X JORNADA FARMACÊUTICA E V AMOSTRA
Sueli Massumi NakataniLaboratório Central do Estado – LACEN-PR
Maio de 2010
DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIAS EM PCR EM TEMPO
REAL: OTIMIZANDO CUSTOS E PRODUTIVIDADE
domingo, 30 de maio de 2010
Laboratório Central do Estado -PR Seção de Biologia Molecular -1997
Programa do MS DST/AIDS Quantificação da carga viral do HIV
Hoje
domingo, 30 de maio de 2010
Laboratório Central do Estado -PR Seção de Biologia Molecular -1997
Programa do MS DST/AIDS Quantificação da carga viral do HIV
Hoje 20 Diagnósticos Moleculares
domingo, 30 de maio de 2010
Benefícios Aumento da sensibilidade / Especificidade
Automatização
Detecção na fase exponencial
Protocolo único Tempo de execução menor
Sem processamento pós-PCR
PCR EM TEMPO REAL
domingo, 30 de maio de 2010
EVOLUÇÃO DA PCR
• Inicialmente, a PCR é exponencial– O produto (P) aumenta exponencialmente
com o número de ciclos (n)• A quantidade de produto de PCR depende do
número de cópias de molde (M) presentes no início da reação – Se no início houver duas vezes mais
molde, se deve obter duas vezes mais produto
P = M (1+E)nOnde: P = Produto M = Molde E = Eficiência n = ciclos
domingo, 30 de maio de 2010
Amplificação por PCR
• Para duas vezes mais molde no início, existe duas vezes mais produto de PCR, na fase exponencial.
• Para 4X Molde, existe 4X mais produto de PCR, etc.
domingo, 30 de maio de 2010
Amplificação por PCREficiência
• Mas....a reação de PCR NÃO é 100% eficiente
– Normalmente a eficiência é de 80-90%
– Produtos de PCR menores amplificam com uma eficiência maiorP = M (1+E)n
Onde: P = Produto M = Molde E = Eficiência n = ciclos
domingo, 30 de maio de 2010
• Os produtos de PCR não podem dobrar para sempre
• Limites– Quantidade de primer– Atividade da Taq Polimerase
• Uma vez atingido o plato...– Não há mais aumento na quantidade de
produto
• Detecção “end point”– Número fixo de ciclos e depois se verifica
a presença de produto em gel de agarose
AMPLIFICAÇÃO POR PCR Fase de Plato
domingo, 30 de maio de 2010
Problemas na detecção no ponto final
•Precisão baixa•Baixa sensibilidade•Range < 2 logs•Baixa resolução•Não automatizado•Baseado somente no tamanho •Resultados não expressam em números•O corante brometo de etídeo não é quantitativo•Manipulação com produtos Pós-PCR
domingo, 30 de maio de 2010
Fases da PCR
Área de detecção real time PCR
Área de de detecção no PCRtradicional
domingo, 30 de maio de 2010
Como quantificar a quantidade inicial de molde ???
• Use os dados da fase exponencial– Quantidade de produto é proporcional a
quantidade de molde inicial– Neste caso, é necessário avaliar o produto
de PCR a cada ciclo
• Usar FluorescênciaA fluorescência deve ser proporcional
quantidade de produto • Use uma máquina que verifique a
fluorescência em cada ciclo (Real Time-PCR)
domingo, 30 de maio de 2010
Real Time PCRSyber Green
• Vantagem:– Barato – Flexível
• Desvantagem:– Pouco específico
– Todo e qualquer produto formado contribuirá para o aumento da fluorescência
– Primer dimers são um problema
– Necessita de uma otimização para que não haja formação de produtos inespecíficos na reação
domingo, 30 de maio de 2010
Real Time PCRSyber Green
• Corante não-específico• Equivalente ao brometo
de etídio– Se liga a dupla fita de
DNA
• A quantidade de fluorescência é proporcional a quantidade de DNA
• Intensificação da emissão de fluorescência quando ligado à fita dupla de DNA
domingo, 30 de maio de 2010
Real Time PCRTaqman probes
• Sonda marcada com um fluoróforo (reporter ) e um quencher
A sonda se liga ao produto de PCR durante a fase de annealing
o reporter emite fluorescência que é captada pelo quencher
• A atividade exonucleásica 5’-3’ da Taq polimerase hidroliza a sonda e permite que o reporter se afaste do quencher
Amplicon
Amplicon
Emission
EXTENSION
ANNEALING
Excitation
5’-3’ exonuclease
Reporter Quencher
domingo, 30 de maio de 2010
Real Time PCRTaqman probes
• O acúmulo de reporter livre é proporcional a quantidade de produto de PCR
• A fluorescência é captada na fase de extensão
• Vantagem– Alta especificidade
Amplicon
Amplicon
Emission
EXTENSION
ANNEALING
Excitation
5’-3’ exonuclease
Reporter Quencher
domingo, 30 de maio de 2010
Real Time PCRHibridization probes
• FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) utilizando hybridization probes adjacentes
• Probes são marcados
• A fluorescência é captada na fase de anneling
FITC Red 640
FRET Emission
P
Excitation
Amplicon
94oC
55oC
72oC
domingo, 30 de maio de 2010
Real Time PCRMolecular Beacons
Hybridisation probes em forma de “loop”
Quando não anelado ao DNA, a estrutura em loop mantém o reporter e quencher próximos. Não há fluorescência
Durante o annealing, o reporter e quencher são separados e a fluorescência emitida é proporcional a quantidade de produto
Amplicon
Excitation
ANNEALING
domingo, 30 de maio de 2010
Quais os passos necessários para o desenvolvimento de um teste de PCR em tempo
real?
domingo, 30 de maio de 2010
Desenho dos primers e sondasSONDA PRIMEREscolha do gene de interesseEscolha do gene de interesseAmplicons de 50-150bpAmplicons de 50-150bpConteúdo G/C de 20-80%Conteúdo G/C de 20-80%
Evitar repetição consecutiva da mesma baseRepetições de mais do que 4 Gs devem ser evitadas
Evitar repetição consecutiva da mesma baseRepetições de mais do que 4 Gs devem ser evitadasTM 68-70ºC TM-58-60ºCNenhum G na extremidade 5’Selecionar a fita que contenha mais Cs do Gs
Os 5 nucleotídeos da extremidade 3’ nãoDevem ter mais de que dois Gs ou Cs
domingo, 30 de maio de 2010
SONDA-FLUORÓFORO-QUENCHER
O desenho da sonda depende do sistema escolhido TaqMan, FretConcentração da sonda 150-300nMA seleção dos fluoróforos deve ser compatíveis comequipamento Escolha adequada do quencher –preferencial paraNEF-MGBSelecionar fluoróforos com alto coeficiente de excitaçãoSistema Multiplex- verificar se não há sobreposição dentro do mesmo espectro de ação
domingo, 30 de maio de 2010
QUANTIFICAÇÃO ABSOLUTA
1- Realização da curva padrão Plasmídeo Diluição de amostra
2- Correlacionar com valores previamente conhecidos Painel Internacional de Curva Padrão
domingo, 30 de maio de 2010
DESENVOLVIMENTO DE QUANTIFICAÇÃODE CARGA VIRAL DO VÍRUS DA HEPATITE B
1-Escolha da região do genoma de interesse Região S2- Desenho dos primers e sondas3- Método de extração4- Padronização da curva5- Curva padrão com Painel Internacional Opti Quant® (Acrometrix)6- Análises Estatísticas de validação -Precisão -Especificidade -limite de detecção -Coeficiente de variação7- Controle Interno
domingo, 30 de maio de 2010
Comparação entre Cobas TaqMan e TaqMan LACEN-PR para HBV
Correlação de Pearson(r):0,9589(p<0,0001)
domingo, 30 de maio de 2010
Comparação entre Cobas Amplicor e TaqMan LACEN-PR para HBV
Correlação de Pearson (r):0,8497 (p<0,0001)
domingo, 30 de maio de 2010
Comparação entre Cobas Amplicor e Cobas TaqMan para HBV
Correlação de Pearson (r):0,8578 (p<0,0001)
domingo, 30 de maio de 2010
MÉTODOS DE GENOTIPAGEM
LiPA – hibridização reversa (Stuyver, 1993)
Trugene – seqüenciamento da região 5’UTR
Abbot HCV ASR – PCR em tempo real
domingo, 30 de maio de 2010
DESENHO DOS PRIMERSPRODUTO DE 688pb
ANÁLISE DAREGIÃO NS5B
SEQÜÊNCIAS CONSENSO
domingo, 30 de maio de 2010
EXTRAÇÃO DO RNAKIT NUCLISENS MINIMAG
DESENHO DOS PRIMERSPRODUTO DE 688pb
ANÁLISE DAREGIÃO NS5B
SEQÜÊNCIAS CONSENSO
domingo, 30 de maio de 2010
EXTRAÇÃO DO RNAKIT NUCLISENS MINIMAG
RTPCR
DETECÇÃO
DESENHO DOS PRIMERSPRODUTO DE 688pb
ANÁLISE DAREGIÃO NS5B
SEQÜÊNCIAS CONSENSO
domingo, 30 de maio de 2010
EXTRAÇÃO DO RNAKIT NUCLISENS MINIMAG
RTPCR
DETECÇÃO
DESENHO DOS PRIMERSPRODUTO DE 688pb
ANÁLISE DAREGIÃO NS5B
SEQÜÊNCIAS CONSENSO
domingo, 30 de maio de 2010
EXTRAÇÃO DO RNAKIT NUCLISENS MINIMAG
PURIFICAÇÃO DO PRODUTO DE PCR
QUANTIFICAÇÃO DO DNA PURIFICADO DILUÍDO 20NGSEQÜENCIAMENTO ABI 3130
RTPCR
DETECÇÃO
DESENHO DOS PRIMERSPRODUTO DE 688pb
ANÁLISE DAREGIÃO NS5B
SEQÜÊNCIAS CONSENSO
domingo, 30 de maio de 2010
EXTRAÇÃO DO RNAKIT NUCLISENS MINIMAG
PURIFICAÇÃO DO PRODUTO DE PCR
QUANTIFICAÇÃO DO DNA PURIFICADO DILUÍDO 20NGSEQÜENCIAMENTO ABI 3130
ANÁLISES DAS SEQÜÊNCIAS
BIOEDITCODONCODESEQSCAPE
RTPCR
DETECÇÃO
DESENHO DOS PRIMERSPRODUTO DE 688pb
ANÁLISE DAREGIÃO NS5B
SEQÜÊNCIAS CONSENSO
domingo, 30 de maio de 2010
EXTRAÇÃO DO RNAKIT NUCLISENS MINIMAG
PURIFICAÇÃO DO PRODUTO DE PCR
QUANTIFICAÇÃO DO DNA PURIFICADO DILUÍDO 20NGSEQÜENCIAMENTO ABI 3130
ANÁLISES DAS SEQÜÊNCIAS
BIOEDITCODONCODESEQSCAPE
RTPCR
DETECÇÃO
DESENHO DOS PRIMERSPRODUTO DE 688pb
ANÁLISE DAREGIÃO NS5B
SEQÜÊNCIAS CONSENSO
domingo, 30 de maio de 2010
limite de detecção
Sensibilidade analítica painel da Optiquant gen 1b
Sensibilidade relativa amostras clínicas gen 3a gen 2b gen 1a
250 UI/ml
125 UI/ml
250 UI/ml
500 UI/ml
domingo, 30 de maio de 2010
9 amostrasRNA VHC
Não detectável
194 amostrasGenótipo 1
36 amostrasGenótipo 2
80 amostrasGenótipo 3
Total319 amostras
310 amostrasRNA VHC
detectável
190 amostrasdetectadas
31 amostrasdetectadas
80 amostrasdetectadas
Genotipagem por PCR em Tempo Real
domingo, 30 de maio de 2010
Comparação dos métodos de seqüenciamento e PCR em tempo real para a genotipagem do
κ=0,6222; p=0,002
domingo, 30 de maio de 2010
Comparação dos métodos de genotipagem por PCR em tempo real e LiPA
κ=0,6933; p<0,0001
domingo, 30 de maio de 2010
Números de amostras com subtipos discordantes, indefinidos ou resultados incompletos pelo LiPA (5'UTR) quando comparados com genotipagem por PCR em tempo real da região NS5B do
VHC
κ=0,1111; p<0,2218
domingo, 30 de maio de 2010
Algoritmo sugerido para laboratório de saúde pública para a realização da
genotipagem do VHC por PCR em tempo real
domingo, 30 de maio de 2010
Algoritmo sugerido para laboratório de saúde pública para a realização da
genotipagem do VHC por PCR em tempo real
R$ 42,28
domingo, 30 de maio de 2010
Algoritmo sugerido para laboratório de saúde pública para a realização da
genotipagem do VHC por PCR em tempo real
R$ 42,28
R$ 59,56
domingo, 30 de maio de 2010
Algoritmo sugerido para laboratório de saúde pública para a realização da
genotipagem do VHC por PCR em tempo real
R$ 42,28
R$ 59,56
R$ 58,34
domingo, 30 de maio de 2010
Cytomegalovirus
pneumonite
encefalite
gastroenterite
Cório-retinite
hepatite
domingo, 30 de maio de 2010
30dias >100dias100dias
Herpes virus
Varicella zoster Cytomegalovirus
HHV-6Epstein-Barr virus
NeutropeniaMucositeGVHD agudo
↓imunidade celularGVHD agudo e crônico
RISCO DE INFECÇÃO TMO
Vírus respiratório
Fase I Fase IIIFase II
↓ imunidadecelular e humoralGVHD crônico
domingo, 30 de maio de 2010
Pesquisa Quantitativa do Cytomegalovirus
Gene ien – expressa na replicação viral
Controle interno plasmidial
Limite de detecção de 10 à 500.000 cópias/ml
domingo, 30 de maio de 2010
Identificação do Mycobacterium tuberculosis por PCR em Tempo Real
•Dificuldades na identificação de M. tuberculosis de amostras diretas em amostras extra pulmonares
•Presentes em baixa densidade e em baixo número em bacteremias intermitentes (Kiehn, T. JCM, 1986)
domingo, 30 de maio de 2010
Amostras Sensibilidade Especificidade VPP% VPP%Escarro 72,7 97,5 91,4 90,7LBA 82,1 97,4 89,4 82,1Urina 11.1 95,2 14,2 93,7Líquor 5,8 100 100 95,1Sangue 0 100 0 96,1Lavado gástrico
66,6 100 100 90
NAUCK, R,2004
Sensibilidade, Especificidade, Valor preditivo positivo e negativo de amostras pulmonares e extrapulmonares
Amostras Pulmonares : 3817 amostrasAmostras extra pulmonares : 622 amostras
domingo, 30 de maio de 2010
Identificação do Mycobacterium tuberculosis por PCR em Tempo Real
Desenvolvimento da detecção do M. tuberculosis conforme Takahashi, T (JCM, 2006),baseado no gene MPT64
domingo, 30 de maio de 2010
PCR convencional : 4,5%qPCR : 8,2%
Identificação do Mycobacterium tuberculosis por PCR em Tempo Real
Amostras de 139 LCRs: 3 detectadas por PCR convencional 7 detectadas por PCR Tempo Real
domingo, 30 de maio de 2010
•PCR em Tempo Real (Triplex) para a detecção de Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae
•N.meningitidis gene ctrA-transporte de cápsula polissacarídica
•Streptcoccus pneumoniae gene lytA responsável pela produção de autolisina
•Haemophilus influenzae gene bexA responsável pela expressão da cápsula polissácarídica
Meningites Bacterianas
domingo, 30 de maio de 2010
Aumentar a sensibilidade da identificação bacteriana
Implantação no LACEN-PR através da CGLAB-MS e Instituto Adolf Lutz
Implantado em Janeiro de 2008
Meningites Bacterianas
domingo, 30 de maio de 2010
PadronizaçãoMeningites Bacterianas
0
100
200
300
400
Cultura Látex qPCR
Comparação entre Latex e PCR em tempo real
Nº am
ostras LCR
Posi6vo Nega6vo
40 369 56 351 112 299
domingo, 30 de maio de 2010
PadronizaçãoComparação entre Latéx e PCR em Tempo Realem amostras de soro
0
13
25
38
50
Latex PCR em tempo realposi6vo nega6vo
8,3%29,16%
domingo, 30 de maio de 2010
PadronizaçãoDiagnóstico da Gripe Pandêmica H1N1
Pesquisa por PCR em Tempo RealProtocolo do CDC:
4 genes:
Gene da MatrizNucleoproteínaHemaglutinina
RnaseP
domingo, 30 de maio de 2010