Distrofia Muscular Miotônica

FABRÍCIO MACIEL

MEDICINA

Aspectos Clínicos

Doenças com repetições de bases 3,4,5 e até 6

X-Frágil (5’ UTR) – inibição da expressão gênica

DMM1 (3’ UTR) – expressão de RNA tóxico com ganho de função

Doença de Huntington (Região Codificante) – expressão de proteína tóxica

Autossômica Dominante

Fadiga muscular progressiva, arritmias cardíacas, resistência à insulina e distúrbios neuropsiquiátricos.

Miotonia, caracterizada por excitabilidade acima do normal dos músculos, causando rigidez no paciente.

(Harper, 2001)

Classificada em dois tipos distintos: sendo o tipo 1 o mais comum com uma taxa de prevalência de 1 para 20,000, e o tipo 2 que cursa com uma clínica mais favorável.

(Bird et al., 1999)

O tipo 1 é a segunda causa mais comum de distrofia muscular, precedida apenas pela distrofia muscular de Duchenne. Em adultos é a maior causa, com uma incidência de 1 para cada 8500.

(Day and Ranum, 2005)

Sofrem antecipação: o fenômeno do aumento de severidade fenotípica e diminuição da idade de manifestação nas gerações seguintes – na DM1 de 25 a 30 anos por geração. O trinucleotídeo expandido é instável e tende a se expandir em gerações sucessivas.

(Pratter, A., 2015; C.J. Howeller., 1989)

A severidade da doença e a idade de aparecimento dos sintomas na DM1 estão relacionadas ao tamanho da expansão: Indivíduos normais têm de 5 a 34 repetições.

Os sintomas costumam aparecer em pacientes com 50+

As formas mais severas se manifestam em pacientes com 1000+(Brook et al., 1992; Day and Ranum, 2005; Cho and Tapscott, 2007)

De acordo com a idade de acometimento: Congenital (ao nascimento);

Childhood (1-10),

Early Adult (11-20),

Adult (entre 21-40),

Mild (depois dos 40 anos)

A idade de acometimento é inversamente relacionada ao número de expansões e diretamente relacionada à severidade dos sintomas.

(Koch et al., 1991)

A forma de acometimento em idade adulta (Adult Onset) é a mais prevalente, aparecendo na 2ª ou 3ª década de vida, e é a forma clínica típica da DM1. Os sintomas incluem degeneração muscular levando a fraqueza e cansaço dos músculos faciais, do pescoço, e dos músculos distais dos membros (mãos e pés).

A expectativa de vida é reduzida, e costumam falecer de pneumonia e arritmias cardíaca.

A forma congênita (congenital) é a mais severa, sendo caracterizada por hipotonia, respiratory distress no nascimento, assim como déficit motor e cognitivo.

O progresso dos sintomas cardíacos da doença pode levar à repentina e imprevista morte, portanto é importante identificar esse subgrupo e tratar adequadamente

(Khalighi e Kodali, 2015)

Aspectos Genéticos A DM1 resulta da expansão de um segmento de trinucleotídeos

(CTG) repetidos na 3’-UTR do gene DMPK, gene localizado em 19q13.3

(Brook et al.,1992; Caskey et al., 1992)

A DM2 é causada pela expansão de um tetranucleotídeo (CCTG) no primeiro íntron do gene ZNF9/CNBP, no 3q21.

(Liquori CL., 2001)

As expansões de CUG no mRNA inibiam a tradução da proteína DMPK,

Ratos knockout para DMPK não foram afetados.

Outra hipótese era que presença das expansões pudessem afetar a expressão de genes adjacentes, como o SIX5,

Entretanto ratos knockout para Six5 não exibiram nenhuma patologia muscular(Jansen et al., 1996; Berul et al., 1999) (Klesert et al., 2000)

Somente em 1997, descobriu-se que o mRNA mutado formava hairpin loops estáveis que se agregavam na célula e que tinham afinidade com proteínas reguladoras, causando sequestro e desregulação de vários processos.

(Davis et al., 1997; Napierala and Krzyzosiak, 1997)

A superexpressão da repetições de CUG em ratos provaram a hipótese de que o RNA tóxico era a base da fisiopatologia da doença provocando miotonia, miopatia, acumulação de RNA tóxico e sequestro de reguladoras, características encontradas em vários paciente.

Hairpin Loops

MBNL

PKC

micRNA

CELF

Ambas as proteínas desreguladas no processo são necessárias para a regulação do splicing normal dos produtos de vários genes, incluindo alguns como CLCN1, BIN1, IR, PKM e TNNT2, explicando grande parte dos achados semiológicos nos pacientes.

CLCN1

O splicing da transcrição do gene codificador dos canais de cloro (CLCN1) é dependente das proteínas MBNL e CELF splicing do gene inclui exóns contendo códons de parada inviabilidade e degradação dos RNAs miotonia

(Lueck et al., 2007) 

IR

O splicing do RNA para os receptores de insulina também é regulado pelas proteínas envolvidas na fisiopatologia da DMM. A CELF exclui do splicing o exon 11, produzindo um receptor com baixa atividade quando comparado ao receptor produzido com a inclusão do exon (MBNL) Resistência Insulínica

(Kellerer et al., 1992)

BIN 1

Tem mecanismo semelhante à IR, a função da proteína é organizar os microtubulos e as miofibrilas durante a contração Cansaço

(Fugier et al., 2011).

TNNT1

O gene para troponina T também passa por splicing coordenado pelas proteínas MBNL e, principalmente CELF. Os mecanismos ainda não foram bem entendidos, mas a forma da troponina presente em DM1 é mais sensível ao cálcio. arritmias.

(McAuliffe et al.,1990; Godt et al., 1993)

Essa descoberta tornou a DMM a primeira doença que envolve o ganho de função de RNA tóxico em sua patologia.

Diagnóstico

Miotonia e Fraqueza dos músculos faciais e temporais são as primeiras características a se manifestarem na DM. Degeneração de músculos distais dos membros (pés e mãos) são outros importantes achados.

Exames como a Eletromiografia também são utilizados, tendo um achado característicos da doença “mergulho do bombardeiro”.

Eletrocardiogramas devem ser realizado frequentemente, para avaliação do estado cardiológico.

PCR e Southern Blot são utilizados na identificação das mutações e na extensão das repetições.

Terapias

O sequestro de MBNL corresponde a 80% dos missplicing e consequentemente das apresentações fenotípicas super-expressar MBNL1 através de infecção viral pode ser uma via de ataque.

(Kanadia et al., 2006; Chamberlain and Ranum, 2012)

Reduzir os níveis de CELF é outra forma de combater os sintomas, principalmente os musculares inibindo a via da PKC, e reduzindo a fosforilação de CELF. Ratos knockout para CELF tiveram ainda taxa de sobrevivência maiores.

(Wang et al., 2009)

Atacar diretamente o RNA toxico pode ser feito de duas maneiras: degradando-o ou cobrindo os hairpinloopings com moléculas que impeçam a ligação e consequente sequestro de MBNL.

(Furling et al., 2003)

Premature senescence in primary muscle cultures of myotonic dystrophy type 2 is

not associated with p16 induction.L.V. Renna, R. Cardani, A. Botta, G. Rossi, B. Fossati, E. Costa, G. Meola

Introdução

Ainda não existe explicação para a atrofia e hipertrofia (em menor grau) observado nos pacientes de DM, ou para as características histopatológicas da doença, que incluem aumento do número de núcleos centrais e a presença de fibras com nuclear clumps.

Músculos de pacientes com DM tem várias similaridades com o músculo de pacientes sadios com idade superior, assim como a fraqueza muscular e atrofia com capacidade regenerativa baixa.

A capacidade regenerativa está relacionada com as células satélites, que em situação de injúria se ativam, proliferam e se fundem em miotubos para regenerar o músculo.

A diminuição da capacidade proliferativa dessas células está relacionada na DM1 com diminuição progressiva dos telômeros em cada divisão celular ou por vias adicionais, como a via de stress p16, que também induz a senescência prematura em mioblastos.

Objetivos

Elucidar se os mioblastos derivados de células satélites, obtidos de músculo esquelético de pacientes com DM2 também exibem senescência prematura como acontece na DM1.

Se as alterações no potencial de proliferação dessas células pode contribuir para algumas das características clínicas e histopatológica observados em DM2.

Que mecanismos estão envolvidos na perda da capacidade proliferativa da DM2

Métodos

Biópsias do bíceps braquial de humanos portadores de DM1 (n=3) e DM2 (n=4) foram feitas em condições estéreis.

 

Foram utilizados controles agematched (n=4) sem nenhum sinal de doença neuromuscular.

Os diagnósticos de DM2 foram feitos por fluorescência in situ em secções de músculos usando um (CAGG) probe, para verificar a presença de inclusões ribonucleares.

(Cardani et al.)

A genotipagem de DM1 e DM2 foi feita em DNA extraído de leucócitos do sangue periférico.

Foram realizados testes de: Histopatologia e Imunohistoquímica, Cultura celular, Capacidade proliferativa e Senescência, Capacidade Diferenciativa, Western Blot, Imunofluorescência, Análise do comprimento de telômeros.

Resultados

Todos os pacientes avaliados no estudo mostraram aumento da atrofia da fibra muscular, em particular um aumento da atrofia dos dois tipos de fibra em pacientes com DM1 e aumento de atrofia da fibra do tipo 2 em pacientes com DM2.

A capacidade proliferativa de mioblastos DM1 e DM2 estava reduzida em 50% e 36%, respectivamente, quando comparada aos controles. Foi observado também que os mioblastos doentes tinham menos divisões que os controles.

Para avaliar os mecanismos que afetam a capacidade proliferativa dessas células, avaliaram-se biomarcadores usualmente reconhecidos em células senescentes (b galactosidase).

No início do experimento não foram detectados nenhuma célula com atividade da bgal, entretanto, no final, o número de células senescentes e portanto positivas para bgal aumentou consideravelmente.

A expressão da proteína p16 foi analisada no começo e no final do experimento para verificar se o mecanismo estava envolvido na DM2 também.

Como era esperado, nos mioblasto com DM1 notou-se grande expressão da proteína, entretanto os níveis de p16 na DM2 foram similares aos do controle.