Discente: Igor Vinícius

Acadêmico do curso de Ciências Biológicas – 6º período

Epidemiologia:

A prevalência da Síndrome de Prader-Willi varia de 1 para cada 15.000 a 30.000 indivíduos, acometendo igualmente ambos os sexos (CASSIDY; DRISCOLL, 2009).

Esse índice pode estar subestimado, pois há pacientes que apresentam um quadro clínico moderado, com características comportamentais sutis.

A síndrome de Prader-Willi foi descrita primeiramente em 1956 em pacientes que apresentavam:

Atividade fetal diminuída

Hipotonia infantil severa

Problemas de alimentação na infância

Hipogonadismo e hipogenitalismo

Estatura baixa

Mãos e pés pequenos

Atraso no desenvolvimento

psicomotor

Aparência facial característica

Retardo mental moderado

Fome insasiável que levava a um quadro de obesidade na infância

Problemas no comportamento

Tendência ao desenvolvimento de diabetes na adolescência.

A Síndrome de Prader-Willi é causada por uma deleção intersticial em 15q11-q13, no cromossomo herdado do pai.

Erro no imprinting: a fertilização por um espermatozóide que ainda possui um imprinting feminino produz uma criança portadora da síndrome.

Dissomia uniparental, ocorrendo a herança dos dois cromossomos 15 provenientes da mãe.

Epidemiologia

A prevalência da Síndrome de Angelman está estimada em 1:10.000 a 1:40.000 nativivos em todo o mundo. (CLAYTON-SMITH; LAAN, 2003) e atinge homens, mulheres e todos os grupos raciais e éticos igualmente.

A síndrome tem sido bastante divulgada nos últimos anos, especialmente por causa da descoberta dos mecanismos genéticos que levam ao surgimento da doença.

A síndrome de Angelman foi descrita pela primeira vez em 1965 com base nas características de três crianças:

Severo retardo mental;

Epilepsia;

Deglutição atípica;

Marcha atáxica;

Microcefalia;

Dificuldades na fala;

Movimentos desconexos;

Sorriso frequente;

Excitabilidade sem motivo;

Deficiência intelectual grave e alterações no sono.

A etiologia molecular da AS pode se dar de quatro formas: Deleção da região crítica do cromossomo materno

15q11q13;

Dissomia uniparental paterno(UPD) do cromossomo 15;

Imprinting genômico incorreto causando falta de expressão da cópia materna do gene da proteína ubiquitina-ligase E3A (UBE3A) no cérebro;

Mutações intragênicas na cópia do gene herdado pela mãe, que incluem deleção, inserção e mutações missense no sítio de splicing.

UBE3A faz parte de um pequeno subconjunto de genes humanos que são “imprintados”. No cérebro, o gene UBE3A derivado paternalmente é silenciado, e apenas a cópia herdada maternalmente é ativa.

UBE3A: gene candidato para o autismo. Alterações genéticas na região cromossômicas 15q11-q13 são as mais encontradas na maioria das mutações identificadas e relacionadas aos Distúrbios do Espectro Autista.

A origem mais provável da UPD paterna é a não-disjunção materna produzindo um embrião com monossomia do cromossomo 15.

Resgate pós-zigótico através da duplicação do cromossomo 15 paterno.

A deleção no centro de imprinting no gameta feminino resulta em uma não troca do imprinting materno adequadamente durante a ovogênese;

Os alelos paternos continuam sendo expressos no óvulo, que, quando é fecundado, origina um concepto erroneamente “imprintado” e portador da AS.

A metilação envolve a adição de um grupo metil ao DNA, por exemplo, ao carbono 5 do anel de pirimidina da citosina, ocorrendo uma redução da expressão genética.

Ocorre geralmente em citosinas localizadas dentro de um dinucleotídeo de citosina-guanina, conhecimentos como “Ilhas CpG”.

Detecção de metilação em ilhas CpG:

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP): observa a diferença em sequências homólogas do DNA, pela presença de fragmentos de diferentes tamanhos após a digestão por uma endonuclease de restrição específica.

PCR específica de metilação usando amostras de DNA tratadas com bissulfito e PCR alelo-específica, seguida por eletroforose em gel.

Após o DNA ser separado por eletroforese em gel 0,1% e aderido a uma membrana de nylon, o que se espera na análise da eletroforese é:

Pacientes com PWS apresentarem uma banda materna não metilada, enquanto os com AS apresentem uma banda paterna não metilada.

MS-MLPA: Uma sonda de MLPA contem dois oligonucleotídeos: um sintético e um longo derivado de M13.

A seqüência detectada pela sonda de MS-MLPA contêm uma sequencia de reconhecimento para a HpaII ou HhaI. Sondas que reconhecem seqüência que estão metiladas geram um sinal. Se o sítio CpG estiver não metilado, o complexo sonda MS-MLPA e DNA genômico será digerido e não vai gerar produto de PCR nem amplificação exponencial do mesmo.

Foi realizada a amplificação de sonda dependente de ligação específica de metilação multiplex (MS-MLPA) para validar o método de análise de metilaçao-específica (MS-MA).

MS-MLPA detecta número de cópias de genes e tem a capacidade de diferenciar deleções de possíveis UPDs.

52 amostras de sangue pacientes.

19 deles foram testados através da PCR específica para metilação e tratadas com bissulfito para a região do promotor SNRPN e foram positivas tanto para PWS (12) como para AS (7).

As outras 33 amostras foram de indivíduos não-afetados.

O DNA genômico foi extraído de sangue periférico (3 mL) com o uso do Kit da PUREGENE ® DNA Purification.

Para a análise de metilação, foi extraído DNA genômico com bissulfito de sódio e utilizando o KitTM DNA Methylation, de acordo com o protocolo do fabricante.

Após o tratamento com bissulfito, amplificou-se por PCR um fragmento de 322 pb da região promotora do gene SNRPN e o exon parcial correspondente aos nucleotídeos g.5 ao g.326.

A PCR foi feita em um volume de reação de 20 µl usando um buffer 1x do conjunto de reagentes SYBR Green I LightCycler FastStartMaster, primers a 0,5 µM cada, 4 mM de MgCl2 e 2 µl de DNA tratado com bissulfito.

Ativação de desnaturação 95 ° C por 10 min.

30 ciclos com uma temperatura de desnaturação de 95 ° C durante 10 s; anelamento a 68 ° C durante 30 s e um aumento de 72 ° C a uma velocidade de transição rápida de 20 ° C / s.

Produtos de PCR foram desnaturadas a 95° C;

Abaixou para uma temperatura de 40° C;

Aqueceu-se a 95° C novamente com uma taxa de transição térmica de 0,05° C/s, monitorando-se continuamente a fluorescência.

A análise dos dados foi realizada com o software LightCycler, Ver. 5,32 (Roche Diagnostics), com o derivativo de alterações de fluorescência no eixo y e a temperatura no eixo x.

Uma mistura dos probes foi comprada da MRC-Holland e continham 43 probes, 25 específicos de genes da região crítica para a PWS/AS (15q11-12).

Dentre esses específicos, 15 são sensíveis à metilação e contêm o sítio de restrição para a HhaI e somente 5 deles foram selecionados por se ligarem a seqüências alvo metiladas e, portanto, adequados para a diferenciação genotípica.

Essas 5 sondas têm como alvo regiões imprintadas. 4 delas hibridizam na região promotora do SNRPN gerando fragmentos de tamanhos de 142, 166, 190 e 247 pb e 1 sonda na região promotora (exon 1) que codifica para a necdina (NDN) gerando um fragmento de PCR de 418 pb.

Foi utilizado 80 ng de DNA genômico para cada amostra testada. Usou-se 10 mol/L de Tris-EDTA para diluição do DNA se necessário.

Após 16 h de hibridização à 60° C, amostras foram igualmente divididas em 2 alíquotas. A primeira alíquota foi submetida à ligação apenas, enquanto que a segunda foi submetida à ligação e digestão enzimática.

A normalização e análise dos dados foi feito pelo software GeneMarker, Ver. 1.4 normaliza a altura do pico (intensidade de fluorescência) de cada fragmento.

Dados resultantes foram colocados em um modelo de regressão em uma razão: proporção entre a intensidade da fluorescência no eixo y e do tamanho do fragmento no eixo x.

Proporções da intensidade da fluorescência de 1.5: duplicação; 1.0: sequência selvagem; 0.5: deleção e 0.0: ausência da sequência.

Os limites superiores e inferiores para as proporções de altura usadas para determinar os números de cópia foram estabelecidos como: <0.65 para deleção e >1.35 para duplicação.

Espera-se que o amplicon dos pacientes com PWS derretam a uma temperatura mais alta (~87°C) devido às maiores concentrações de GC oriundos dos alelos paternos metilados.

Um amplicon de um paciente com AS derreteria a uma temperatura mais baixa (~83°C) devido aos alelos não metilados paternos.

Um aplicon de mesmo tamanho do tipo selvagem possuiria ambos os picos no espectro de fusão.

Picos de fusão de amplicons detectados em uma amostra de tipo selvagem à 82.37 e 86.74°C.

Pico de fusão de um único amplicon à 83°C, indicando ou uma deleção típica de AS ou uma dissomia uniparental paterna do cromossomo 15.

Pico de fusão um único amplicon à 86,68°C, indicando ou uma deleção típica de PWS ou uma dissomia uniparental materna do cromossomo 15.

Comparou-se os dados da proporção de altura obtida com as 5 sondas sensíveis à metilação (4 SNRPN e 1 NDN) para uma amostra tratada com ligação e reações de ligação/digestão.

Os autores encontraram que os padrões distintos da proporção de altura eliminou a possibilidade de deleções, levantando as possibilidades de UPD ou defeitos no centro de imprinting.

Amostra de um paciente com AS testada: a proporção de altura das sondas do cromossomo 15 permaneceram próximas a 0,5 após a ligação e amplificação (similar ao padrão de ligação de PWS).

Porém, uma proporção de altura de 0 (0 cópias) foi observada nas 5 sondas sensíveis à metilação após ligação, digestão e amplificação por PCR.

Isso foi distinto dos tipos selvagem e dos padrões de ligação/digestão da PWS. Alelo paterno não metilado.

Determinação do status de UPD para PWS e AS

Foram testadas as amostras de PWS-UPD por MS-MLPA. Todas as sondas do cromossomo 15 tiveram uma proporção de altura de 1.0 após ligação e amplificação. Foi compatível com outras amostras de PWS com status de UPD confirmados.

Ao contrário, se uma amostra tiver perdido o alelo materno e herdado as duas cópias do pai, tem-se um caso de AS-UPD. Encontrou-se uma proporção de 0 para todas as sondas sensíveis à metilação após ligação, digestão e amplificação.

Esse padrão é predito dentro da suposição de que os dois alelos paternos herdados não estão metilados e serão digeridos pela HhaI, não havendo produtos de PCR e portanto, não amplificados.

Detecção de duplicação rara no cromossomo 15

Os resultados mostraram que todas as sondas do cromossomo 15, exceto o 4, tiveram uma proporção de intensidade de fluorescência de 1,5 após a ligação e amplificação por PCR.

Encontrou-se diferentes proporções de intensidade de fluorescência para sondas sensíveis à metilação (0.5) e para as específicas de regiões não-metiladas (1.5).

O gene SNRPN está localizado na região crítica para as PWS/AS, onde o promotor e o éxon 1 parcial está completamente metilado no cromossomo materno e não metilado no cromossomo paterno.

É usada na análise de metilação com base na PCR e gel, com 99% de taxa de detecção para pacientes com PWS e 80% para os pacientes com AS.

1% restante de pacientes com PWS: variantes em uma única base ou deleções pequenas.

20% de pacientes com AS: sequência variante no gene UBE3A ou causa desconhecida.

Porém, a análise de metilação baseada em PCR e no gel consome muito tempo e está sujeita à contaminação cruzada.

A MS-MA pode determinar padrões aberrantes de metilação de DNA na região promotora e no éxon parcial 1 do gene SNRPN.

Varredura das amostras podem ser completadas dentro de 45 minutos em um ensaio em tubo-fechado.

Limitações do MS-MA: não consegue diferenciar as deleções da UPD e padrões de imprinting raros atribuídos à duplicação no cromossomo na região crítica para as PWS/AS.

Deve ser complementada por técnica que mostre a origem parental dos cromossomos, utilizando marcadores STR altamente polimórficos no cromossomo 15.

A análise de STR requer amostras do probando e dos pais.

Requer grande quantidade de DNA para o tratamento com bissulfito.

Compensados pelo MS-MLPA: informação do status de metilação e do número de cópias pelo uso das enzimas de restrição específicas de sítios metilados. Não exige amostras dos pais e pouca quantidade de DNA do paciente (20-200 ng).

A análise de STR fornece dados de confirmação de status UPD. Já a MS-MLPA é usada para confirmar status de metilação e número de cópias de genes.

Apesar da análise de STR ainda ser necessária para confirmar o status de UPD, a combinação da MS-MA e da MS-MLPA pode levar à substituição de testes citogenéticos tradicionais como o FISH.