Hereditariedade ligada aos CROMOSSOMAS SEXUAIS

Thomas H. Morgan – embriologista, desenvolveu trabalho com as moscas Drosophila

Melanogaster (mosca da fruta).

Razões para o uso de Drosophila Melanogaster:

Apresenta um curto período de desenvolvimento e apresenta cromossomas muito grandes,

que facilitam o seu estudo e observação.

Aspeto da Drosophila

Melanogaster Forma selvagem Forma mutante

Corpo cinzento Olhos vermelhos

Asas longas

Corpo negro Olhos brancos Asas vestigiais

Representamos a constituição genética das formas alternativas pela letra inicial da palavra inglesa que expressa a característica que elas manifestam.

Exemplo: alelo para olhos brancos -> w (white). Quando é da forma selvagem é w+. Nas experiências de Mendel não era relevante que um determinado fenótipo pertencesse a

uma fêmea ou a um macho – o cruzamento recíproco não interferia nos resultados. Os resultados obtidos por Morgan eram diferentes – ao cruzar uma fêmea de olhos

vermelhos com um macho de olhos brancos não obtinha os mesmos resultados de quando cruzava uma fêmea de olhos brancos com um macho de olhos vermelhos.

No 1º cruzamento todos os indivíduos apresentavam olhos vermelhos, sendo 50% machos e 50% fêmeas – de acordo com o previsto por Mendel. ☺

No 2º cruzamento as fêmeas têm todas olhos vermelhos e os machos olhos brancos – não se verifica a uniformidade fenotípica dos indivíduos da primeira geração. �

COMO EXPLICAR? Na Drosophila, como na maioria das espécies animais, existe um par de cromossomas

chamado cromossomas sexuais.

Indivíduos que apresentam dois cromossomas sexuais idênticos

HOMOGAMÉTICOS

Indivíduos que apresentam dois cromossomas sexuais diferentes entre si

HETEROGAMÉTICOS

Como a espécie humana, as fêmeas de Drosophila, para além dos autossomas, apresentam dois cromossomas sexuais X, enquanto que os machos apresentam, para além dos autossomas, um cromossoma sexual X e outro, mais curto e praticamente desprovido de genes, Y.

O sexo heterogamético é portanto o masculino. Se considerarmos que o alelo da cor branca dos olhos de Drosophila se localiza no

cromossoma X, podemos justificar o resultado dos dois cruzamentos. As características hereditárias que dependem de genes localizados no cromossoma X são

características ligadas ao sexo. Nestes casos, os resultados obtidos no cruzamento direto e no seu recíproco são

diferentes. Estes resultados devem-se ao facto de o cromossoma Y do macho não possuir os alelos correspondentes do cromossoma X, dado que os dois cromossomas não são totalmente homólogos.

A maior parte dos genes localizados no cromossoma X não têm alelo correspondente no cromossoma Y, pelo que existe um único alelo para esse gene e esse alelo exprime-se sempre no fenótipo dos machos, que são hemizigóticos.

Os genes presentes no cromossoma Y são transmitidos DE PAI PARA FILHO. Os genes presentes no cromossoma X são transmitidos de PAI PARA FILHA e de MÃE PARA FILHO OU FILHA.

Transmissão de um alelo DOMINANTE

ligado ao cromossoma X Transmissão de um alelo RECESSIVO

ligado ao cromossoma X

O caráter exprime-se sempre nos homens, de uma forma mais severa do

que nas mulheres

O caráter exprime-se sempre nos homens

O caráter exprime-se nas mulheres homozigóticas dominantes e

heterozigóticas

O caráter exprime-se apenas nas mulheres homozigóticas recessivas ( e

nos homens?)

Um homem afetado tem uma mãe afetada

Uma mulher afetada tem uma mãe afetada ou um pai afetado

Um homem afetado tem uma mãe afetada ou portadora

Uma mulher afetada tem obrigatoriamente um pai afetado e

uma mãe afetada ou portadora

Síndrome de Rett, hipertricose Daltonismo, hemofilia, diabetes

insípidos

Os trabalhos de Morgan são exceções às Leis de Mendel – contudo, apoiaram a teoria

cromossómica da hereditariedade.

Descrição Exemplos de situações em que

se verifica

Ligação fatorial

Os genes localizados no mesmo cromossoma, não sofrem geralmente, segregação independente na meiose – ficam juntos nos mesmos gâmetas e, por isso, os fenótipos da descendência não seguem as proporções previstas pelas Leis de Mendel. Os fenómenos de crossing-over podem separar genes ligados, o que faz com que se comportem como se estivessem localizados em cromossomas diferentes e apareçam recombinados na descendência. Quanto mais distantes estiverem dois genes no mesmo cromossoma, maior a probabilidade de serem separados por crossing-over.

O gene do grupo sanguíneo Rh e o gene da eliptocitose (uma forma de anemia) estão localizados no mesmo cromossoma. Estes dois cromossomas são herdados em bloco por 96% dos indivíduos e 4% dos indivíduos são recombinantes.

Explicação do manual Cada cromossoma tem de ter muitos genes. Os genes que se dispõem linearmente ao longo do mesmo cromossoma dizem-se em

linkage e constituem um grupo de ligação fatorial – são transmitidos em bloco.

Cruzam-se indivíduos de duas linhas puras com características antagónicas.

Fenotipicamente Corpo negro e asas vestigiais

x Corpo cinzento e asas longas

Genotipicamente bbvgvg x b+b+vg+vg+

b – símbolo do alelo responsável pela cor negra (black) vg – símbolo do alelo responsável pelas asas vestigiais ( vestigials) b+ - símbolo do alelo responsável pela cor selvagem (cinzenta – DOMINANTE) vg+ - símbolo do alelo responsável pela forma selvagem das asas (longas – DOMINANTE)

O cruzamento destas linhas puras resulta numa geração F1 – cujos resultados correspondem a uma situação normal de diibridismo, em que os descendentes são HETEROZIGÓTICOS e manifestam as características do ALELO DOMINANTE.

Fenótipo – Corpo cinzento e asas longas Genótipo – heterozigótico b+bvg+vg

para que se mantivessem as previsões mendelianas, deviam agora surgir quatro classes fenotípicas, que seriam: Fenótipo dos

descendentes

Resultados

esperados em

diibridismo

Resultados

observados

Corpo cinzento e asas longas

9/16 3/4

Corpo negro e asas longas

3/16 -

Corpo cinzento e asas vestigiais

3/16 -

Corpo negro e asas vestigiais

1/16 1/4

Estes resultados são explicados pelo

facto de os alelos do corpo negro e asas

vestigiais estão situados no mesmo

cromossoma – são transmitidos em

conjunto (não há segregação

independente prevista por Mendel) –

correspondem a um cruzamento de

Linhas puras em monibridismo.

Nem sempre os genes em linkage se comportam como uma unidade inseparável – pode acontecer, que como resultado de crossing-over durante a meiose, os genes se separarem, como se estivessem em cromossomas separados.

Assim, obtém-se uma descendência qualitativamente igual à prevista numa segregação independente (em que os alelos são segregados de forma aleatória). Contudo, estes genes só se transmitem deste modo quando há a sua separação em crossing-over, e isto ocorre muito menos frequentemente que a transmissão em bloco.

Embora possam surgir as 4 classes fenotípicas esperadas, as suas proporções são completamente aleatórias.

Organização e regulação do material genético

Genoma – totalidade do material genético de um indivíduo (contém todos os genes). Gene – sequência de nucleótidos de uma molécula de DNA que origina uma molécula de

RNA funcional. Organização do Material Genético

Genoma dos procariontes Genoma dos eucariontes

Molécula circular de DNA associada a proteínas

não histónicas, que forma o seu único

cromossoma e se concentra na região do nucleoide. Algumas bactérias também possuem moléculas circulares de DNA chamadas plasmídeos.

Várias moléculas lineares de DNA nuclear associadas a uma grande quantidade de proteínas, especialmente histonas, formando a cromatina. Cada molécula de DNA associada a proteínas constitui um cromossoma. Também possui material genético extranuclear. As mitocôndrias e cloroplastos contêm DNA que codifica produtos essenciais à sua função biológica e que é muito semelhante ao DNA bacteriano.

Um cariótipo organiza os cromossomas metafásicos aos pares com base no seu tamanho e noutras marcas físicas, como a posição do centrómero.

O cariótipo humano tem 46 cromossomas, organizados em 23 pares. 44 são autossomas e são idênticos nos dois sexos (possuem os mesmos genes, na mesma

sequencia) e 2 são heterossomas (ou cromossomas sexuais). A análise do cariótipo é útil para confirmar diagnósticos clínicos de certas doenças de

transmissão hereditária – a comparação de cariótipos de diferentes espécies permite encontrar relações evolutivas.

Regulação do material genético Temos muitos genes no nosso corpo, mas só apenas alguns se manifestam. Tem de haver

portanto uma regulação dos genes. Este processo foi estudado pelos franceses François Jacob e Jacques Monod.

Os organismos unicelulares reagem às variações do meio ambiente, variando a expressão dos genes e ajustando o seu metabolismo – desenvolveram mecanismos de resposta RÁPIDOS face às alterações das condições do meio, das quais dependem muito.

Nos eucariontes multicelulares, o controlo da expressão dos genes torna possível que as

células com o mesmo DNA possam divergir (em forma e função), tornando-se especializadas. A transcrição do DNA para mRNA é um exemplo da regulação da expressão dos genes.

Modelo do Operão (principal mecanismo de controlo da expressão dos genes em bactérias)

Operão Unidade funcional constituída pelos elementos descritos abaixo.

Genes estruturais

Conjunto de genes que codificam proteínas com funções relacionadas. Ex.: enzimas de uma determinada via metabólica

Gene promotor

Sequência específica de nucleótidos do DNA à qual se liga a RNA polimerase e onde tem início a transcrição

Gene operador

Sequência de DNA que controla o acesso da RNA polimerase ao promotor e que permite ativar ou desativar a transcrição de todos os genes estruturais

Gene regulador

Encontra-se a uma determinada distância do operão, tem o seu próprio promotor e codifica o repressor

Repressor É uma proteína alostérica com duas formas, uma ativa e uma inativa. É específico, reconhece e liga-se apenas ao operador de um determinado operão.

Explicação do funcionamento do operão lac.:

Funcionamento de um operação do tipo indutivo

NA AUSÊNCIA DE LACTOSE NA PRESENÇA DE LACTOSE

O gene regulador determina a síntese de um repressor; O repressor bloqueia o promotor, ao ligar-se ao operador; A enzima RNA polimerase não se liga ao promotor; Os genes estruturais não são transcritos;

Não ocorre a síntese das três enzimas.

A lactose liga-se ao repressor, inativando-o; O operador fica desbloqueado; A enzima RNA polimerase liga-se ao promotor; Os genes estruturais são transcritos;

Dá-se a síntese de enzimas.

Explicação do funcionamento do operão trp.:

Muitos genes de um genoma se destinam a regular o funcionamento de outros genes. Os genes que se expressam numa determinada situação dependem das interações que o

ambiente estabelece com o DNA.

Transmissão Genética de Genes Mitocôndriais

O material genético contido nas mitocôndrias é transmitido pela mãe para os filhos e filhas. A razão para este facto é simples: o citoplasma (e todos os seus constituintes) que vai dar origem ao zigoto é proveniente do oócito (tem, portanto, todos os organelos celulares da mãe – incluindo a mitocôndria!); o espermatozoide, apenas contribui com o núcleo para a formação do zigoto, pelo que não são transmitidas as mitocôndrias do progenitor masculino.

Funcionamento de um operação do tipo repressivo

NA AUSÊNCIA DE TRIPTOFANO NA PRESENÇA DE TRIPTOFANO

O gene regulador produz um repressor que está inativo; O operador está livre; A RNA polimerase pode ligar-se ao promotor; Dá-se a transcrição;

Ocorre a síntese de enzimas.

O triptofano liga-se ao repressor, ativando-o; O repressor liga-se ao operador; A RNA polimerase não pode ligar-se ao promotor; Não se dá a transcrição;

Não se sintetizam as enzimas.

Diferenças e semelhanças entre o DNA mitocondrial e o DNA nuclear.

DNA mitocondrial DNA nuclear Não possui exões Possui exões Não ocorre crossing-over Ocorre crossing-over Possui várias cópias de DNA em cada mitocôndria, permitindo que na mesma célula existam diferentes alelos para o mesmo gene

Só possui uma cadeia (com dupla hélice) de DNA no núcleo da célula

Taxa de mutação muito elevada Taxa de mutação pouco elevada Não possui enzimas que reparam o DNA Possui enzimas que reparam o DNA

Mutações

Mutação – alteração permanente no material genético que afeta a expressão de um ou mais genes.

Apesar de se darem centenas de alterações do DNA por dia, as células possuem enzimas capazes de corrigir ou eliminar porções mutadas do DNA, diminuindo a hipótese de esta ser uma mutação que se manifeste fenotipicamente. Podem ser génicas ou cromossómicas.

m. génicas – alteram a estrutura do

DNA; m. cromossómicas – alteram a

estrutura/número de cromossomas; m. silenciosas – não alteram a

proteína ou a sua ação; m. letais – provocam a morte ou

doenças e anomalias; m. benéficas – levam à evolução

das espécies; m. prejudiciais – provocam a

morte do indivíduo. Agentes mutagénicos são fatores do meio que provocam mutações em genes e/ou

cromossomas.

As mutações podem ocorrer em células somáticas ou germinativas. Mutação somática ���� Ocorre durante a replicação do DNA que precede uma divisão mitótica. ���� Pode originar um conjunto ou um clone de células mutantes identicas entre si, que se

distinguem das restantes células do indivíduo. ���� A descendência do indivíduo não é afetada. ���� Este tipo de mutação está na origem de certos cancros. Mutação nas células germinativas ���� Ocorre durante a replicação do DNA que precede a meiose. ���� A mutação afeta os gâmetas e todas as células que dela descendem após a fecundação. Mutações génicas Ocorrem quando se dá uma alteração pontual ao nível dos nucleótidos de um gene,

constituindo-se uma nova versão do gene. Alteram a sequencia de nucleótidos do DNA, por substituição, adição (inserção) ou

remoção (delecção) de bases. Estas mutações podem conduzir à modificação da molécula de mRNA que é transcrita a

partir do DNA e à alterção da proteína produzida. O efeito desta alteração é imprevisível, dependendo de qual o tipo de mutação e qual a proteína que passa a ser codificada. Pode ter efeitos benéficos e levar à evolução da espécie, ou pode ser prejudicial e causar a morte do indivíduo ou um grande numero de doenças e anomalias. Pode também ter um efeito neutro, não causando quaisquer modificações.

Mutações génicas

Substituição Ocorre a troca de um ou mais pares de bases.

Inserção

Acontece quando uma ou mais bases são adicionadas ao DNA, modificando a ordem de leitura da molécula durante a replicação ou transcrição.

A adição/remoção de um numero que não seja múltiplo de três altera completamente a mensagem do gene.

Delecção

Acontece quando uma ou mais bases são retiradas do DNA, modificando a ordem de leitura, durante a replicação ou transcrição.

Mutações cromossómicas Traduzem-se numa alteração da estrutura ou do número de cromossomas. Podem afetar

uma determinada região de um cromossoma, um cromossoma inteiro ou todo o complemento cromossómico de um indivíduo.

Mutações cromossómicas numéricas

Tipo de mutação

Definição/causas Consequências/exemplos P

olip

loid

ia Existe pelo menos um conjunto completo de

cromossomas a mais.

É comum nas plantas. As plantas poloplóides podem autopolinizar-se ou cruzar-se com plantas semelhantes. Nos humanos embiões poliploides não se desenvolvem e são abortados espontaneamente. Algumas células somáticas podem ser poliploides.

Entre as causas possiveis: -fecundação de um oócito por 2 espermatozoides; -fecundação de um gâmeta diploide (triploidia); -falta de divisão do zigoto após a replicação dos cromossomas

An

eu

plo

idia

Existem cromossomas a mais ou a menos

em relação ao numero normal.

Geralmente, envolve apenas um par de cromossomas e pode ser autossómica ou nos cromossomas sexuais. Podem distinguir-se: Polissomia – um ou mais cromossomas extra; Monossomia – um cromossoma em falta;

Anuploidias mais comuns em seres humanos são as trissomias dos cromossomas 21, 13, 18 e a monossomia do X. Aneuploidias de outros cromossomas não permitem o desenvlvimento até ao nascimento e resultam num aborto espontâneo. As aneuploidias nos cromossomas sexuais são melhor toleradas que as dos autossomas. Síndrome.

As aneuploidias são causadas pela não-disjunção dos cromossomas homólogos ou dos cromatídeos na anafase da meiose I ou II. Um gâmeta recebe 2 cromossomas do mesmo par e outro não recebe nenhum.

Sindromes estudadas: Trissomia 21 – (47,XX) ou (47,XY) – SÍNDROME DE DOWN Cromossoma extra no ‘lote’ 21. Monossomia do X – (45,X0) – SÍNDROME DE TURNER Afeta apenas mulheres, que carecem de um dos cromossomas sexuais. (47,XXY) – SÍNDROME DE KLINEFELTER

Mutações cromossómicas estruturais Tipo de

mutação Definição/Causas Consequências/Exemplos

Delecção

Representa uma perda no material cromossómico. As delecções visíveis de cromossomas humanos estão sempre associadas a grandes incapacidades.

Duplicação

Caracteriza-se pela repetição de uma porção de cromossoma. As duplicações são alterações cromossómicas muito importantes sob o ponto de vistaa evolutivo, porque fornecem informação genética complementar, potencialmente capaz de assumir novas funções.

Translocação

Ocorre uma inversao quando um segmento cromossómico experimenta uma rotação de 180º em relação à posição normal, sem alterar a sua localização no cromossoma.

Inversão

A transferencia de uma porção de um cromossoma, ou mesmo de um cromossoma inteiro para outro não homólogo designa-se por translocação simples. As translocações mais comuns são as translocações recíprocas, havendo troca de segmentos entre cromossomas não homólogos. As translocações podem alterar drasticamente o tamanho dos cromossomas, assim como a posição do centrómero.

Poliploidia Os inivíduos poliploides são indivíduos em que o número de conjuntos completos de

cromossomas é multiplo do numero haploide primitivo existente nos gâmetas. Apresentam cariótipos triploides (3n), tetraploides (4n) ou mesmo numeros mais elevados de cromossomas.

A poliploidia surge: - acidentalmente; - a partir da não-disjunção dos cromossomas durante a meiose ou mitose. Também pode

acontecer que não há citocinese na repartição dos cromossomas pelas células filhas. - cruzamento entre indivíduos de espécies diferentes (o que é muito comum entre as

plantas) – os indivíduos resultantes deste processo são naturalmente estéreis, uma vez que não possuem cromossomas homologos, não podendo estes emparelhar durante a meiose.

Como é que estes indivíduos se reproduzem então?

Através de reprodução assexuada – no caso dos individuos que resultam do cruzamento entre espécies diferentes, estes acabam por tornar-se ferteis apos algumas gerações, devido a uma ocorrencia de uma duplicação cromossómica resultante de uma não-disjunção dos cromossomas na divisão celular.

A poliploidia é muitas vezes provocada em laboratório para que se obtenham plantas mais resistentes, com grandes frutos, sem caroço ou sementesm grãos de trigo maiores, etc.

As Mutações, a tecnologia e a vida Um agente mutagénico é qualquer agente responsável por uma mutação. O processo que conduz ao aparecimento de mutações pelo agente mutagénico é a

mutagénese. As nossas células tem a capacidade de reparar alguns danos causados ao DNA. Há portanto,

um equilíbrio entre a proliferação celular, em que as células se renovam e multiplicam e entre a morte das células.

Apesar disso, este equilíbrio por vezes perde-se – umas das consequências é o aparecimento de um cancro.

Um cancro (neoplasia maligna/tumor maligno) é um conjunto muito heterogéneo e multifatorial de doenças que têm em comum o facto de apresentarem sempre o crescimento de um tecido neoformado.

Outra definição O cancro é uma doença genética que resulta da perda de controlo do ciclo celular. A divisão

da célula com mais frequência dá origem a uma população de células em proliferação descontrolada e forma um tumor.

As células cancerosas: -são pouco especializadas e com forma arredondada; -dividem-se continuamente; -invadem os tecidos adjacentes; -podem instalar-se noutros lugares do organismo. O aparecimento de cancros está normalmente associado a alterações dos mecanismos que

regulam a divisão celular. Necrose – as células morrem devido à ação de substâncias tóxicas ou à falta de nutrientes

essenciais. Apesar de manterem o núcleo intacto, aumentam de volume, rompe-se a membrana plasmática e verte-se o conteúdo da célula no meio extracelular, causando uma pequena inflamação.

Apoptose – ocorre um conjunto de fenómenos programados geneticamente e que levam à morte da célula – processo mais comum. Quando as células apresentam anomalias – sobretudo genéticas – ou já não são necessárias ao organismo, desencadeia-se um “suicídio” por parte das células.

1. A cromatina começa a condensar; 2. A célula isola-se das células vizinhas,

compactando o citoplasma e a cromatina; 3. Uma enzima (endonuclease/enzima de

restrição) fragmenta o DNA em pequenas unidades; 4. A célula fragmenta-se sem que ocorra rutura

nem resposta inflamatória. Quando este equilíbrio, entre a divisão celular e a apoptose é quebrado, pode surgir um

cancro. As neoplasias têm origem genética, pois resultam de

alterações no DNA.

No caso de as alterações se darem a nível dos proto-oncogenes:

Estes são genes que estimulam a divisão celular, mas que estão inativos em células que não se dividem. Devido à ação de agentes mutagénicos podem tornar-se ativos, e passam a estimular permanentemente a divisão celular, passando a oncogenes.

No caso de as alterações se dares ao nível dos genes supressores tumorais: Estes genes têm a função de regulam a proliferação celular, contrabalançando a ação dos

proto-oncogenes, inibindo-os. Estes genes estão normalmente ativos (bloqueiam a divisão celular), mas devido à influencia de agentes mutagénicos podem desativá-los, fazendo com que as células se continuem a dividir.

As infeções por vírus contribuem para o aparecimento de cancro pela integração do material genético do vírus no DNA das células infetadas. O DNA viral pode ser inserido num local onde destrua a atividade de um gene supressor tumoral ou converta um proto-oncogene num oncogene.

Todos os cancros são genéticos, mas quase nenhuns são hereditários. Nestes casos, a alteração genética está presente em todas as células do indivíduo, manifestando-se muito cedo.

A maioria dos cancros é esporádica (95%) e surgem como resultado de mutações nas células somáticas. Estas alterações são promovidas pela interação entre o genoma do indivíduo e o ambiente.

As componentes genética e ambiental estão sempre presentes, apesar de nem sempre assumirem igual importância.

Ex: melanoma – radiações solares + alteração de um gene supressor tumoral (MTS) localizado no cromossoma 9.

Todos os dias surgem neoplasias no nosso corpo, que são eliminadas por apoptose. Quando isto não acontece, inicia-se um cancro, que corresponde ao momento em que estas células se proliferam e invadem tecidos vizinhos.

Pode seguir-se um processo de metastização, em que as células cancerosas se podem movimentar através da corrente sanguínea ou linfática e continuar a desenvolver-se noutras partes do corpo.

Fundamentos da Engenharia Genética

A engenharia genética permite manipular diretamente os genes de determinados

organismos com objetivos práticos. Após a descoberta de que também o DNA podia ser manipulado, a primeira “ferramenta”

da engenharia genética foram as enzimas de restrição (ou endonucleases). Estas enzimas cortam a hélice dupla do DNA em zonas específicas, sempre que as

encontram. Funcionamento das enzimas de restrição Os vírus invadem as bactérias e afetam o seu DNA. Algumas bactérias têm um mecanismo de defesa contra os vírus, que consiste na produção

de enzimas de restrição.

Ou seja: 1. As enzimas cindem a cadeia de DNA do vírus quando encontram uma determinada

sequência de pares de bases. 2. Estas enzimas atuam em pontos específicos (ZONAS DE RESTRIÇÃO), catalisando o

desdobramento do DNA em fragmentos menores. 3. Estes fragmentos possuem nas extremidades a sequência de nucleótidos reconhecida

pela enzima de restrição – são constituídos por cadeia simples ligada a cadeia dupla e chamam-se extremidades coesivas.

As extremidades coesivas podem ligar-se por complementaridade a outro DNA. Intervêm as

ligases do DNA, que catalisam o processo que permite que fragmentos de DNA se voltem a ligar.

Para a transferência destes genes, é também necessária a existência de um vetor, que será a entidade que leva o material genético do genoma de onde foi retirado para o genoma que o vai receber.

Os plasmídeos das bactérias são exemplos de vetores.

Técnica do DNA recombinante A técnica do DNA recombinante permite combinar na mesma molécula de DNA genes

provenientes de fontes diferentes, mas não necessariamente de espécies diferentes, obtendo uma molécula de RNA recombinante (rDNA).

Nesta técnica, recorre-se a enzimas de restrição para cortar o DNA em pontos específicos e a ligases do DNA para reconstruir a molécula.

Obtenção e expressão da molécula de rDNA: 1. Seleção de uma molécula de DNA (a integrar) contendo um gene com interesse, que se

pretende transferir e clonar; seleção de um vetor adequado (plasmídeo); 2. A molécula de DNA e o vetor são tratados com a mesma enzima de restrição, que corta

as duas moléculas em regiões com a mesma sequência de nucleótidos; 3. Misturam-se os fragmentos de restrição da molécula de DNA e o vetor, adicionando

ligases do DNA. O vetor e os fragmentos de restrição emparelham pelas extremidades coesivas e a ligase estabelece a ligação entre eles;

4. O vetor, contendo o DNA dador, é transferido para uma célula/organismo recetor; 5. O DNA dador é incorporado no genoma da célula/organismo recetor, que passa a

possuir um DNA recombinante; Os plasmídeos possuem genes que lhes conferem resistência a um antibiótico, permitindo

localizar as bactérias que têm o DNA recombinante. O cultivo de bactérias que foram misturadas com plasmídeos num meio com esse antibiótico, é possível isolar as bactérias que resistem – essas têm certamente os plasmídeos recombinantes, porque as que não têm desaparecem com a aplicação do antibiótico.

Os vírus também podem ser utilizados como vetores. As células hospedeiras dos genes já não são só bactérias, mas podem ser outras células, como leveduras e mesmo células eucarióticas.

São comuns as plantas e os animais em cujo genoma foram introduzidos genes que determinam características vantajosas, constituindo os OGM.

A técnica do rDNA é utilizada, por exemplo, na produção de insulina humana.

Técnica do DNA complementar Os procariontes são organismos muito utilizados em Engenharia Genética como recetores

de DNA estranho porque: ���� São fáceis de cultivar, ���� Têm um crescimento rápido, ���� Processos bioquímicos bem conhecidos.

No entanto, os seres procariontes não processam o mRNA e se, em alternativa, recebem genes com intrões, não são capazes de os retirar e a proteína produzida não é funcional.

Este problema é ultrapassado pela obtenção e transferência de DNA complementar ou cDNA.

Para a técnica de DNA complementar são necessários: ���� Molécula de mRNA; ���� Transcriptase reversa (enzima que catalisa a formação da cadeia complementar do

DNA – transcriptase porque é um processo de transcrição, reversa porque é inverso ao processo de transcrição da molécula de DNA em mRNA);

���� DNA polimerase – que catalisa a formação da cadeia complementar de DNA; ���� Nucleótidos livres.

O cDNA é uma molécula de DNA sem intrões, que é diretamente transcrita numa molécula

de mRNA funcional. O processo de obtenção de cDNA é o seguinte: 1. Isola-se uma molécula de mRNA funcional das células; 2. Adiciona-se a trancriptase reversa e nucleótidos livres; 3. Junta-se uma enzima que degrada o mRNA que serviu de molde e DNA polimerase,

que catalisa a formação da cadeia complementar do DNA. O cDNA pode ser inserido num procarionte através de um vetor contendo o promotor e

sequências reguladoras.

Reações de polimerização em Cadeia – PCR O PCR é uma técnica que permite amplificar qualquer porção de DNA fora das células. Esta técnica é útil para quando é necessária uma determinada quantidade de DNA que não

se possui, mas que pode ser obtido através desta técnica. Esta técnica consiste nas seguintes etapas: 1. O fragmento de DNA a amplificar é aquecido de modo a separar as duas cadeias da

dupla hélice, quebrando as ligações entre os aminoácidos - DESNATURAÇÃO;

2. Obtêm-se duas cadeias simples; 3. São adicionados nucleótidos livres e DNA polimerase resistente ao calor – esta DNA

polimerase é obtida a partir de microrganismos termófilos, uma vez que vivem a temperaturas muito elevadas, e aguentam ser mantidos às mesmas, enquanto a DNA polimerase normalmente usada acaba por sofrer também DESNATURAÇÃO quando sujeita a temperaturas muito elevadas;

4. A DNA polimerase catalisa a formação das cadeias complementares, restituindo a dupla hélice, formando duas moléculas de DNA a partir de uma;

5. Arrefecimento das novas moléculas; 6. Repetição do processo – em cada ciclo a quantidade de DNA é duplicada. Esta técnica permite a obtenção de biliões de cópias de uma porção de DNA em poucas horas e é executada por aparelhos

DNA fingerprint No genoma humano existem sequências de DNA repetitivas que são reconhecidas e

cortadas por determinadas enzimas de restrição. O DNA fica então fragmentado – estes fragmentos apresentam tamanhos e composição

diferentes, variando de pessoa para pessoa. Quando submetidos a técnicas como a eletroforese, o resultado é um padrão de bandas

que difere de indivíduo para individuo, sendo possível identificar uma pessoa através destas bandas, com quase (ou mesmo) 100% de certezas.

O processo de identificação por DNA fingerprint é feito da seguinte forma: 1. Obtenção de fragmentos da molécula de DNA, colocando em recipientes amostras de

DNA e enzimas de restrição, que a fragmentam nas respetivas zonas de restrição; 2. Os fragmentos obtidos são colocados num meio apropriado (por exemplo gel) e

quando submetidos a um campo elétrico, deslocam-se até à extremidade oposta de onde foram inseridos, a velocidades diferentes, consoante o tamanho e “peso” do fragmento;

3. Ao fim de algum tempo, os fragmentos localizam-se em diferentes secções do gel, permitindo identificar um indivíduo pelo padrão obtido por eletroforese.

Técnica Aplicações

DNA Recombinante

(rDNA)

Investigação fundamental – torna possível isolar genes de organismos complexos e estudar as suas funções a nível molecular Obtenção de organismos geneticamente modificados (OGM) – organismos em cujo genoma foram introduzidos genes que conferem características vantajosas. São usados: -na produção de alimentos em maior quantidade e qualidade; -na produção de grandes quantidades de substancias com aplicação médica ou farmacêutica; -na com aplicação industrial; -biorremediação.

DNA Complementar

(cDNA) Obtenção de cópias de genes que codificam produtos com interesse.

Polimerização por reação em cadeia (PCR)

Obtenção de grandes quantidades de DNA em pouco tempo.

DNA fingerprint -Investigação criminal, forense e histórica; -Determinação de paternidade.