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Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 27
CONTROLE BACTERIANO DE
EFLUENTES
Mariana Roberta dos ReisFaculdade de Tecnologia de Sorocaba, FATEC,
Sorocaba; Departamento de Microbiologia e
Imunologia, Instituto de Biologia
Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP
Elisabeth Pelosi TeixeiraDra. Departamento de Saúde
Faculdade de Tecnologia de Sorocaba, FATEC
Wanderley Dias da SilveiraPh.D.Departamento de Microbiologia e Imunologia,
Instituto de Biologia, Universidade Estadual de
Campinas, UNICAMP, Campinas.
Ilustrações cedidas pelos autores
Pesquisa
Introdução
aumento populacional, jun-tamente com o crescimentodesordenado das cidades,
tem levado, paulatinamente, ao des-gaste qualitativo e ao consumoirreversível das fontes de abasteci-mento, incluindo, aqui, as fontesaqüíferas para consumo, uso domésti-co e agricultura. O esgoto urbano bru-to é resultante dos despejos domésti-cos e industriais, o qual lançado nummanancial contribui para sua degrada-ção, afetando sua qualidade (JORDÃOet al., 1995).
Assim, com a finalidade de pou-par as fontes naturais, a água já utiliza-da por seres humanos para consumopróprio, ou outras finalidades, devepassar por processos de tratamento
que permitam a sua reutilização segu-ra sem causar processos de morbidadeà saúde e/ou mortalidade.
A implantação de uma estação detratamento de efluentes (ETE) tempor objetivo reduzir a cargacontaminante ou poluente das águasresiduárias, de modo que o efluentefinal tratado possa retornar para ocorpo d’água, sem provocar a degra-dação do meio e não causar riscos àsaúde do homem (BORSOI et al.,
2002; Von SPERLING, 1996).O presente trabalho relata o uso
de bacteriófagos (fagos líticos), vírusque lisam bactérias, como métodopara a redução de número de unida-des formadoras de colônias (UFC) debactérias potencialmente patogênicaspara os seres humanos e presentes emestações de tratamento de esgotos(ETE), com o objetivo de minimizarpossíveis processos de morbi-mortali-dade causadas por essas mesmas bac-térias quando da utilização da águapara consumo.
A principal vantagem de utilizarfagos líticos como controle bacterioló-gico, e ferramenta complementar emtratamento de efluentes nas ETEs resi-de na propriedade que eles possuemde se replicarem apenas na presençade seu hospedeiro específico, levan-do à lise celular bacteriana com produ-ção de novos fagos, os quais mantêmseu ciclo de lise enquanto existiremcélulas bacterianas disponíveis parasua replicação, o que deverá, teorica-mente, levar a uma diminuição pro-gressiva dos possíveis contaminantesbacterianos presentes as ETEs (DAVISet al., 1973). Por outro lado, os mes-mos fagos podem estar presentes den-
Figura 1: Curva de avaliação de morte celular bacteriana de Staphylococcus aureus
(Sa), determinada através da contagem de UFC. A: Curva controle contendo apenas
Sa. B: Curva Sa contendo fago não mutante. C: Curva Sa’ contendo fago mutante lítico
obrigatório. Os dados são médias de 2 repetições ± desvio padrão da média.
Gráfico: Mariana Roberta dos Reis
Controle biológico bacteriano e tratamento de efluentes através do uso de bacteriófagos
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tro do genoma de sua célula hospedei-ra, em estado quiescente ou profágico,e não levar à lise celular dele. Por essemotivo, a obtenção e utilização defagos mutantes que realizem apenas ociclo lítico para posterior utilização nasETEs é um objetivo que deve seralcançado.
Como dentro dos resíduos dasETEs existem milhares de espéciesbacterianas diferentes, muitas das quaispotencialmente contendo um ou maisfagos específicos, este trabalho tevepor objetivo selecionar fagos que pu-dessem ser utilizados para o objetivoacima e dentre esses, selecionar umpara a obtenção de mutante que obri-gatoriamente realizasse apenas o ciclolítico.
Metodologia e resultados
Seleção de fagosPara essa finalidade, suspensões
contendo material bruto de diferentesETEs (industriais, hospitalares emunicipais) foram coletados emcondições de assepsia, filtradas emmembranas Millipore de 0,2µm e osobrenadante resultante mantido emcondições de refrigeração (4°C). Umvolume de 200µL dessas suspensõesfoi, a seguir, adicionadas a culturasbacterianas líquidas purificadas(Shigella flexneri, Shigella
sonnei, Klebsiella pneumoniae,Salmonella typhimurium, Escherichia
coli , Streptococcus pyogenes,Staphylococcus aureus) e mantidasem cultivo (37°C) por 12 horas. Aseguir, os meios foram centrifugados eos sobrenadantes armazenados entre4°C e 8°C, após filtração. A confirmaçãode fagos específicos na cultura de cadauma das bactérias foi realizada atravésdo mesmo procedimento observando-se agora, ou o não crescimentobacteriano, ou a diminuição da turbidezdo meio de cultura líquido. A obtençãode fagos purificados específicos foirealizada através da metodologiadescrita por DAVIS et al., 1973 e aobservação do sobrenadante líquidoatravés de microscopia eletrônica(PALMER, 1988). Posteriormente, cadafago isolado em uma determinadacultura bacteriana foi testado contra asdemais culturas para confirmar a suaespecificidade.
Obtenção de fago lítico mutanteobrigatório
Para isto, uma suspensãobacteriana contendo Staphylococcus
aureus, com um bacteriófago em seuinterior, foi submetida ao tratamentocom luz ultravioleta (260nm) (5% desobrevivência de UFC/mL) e osobrenadante obtido, após filtração,novamente testado contra essa culturabacteriana, usando-se como controleuma cultura contendo essa bactéria ea suspensão do fago não-lítico obriga-tório. A seguir, após nova filtração, osobrenadante (300µL) foi adicionado a200µL da cultura bacteriana receptorae a mistura adicionada a 4mL de meioLA semi-sólido e, então, incubada a37°C por 30min, para haver a interaçãodo fago com a célula bacteriana. Estasuspensão final foi, então, adicionadasobre uma placa contendo 15mL demeio LA (conforme metodologia des-crita por SAMBROOK et al., 1989, commodificações). Após incubar a 37°Cdurante a noite uma placa de lise (aque apresentou halo o mais translúcidopossível) foi retirada do ágar e adicio-nada a uma cultura bacteriana em faseexponencial de crescimento. Apóscultivo (37°C) por 12 horas ecentrifugação (12.000rpm), osobrenadante foi novamente filtrado emantido em estoque a 4°C.
Utilização do fago lítico mutanteobrigatório no controle de
células bacterianas específicasSuspensões fágicas, não mutante
e mutante, obtidas como descrito an-teriormente, foram, separadamente,adicionadas em culturas contendoStaphylococcus aureus (1:1000) emfase exponencial de crescimento(5x106 UFC/mL) e alíquotas (100µL)retiradas, diluídas seqüencialmente, narazão 1:10, e semeadas em placas dePetri contendo meio LA. Após cresci-mento (37°C, 12h) as UFC/mL foramdeterminadas.
Resultados e discussão
Assim, como há preocupação nosentido de tornar pura a água captadaem rios, fontes ou poços, antes deservi-la à população, também há pre-ocupação quanto ao destino dos esgo-tos sanitários, sabendo-se que o des-
pejo “in natura”, nos rios, tem conse-qüências danosas à saúde das popula-ções, ocorrendo, não raras vezes, umarelação entre manifestações de doen-ças de transmissão fecal-oral e a exis-tência de focos de contaminação. Talsituação, porém, pode ser minimizadacom o tratamento de esgotos sanitári-os.
Há várias opções disponíveis paratratamento de efluentes, que devemser avaliadas segundo critérios de via-bilidade técnica e econômica, além deadequação às características topográfi-cas e ambientais da região. Depen-dendo das necessidades locais, o trata-mento pode se resumir aos estágiospreliminar, primário e secundário (COS-TA, 2004).
No entanto, quando o lançamen-to dos efluentes tratados se der emcorpos d’água importantes para a po-pulação, seja porque deles se capta aágua para o consumo, seja porque sãoespaços de lazer, recomenda-se tam-bém o tratamento terciário caracteri-zados pelo uso de hipoclorito de sódio,ozonização, luz ultravioleta, etc.(LINSLEY et al., 1992).
A abundância e a importânciaecológica dos vírus nos meios aquáti-cos têm sido atestadas com o aumentodo número de estudos voltados paraeles. Segundo TEDIASHVILI et al.,2003, os fagos apresentam um papelimportante no controle da densidadee diversidade da população bacterianano meio. Eles também são considera-dos indicadores naturais da populaçãomicrobiológica do efluente.
Neste trabalho, procuramos obterfagos que pudessem ser utilizadoscomo tratamento complementar, aosjá disponíveis, para a diminuição donúmero de bactérias potencialmentepatogênicas presentes em ETEs. Paraisso, a primeira etapa foi a obtençãode bacteriófagos a partir da água dediferentes ETEs sendo obtidos fagoscom capacidade de lise de todas asamostras bacterianas estudadas, a mai-oria dos quais com especificidade parauma determinada bactéria utilizadacomo hospedeiro. A exceção a essecomportamento foi um bacteriófago,isolado em Shigella flexneri, que tam-bém apresentou capacidade de lise deShigella sonnei e Escherichia coli.
Existem muitos estudos com efei-
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tos da luz UV em diferentes microrga-nismos (ANGEHRN, 1984;MASSCHELEIN, 2002; OPPENHEIMERet al., 1993). Lâmpadas UV emitemradiação num comprimento de ondaentre 240-260nm, comprimento deonda no qual o ácido nucléico absorvea energia (ANGEHRN, 1984). A luz UVcausa mutação através da formação dedímeros de pirimidinas nas basesnitrogenadas existentes ao longo dacadeia de DNA (MASSCHELEIN, 2002).Assim, o uso dessa luz pode causarmutação nos genes responsáveis pelamanutenção adequada do vírus noestado de profago e liberar vírus quepossuam apenas a capacidade lítica.
Dessa maneira, entre todos osfagos específicos que foram isolados,e com a finalidade de simplificar osresultados obtidos, utilizamos aquelesoriginários de Staphylococcus aureus
para a irradiação com luz UV e obten-ção de fagos líticos obrigatórios.
Verificou-se que, após irradiaçãopara a determinação da dose letal quelevava à sobrevivência de 5% dasUFC/mL (7,75 x 105 UFC/mL), umelevado número de placas de lise emcultura sensível (Staphylococcus
aureus).No teste realizado “in vivo”, os
fagos mutantes líticos obrigatórios deStaphylococcus aureus foram utiliza-dos, sendo obtida uma diminuição donúmero de UFC/mL de 55,4% do cres-cimento bacteriano, em relação aocontrole A utilizado.
Uma diminuição maior do núme-ro de UFC/mL pode não ter sido obtidadevido à provável existência da pre-sença de bacteriófagos integrados aogenoma de uma parcela da populaçãoda bactéria hospedeira, Staphylococcus
aureus, o que torna essas bactériasimunes à lise fágica (LEWIN, 1987).Isso, porém, não inviabiliza nossosresultados, pois diferentes tipos defagos líticos obrigatórios, específicospara a bactéria hospedeira, podem serselecionados e utilizados com o pro-pósito de provocar o aumento da lisebacteriana, minimizando, assim, a pos-sível presença de fagos em estadoprofágico.
Nosso trabalho demonstra quefagos líticos obrigatórios podem serobtidos a partir de fagos não mutantes,pré-existentes, como já descrito na
literatura (NAKASHIMA et al., 1998) eque o uso deles em uma cultura celular“in vivo” pode levar a uma diminuiçãono número de unidades formadoras decolônias e, consequentemente, dimi-nuição do número de bactériaspatogênicas presentes em uma deter-minada ETE.
Dessa maneira, sugerimos que ouso de fagos líticos específicos podeser obtido para qualquer tipobacteriano, inclusive aquelespatogênicos presentes no esgoto bru-to, e que o uso deles pode ser utilizadode maneira complementar àqueles jápreconizados em estações de trata-mento de águas residuais. Outrossim,suspensões contendo diferentes fagos,para diferentes espécies bacterianas,poderiam ser utilizados para tal finali-dade, levando a uma diminuição glo-bal de prováveis patógenos.
Conclusão
Os resultados aqui obtidos de-monstram que o isolamento de fagosespecíficos pode ser realizado a partirde fagos presentes em águas residuaisobtidas a partir de estações de trata-mento de esgotos.
A partir destes isolados de fagospodem ser obtidos fagos líticos obriga-tórios, de maneira prática, rápida e debaixo custo.
Os fagos líticos podem ser utiliza-dos de maneira complementar aosmétodos já existentes para a diminui-ção do número de bactérias patogênicaspresentes em uma determinada esta-ção de tratamento, o que torna essetratamento mais eficiente e, portanto,a água a ser liberada dela com menorpotencial patogênico.
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