Universidade Estadual de CampinasCentro de Biologia Molecular e Engenharia Genética

Identificação e Diversidade Genética de Populações Identificação e Diversidade Genética de Populações

de Helicoverpa armigera do Norte e Nordeste do Brasil

Dr. Thiago Mastrangelog g

Engº Agrônomo pela ESALQ/USPPhD pelo CENA/USPE-mail: mastrangelo@cbmeg.unicamp.br

Sumário

1. Introdução– Crise Fitossanitária

– Identificação Morfológica de Helicoverpa armigera

– Novas incursões da praga no Brasil

– DNA barcoding

2. Material e Métodos– Extração de DNA Total

– PCR, Purificação e Sequenciamento

3. Resultados– Análises Filogenéticas

– Distâncias Genéticas

b d– DNA barcodes

– Rede de Haplótipos

– Diversidade Genética e Distribuição dos Haplótipos no Brasil

– Estrutura Genética das Populações Estrutura Genética das Populações

– Divergência Genética entre H. armigera e H. zea por 3 Genes Nucleares

4. Conclusões

1. Introdução

1. H. armigera x Crise Fitossanitária

• Praga de importância econômica no mundo:

- World: annual costs (control+yield losses) around US$ 5 billion (Lammers & MacLeod, 2007).

- China (1992): losses of US$ 1.3 billion in the Yellow River cotton region, North China (Sheng, 1993).

- India + China: 50% pesticides used to control H. armigera (Lammers & MacLeod, 2007).

- USA: 4,431 interceptions of H. armigera + Helicoverpa spp. since 1985 on fruits, vegetables and 4,43 p g p pp 9 5 , g

ornamentals (Venette et al., 2003).

- USA: 1,400 interceptions at US ports between 2000 and 2004 (Passoa, 2004).

1.2. Identificação Morfológica

(Pogue, 2004)

1.3. Novas incursões da praga

Analysis of the Genetic Diversity and Structure of Cochliomyia hominivoraxPopulations from the Brazilian Amazon basin

(Caterino et al. 2000; Hebert et al. 2003)

1. CATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATCGAATAAACTGGGTGGGTTGTTGCTGTCCCTCTCGGGGGAACTGTGCACGCCTTACCTTTTTTGTTTTTCCA………….. Helicoverpa assulta

2. CATTATTGAATAAACTTGGTTAGGTTGCTGCTGGCTCCTTGGAGCATGTGCACACCTAGCACCNTTTTTACCACCTGTGCACCCTTTGTAGACCTGGATACCTCTCGAGGAAACTCGGTTTGAGGACTTTTTTCCA………….. Helicoverpa armigera

OU

1. …………………………………..…………………………………………………… Helicoverpa assulta2. ….…………………………………………………………………………………... Helicoverpa armigera

2. Material e Métodos

2. Extração de DNA Total

Método Fenol:Clorofórmio (Lyra et al. , 2009)

2. Extração de DNA Total

Ressuspendidos em 100 µL de TE buffer Armazenados a -80 ºCRessuspendidos em 100 µL de TE buffer Armazenados a 80 C

2. Amplificação por PCR

• Primers: • Mix para PCR:

- COIF e COIR (Li et al., 2011)

- A-tLEU e B-tLYS (Liu & Beckenbach, 1992)

- 25 ng de DNA total

- 2,5 mM de MgCl2

- 0,25 mg/mL de BSA

-0,5 mM de cada primer

- 1,5 U de TaqDNA polymerase

- 10 x TaqBuffer

- EF-1α, IDH e RpS5 (Wahlberg & Wheat, 2008)- 100 µM de dNTPs - Volume final: 25 µL

GeneAmp®PCR System 9700 thermal cycler

Condições94oC 3’94oC 30”

45 oC COI 2 µL

Gel agarose 1% em 1 x TAE

35 Ciclos45 C - COI

48 ºC – COII55 ºC - Nucleares

30”

70 oC

72 ºC – COII 1’ e 30”oC ’

µ

70oC 7’10oC forever

2. Purificação e Sequenciamento

IllustraTMGFXTM kitABI3730xl DNA Analyzer sequencer

IllustraTMGFXTM kit

3. Resultados

http://blast.ncbi.nlm.nih.govBasic Local Alignment Search Tool

http://www.boldsystems.org/

3. Análises Filogenéticas – COI (658 pb)

3. Distâncias Genéticas - COI

3. DNA barcodes DNASP.V5 software

3. Rede de Haplótipos – 96 sequências COI

arm13PI‐7,16,17arm12arm11RR‐5

arm7

TCS version 1.21 software

arm 1

PI‐1,2,6,8,9,10,11,13,20,21,22, 25,27,29,30,32,33,39 

BA‐1 3 4 5 6 7 9 12

PI‐14,26,35BA‐11RR‐12

PI‐3,4RR‐7

arm6

arm16

arm5

arm9BA‐2

BA‐1,3,4,5,6,7,9,12

RR‐1,2,3,6,8

arm 2

PI‐5,12,15,18,19,23,24,28, 31,36,37

arm10

arm8

arm3

arm4

BA‐8, 10

RR‐4,9,10,11,13,14arm15

PI‐38 arm14

PI‐34

13 mutations

11 mutations

H. gelotopoeon

10 mutations 6 mutations

6mutations5 mutations

H. zea

(Li et al., 2011)

H. virescens

H. hawaiiensis

H. punctigera

6 mutations

25 mutations

39 mutations

H. assulta

3. Diversidade Genética das Populações e Distribuição dos Haplótipos – COI + COII

‒ 22 haplótipos

‒Alta Ĥ e baixa π

‒ Fluxo Gênico

3. Estrutura Genética das Populações – COI + COII Arlequin v.3.5 software

As populações de H. armigera não estão estruturadas !

Grande Capacidade de Dispersão

• Esse padrão de variação genética é comum em

pragas capazes de se dispersar por longas

distâncias, como H. armigera (Daly & Gregg, 1985;

Zhou et al., 2000; Endersby et al., 2007) .

- Mark-recapture experiments H. armigera

Moths can fly 200-300 km in a single night

(Pedgley, 1985)

y 3 g g

(Armes & Cooter, 1991).

- Barriers such as the Sahara desert had not prevented long

di i i i H i ( b h l )distance migration in H. armigera (Nibouche et al., 1998).

3. Compatibilidade Reprodutiva entre H. armigera e H. zea

Problemas

• Problemas de usar apenas mtDNA:

- Genes COI + COII são informativos apenas quanto à herança maternal.

- Os 65 espécimes podem pertencer à linhagem original introduzida ou um híbrido

proveniente do cruzamento entre uma fêmea de H. armigera e um macho de H. zea. p g

3. Divergência Genética

1.2. Identificação Morfológica

(Pogue, 2004)

Cooperação Internacional

Austrália, China, Índia, Paquistão, Burkina Faso, Uganda ilUSA + Brasil

Publicação Internacional

4. Conclusões

1) Há fortes evidências genéticas de que as lagartas analisadas de Roraima, Piauí e

Bahia são Helicoverpa armigera.Bahia são Helicoverpa armigera.

2) Estudos futuros combinando mtDNA e novos marcadores nucleares com linhagens

puras e híbridos de H. armigera e H. zea são necessários para a elaboração de

protocolos de identificação para essas duas espécies.

3) Enquanto esses protocolos estão sendo desenvolvidos, sistemas de identificação

baseados em mtDNA podem continuar provendo informações diagnósticas e dep p ç g

origem geográfica que excedem aquelas que podem ser alcançadas utilizando-se

apenas chaves morfológicas.

4. Conclusões

) á dê d fl ê l d d d l4) Há evidência de fluxo gênico entre as populações do Norte e Nordeste do Brasil.

5) H. armigera não está restrita apenas ao Brasil central ou Nordeste, tendo cruzado a5) H. armigera não está restrita apenas ao Brasil central ou Nordeste, tendo cruzado a

região amazônica.

6) Amostragens na Venezuela e Colômbia devem ser iniciadas o quanto antes para se

poder monitorar a entrada ou avanço dessa praga na América Central e EUA.

Muito Obrigado !g