transdução. De uma maneira geral, esse tipo de técnica mede a diferença de potencial
(DDP) entre um eletrodo indicador e um de referência. No que se refere a alguns dos tipos de
transdutores na tabela 1 é apresentado os diferentes tipos de transdutores utilizados na
construção de biossensores e suas principais aplicações.
18
Tabela 1: Transdutores empregados em biossensores.
Fonte: (SILVA, 2011).
2.2.1. Calorimétricos
Reconhecidos no mercado como termistores (THÉVENOT, 2001). Estes baseiam-se
na detecção do calor que é produzido nos processos reacionais, seja uma mistura, ou ainda, uma
diluição de componentes (MELO, 2008). Entretanto, uma grande parcela do calor não é
quantificada, promovendo consequentemente a diminuição do grau de sensibilidade desse tipo
de biossensor (MALHOTRA e TURNER, 2003; NAKAMURA e KARUBE, 2003;
MEHRVAR e ABDI, 2004).
2.2.2. Ópticos
São biossensores baseados nas modificações de propriedades ópticas, onde é possível
quantificar a concentração do analito alvo por meio de alterações na luz observada ou emitida
em um sistema reacional, seja biológico ou químico (MALHOTRA e TURNER, 2003;
NAKAMURA e KARUBE, 2003). Nesses as propriedades que podem ser observadas são:
absorção, comprimento de onda, índice de refração, fluorescência, fosforescência e
refletividade. Quando comparados a outros tipos de biossensores, não necessitam de
constituintes ativos na biocamada e possuem um tempo de resposta mais curto (MALHOTRA
e TURNER, 2003; NAKAMURA e KARUBE, 2003; MEHRVAR e ABDI, 2004).
19
2.2.3. Piezoelétricos
Constitui-se em cobrir a superfície do biossensor com um componente biológico
(seletivo), que ao imergir o mesmo em um meio onde se encontra o analito alvo, a massa de
quartzo cresce, e de maneira equivalente a frequência das oscilações diminuem (MEHRVAR e
ABDI, 2004). Esse tipo de cristal possui uma aplicabilidade enorme em sistemas piezoelétricos
devido a sua sensibilidade de alteração de massa e alta faixa de frequência (106
ciclos/segundos). Motivados pela característica única de sensibilidade deste tipo de biossensor,
um tipo de sensor, Quartz-Crystal Microbalance (QCM), foi construído com o objetivo de
quantificar as quantidades menores de massa (nanogramas) no momento em que algo entra em
contato com o sensor e se adere ao mesmo (WANG, 2011).
2.2.4. Eletroquímicos
Consistem do elemento biológico, o qual reconhece o analito alvo e o eletrodo -
transdutor, que "traduz" o fenômeno do bio-reconhecimento em um sinal elétrico útil.
Constituem-se de uma classe que possuem como características: instrumentação de baixo custo,
sensíveis, confiáveis e com resposta rápida. Além disso, não se faz necessário realizar um
tratamento prévio para emprega-los e abrangem uma ampla faixa de concentração. O material
biológico tem a função de fazer o reconhecimento do substrato e o transdutor (traduzir o sinal
medido em algo mensurável). Estes, são amplamente empregados na área clínica, seja para
testes de monitoramento ou diagnósticos (GAUA, 2005; SANTOS, et al. 2016).
Os biossensores eletroquímicos podem ser de três tipos: potenciométrico,
condutométrico e amperométrico.
2.2.4.1. Amperométricos
Mensuram a corrente elétrica proveniente do processo oxidativo ou redutivo de
uma espécie eletroativa, comumente no ato de transferência dos elétrons entre o substrato e o
transdutor (THÉVENOT, 2001; WANG, 2008). Porém, operam por meio do processo difusivo
e por isso, tem como pontos negativos: apresentar uma parte reduzida, devido a saturação das
enzimas, um acréscimo de aumento dos potenciais que acarretam na oxidação de constituintes
afetando assim as correntes, que são influenciadas pela velocidade de difusão do substrato até
ao eletrodo. Mas estudos baseados nas limitações dos processos difusivos vêm sendo feitos, de
modo a garantir que a concentração do analito permaneça em níveis mais baixos de saturação
da enzima (PEREZ, 2000).
20
2.2.4.2. Potenciométricos
Medem a diferença de potencial (DDP) entre um eletrodo indicador e um de
referência ou ainda, entre dois de referência isolados por uma membrana permeável, onde é
inexistente a presença de corrente (THÉVENOT, 2001). Dentre os biossensores
potenciométricos, os de íon-seletivo vem sendo muito empregados na detecção de íons de
natureza orgânica e inorgânica em análises ambientais, clínicas e até mesmo industriais
(BRATOV, et al., 2010).
2.2.4.3. Condutimétricos
O transdutor condutimétrico mede a mudança na condutância entre um par de
eletrodos metálico como consequência de um componente biológico. Dificilmente empregadas,
mas quando utilizado possibilita aferir a alterações de condutância existente, pela utilização da
enzima (de ação catalítica), que pode consumir ou produzir constituintes iônicos modificando
assim o número de cargas do eletrólito (MELO, 2008; WANG, 2008). Esse tipo de biossensor
não exige o uso de eletrodos de referência. O sinal obtido neste caso, depende significamente
da temperatura, logo impossibilitam de serem estáveis e as amostras analisadas jamais devem
ser diluídas (GERARD, et al., 2002).
2.3. Bioreceptores
A biocamada que constitui os biossensores inclui o bioreceptor ou material biológico de
alta seletividade, permitindo diferenciar em alguns casos, isómeros de uma molécula. Existem
diferentes tipos de bioreceptores que se podem imobilizar sobre os transdutores, tais como:
anticorpos, ácidos nucleicos, microorganismos, tecidos orgânicos, e enzimas.
Dentre as opções, quanto ao uso do elemento de reconhecimento biológico destacam-se
as enzimas. A aplicabilidade prática dos biossensores enzimáticos permitem que alterem não
apenas o grau de especificidade, mas também, o tempo de resposta frente ao analito (KARIM
e FAKHRUDDIN, 2012). A utilização das enzimas pode por um lado acarretar pontos não
vantajosos no processo de obtenção do biossensor, pois não são muito estáveis quando
submetidas a variações físico-químicas, porém esse ponto pode ser contornado ajustando por
exemplo a temperatura, pressão ou pH do meio em que a reação ocorre (MELO, 2008).
Sendo as mais utilizadas na produção de biossensores devido à sua disponibilidade no
mercado e fácil manipulação no seguinte item se descreverá com mais detalhe o referido
bioreceptor.
21
2.3.1. Enzimas
As enzimas são proteínas que tem a capacidade de poderem ser utilizadas como agentes
catalisadores em reações, como por exemplo as biológicas (FILHO e CAPELATO, 1992). A
aplicabilidade desta no processo de catálise se deve ao fato de essas possuírem alta
especificidade e seletividade (NELSON e COX, 2002). A figura 2 apresenta uma representação
ilustrativa da enzima glicose oxidase (GOx) pelo método de fitas.
Figura 2: Representação da enzima glicose oxidase pelo método de fitas.
Fonte: (PROTEIN DATA BANK, 2016).
As enzimas podem ser classificadas por uma diversidade de modos, contudo o mais
comum e de maior importância dentre eles é o estabelecido pela IUPAC (MARQUES, 2012).
Neste caso, as enzimas podem ser classificadas de acordo com a classe e o tipo de reação que
essas promovem (COPELAND, 2000). Na tabela 2, pode-se observar as classificações das
enzimas e o tipo de reação associada.
22
Tabela 2: Classificação das enzimas.
Fonte: (COPELAND, 2000).
2.3.2. Aplicação das enzimas aos biossensores
As enzimas têm sido vastamente empregadas em biossensores, onde essas atuam
como meio de identificação, devido as suas características catalíticas e elevada especificidade.
A aplicabilidade prática dos biossensores enzimáticos permitem que alterem não apenas o grau
de especificidade, mas também o tempo de resposta frente ao analito (KARIM e
FAKHRUDDIN, 2012). A utilização das enzimas, pode por um lado acarretar pontos não
vantajosos no processo de obtenção do biossensor, pois não são muito estáveis quando
submetidas a variações físico-químicas, porém esse ponto pode ser contornado ajustando por
exemplo a temperatura, pressão ou pH do meio em que a reação ocorre (MELO, 2008).
2.3.3. Métodos de imobilização de enzimas
Um outro ponto de interesse a considerar ainda na primeira etapa da elaboração de
um biossensor baseado em enzimas é a imobilização desta molécula em uma matriz capaz de
garantir totalmente ou em parte as características da enzima. Contudo, desafios que dizem
respeito a uma melhor imobilização com a finalidade de obtenção de filmes mais concentrados
por tempos maiores, consistem em efetuar a deposição em uma matriz constituída de moléculas
que promovam uma resposta mais rápida e de sinal que pode ser medido (NOBRE, et al., 2010).
A imobilização enzimática pode ser feita fisicamente, onde neste caso há uma interação entre
o suporte utilizado e a enzima empregada para tal, e também pode ocorrer quimicamente, onde
23
há presença de ligações covalentes entre eles (CARVALHO, et al., 2006). Na presente figura
3, exemplifica-se alguns tipos dos métodos de imobilização de enzimas.
Figura 3: Representação dos métodos de imobilização de enzimas mais empregados. (A)
Adsorção; (B) Ligação covalente; (C) Aprisionamento; (D) Encapsulamento; (E) Ligação
cruzada.
Fonte: (SCHÖFFER, 2013).
2.3.3.1. Imobilização por adsorção
Neste caso, a enzima é adsorvida por forças de interações fracas (interação
eletrostática, força de Van der Waals ou ligação de hidrogênio). Dentre os métodos existentes
este se enquadra entre os mais simples, de baixo custo e não há necessidade de realização de
pré-tratamento, porém a enzima pode acabar sendo dessorvida se estiver sendo empregada em
meios aquosos
2.3.3.2. Imobilização por ligação covalente
Dentre os métodos de imobilização este apresenta um grau de complexidade maior,
devido a necessidade de ativar previamente ou realizar um impedimento de grupos reativos pós-
imobilização (GALASIS, 2011). O emprego e a utilização do método garantem que a enzima
fique fixa e impede que migre para o meio facilmente, evitando com isso a contaminação do
produto de interesse. O aumento do número das ligações covalentes das enzimas diminui a
24
desnaturação da proteína e vibrações térmicas, contudo a alteração química promove uma
diminuição do grau de atividade das enzimas (CAO, 2005).
2.3.3.3. Imobilização por aprisionamento ou encapsulamento
Neste método de imobilização os suportes empregados possuem a função de
aprisionar ou até mesmo encapsular a enzima, contudo existem algumas restrições quanto aos
tamanhos dos poros desses que devem permitir a difusão do substrato utilizado sem maiores
dificuldades garantindo ainda que a enzima permaneça fixa. Uma das maiores dificuldades para
este caso, está na utilização de substratos com tamanhos maiores e a alta instabilidade dos
suportes, que limitam seu uso em espaços de tempo maiores (CARVALHO, et al., 2006).
2.3.3.4. Imobilização por ligação cruzada
Consiste em utilizar suportes ou emprega-se o uso de biocatalisadores interligados
na imobilização das enzimas que oferecem vantagens como: baixo custo de produção, alta
estabilidade e nível de atividade alto (SHELDON, 2007). No referido método, as enzimas
quando imobilizadas sem suporte utilizam-se cristais de enzimas reticulados (CLEC) ou os
chamados cristais de agregados (CLEA) nos casos onde se emprega a CLEC a enzima pura, é
cristalizada e em seguida é feita a adição do agente químico (permite a formação das ligações
cruzadas) com a finalidade de realizar a reticulação química e quando se faz o uso da CLEA
essa reticulação é realizada após o processo de junção das enzimas (CAO, 2005).
2.4. Nanomateriais aplicados aos biossensores
A nanotecnologia é uma ciência multidisciplinar que envolve o desenvolvimento e
preparação de sistemas com um tamanho na escala dos nanômetros (LANE, 2011). É um ramo
que compreende a utilização de partículas pequenas com um tamanho entre 1-1000 nm e que
explora novas propriedades da matéria a uma nanoescala (NASIR, 2010). Atualmente a ciência
de materiais atingiu um alto nível de sofisticação. Isso é resultado de um progresso contínuo da
síntese, funcionalização e manipulação em escalas micro e nano. A maioria dos materiais exibe
propriedades diferenciadas quando diminuídos para a escala nanométrica, que não podem ser
extrapoladas como comportamento do material bulk. No entanto, a nanotecnologia não é
somente a miniaturização das escalas. Em geral, nanotecnologia pode ser entendida como o
design, a fabricação e aplicação de nanoestruturas e nanomateriais. Engloba materiais e
sistemas cujas estruturas e componentes exibem novas e grandes melhorias nas propriedades
físicas, químicas e biológicas devidas ao seu tamanho (SMART e MOORE, 2005). Materiais
25
nanoestruturados podem ter diferentes morfologias e incluem nanopartículas esféricas,
nanobastões, nanofios, filmes finos e materiais bulk constituídos de nanoestruturas, em meio a
estes as nanopartículas metálicas, devido ao fácil controle de suas propriedades como tamanho
e qualidade são mais amplamente empregadas em sensores.
Os nanomateriais têm demonstrado as suas propriedades para aplicações em
biossensoriamento. O uso inteligente dos nano-objetos levou a atingir desempenhos com
maiores sensibilidades e redução dos valores de limites de detecção. Uma vantagem geral do
uso de nanomateriais é uma elevada área de superfície específica, permitindo assim a
imobilização de uma quantidade maior de bioreceptores. No entanto, um dos desafios
constantes é a estratégia de imobilização utilizada para conjugar o bio-receptor e os
nanomateriais. Além do mais, a técnica usada para a imobilização da enzima é um dos fatores-
chave no desenvolvimento e confiabilidade do biossensor (HOLZINGER, et al., 2014).
2.4.1. Nanopartículas metálicas
Na era da nanotecnologia, as nanopartículas (NPs) de metais nobre têm desempenhado
um papel importante no desenvolvimento de novos biossensores e no aprimoramento das
existentes técnicas biossensoriamento para atender a demanda de diagnósticos mais específicos
e altamente sensíveis. De fato, as NPs são em geral, uma das abordagens mais comuns na
nanotecnologia no desenvolvimento de biossensores, devido a sua simplicidade, maleabilidade
e elevada área de superfície (AZZAZY, 2009). As NPs podem medir entre 1 a 100 nm de
diâmetro, têm formas diferentes e podem ser compostas de um ou mais compostos inorgânicos,
tais como metais nobre, metais pesados, ferro e etc (WANG, et al., 2009).
Nanopartículas metálicas possuem aplicações em muitas áreas, incluindo biomédica,
ciência dos materiais e catálise, sua incorporação pode efetivamente melhorar as propriedades
elétricas, ópticas e dielétricas dos compósitos, elas atuam como condutores entre o grafite
resultando em um aumento da condutância elétrica do compósito (BÜHLMANN, 2008).
Numerosas técnicas têm sido desenvolvidas para sintetizar NPs metálicas, incluindo
métodos químicos (por exemplo, redução química, redução fotoquímica, co-precipitação,
decomposição térmica, hidrólise, etc.) e métodos físicos (por exemplo, deposição de vapor,
ablação por laser, moagem e etc), no qual o objetivo principal é a obtenção de NPs com um
bom nível de homogeneidade e proporcionar um bom controle sobre propriedades como:
tamanho, forma e área de superfície (SPERLING e PARAK, 2010).
A síntese de nanopartículas por métodos de redução químicos são muitas vezes
executadas na presença de estabilizadores, de modo a evitar a aglomeração indesejada da
26
solução coloidal de nanopartículas. A maioria das aplicações de biossensoriamento baseados
em NPs que têm sido desenvolvidos até agora baseiam-se na NPs de ouro, devido às suas
propriedades ópticas únicas e facilidade de derivatização com diferentes biomarcadores em
solução aquosa (SPERLING, et al., 2008). Geralmente, o método de escolha para sintetizar NPs
de prata esféricas é o método primeiramente desenvolvido por Turkevich (1951) no qual há
redução química de íons de Ag+ em Ag0 utilizando borohidreto de sódio como agente redutor e
esta última otimizado por Frens (1973) (GONÇALO, et al., 2012). Nessa abordagem, como
mostrado na Figura 4 o borohidreto de sódio atua tanto como agente de redução como agente
encapsulante, então na medida em que se forma as NPs de prata, elas são impedidas de
formarem partículas maiores e, simultaneamente, conferindo-lhes uma estabilidade média,
devido à repulsão eletrostática entre as NPs de prata cobertas do íon BH4- (WILCOXON e
ABRAMS, 2006).
Figura 4: Mecanismo de encapsulamento das AgNPs pelo borohidreto de sódio.
Fonte: (AGNIHOTRIA e MUKHERJI, 2014).
Modificações recentes do método de Turkevich permitiram uma melhor distribuição e
controle sobre o tamanho das nanopartículas de ouro, onde uma grande quantidade entre 9-120
nm pode ser alcançada apenas pela variação da razão citrato/Au (DANIEL e ASTRUC, 2004;
KIMLING, et al., 2006; TRÉGUER-DELAPIERRE, et al., 2008).
As nanopartículas de prata (AgNPs) tem sido amplamente estudadas e aplicadas devido
às suas propriedades únicas (como propriedades ópticas, elétricas e magnéticas) que podem ser
incorporadas em aplicações antimicrobianas, fibras compostas, materiais supercondutores
criogênicos, produtos cosméticos, componentes eletrônicos e materiais para biossensores
(SANTOS, et al., 2016).
27
Assim como na síntese de AuNPs o método mais comum empregado na obtenção de
AgNPs é também o método de Turkevich, que é baseado numa reação de oxi-redução entre o
citrato e o sal metálico. Trata-se de uma maneira simples, rápida, de baixo custo, reprodutível
e segura de sintetizar NPs com dimensões, aproximadamente 20 nm, que são responsáveis pela
alta atividade cinética proporcionando uma maior interação com o substrato (TURKEVICH, et
al., 1951).
O espectro de absorção da solução coloidal de AgNPs, exibe uma banda de absorção
em aproximadamente 400 nm, apresentando uma cor amarelo ouro que é característica das
AgNPs. A medida em acontece a aglomeração das nanopartículas o espectro da solução coloidal
muda como mostrados na Figura 5. Tais bandas são propriedades físicas dessas nanopartículas.
Quando um campo eletromagnético externo, como a luz por exemplo é aplicado a um metal, os
elétrons de condução se movem em conjunto, de modo a alterar a distribuição eletrônica
perturbado que é conhecido como plasma localizada perto da superfície do metal.
Figura 5: Aglomeração de uma solução coloidal de nanopartículas de prata ao longo do
tempo.
Fonte: (MULFINGER, 2007).
A confecção de eletrodos quimicamente modificados com as AgNPs vem
aumentando. Uma vez que a prata é quatro vezes mais econômica que o ouro, demonstra
excelente atividade catalítica, boa condutividade elétrica e térmica, sua aplicação em
eletroanálises é muito favorável atuando como pré-concentradores de espécies de interesse e/ou
mediando reações redox (OLIVEIRA, 2012).
28
2.4.2. Nanotubos de carbono
Durante vários séculos, os materiais mais conhecidos formados por carbono eram o
diamante e o grafite. Em 1985, os cientistas descobriram que os átomos de carbono também
podiam se organizar no espaço de forma oval, como os fulerenos (TANG, et al., 2006). As
pesquisas científicas envolvendo estruturas baseadas em carbono puro cresceram após a
descoberta dos fulerenos, o que ocasionou um maior interesse de estudo nessas estruturas,
levando à descoberta de uma série de novas formas, como os nanotubos de carbono (CNTs), os
quais foram obtidos por Lijima em 1991 como subproduto na síntese de fulerenos (SOUZA,
2007). Desde então houve uma crescente busca pelos pesquisadores para elucidar o uso do
nanomaterial em distintos dispositivos.
A estrutura química dos nanotubos de carbono é formada por uma folha de grafeno
enrolada (que consiste em átomos de carbono que constituem uma estrutura bidimensional com
hibridização sp2), ligados em hexágonos como pode ser observado na figura 6, cujo
empilhamento resulta na estrutura do grafite, em dimensões nanométricas, formando uma
cavidade interna oca (AWASTHI, et al., 2005). Na figura 6, tem-se exemplificado as estruturas
químicas básicas dos nanotubos de carbono.
Figura 6: Estruturas químicas básicas dos nanotubos de carbono: (a) planar; (b) nanotubo de
carbono de simples parede (SWCNT); (c) Nanotubos de paredes múltiplas (MWCNT).
Fonte: (KREUPL, et al., 2004).
Os CNTs têm encontrado várias aplicações, dentre elas: ponteiras para microscopia de
varredura por sonda, como transistores de efeito de campo, retificadores eletrônicos, eletrodos
para supercapacitores e para sensores (RIVAS, et al., 2007; HEGDE, et al., 2009). Em 1996,
29
Britto e Santhanan foram os pioneiros na aplicação dos CNTs para biossensores. Desde então,
a pesquisa de desenvolvimento de biossensores utilizando CNTs tem sido empregada devido a
suas propriedades como o aumento das iterações eletrodo-proteína, resultando em correntes
faradaicas muito altas.
Os CNTs possuem diversas propriedades que atraem seu uso na aplicação de
biossensores, eles têm elevada razão área superfície/volume, conferem aos eletrodos
modificados maior área eletroativa, promovem reações de transferência de elétrons e baixos
sobrepotenciais, melhoram a reversibilidade de alguns processos. Além disso, possuem alta
condutividade elétrica, boa estabilidade química e resistência mecânica, permitem melhor
imobilização de enzimas, antígeno, anticorpo, ácidos nucléicos (OU, et al., 2007; REZAEI e
DAMIRI, 2008).
Através da modificação dos CNTs é possível torná-los seletivos. Então, muitos esforços
e pesquisas vêm sendo feitas para otimização e estabilidade da aplicação desses nanomateriais.
Isto pode ser alcançado pela correta funcionalização, conjugando grupos reativos, tais como
grupos carboxílicos ou aminas. Assim os CNTs são imobilizados facilmente e ficam mais
estáveis na superfície do eletrodo. Tal fato é muito importante para o desenvolvimento de
biossensores em que as ligações de materiais biológicos são desejadas (FENG, et al., 2003;
YUN, et al., 2007).
2.4.3. Nanocelulose
Nos últimos anos o interesse tecnológico em materiais renováveis e recursos
ecológicos e sustentáveis aumentou exponencialmente principalmente no que se diz respeito a
pesquisa e aplicação de nanocompósitos de celulose (KLEMM, 2005). De fato, dentro dos
polímeros obtidos a partir de fontes renováveis, a celulose é o polímero natural mais abundante
na natureza, bem como o componente mais importante do ‘esqueleto’ das plantas. O
biopolímero formado por repetidas conexões de blocos de glicose (figura 7) é a base estrutural
das paredes celulares de praticamente todas as plantas e é geralmente considerada uma fonte
quase inesgotável de matérias-primas (KLEMM, 2005; ROBERTS, 1996).
30
Figura 7: Estrutura química da celulose.
Fonte: (ROJAS, et al., 2015).
Caracterizada por suas interessantes propriedades como hidrofilicidade, quiralidade,
biodegradabilidade, ampla capacidade de modificação química, formação de diferentes
morfologias de fibras semi-cristalinas, a celulose tem uma significância particular devido a sua
estrutura e clara tendência para formar ligações intramoleculares e ligações intermoleculares.
As características influenciam no arranjo desta supermolecula de celulose, que juntamente com
aspectos práticos, tais como a origem do produto e processo de tratamento, terão uma
importância significativa sobre as suas propriedades finais. Este polímero é o principal
constituinte de fibras longas e curtas, o que representa cerca de 40-45% de madeira seca, sendo
a polpa da madeira restante a fonte mais importante para o processamento de celulose, ou seja,
na fabricação de papel (KLEMM, et al., 2005; SJOSTROM, 1993; KLEMM, et al., 2006).
A celulose também é amplamente utilizada na área biológica e em aplicações
biomédica como o principal componente das membranas de diálise (Celulose regenerada) e
TNT. Da mesma forma, celulose bacteriana (CB) e outros hidrogéis nanocelulose têm
encontrado aplicações biomédicas no desenvolvimento de dispositivos médicos, tais como
vasos sanguíneos artificiais, aplicação de nanocelulose bacteriana como curativos de tecido
animal e cosméticos (JORFI e E., 2014).
Variadas formas de nanocelulose como nanocompósitos, géis, membranas de
microdiálise, celulose microfibrilada e moldes de enxerte de superfície vem sendo
31
caracterizadas e discutidas devido a suas propriedades morfológicas (KLEMM, et al., 2011).
Mais especificamente, materiais incluindo nanotubos de carbono, sílica, ouro mesoporoso,
pontos quânticos, dendrímeros, biopolímeros e blocos de copolímeros, quando combinados
com nanocelulose têm-se mostrado úteis na otimização do biosensor (KANG, et al., 2013).
Os derivados de celulose em forma de blocos de copolímeros vem sendo propostos
como respostas mediadoras a estímulos que podem ser preparados
regiosselectivamente modificados por meio de dissolução da celulose em líquidos iónicos, e
modificado através de polimerização por radicais (KANG, et al., 2009). Celulose
regiosseletivamente modificada como um derivado de polietileno glicol também é sintetizada
e utilizada para dar origem a filmes modelados a favo de mel que são formados com base em
propriedades anfilico celulósico (XU e KADLA, 2012). Moléculas fluorescentes e ponto de
quântico são geralmente associadas aos filmes para demonstrar a potencial funcionalidade em
áreas especificas adequada para os biossensores.
As enzimas podem se unir com nanocelulose através de ligações covalentes, pontes
salinas, e com complexas inclusões físicas (ICANI, et al., 2013; YILUN, et al., 2012). As
propriedades de superfície hidrófila proporcionam uma matriz biocompatível para a atividade
seletiva ocorrer. A glicose oxidase imobilizada em celulose nanocristalina com nanopartículas
de ouro ligadas através de derivados de tióis de polietilenoimina proporcionam vários níveis de
atividade em função da ponte de tiol (ICANI, et al., 2013). Dendrímeros como ligantes
agregados a antígenos também são usualmente ligados a nanocelulose e combinados com
zeólitas para melhorar o reconhecimento específico pelo anticorpo (SANCHEZ, et al., 2012).
Desde o primeiro biosensor relatado, a glicose oxidase despertou interesse cientifico, e
vem sendo estudada no monitoramento de glicose para controle de diabetes (CLARK e
LYONS, 1962). Atualmente, a glicose oxidase, também tem sido imobilizada em compósitos
de nanotubos de carbono e celulose bacteriana-filtrada depositada sobre eletrodos, aumentando
uma transferência eletrônica direta entre a glicose e a glicose oxidase no sensor (KIM, et al.,
2013). Além disso, testes vem propondo o uso de nanoparticulas quaternizadas de celulose,
combinadas com acetileno preto, no qual é utilizado para inclusão física da glicose oxidase
sobre a superfície de elétrodos proporcionando uma maior sensibilidade aos niveis de glicose e
de peróxido de hidrogênio (LI, et al., 2012). No seguinte item se apresentará o método de
controle glicêmico paar ilustrar essa aplicação.
32
2.5. Métodos de controle glicêmico
Diabetes mellitus é um problema de saúde pública mundial. Esta desordem metabólica
resulta da deficiência de insulina e hiperglicemia e é refletida por concentrações de glicose no
sangue maior ou menor do que o intervalo normal de 80-120 mg / dl (4,4-6,6 mM). A doença é
uma das principais causas de morte e incapacidade no mundo. As complicações da diabetes são
numerosas, incluindo os riscos mais elevados de doença cardíaca, insuficiência renal e cegueira.
Tais complicações podem ser grandemente reduzidas através do controle pessoal rigoroso da
glicose no sangue (REACH e WILSON, 1992).
O diagnóstico e tratamento de diabetes mellitus, requer um controle severo dos níveis
de glicose no sangue. Assim, milhões de diabéticos devem testar os seus níveis de glicose no
sangue diariamente, fazendo com que a glicose seja o analito mais comumente analisado.
Consequentemente, os biossensores de glicose são responsáveis por cerca de 85% de todo o
mercado de biossensores. Tal crescente demanda faz com que o mercado cresça
consideravelmente cada ano e se torne uma doença modelo para o desenvolvimento de novos
conceitos de biossensoriamento. As perspectivas econômicas associadas à gestão da diabetes,
juntamente com o desafio de fornecer esse controle glicêmico confiável e preciso levou
pesquisadores do mundo todo a desenvolverem técnicas inovadoras de detecção (REACH e
WILSON, 1992; WANG, 2001). Eletrodos amperométricos de enzima, baseado em glicose
oxidase (GOx), têm desempenhado um papel de liderança no movimento para testes dos níveis
de açúcar no sangue e devem desempenhar um papel similar no movimento em direção a
monitorização contínua da glicose.
2.6. Princípios básicos de funcionamento de um biossensor de glicose
O conceito básico de um biossensor de glicose é baseado no fato da GOx imobilizada
catalisa a oxidação de β-D-glicose pela molécula de oxigênio, produzindo ácido glicólico e
peróxido de hidrogênio, representado na Equação 2.1 (WEIBEL e BRIGHT, 1971). Para
funcionar como um catalisador, a GOx requer um cofator redox de Flavina Adenina
Dinucleotídeo (FAD). O FAD funciona como o aceptor inicial de elétrons e é reduzido a FADH2
como representado na equação 2.2.
β − D − glicose + O2 + H2O → Ácido Glicólico + H2O2 (2.1)
33
Glicose + GOx + FAD++ → Gluconolactona + GOx + FADH2 (2.2)
Este cofator é regenerado por meio de reação com o oxigênio, o que leva à formação
de peróxido de hidrogênio (equação 2.3).
GOx + FADH2 + O2 → GOx + FAD + H2O2 (2.3)
Como visto na reação acima o peróxido de hidrogênio é oxidado em um eletrodo de
platina (Pt). O eletrodo consegue facilmente reconhecer o número de elétrons que estão sendo
transferidos, e através deste fluxo de elétrons é possível calcular o nível de glicose presente no
sangue (GUILBAULT e LUBRANO, 1973a). Como pode ser visto na Figura 8 abaixo:
Figura 8: Esquema eletroquímico da reação da Glicose Oxidase.
Fonte: (TURNER, et al., 1999).
2.5.1. Biossensores na medição do nível de glicose
Embora uma variedade de sensores de glicose esteja disponível, o princípio do
biossensor de glicose mudou muito pouco ao longo de vários anos (Tabela 3). No entanto, o
primeiro medidor de glicose no sangue não foi um biossensor, foi um Medidor de reflectância
Ames (MRA) (Miles Laboratories, Elkhart, IN, EUA) com base em uma reflectómetro de
Dextrostix introduzido em 1971. Dextrostix, o primeiro método de medição da faixa de glicose
34
no sangue está disponível desde 1965, e foi originalmente concebido para mostrar mudanças de
cores (DRURY, et al., 1965; KORP, 1965).
Tabela 3: História dos Biossensores de Glicose.
Fonte: Adaptado de (YOO e LEE, 2010).
2.6. Geração dos Biossensores
Os biossensores amperométricos se classificam em três gerações, podendo ser de
primeira, segunda e terceira geração, de acordo com o processo envolvido na transferência de
carga, reconhecimento do analito, geração e processamento do sinal.
2.6.1. Biossensores de primeira geração
O princípio básico da primeira geração de biossensores de glicose é a quantificação da
glicose através da detecção eletroquímica do H2O2 liberado, onde a corrente produzida é
proporcional à sua concentração. Em um biossensor de glicose amperométrico, as medidas são
normalmente realizadas utilizando um eletrodo de platina e o potencial de trabalho sobre o qual
é detectado o H2O2 é tipicamente entre 500-750 mV vs. Ag/AgCl (GUILBALT e LUBRANO,
1973).
Medidas de formação de peróxido de hidrogênio têm a vantagem de serem mais simples,
especialmente quando estão relacionados a dispositivos miniaturizados (UPDIKE e HICKS,
35
1967). No entanto, o principal problema com a primeira geração de biossensores de glicose era
que a medição amperométrica de peróxido de hidrogénio necessitava de um elevado potencial
de operação para uma alta seletividade.
A detecção de peróxido de hidrogênio também pode ser realizada pela redução do
mesmo em eletrodo de platina segundo a Equação 2.4:
H2O2 + 2H+ + 2é → 2H2O (2.4)
A dependência da necessidade de consumo de O2 pela via enzimática se tornou um
grande problema para os biossensores baseados em peroxido de hidrogênio pois sua
concentração pode variar de acordo com o meio. Com efeito de diminuir a dependência do sinal
amperométrico com o meio, membranas com características hidrofóbicas foram usadas de
modo a restringir o fluxo de glicose, admitindo uma maior concentração de oxigênio.
A baixa solubilidade de O2 em solução aquosa, a dificuldade associada com o controle
da pressão parcial de produtos gasosos e o alto potencial aplicado, levaram ao desenvolvimento
de biossensores amperométricos de segunda geração (WANG, 2008).
2.6.2. Biossensores de segunda geração
As limitações dos biossensores de glicose da primeira geração foram superadas
utilizando biossensores mediadores de glicose. As melhorias foram conseguidas através da
substituição de oxigênio com aceptores de elétrons não-fisiológicos, chamados mediadores
redox que foram capazes de transportar elétrons a partir da enzima para a superfície do eletrodo
de trabalho (LIU e WANG, 2001). Após a oxidação da β-D-glicose pela GOx, a forma reduzida
de um mediador é formada em vez de peróxido de hidrogênio e, em seguida reoxidada no
eletrodo, fornecendo um sinal amperométrico e regenerando a forma oxidada do mediador
como apresentado nas equações 2.5, 2.6 e 2.7 (TURNER, et al., 1999). Uma variedade de
mediadores de elétrons, tais como ferroceno, ferricianeto, quininos, tetrathialfulvalene (TTF),
tetracianoquinodimetano (TCNQ), tionina, azul de metileno, e metilviologênio são utilizados
para melhorar o desempenho do sensor (CASS, et al., 1984; CHAUBEY e Malhotra, 2002).
β-D-glicose + GOx(FAD++) →Gluconolactona +GOx(FADH2)
FADH2 → FAD++ + 2MED(red) +2H+
2MED(red) → 2MED(ox) +2e-
(2.5)
(2.6)
(2.7)
36
Sendo Med(ox) e Med(red) as formas oxidadas e reduzidas, respectivamente, dos
mediadores. No caso do uso de mediadores, estes reagem rapidamente com a enzima reduzida,
precisam ser preferencialmente não tóxicos e quimicamente estáveis (em ambas as formas
reduzida e oxidada), e possuir um baixo potencial redox (LIU e WANG, 2001).
Várias estratégias foram empregadas para facilitar a transferência de elétrons entre o
centro da GOx reduzida e a superfície do eletrodo como, a modificação química da GOx com
grupos de retransmissão de elétrons e a aplicação de nanomateriais como condutores elétricos.
O uso de mediadores se tornou uma técnica amplamente utilizada na fabricação de
biossensores de glicose comerciais para uso próprio, pois sua independência do sinal com
relação concentração de O2 e custo acessível possibilitou a produção em larga escala desses
biossensores (FERNANDES, 2005). Apesar disso, a limitação do transporte de massa por
difusão dos elementos responsáveis pela troca eletrônica com o eletrodo do sistema motivou a
busca por um novo método de medição, o que levando a terceira geração de biossensores de
glicose.
2.6.3. Biossensores de terceira geração
Os biossensores de glicose de terceira geração são baseados na transferência direta de
elétrons entre a enzima e o eletrodo, sem mediadores. Em vez de mediadores de alta toxicidade,
o eletrodo pode realizar transferências eletrônica direta utilizando materiais condutores
orgânicos baseados em complexas transferências de cargas (KHAN, et al., 1996;
PALMISANO, et al., 2002). Portanto, biossensores de glicose de terceira geração levaram a
dispositivos do tipo agulha implantáveis para monitorização ‘in vivo’ de glicose no sangue
contínuo. A ausência de mediadores fornece aos biossensores uma seletividade superior. No
entanto, apenas algumas enzimas, incluindo as peroxidases provaram exibir uma transferência
eletrônica direta na superfície do eletrodo (ZHANG e LI, 2004; MARTINS, et al., 2003).
Na figura 9 abaixo está esquematizado as três gerações de biossensores
amperométricos baseados em oxidases.
37
Figura 9: Representação esquemática de três gerações de biossensores (a) Primeira geração
(b) Segunda geração e (c) Terceira geração.
Fonte: Adapatado de (SATVEKAR, et al., 2014).
38
3. METODOLOGIA
O capítulo de metodologia em quatro secções. Na primeira descreve-se os reagentes e
materiais empregados. Na segunda secção expõe-se o a síntese das nanopartículas de pratas e
seu encapsulamento mediante a nanocelulose e na terceira secção é feita uma descrição da
construção dos eletrodos em estudo. Na quarta secção aborda-se todo o procedimento relativo
à caracterização das mesmas.
3.1. Reagentes e Materiais
Os reagentes utilizados foram grafite em pó (Vetec), nanocelulose em gel, obtida da
Suzano Papel e Celulose S/A, resina epóxi DER 332 adquiridos da Sigma-Aldrich, nitrato de
prata, borohidreto de sódio, ferrocianeto de potássio, cloreto de potássio e cloreto de potássio
adquiridos da Vetec. Os reagentes utilizados no estudo foram preparados de maneira analítica
e o solvente utilizado foi água destilada. Para análise da resposta eletroquímica por meio de
voltametria cíclica foi utilizado um potenciostato com módulo de espectroscopia de impedância
eletroquímica integrada marca Ivium, modelo CompactStat (Ivium Technologies, The
Netherlands) controlado por um computador via software dá IviumSoft. As experiências foram
realizadas em uma célula eletroquímica estática a 25°C a diferentes velocidades de varredura
(10, 30, 50,75, 100 mV/s).
A célula eletroquímica é composta por três eletrodos: Eletrodo de Platina, eletrodo de
referência Ag/AgCl (3M) e o eletrodo de trabalho onde é fixado o compósito Grafite/Epóxi
(GEC) impregnados de nanopartículas de prata, nanocelulose (GEC/NC/AgNPs). Como
solução eletrolítica padrão utilizou-se uma solução aquosa de K4Fe(CN)6 10 mM, em KCl
0,01M, pH 7.0. As experiências amperométrica foram realizadas num sistema agitado aplicando
um potencial de -0,4V a +0,8V ao eletrodo de trabalho. Todas as soluções foram purgadas com
N2 de elevada pureza durante pelo menos 20 min antes das experiências.
A preparação de cada um dos reagentes aplicados nos experimentos estão presentes no
Apêndice A.
3.2. Síntese das nanopartículas de prata
O procedimento empregado para obtenção das AgNPs foi o seguinte:
Uma solução de 30ml de borohidreto de sódio 0,0020M foi preparada frescamente, e
com ajuda de uma proveta graduada a solução foi vertida em um erlenmeyer de 200 ml, o qual
foi mantido em um banho de gelo e deixou-se esfriar por cerca de 20 minutos. Sob agitação foi
39
adicionado gota a gota (cerca de 2ml) uma solução de AgNO3 0,001M á solução de borohidreto
de sódio contida no erlenmeyer, até que se formasse uma solução de coloide de cor amarelo
escuro. As nanopartículas de prata que se formaram foram estabilizadas por uma camada
protetora de íons borohidreto, o que garantiu sua estabilidade e evitou a aglomeração das
nanopartículas de prata. Após formado o coloide manteve-se sob agitação em banho de gelo
por 5 min.
Após a obtenção da solução de nanopartículas adicionou-se a 150mg de grafite puro,
onde se homogeneizou e deixou em processo de secagem em estufa a 80ºC por 12 horas. Após
a obtenção do compósito Grafite/AgNPs adicionou-se epóxi na proporção 65/35 (p/p)
respectivamente, e foi adicionado na superfície do sensor onde deixou-se secar por 24 horas a
temperatura ambiente para posterior análise eletroquímica por meio de voltametria cíclica
(SANTOS, et al., 2016). A figura 10 mostra as etapas do processo da síntese das AgNPs.
Figura 10: Etapas da síntese e incorporação das NP’s Ag a mistura de Grafite/Epóxi.
3.2.1. Impregnação de nanocelulose com nanopartículas de prata
De modo a comparar a eficiência da incorporação da nanocelulose no compósito do
biossensor, construiu-se um eletrodo baseado no compósito GEC/AgNPs/NC. O procedimento
adotado foi o seguinte:
40
Primeiramente preparou-se o eletrodo base contendo GEC/Epóxi na proporção 65/35
(p/p) e deixado secar por 24 horas a temperatura ambiente. Em seguida, a superfície do sensor
foi polida com lixa 1200 e lavada com água destilada.
Posteriormente, 4 ml de suspensão aquosa de NC foi pesada e adicionada a uma solução
de 25 ml de AgNO3 0,001M previamente preparada. A solução foi mantida a 60 °C em
condições estáticas por 1 h. Dessa suspensão gotejou-se uma gota sobre a superfície do
compósito GEC pré-tratado e deixou-se secar à temperatura ambiente por 24 h. Após o tempo
o sensor GEC/AgNP/NC foi armazenado na geladeira a 4ºC para posterior análise eletroquímica
por meio de voltametria cíclica.
3.3. Confecção dos eletrodos
A figura 11 representa o tipo de eletrodo-compósito confeccionado. O sensor
desenvolvido consiste em um suporte de PVC onde foi inserido um fio de cobre previamente
lixado com lixa 400 deixando aproximadamente 1,5 mm de comprimento na região onde será
introduzida o compósito e aproximadamente 20,0 mm de comprimento na outra extremidade
para receber a conexão do potenciostato.
Figura 1: Eletrodo GEC. A) Montagem inicial com fio elétrico e tubo de teflon; B)
Incorporação do compósito no sensor com um excesso da mistura C) Aspecto final após cura
e polimento.
Fonte: (BOJORGE e ALHADEFF, 2011).
41
3.4. Caracterização das nanopartículas de prata
A caracterização da solução de AgNPs foi realizada através de uma análise por
espectroscopia por energia dispersiva (EDX), utilizando o equipamento EDX-7000/8000-
Shimadzu, no qual se baseia na investigação de uma amostra através de interações entre
partículas e matéria, analisando os raios X emitidos pela matéria em resposta à incidência de
partículas carregadas (SANTOS, et al., 2016).
Além disso, utilizou-se a Espectrometria de absorção atômica, também chamada de
espectrofotometria de absorção atômica para determinar a presença das nanopartículas de prata
na solução coloidal, usando como princípio a absorção de radiação ultravioleta por parte dos
elétrons absorvendo apenas a radiação com comprimento de onda referente ao elemento
químico do qual fazem parte.
42
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste capítulo são apresentados os resultados obtidos para o trabalho, abordando
discussões e análises/avaliação dos métodos empregados para a obtenção dos resultados do
sistema em estudo.
4.1. Caracterização da dispersão coloidal da solução de AgNPs
4.1.1. Caracterização por espectrometria de absorção atômica
Através da técnica de espectrometria de absorção atômica pôde-se determinar a presença
do metal Ag na solução. Nessa técnica os elétrons presentes na solução coloidal são excitados
por uma fonte de energia e sofrem um salto quântico, quando retornam ao seu estado inicial
emitem essa energia para meio em forma de fóton de luz o qual possui um comprimento de
onda característico do elemento presente na solução.
A Figura 12 mostra o espectro de absorção contra o comprimento de onda da solução
nanocoloidal de Ag. As curvas apresentadas são referentes ao preparo após 0h, 24h, 48h e 120h.
Segundo (RASHID, 2013; RAJKUMAR, 2015) nanopartículas de prata exibem uma banda de
absorção típica na região entre 350nm a 450nm, o qual confirma que a síntese da AgNPs foi
bem-sucedida. Tais bandas são propriedades físicas destas nanopartículas.
A absorbância resultante da suspensão nanocoloidal de Ag recentemente preparada
usando 2 mL de AgNO3 foi de 0,666 e um comprimento de onda característico de 398 nm. No
entanto, após 24 horas da síntese, já era possível notar uma mudança na absorbância do coloide,
apresentando um valor de 0,591. Com o passar do tempo a absorbância da solução tendeu a um
decréscimo do valor de pico. Após 120 horas o espectro de absorbância da solução coloidal de
AgNP mostrou um comprimento de onda de 400nm e absorbância de 0,530. É importante notar
que o pico de absorção se tornou mais largo ao longo do tempo. Isto indicou que os
nanocolóides de Ag tendem a se agregar com o tempo.
43
Figura 2: Espectros de absorção UV-Vis de AgNPs em tempos diferentes desde recentemente
preparado até cinco dias depois.
A adsorção de borohidreto desempenha um papel chave na estabilização de nanopartículas de
prata proporcionando uma carga superficial sobre as partículas e deve estar em quantidades suficientes
para estabilizar as partículas à medida que a reação prossegue. No entanto, com o tempo, o borohidreto
de sódio em excesso na solução aumenta a força iônica global e começa a ocorrer a agregação das
partículas (SOLOMON, et al., 2007).
4.1.2. Caracterização por espectrometria por energia dispersiva de raios X (EDX)
A caracterização química da amostra utilizando a técnica de Espectroscopia de raios X
por dispersão em energia (EDX), mostrou a presença hegemônica de Ag0 (prata metálica)
dispersa na solução, como observado na tabela 4 abaixo.
Tabela 4: Análise EDX de solução de AgNps.
44
4.2. Caracterização eletroquímica dos eletrodos de trabalho por voltametria
cíclica
4.2.1. Eletrodo grafite/epóxi com incorporação de nanopartículas de prata
Para caracterização eletroquímica voltamétrica GEC, foram realizados testes de
voltametria cíclica em solução de ferrocianeto [Fe(CN)6]-3. Na análise da aplicação do uso de
nanopartículas de prata no compósito de grafite (65%) e Epóxi (35%) p/p respectivamente,
observou-se um aumento da condutividade e uma maior sensibilidade a concentração da
solução. Utilizando-se do software Ivium-n-Stat potentiostat para análise voltamétrica, foram
testadas velocidades de varredura que variaram de 10 mV/s a 100 mV/s no sensor eletroquímico
com nanopartículas de prata. Os resultados da caracterização eletroquímica voltamétrica é
apresentado na figura 13:
Figura 13: Voltamogramas cíclicos de sensor GEC em uma solução de K4Fe(CN)6, pH 7.0 a
diferentes velocidades de varredura (10, 30, 40, 75, 100 mV/s).
4.2.2. Eletrodo grafite/epóxi/AgNps com incorporação de nanocelulose
Assim como no sensor eletroquímico com nanopartículas de prata, de modo a obter
uma comparação da condutividade eletroquímica em um biossensor com e sem a aplicação de
nanocelulose foram testadas velocidades de varredura que variaram de 10 mV/s a 100 mV/s em
45
uma solução de 50mL de K4Fe(CN)6 10mM em KCl 0,01M , pH 7. Uma outra bateria de testes
permitiu obter os voltamogramas cíclicos do biossensor sem nanocelulose e os respectivos
voltamogramas cíclicos do biossensor com nanocelulose incorporadas ao compósito. Como se
vê na comparação a seguir na Figura 14:
Figura 14: Voltamogramas cíclicos obtidos com os eletrodos GEC e eletrodo modificado
com nanoparticulas de Prata e nanocelulose em solução contendo K3[Fe(CN)6 10mM em KCl
0,01M vs. Ag/AgCl a velocidade de varredura de 100mV/s.
O comportamento eletroquímico do compósito foi investigado no eletrodo modificado e
não modificado de modo a esclarecer as diferenças entre a sua sensisbilidade e o seu
desempenho eletroquímico em uma velocidade de varredura de 10Mv/s com um potencial
aplicado a faixa de -0,4 a 0,8. Como mostrado na figura 14, o eletrodo GEC apresenta uma
corrente de pico anódico (Ipa) igual a 0,286 mA e uma corrente de pico catódico de (Ipc) igual
a 0,266 mA, o pico de potencial anódico (Epa) é ligeiramente largo e os pares redox apresentam
uma separação entre os potenciais de pico anódico (Epa) e catódico (Epc), apresentando um
Epa de 0,33 V e Epc de 0,15 V o que caracteriza um sistema quase-reversível. Apesar do
eletrodo modificado (GEC/AgNP/NC) ter apresentado um valor semelhante de Epa igual a
0,33V e Epc em torno de 0,15 V, pode-se notar que a corrente de pico anódica e catódica do
eletrodo modificado aumentou significativamente, apresentando um pico de oxidação maior
com Ipa no valor de 0,365 mA e um pico de redução com Ipc igual a 0,339. A razão |Ipa/Ipc|
46
do eletrodo modificado foi de 1,08, caracterizando também um sistema quase-reversível e a
aplicabilidade do eletrodo. É possível observar que a inserção da nanocelulose impregnadas
com nanopartículas de prata co compósito GEC se mostrou muito eficaz resultando em um
aumento de 21,46 %na corrente de pico anódico e 21,53% na corrente de pico catódico, bem
como no aumento da reversibilidade do eletrodo, devido à relação |Ipa/Ipc| torna-se mais
próxima de 1.
Os resultados dos voltamogramas também podem ser verificados na tabela 5 abaixo:
Tabela 5: Comparação entre as correntes de pico dos eletrodos GEC e GEC/AgNP/NC
Quanto a aplicação das nanopartículas e a nanocelulose observou-se que a diferença
entre o potencial de pico anódico, Epa e o valor catódico, Epc, mostram uma fraca dependência
com relação as velocidades de varredura, apresentando um valor em torno de 60/n mV
característico de um sistema de processo redox quase reversível, bem próximo de um sistema
completamente reversível (Ep=57/n mV). Como mostrado na Figura 15 abaixo, se observa
com a linearização dos dados que tanto os picos anódicos quando os picos catódicos são
proporcionais a raiz da velocidade de varredura. Na relação das correntes Ipa/Ipc obteve-se uma
média ligeiramente superior a 1 indicando também que se apresenta muito próximo de um
sistema reversível (Ipa/Ipc=1) mV/s ½.
47
Figura 3: Relação da corrente de pico anódico e catódico em função da raiz quadrada da
velocidade de varredura.
48
5. CONCLUSÕES
Neste estudo foi observado através de diversas técnicas de caracterização o efeito da
incorporação de AgNPs nos diferentes compósitos de grafite preparados. As AgNPs foram
sintetizadas utilizando o borohidreto como agente redutor. Neste caso, se mostrou eficaz na
síntese das nanopartículas conferindo as mesmas uma estabilidade média devido a repulsão
eletrostática evitando com que se agregassem formando assim partículas de tamanho maior.
As nanopartículas de prata agregadas ao compósito grafite/epóxi conseguiram melhorar
as propriedades elétricas do compósito resultando em um aumento da condutância elétrica do
compósito, e aumentando sua sensibilidade e a seletividade.
A caracterização por espectroscópia por energia dispersiva (EDX) comprova que a
síntese das nanopartículas foi bem-sucedida onde aferiu-se a presença de 100% do elemento
Ag na solução sintetizada. Além disso, a caracterização por Espectrometria de Absorção
Atômica pode comprovar através de análise que a dispersão coloidal de AgNPs exibe uma
banda de absorção aproximadamente em 400 nm, que é a banda de absorção característica para
AgNPs, uma vez que sua banda típica é na região de 350 a 450 nm.
As varreduras foram realizadas utilizando um eletrodo sem modificação (GEC) e outro
modificado, no qual se consiste em Grafite/Epóxi/AgNPs/Nanocelulose (GEC/AgNPs/NC).
Como esperado, eletrodo GEC incorporado com as AgNPs e nanocelulose apresentou
uma melhor condutividade elétrica, como está evidenciado no diagrama obtido por meio da
voltametria cíclica, onde é possível observar picos anódicos e catódicos maiores e mais bem
definidos comparado ao sensor sem nanocelulose e com uma reversibilidade por meio da razão
Ipa/Ipc bem próxima de 1, garantindo assim a aplicação do sensor na detecção de analítos de
interesse.
.
5.1. Perspectivas e Sugestões para Trabalhos Futuros
O eletrodo apresentado neste trabalho serve como base para futuros projetos visando o
desenvolvimento e aplicação de diversos analitos de interesse. Sugere-se a aplicação da
nanocelulose no sensor na forma de filme aplicado a área de superfície do compósito de modo
a comparar com técnica descrita no presente trabalho. Seria interessante também, devido à alta
demanda por biossensores de medição de nível de glicose, a realização de testes com a enzima
Glicose Oxidase imobilizada na superfície do biossensor e a realização de voltametrias com
solução de glicose padrão.
49
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APÊNDICE A – Preparação dos reagentes aplicados no experimento:
Solução de cloreto de potássio:
A solução de cloreto de potássio 0,50 mol L-1 foi preparada a partir de 1,8670 g de
cloreto de potássio em 50,0 mL de água destilada.
Solução de ferrocianeto de potássio:
A solução de ferrocianeto de potássio 0,05 mol L-1 foi feita a partir de 0,0823 g em 50,0
mL de solução de cloreto de potássio 0,50 mol L-1.
Solução de Borohidreto de sódio:
A solução de borohidreto de sódio 0,002M foi feita a partir de uma massa de 0,0756g e
foi adicionado água destilada até o volume de 1000 mL, homogeneizou-se a solução,
alcançando assim a concentração desejada.
Solução de Nitrato de Prata:
Foi adicionado 1ml a partir de uma solução de AgNO3 0,1M e completado até 100ml
com agua destilada e assim preparado uma uma solução de 0,001M de AgNO3 para uso no
experimento.
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