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Cepas causadoras de doenças Moko de Ralstonia
solanacearum do Brasil ampliando a diversidade
conhecida no filotipo parafiléticos IIGreecy M. R. Albuquerque, et al
Apresentação: Lourdes Regina Lopes Batista
INTRODUÇÃO
Fonte: C
ellier e Prior (2011)
Fonte: E
MB
RA
PA
Fonte: E
MB
RA
PA
Ralstonia solanacearum
INTRODUÇÃO
Cepas R. solanacearum raça 2 biovar 1
Praga quarentenária : - Amazonas,
Presente (A2) - Pará,
-
Rondônia,
- Roraima,
- Pernambuco
- Sergipe
Fonte: E
MB
RA
PA
INTRODUÇÃO
Cosmopolita + Diversidade genética
classificados características fenotípicas e propriedades genéticas
Raça e biovar
INTRODUÇÃO
PORÉM...
COMPLEXO
Ralstonia solanacearum
R. syzygii Doença Bactéria Sangue (BDB)
INTRODUÇÃO
2000 - Fegan e Priore : Classificação hierárquica
quatro filotipos e 52 sequevars
- Fiotipo I = linhagens da Ásia,
- Fiotipo II = cepas da América
- Fiotipo III = cepas da África e do Oceano Índico
- Fiotipo IV = cepas da Indonésia, Japão e Austrália
INTRODUÇÃO
Moko :
- Filotipo II e subdivididos em linhagens IIA e IIB
- Quatro sequevars distintas:
II-6,
II-24,
II-B
II-B-3-4
INTRODUÇÃO
SINTOMAS
amarelecimento e murcha das folhas
Frutos deformado
polpa podridão seca
Fonte: E
MB
RA
PA
OBJETIVO
Explorar a diversidade patogênica e
filogenética de linhagens de R.
solanacearum que se origina no Brasil
MATERIAIS E MÉTODOS
Cepas
QUANTIDADE ORIGEM LOCAL
27 Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia MANAUS
7 Coleção de Culturas de Fitobacterias do Instituto Biológico SÃO PAULO
2Coleção de Culturas do Laboratório
Fitobacteriologia da Universidade Federal Rural de Pernambuco
RECIFE
1 Embrapa Tabuleiros Costeiros ARACAJU
TIPAGEM DE DNA
Culturas bacterianas cultivadas em meio
Kelman a 29 º C durante 48 h
Fonte: E
MB
RA
PA
EXTRAÇÃO
Kit AxyPrep bacteriana Genomic DNA Miniprep
reação em cadeia da polimerase multiplex específico-
phylotype (Pmx-PCR):
- Espécie do complexo de R. solanacearum e
filotipos
- Estirpes pertencentes ao Filotipo II causadoras
do Moko
TIPAGEM DE DNA
DNA parcial da endoglucanase (EGL)
Amplificação da região de 750 bp do gene EGL:
- Endo-F (5'-ATGCATGCCGCTGGTCGCCGC-3 ')
- Endo-R (5'-GCGTTGCCCGGCACGAACACC-3')
A mistura de reação:
- Aquecidas durante 9 min a 96 º C, seguido de 30 ciclos de (95 º C
durante 1 min, 55 º C durante 40 s e 72 º C durante 2 min), com um passo de
extensão final de 10 min a 72 º C.
TIPAGEM DE DNA
A amplificação do fragmento de 758 bp do gene mutS
primers mutS:
- RsF1570-(5'--ACAGCGCCTTGAGCCGTACA 3 ')
-RsR1926 (5'-GCTGATCACCGGCCCGAACAT-3')
As misturas de reação:
-Aquecidas durante 5 min a 96 º C, seguido de 35 ciclos de (94 º C durante 1
min, 66 º C durante 1 min e 72 º C durante 90 s) com um passo de extensão final de
5 min a 72 º C.
TIPAGEM DE DNA
TIPAGEM DE DNA
electroforese sobre um gel de agarose
Sequenciamento por Macrogen (Seul, Coreia do Sul).
TIPAGEM DE DNA
Árvores filogenéticas: software ARB
A reconstrução filogenética das linhagens: software PhyML
GenBank
Teste de patogenicidade
BANANA
Micropropagação
As mudas foram cultivadas em vasos de plástico de 500 ml
Inoculadas por injecção de 1 ml de uma suspensão de R. solanacearum
Temperatura média de 36 ± 2 º C e umidade relativa média de 85%
Observações por 40 dias
Teste de patogenicidade
TOMATE
mudas da cultivar Santa Clara
Cultivadas em potes de plástico 500 ml
inoculados pelo método ferida raiz
temperatura média 38 ± 2 º C e umidade relativa de 88%,
avaliadas durante 30 dias.
A patogenicidade do isolado foi gravado utilizando um
critério qualitativo, ou seja, (-) para as plantas livres de
sintomas e (+) para murcha ou plantas mortas.
RESULTADOS
282 bp e 372 bp
IIB-25 : Batata (Peru)
IIA-53
IIA-41: Tomate (Camarões)
mutS: IIA-24EGL: IIA-53
Distinto no cluster IIB – Banana (Indonesia, Honduras e Costa Rica
1= IIA-6
5= IIA-24
6= IIA-41
CONCLUSÃO
Todas as cepas de R. solanacearum brasileira causadoras da doença do
Moko testados neste estudo foram patogênicos a plantas de banana e
apresentaram sintomas característicos da doença
Estes resultados salientam a grande diversidade de estirpes de Moko no
Brasil,
reforçar a eficiência do gene EGL ao revelar as relações de diversidade
genética causadoras da doença do Moko de R. solanacearum onde os
grupos genéticos distintos foram descritos