Aulasprticasmicrobiologia adaptado

Material e Técnicas Básicas Utilizadas no Laboratório de Microbiologia

Normas de segurança• Uso de jaleco; • Desinfecção das mãos com solução germicida, água e sabão, após

contato com material microbiológico;

• Gestos bruscos;

• Contato de áreas desprotegidas com material infeccioso deve ser comunicado ao professor;

• Instrumental usado não deve ser desprezado sobre a bancada;

• Verificar posição da entrada de ar do bico de Bunsen;

Normas de segurança• Para abrir ou fechar tubos com material microbiológico, ou meio

de cultura a ser inoculado, segure-o com a mão esquerda, remova a

tampa com a direita retendo-a com o dedo mínimo;

• Ao terminar de usar o microscópio, desligá-lo;

• Lâminas utilizadas devem ser descartadas na travessa de vidro

sobre a bancada;

• Não abrir os meios de cultura que estiverem sobre a bancada sem

autorização do professor, para se evitar contaminações.

Cultura pura

Crescimento, em meio de cultivo adequado, de um conjunto de células idênticas, correspondentes a mesma espécie

Esterilização – eliminação de toda e qualquer forma de vida presente em determinado material ou ambiente.

Assepsia – uso de manobras assépticas, que são técnicas que impedem a entrada de micro-organismos onde não são desejados.

Prática 1Objetivos:

Identificar e manipular corretamente a vidraria principal e outros objetos de uso mais frequente em microbiologia;

Definir cultura pura, esterilização e asspsia;

Descrever as principais técnicas de manobras assépticas,

Desenvolver habilidade de manipular tubos com meios estéries, bem como transferir micro-organismos de meio sólido para meio sólido e para meio líquido;

Conscientizar-se da presença de micro-organismos no ambiente.

Execução1ª: Apresentação do material de laboratório: mostrar a vidraria principal (tubos, pipetas Pasteur, placas, etc)

2ª: Treinar manobras assépticas:

1 – Distribuição, de um tubo para o outro, caldo simples estéril, usando pipeta (2,0ml). Repetir quando a técnica não se mostrar adequada.

2 – Transferir uma porção do crescimento de Serratia sp crescida em tubo de agar inclinado contendo meio de agar simples, para outro meio idêntico, com auxílio de alça de inoculação.

3 – Transferir uma porção do crescimento de Serratia sp crescida em tubo de agar inclinado para meio líquido de caldo simples. Incubar os tubos no escuro por, no mínimo 48 horas.

3ª: Verificar a presença de micro-organismos no ambiente:

1 – Verter o meio de agar simples fundido em placa e esperar solodificar.

2 – Expor uma das placas durante 15 minutos ao ar.

3 – Com uma 2ª placa, realizar uma das seguintes opções:

1) Friccionar um swab na bancada e em seguida espqlhar o mesmo na superfície do agar;

2) Friccionar alguns fios de cabelo sobre o agar;

3) Tocar suavemente a superfície dos dedos na superfície do agar;

4) Soprar, tossir ou esperrar sobre a superfície do agar. Incubar as placas a temperatura ambiente por cerca de uma semana.

Interpretação dos resultados

2ª: Manobras assépticas

a) Leitura dos tubos de caldo simples estéreis, submetidos a transferência em condições assépticas: a observação de turvação no meio de cultura indica a presença de crescimento bacteriano, e portanto, manobra asséptica inadequada.


b) Leitura dos tubos de agar simples inclinado, inoculado com Serratia sp: a presença de crescimento vermelho-alaranjado indica Serratia sp; a presença de outro tipo de crescimento que não apresente a referida cor indica contaminação, e portanto, manobra asséptica inadequada.

c) Leitura dos tubos de caldo simples inoculados com Serratia sp: a observação de turvação no meio de cultura indica crescimento da Serratia sp, mas não permite verificar se houve ou não contaminação


3ª: Presença de micro-organismos no ambiente

Observar a presença de diferentes colônias na superfície das placas; observar os diferentes tipos de bactérias e fungos; preparar lâminas e observa-las ao microscópia. Distinguir os diferentes tipos microbianos.


Morfologia Colonial

• Pigmentação


Métodos Físicos e Agentes Químicos no Controle do Crescimento Microbiano:

Esterilização, Desinfecção e Antissepsia

O crescimento dos micro-organismo pode ser controlado através de métodos físicos e químicos.

Eliminação total ou parcial

Esterilização – Eliminação total dos micro-organismos presentes em determinado material ou ambiente.

Desinfecção – Inativação ou redução do número de micro-organismos presentes em material inanimado. A desinfecção não implica na eliminação de todos os micro-organismos viáveis, porém elimina a potencialidade infecciosa do objeto, superfícies ou local de trabalho. Assim, a desinfecção tem como objetivo eliminar os micro-organismos.

Antissepsia – Consiste no mesmo conceito de desinfecção, porém está relacionado com substâncias (antissépticos) aplicados em tecido vivo.

I – Métodos Físicos de Controle do Crescimento de Micro-organismos

Calor

1 – Calor úmido

Autoclave – utiliza o calor na forma de vapor d’água sob pressão. Destrói formas vegetativas e esporuladas (121ºC/15-30minutos). Usados para meios de cultivo, vidrarias, etc.

Água em ebulição – utiliza o calor na forma de vapor d’água livre. Destrói apenas formas vegetativas (100ºC/20minutos

Tindalização – utiliza o calor na forma de vapor d’água livre. Visa destruir formas vegetativas e esporuladas. É também denominado esterilização fracionada ou intermitente (100ºC/20min. Durante 3 dias consecutivos). Usado no preparo de alguns medicamento, vacinas, etc.

Pasteurização – Reduz as populações microbianas sem destruir necessariamente todas as formas vegetativas. Muito utilizado nas indústrias de alimentos (leite, cremes, cerveja, etc). Dois tipos:

- Alta temperatura – usa um tempo curto (15 seg.) a 72ºC

- Baixa temperatura – usa um tempo mais longo (30 seg) a 63ºC

2 – Calor SecoFornos ou estufas – utiliza o calor seco a 180ºC durante 1 ou 2 horas. Muito usado para vidrarias e para materiais danificáveis pela umidade como os metais ou óleos.

Flambagem – esteriliza agulhas e alças microbiológicas: aquecimento ao rubro

Incineração – para eliminar animais de laboratório

Radiações

Ultravioleta – o comprimento de onda mais efetivo para efeitos germicidas é entre 2600-2700A. Muito usado para salas cirúrgicas. O poder de penetração é muito baixo. Atua no DNA formando dímeros de timina.

Raios - empregado para materiais descartáveis e material cirúrgico termolábil. Método caro e perigoso. Uso industrial.

Filtração

Filtros bacteriológicos – empregados para esterilizar materiais termolábeis como soro, enzimas, etc. São filtros de materiais diversos como ésteres (acetato ou nitrato) de celulose e amianto

Prática 2Objetivos:

Conceituar os diferentes métodos de esterilização;

Comparar os diferentes métodos físicos de esterilização;

Listar alguns métodos de esterilização pelo calor;

Relacionar as finalidades da desinfecção e antissepsia;

Fazer apreciação dos diferentes agentes antissépticos;

Testar a eficácia da ação do calor e de agentes químicos sobre o crescimento microbiano

Execução

1ª - Teste da ação do calor sobre as bactérias: será verificada a ação de dois métodos diferentes de controle dos micro-organismos que empregam o calor úmido, autoclave e água em ebulição

Adicionar 1 a 2 gotas de cultura pura de bactérias (Bacillus subtilis ou Escherichia coli) a tubos contendo caldo simples e submetê-los aos seguintes tratamentos:

Tubo 1: controle, sem tratamento

Tubo 2: ferver 5 minutos em banho maria

Tubo 3: ferver 20 minutos em banho maria

Tubo 4: submeter à autoclavação durante 15 minutos.

Interpretação dos Resultados:

1ª - Ação do calor sobre bactérias. Observar os 4 tubos semeados na aula anterior. A turvação do meio de cultura, ou a presença de uma película na superfície do meio, indica a presença do crescimento bacteriano.

Avaliar a eficiência dos tratamentos comparando o crescimento em relação ao tubo 1 (controle).

Comparar os resultados obtidos com cada uma das duas espécies bacterianas: B. Subtilis e E. coli. As culturas de B. Sutilis, por serem esporuladas, são muito mais resistentes e só são destruídas por autoclavação. Já as formas vegetativas de ambas as culturas são destruídas em banho-maria.

Escherichia coli X Bacillus

II – Metodos Químicos de Controle de Crescimento Microbiano

• Antisséptico – usado em tecidos vivos para inibição do crescimento (álcool iodado)

• Desinfetante – inibe o crescimento de microorganismos (formas vegetativas) em material inanimado (fenol, etanol)

• Antimicrobianos – utilizado para o tratamento de doenças infecciosas (Penicilinas, cloranfenicol)

Toxidade seletiva – atuação sobre microrganismos sem afetar celulas

hospedeiras

Fenóis e derivados (fenol, cresol) - desnaturação de proteínas

Álcoois (metílico, etílico, propílico) - solvente para lipídios- desnatura e coagula proteínas

Compostos de cloro (hipoclorito de sódio, cloramina, cloro)

- se combina com proteínas- agente ocidante

Tintura de iodo, água sanitária, permanganato de potássio

- agentes oxidantes

Detergentes (lauril sulfato de sódio) - rompe membrana celular- altera permeabilidade celular- diminui tensão superficial

Corantes (cristal violeta) - tem afinidade por ácidos nucleicos

Óxido de etileno (gás esterilizante) - agente alquilante- ativo contra formas vegetativas e esporulados. Usado na preservação de alimento, esterilização de material plástico, equipamentos médicos etc. Desnatura proteínas e danifica DNA e RNA (ação mutagênica)

Agentes

Mecanismo de ação

2ª - Teste da eficácia da ação de agentes químicos (antissépticos) sobre os micro-organismos. Será demonstrada a ação do álcool, álcool iodado, detergentes, água sanitária, etc. Sobre o crescimento de Serratia sp (técnica do polegar)

1 – Em placa de petri contendo meio de cultura, delimitar 3 regiões, utilizando lápis cera. Marcar as regiões 1, 2 e 3;

2 – Sobre a superfície do meio, comprimir ligeiramente o polegar na região 1, tomando cuidado para não ferir o agar;

3 – Umidece o polegar no papel de filtro embebido com cultura de Serratia e comprimi-lo ligeiramente na região 2;

4 – Lavar o polegar utilizando qualquer um dos agentes antissepticos a sua escolha ( alcool, alcool iodado, detergente ou água santária);

5 – Secar o polegar ao ar e novamente comprimi-lo ligeiramente na região 3;

6 – Anotar o composto utilizado. Identificar a placa. Embrulhar com papel e incubar a temperatura ambiante (25-28ºC) por 24/72h;

Prática 2

Interpretação dos Resultados:

2ª - Teste da ação dos agente antissépticos. Observar a placa da aula anterior, e verificar o crescimento bacteriano nas quatro regiões. Comparar a eficiência dos diferentes antiossépticos usados pelos colegas.

Assunto 3: Exame Microscópio de Micro-organismos

300 nm a 1 m

Bactérias e Arqueas

Fungos Protozoários Algas

10 m a 100 m

Pox vius Herpes vius

27 nm a 300nm 0,2 mm0,2 mm

Bactérias e Arqueas

Fungos Protozoários Algas

Microscopia óptica, corada pelo método de Gram, de cocos em um arranjo denominado estafilococos.

Microscopia eletrônica de varredura das células apresentadas acima.

Pox vius Herpes vius

Varredura

Transmissão

Varredura

Transmissão

Principais tipos de preparações microscópicas para visualizar micro-organismos

Colorações

SIMPLESPositivaNegativa

DIFERENCIAL

SEPARAÇÃO DE GRUPOS

Coloração de Gram

Coloração de Ziehl-Neelsen – Alcool-ácido resistente

VISUALIZAÇÃO DE ESTRUTURAS

Esporos

Cápsulas

Flagelo

Tipos de coloração utilizadas em Tipos de coloração utilizadas em microscopia ópticamicroscopia óptica

POSITIVA – corantes carregados positivamente

(núcleo superfície)

Ex: Giemsa

NEGATIVA – corante acídico (lâmina)

Ex: Nanquim

T. cruzi

Plasmodium falciparum

C. neoformans

COLORAÇÃO SIMPLES

Uso de apenas 1 corantes

Coloração de Ziehl-Neelsen

Dificulta a penetração de vários corantes –

grande hidrofobicidade

COLORAÇÃO DIFERENCIADA

Uso de apenas 2 corante

Solução àlcool-ácido

(etanol 95% + HCL concentrado)

5 min, aquecendo

Água destilada

CarbolfucsinaCarbolfucsina

Até o líquisdo

que pararmde

sair colorido

Água destilada

Azul de Metileno

Água destilada

2 min

Papel de filtro e micorscópio óptico

Coloração de Ziehl-Neelsen

COLORAÇÃO DIFERENCIADA

Uso de apenas 2 corantes

LugolLugol (mordente – forma complexo insolúvel com o corante

primário-iodo para-rosalina)

1 min

Água destilada

Cristal VioletaCristal Violeta(cora o citoplasma de púrpura, independentemente do tipo de

célula)

1 min

Água destiladaEtanol a 95% (álcool-acetona ou ambos: solvente lipídico

Água destilada

Safranina Safranina (cora o citoplasma de (cora o citoplasma de vermelho)vermelho)

45 seg Água destilada


Coloração de Gram

Gram +Gram +

Gram -Gram -

Formase

Arranjos(eubactérias)

Prática 3

Objetivos:

Manusear adequadamente um microscópio ótico;

Conhecer os principais métodos de observação microscópica de

micro-organismos;

Distinguir,morfologicamente, bactérias, leveduras, bolores e

protozoários;

Identificar os principais tipos morfológicos das bactérias;

Discutir a importância do método de Gram na identificação de

micro-organismos;

Execução:1ª - Observação microscópica de lâminas prontas

a) Esporos de Bacillus megaterium (cultura com mais de 48 horas de crescimento), coradas pelo método de Schaeffer fulton (célula corada de vermelho (safranina) e esporos corados de verde (verde malaquita)

b) Bactérias coradas pelo Gram: B. subtilis, S. aureus (Gram positiva e E. coli (Gram negativa)

2ª- Preparação de lâminas para observações microscópicas

1) Preparação a fresco de E. coli. Após flambar a alça, colocar uma gota de suspensão bacteriana em uma lâmina, cobrir com lamínula. Adicionar uma pequena gota de óleo de cedro e observar com objetiva de imersão (100x)

2) Preparação a fresco de Sccharomyces cerevisiae. Retirar, com uma alça flambada, uma porção do crescimento da levedura e suspender em uma gota de solução salina em uma lâmina. Cobrir com lamínula e observar com objetiva de 40x.

3) Preparação a fresco de Aspergillus versicolor. Cuidadosamente, para não alterar as estruturas fúngicas, retirar com alça flambada uma porção do crescimento do fungo e suspender em uma gota de solução salina, em uma lâmina. Observar entre lâmina e lamínula com objetiva de 40x.

4) Preparação a fresco de Herpetomonas sp. Retirar, com uma alça flambada, uma porção do crescimento em meio líquido do protozoário e colocar sobre uma lâmina. Cobrir cuidadosamente com uma lamínula. Observar com objetiva de 40x.

5) Coloração de Gram

Colocar uma gota de salina sobre a lâmina. Com alça flambada retirar uma pequena porção da cultura e colocar na gota de salina, espalhar obtendo um esfregaço. Deixar secar.

Fixar o esfregaço na lâmina, presa ao pregador, passando-a na chama do bico de Bunsen

LugolLugol (mordente – forma complexo insolúvel com o corante primário-

iodo para-rosalina)

1 min

Água destilada

Cristal VioletaCristal Violeta(cora o citoplasma de púrpura, independentemente do tipo de célula)

1 min

Água destiladaEtanol a 95% (álcool-acetona ou ambos: solvente lipídico

Água destilada

Safranina Safranina (cora o citoplasma de (cora o citoplasma de vermelho)vermelho)

45 seg Água destilada


3ª- A partir das placas expostas (ar, bancada, dedo, boca, etc) observar diversos tipos de colônias crescidas. Com o auxílio do professor escolher uma colônia de bactéria e outra de fungo, para estudo.

a) Colônia de bactéria: Realizar coloração de Gram.

b) Colônia de fungo: Preparar lâmina a fresco com solução salina.

Interpretação dos Resultados (Leitura)

1ª – Observação de lâminas prontas:

1) Observação de lâminas de Bacillus megaterium. Distinguir os esporos, corados em verde das células vegetativas, coradas em vermelho. Observar esporos dentro e fora da célula.

2) Observação de lâminas de bactérias coradas ao Gram. Distinguir o tamanho, a forma (coco ou bacilo) e a reação ao Gram, roxas, Gram (+) ou vermelhas, Gram (-). Observar algum arranjo característico.


2ª – Observação de lâminas preparadas pelo aluno:

1) Observar, na preparação a fresco de E. coli, seu tamanho relativo, sua forma e sua locomoção.

2) Observar S. cerevisiae quanto a forma, tamanho relativo e a presença ou ausência de brotamento.

3) Observar A. versicolor quanto ao tamanho. Identificar o micélio, hifas septadas ou não, e se possível as estruturas que contêm os esporos.

4) Observar Herpetomonas sp quanto ao tamanho e capacidade de locomoção.

5) Observar as lâminas coradas pelo Gram, como em 2), 1 parte.


3ª – Observação de colônias desconhecidas de micro-organismos do ambiente:

- Observar ao microscópio as lâminas preparadas pelo próprio aluno. De acordo com as características observadas tais como tamanho, forma, Gram, presença de hifas, etc. Confirmar tratar-se de bactéria, levedura ou fungo.

Assunto 4: Técnicas de Isolamento e Contagem de Micro-organismos:

Obtenção de Cultura Pura

Meios de Cultura: Destinam-se ao cultivo artificial dos micro-organismos e portanto devem fornecer os nutrientes indispensáveis ao seu crescimento. Normalmente contém uma fonte de C, N e sais minerais, além de fatores de crescimento, para o caso de micro-organismos exigentes.

Meio de enriquecimento: Adequado ao crescimento de micro-organismos heterotrófico mais exigentes em termos nutritivos, tais como os patogênicos. Costuma-se adicionar sangue, soro, extrato de plantas ou animais. Ex.: B.H.I (Brain Heart Infusion), para protozoários.

Meio Seletivo: Adequado ao isolamento de um grupo particular de micro-organismos, através da adição de substâncias químicas que vão inibir certos grupos sem afetar outros, ou, ao contrário, facilitar certos grupos e não outros. Ex.: adição de antibióticos, de fonte de C específicas, como a celulose para celulolíticos

Meio diferencial: Através da adição de certos reagentes ao meio, após inoculação e incubação, poder-se-á observar uma modificação que permita diferenciar tipos de bactérias. Ex.: meio BEM para diferenciar E. coli, meio de agareur manitol sal para diferenciar Staphylococcus aureus, meio de Teaguer, que diferencia bactérias lactose positivas (escuras) das lactose negativa (claras).

MacConkey – Lactose+ - rosa

EMB – E. coli – verde metálico

Agar manitol sal – S. aureus – amarelo ouro

Obtenção de culturas puras

Isolamento:

técnica de semeadura por esgotamento, e diluições em placas com meio sólido.

Esgotamento:Consiste em espalhar, com auxílio de alça de

inoculação, suspensão de micro-organismos na superfície do meio de cultivo sólido, em três setores distintos, de modo que a quantidade de material contida na alça seja progressivamente menor.

Passos para o sucesso do esgotamento:

a) realizar o maior número de estrias possíveis;b) não perfurar o meio;c) não voltar com a alça sobre as estrias;d) utilizar pequena quantidade de material

para semear

Esgotamento

Técnica de Diluição para obtenção de cultura pura e contagem de colônias

Prática 4

Objetivos:

Mostrar ao aluno os métodos de obtenção de cultura pura;

Treinar o aluno na execução da técnica de esgotamento;

Execução: 1ª - Técnica do esgotamento para o isolamento de bactérias (obtenção de cultura em meio sólido)

a) Utilizar a suspensão mista de bactérias (Serratia sp + Micococcus sp) a ser distribuída pelo professor;

b) Flambar a alça e retirar com ela uma pequena gota da suspensão mista de bactérias; semeá-las sobre a superfície de um meio (agar simples) em placas. A semeadura deve ser feita por estrias, de acordo com o esquema, na seguinte sequência.

1ª operação: colocar a gota na superfície do meio e passar a alça em zig-zag sem tocar no meio já semeado, cobrindo outro 1/3 da placa;

2ª operação: mudar a direção do estriamento para a 2ª região da placa, com o mesmo cuidade da região 1, cobrindo outro 1/3 da placa

3ª operação: mudar a direção da estriamento para a parte final do meio, sem tocar na superfície já semeada.

c) Embrulhar as placas e incubar na estufa a 37°C por 24 horas.


1) Observar o aparecimento de colônias isoladas nas placas de agar simples semeadas. Notar o aparecimento de dois tipos deferentes de colônias. Observar, cor, forma, tamanho, borda, etc.

2) Retirar com agulha flambada, uma porção de uma colônia escolhida e transferir assepticamente para o tubo de agar simples inclinado, fazendo estrias na superfície do agar. Anotar o nome do aluno e incubar a 37°C por 24 horas.

3) Após este tempo, observar a cultura crescida no tubo de agar inclinado, verificando sua pureza através do aspecto homogêneo. Confirmar a pureza realizando Gram e observar a mesma forma e reação ao Gram de todas as células observadas.

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