Universidade Estadual do Ceará Faculdade de Veterinária Programa de Pós-‐Graduação em Ciências Veterinárias Biotécnicas Aplicadas à Reprodução de Fêmeas Caprinas e Ovinas
Transgênese
Vicente José de F. Freitas Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução www.uece.br/lfcr
Plano de Aula
• Apresentar conceitos.
• A transgênese em pequenos ruminantes: • Princípios. • Métodos.
• Discu;r os principais entraves.
• Considerações finais.
Ø Animais ou plantas
• Adição, troca ou ina;vação de um determinado gene.
• Maioria das vezes: OGMs são organismos transgênicos.
Ø Transgênese animal
Ø Possibilidades sem precedentes
Ø Limitações é;cas e legais
• Legalização junto aos orgãos competentes
• Brasil ⇒ CTNBio
• CQB (Cer;ficado de Qualidade em Biossegurança)
Transgênese
Aplicações da transgênese
Salmão (Salmo salar) transgênico para GH: Precoce para abate Aqua Bounty Technologies
Ø Peixes transgênicos com fins comerciais
GloFish com fluorescência vermelha: PET nos EUA
Aplicações da transgênese
Camundongo transgênico para estudo de hipertrofia cardíaca (Dr. João Bosco Pesquero -‐ UNIFESP).
Ø Camundongos transgênicos como modelo de estudo de funções gênicas e doenças humanas
Aplicações da transgênese
Ø Suínos transgênicos para produção de órgãos “humanizados” para uso em xenotransplantes.
Aplicações da transgênese Ø Caprinos transgênicos para produção de proteínas recombinantes no leite.
Lizosima humana (Dr. James Murray -‐ EUA).
Proteína da teia de aranha (Nexia Biotechnologies -‐ Canadá) (Universidade de Wyoming -‐ EUA).
Aplicações da transgênese
• 1º medicamento aprovado para uso humano a par;r do leite de animais transgênicos.
• Prevenção de eventos trombo-‐embólicos em cirurgias e no periparto de pacientes com deficiência hereditária de an;-‐trombina.
An;-‐trombina III humana GTC Biotechnologies è rEVO
Por que a produção em animais?
Houdebine, 2008
Aspectos Bactéria Levedura Cél. de inseto + baculovirus
Cél. CHO
Plantas transgênicas
Animais transgênicos
Nível de Produção
++(+) ++(+) + + ++ ++++
Custo de Produção
+++++ +++++ ++ ++ +++++ ++++
Scaling up +++++ +++++ ++ + +++++ ++++
Processamento pós-‐traducional
+ ++ +++ ++++ +++ ++++
Glicosilação + ++ +++ ++++ ++ ++++
Propriedade Intelectual
++++ +++ +++ ++ +++ +++
Produtos no mercado
++++ +++ +++ +++++ + +++
Por que a produção em animais?
Houdebine, 2008
Fucose
Galactose
Ác. Siálico
Glic-‐Nac
Manose
Xilose
Bactérias
Insetos
Plantas Mamíferos
Proteína
Qual espécie escolher? • 1 L de leite/lactação
• 5 a 8 lactações/ano
• 1ª lactação: 6 meses
• 8.000 L de leite/lactação
• 1 lactação/ano
• 1ª lactação: 2,5 anos
• 800 L de leite/lactação
• 1 lactação/ano
• 1ª lactação: 1 ano
Transgênese na espécie caprina
Ø Principais caracterís;cas:
• Boa ap;dão leiteira
• Gestação: 5 meses
• # prolificidade (cabritos/parto)
• $ custo de manutenção
• # eficiência na microinjeção de DNA (x bovinos)
Métodos para obtenção
• Métodos clássicos: • Microinjeção pronuclear
• Produção de zigotos (in vivo ou in vitro)
• Transferência nuclear de células somáticas (TNCS)
• Métodos alternativos: • Transferência de genes mediada por espermatozoides.
Microinjeção pronuclear
Microinjeção da construção de DNA
Purificação
Fundadores
Leite
Rebanho transgênico
Medicamento
Transferência para receptoras
Doadora de embrião pronuclear
Microinjeção de embriões prónucleares colhidos de cabras Canindé (a) ou Saanen (b).
Doadora de embrião pronuclear
Efeito da raça da doadora sobre a qualidade da microinjeção.
Doadora de embrião pronuclear
Diagnós;co de prenhez, sobrevivência embrionária e parto em receptoras de embriões colhidos de cabras Canindé e Saanen.
Estudos nos fundadores e geração F1
Estudos nos fundadores e geração F1
Dia -‐20 Dia 0
Dinâmica do hG-‐CSF no leite de cabra transgênica durante a lactação induzida.
Mean 690 μg/ml
Estudos nos fundadores e geração F1
Teste de formação de colônia de granulócitos. Controle nega;vo (leite de cabra não transgênica), o leite de cabra transgênica (contendo 50, 100 e 200 ng/ml de hG-‐CSF) e o controle posi;vo (hG-‐CSF recombinante; Filgras;m, 50 ng ml).
Estudos nos fundadores e geração F1
Prenhezes Descendentes Descendentes por sexo (%)a
Taxa de transgênicos (%)b
Total
M F M F
10M 7 11 6 (54,5) 5 (45,5) 3 (50,0) 3 (50,0) 6 (54,4)
12F 5 8 4 (50,0) 4 (50,0) 2 (66,7) 1 (33,3) 3 (37,5)
Total 12 19 10 (52,6) 9 (47,4) 5 (55,6) 4 (44,4) 9 (47,4)
Transmissão do transgene à descendencia das duas linhagens de caprinos transgênicos.
Considerações • A produção de proteínas recombinantes no leite de pequenos ruminantes transgênicos está aos poucos tornando-‐se uma realidade industrial.
• A dificuldade técnica e o custo da transgênese em animais domés;cos são as principais causas de sua len;dão de aplicação prá;ca.
• É necessário o desenvolvimento de métodos mais eficientes para melhorar o sucesso da técnica.