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INSTITUTO RACINE
Pós- Graduação em Desenvolvimento e Pesquisa de Produtos Cosméticos –
Cosmetologia Avançada
José Eder Fontana
Marisa César Domingues Protta
Carolina Kei Miyazaki
AVALIAÇÃO DE UM CREME FACIAL CONTENDO MELITINA COMO AUXILIAR NO TRATAMENTO COSMÉTICO ANTISSINAIS
SÃO PAULO
2014
José Eder Fontana
Marisa César Domingues Protta
Carolina Kei Miyazaki
AVALIAÇÃO DE UM CREME FACIAL CONTENDO MELITINA COMO AUXILIAR NO TRATAMENTO COSMÉTICO ANTISSINAIS
Trabalho de Conclusão de Curso de
Pós Graduação apresentado ao
Instituto Racine como requisito parcial
para obtenção de título de especialista
em Pesquisa e Desenvolvimento de
Produtos Cosméticos – Cosmetologia
Avançada
ORIENTADORA: Profa. Carla Aparecida
Pedriali Moraes
SÃO PAULO
2014
Fontana, José Eder
Avaliação de um creme facial contendo MELITINA como auxiliar
no tratamento cosmético antissinais \ Jose Eder Fontana, Carolina
Kei Miyazaki, Marisa C.D. Protta. São Paulo: RCN 2014, 60f.
Orientação: Professora. Carla Aparecida Pedriali Moraes.
Trabalho de Conclusão de Curso de Pesquisa e Desenvolvimento de
Produtos Cosméticos – Instituto Racine, 2014.
1. Melitina. 2. Anti Rugas. 3. Antissinais. 4. Veneno de Abelhas. 5. Bee
venon .
I. Título
José Eder Fontana
Marisa César Domingues Protta
Carolina Kei Miyazaki
AVALIAÇÃO DE UM CREME FACIAL CONTENDO MELITINA COMO AUXILIAR NO TRATAMENTO COSMÉTICO ANTISSINAIS
Comissão Avaliadora
Professora Carla Aparecida Pedriali Moraes
Assinatura ___________________________________________________
Data da Aprovação:
DEDICATÓRIA
Dedicamos este trabalho aos nossos pais,
cônjuges e filhos os quais serviram de apoio e
incentivo em todos os momentos.
AGRADECIMENTOS
A Professora Carla Aparecida Pedriali Moraes pelo apoio e incentivo constantes,
tanto em aulas como na elaboração deste Trabalho de Conclusão de Curso.
RESUMO
O envelhecimento cutâneo facial é um processo fisiológico que fatalmente resultará no
aparecimento de rugas ou sinais de expressão. Uns apresentarão estes sinais proeminentes
mais rapidamente e outros os terão com menos intensidade e mais tardiamente. O presente
trabalho propõe a utilização de um ativo oriundo do veneno das abelhas, a melitina, como um
possível redutor destes sinais. A melitina é um composto formado por uma mistura complexa
de aminoácidos, peptídeos, carboidratos, lipídeos, enzimas entre outros, cujo mecanismo de
ação pressupõe aumento de fluxo sanguíneo e o estimulo a produção de colágeno além de
inibir a produção de metaloproteinas que podem causar danos ao colágeno em formação. Um
creme baseado na formulação cold cream foi desenvolvido e 0,085% de melitina como ativo
foi adicionado. A segurança de uso foi testada por meio de testes da Avaliação Dermatológica
de Compatibilidade Tópica que envolveu testes de Irritabilidade Dérmica Primária (IDP),
Acumulada (IDA) e Sensibilização Dérmica (SD) cujos resultados demonstraram total
inocuidade alergênica nos 59 indivíduos de ambos os sexos testados. A Eficácia de Uso foi
testada por meio de um Ensaio Clínico para os itens Hidratação, Maciez, Firmeza e Rugas de
Expressão, pontuados em uma escala de 1 a 5. Os indivíduos aplicaram o creme no tempo
inicial T0 e durante os 30 dias subsequentes T30. As medições foram realizadas por médico
dermatologista nos tempos T0 e T30. Com um grau de significância estatística de 5% (teste t
de student) pode-se observar que houve melhora para os itens: Hidratação e Maciez. O
percentual de voluntárias com algum grau de melhora observada clinicamente após o uso do
produto por 30 dias foi de: 65% para Hidratação; 52% para Maciez; 4% para Firmeza. No
ensaio Clinico Subjetivo, realizado em paralelo, os resultados foram comparados aos mesmos
itens mencionados acima no tempo T0 e após 30 dias de uso T30 onde a percepção do
individuo pôde ser captada por meio do preenchimento de um questionário específico no
último dia de avaliação. Os resultados foram: 96% dos voluntários declararam que a pele
ficou hidratada ou muito hidratada, 56% declararam que a pele apresentou maciez intensa ou
muito intensa, 21% declararam que a pele ficou com firmeza intensa ou muito intensa, 17%
declararam que as rugas de expressão ficaram leves ou ausentes. Outro questionário de
Atributos do produto contendo os seguintes itens :Perfume, Espalhabilidade, Toque na Pele e
Intenção de Compra também foi distribuído no último dia da avaliação e os resultados foram:
39% manifestaram que o perfume é bom ou excelente; 82% manifestaram que a
espalhabilidade é boa ou fácil; 83% declararam que o toque na pele do produto é macio ou
possui a textura macia; 91% declararam que provavelmente ou com certeza comprariam o
produto. Podemos concluir que o uso da Melitina veiculado em um cold cream, neste
trabalho, foi eficaz na hidratação e maciez da pele, no entanto sua eficácia no tange a firmeza
e presença de rugas foi discreto o que sugere que outros trabalhos devam ser realizados.
Contudo no que tange a segurança de uso se mostrou totalmente inócua.
Palavras Chave: 1. Melitina. 2. Antirrugas. 3. Antissinais. 4. Veneno de Abelhas. 5. Bee venon
ABSTRACT
The aging facial skin is a physiological process which inevitably results in the appearance of
wrinkles or expression signals. In some people these prominent effects will appear faster and
in other this effects will appear later and with less intensity. This paper proposes the use of an
asset derived from bee venom, melittin. Melittin is a compound composed of a complex
mixture of amino acids, peptides, carbohydrates, lipids, enzymes and others, which
mechanism of action involves an increased blood flow and stimulation of collagen
production, besides inhibiting the production of metalloproteins that can cause damage to
collagen formation. A cream based on cold cream formulation was developed and added
0.085 % of melittin as active. The product was safety tested using the Evaluation of Topical
Dermatological compatibility involving the Primary Dermal Irritation (IDP) Dermal
Accumulated (IDA) and Dermal Sensitization (SD) tests which results shows the total
allergen safety in 59 individuals of both genders that participated in the test. The efficacy of
use was tested through a Clinical Trial for hydration, smoothness, firmness and wrinkles and
this items was scored on a scale of 1 to 5. Subjects applied the cream at the initial time T0 and
during the next 30 days T30. The measurements were performed by a dermatologist at T0 and
T30. With a value of statistical significance of 5 % (Student t test) an improvement can be
observed for the items: hydration and smoothness. The percentage of volunteers with some
degree of clinical improvement observed after using the product for 30 days were: 65 % for
Hydration; 52 % for Softener; 4 % for Firmness. In the Subjective clinical trial, conducted in
parallel, the results were compared in the same items mentioned above at -T0- and after 30
days of use -T30- . The self-perception could be captured by a specific questionnaire
completed on the last day evaluation. The results were: 96 % of volunteers stated that the skin
was very hydrated or moisturized, 56 % stated intense or very intense softness, 21 % said
intense or very intense firmness, 17 % stated that wrinkles were mild or absent. Other product
attributes questionnaire containing the following items: scent/perfume, Spreadability, Touch
Skin and Purchase Intention was also distributed on the last day of the assessment and the
results were: 39 % stated that the smell / perfume is good or excellent; 82 % indicated that the
spreadability is good or easy; 83 % declared that the skin touch of the product is soft or has
soft texture; 91 % said they probably or definitely buy the product. We can conclude that the
use of Melittin, in a typical cold cream, in this paper was effective in skin hydration and
smoothness, however its effectiveness in terms of firmness and wrinkles presence was
discreet suggesting that other studies should be conducted.
However regarding the safety of use it was proved totally safe.
Key Words: 1. Melittin. 2. Anti-wrinkle. 3. Antiaging. 4. Bees Poison. 5. Bee Venon
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1 - Médias das avaliações clínicas no decorrer do tempo experimental para os
itens: Hidratação, Maciez, Firmeza e Rugas de Expressão ......................................................26
GRÁFICO 2 - Porcentagem de voluntários que apresentaram melhora, através da avaliação
clínica, para os itens: Hidratação, Maciez, Firmeza e Rugas de Expressão .............................26
GRÁFICO 3 - Avaliação Subjetiva Hidratação T30 ...............................................................27
GRÁFICO 4 - Avaliação Subjetiva Maciez T30 .....................................................................27
GRÁFICO 5 - Avaliação Subjetiva Firmeza T30 ....................................................................27
GRÁFICO 6 - Avaliação Subjetiva Rugas de Expressão T30 .................................................27
GRÁFICO 7 - Avaliação do produto quanto ao Cheiro/Perfume ............................................28
GRÁFICO 8 - Avaliação do produto quanto a Espalhabilidade ..............................................28
GRÁFICO 9 - Avaliação do produto quanto ao toque na Pele ................................................28
GRÁFICO 10 - Intenção de Compra .......................................................................................28
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Comparação de produtos contendo ativos antirrugas ........................................10
TABELA 2 - Fórmula utilizada para a preparação do creme antirrugas .................................13
TABELA 3 - Cronograma do estudo de Irritabilidade Dérmica Primária ...............................18
TABELA 4 - Cronograma do estudo de Irritabilidade Dérmica Acumulada ..........................19
TABELA 5 - Cronograma do estudo de Sensibilização Dérmica ...........................................20
TABELA 6 - Tabela com a escala de graduação do ensaio de eficácia clínica .......................21
TABELA 7 - Tabela de avaliações de atributos ......................................................................22
TABELA 7.1- Teste IDP, IDA e SD versus Reação Positiva...................................................23
TABELA 8 - Resultados obtidos nas avaliações de Irritação Dérmica Primária e
Acumulada............................................................................................................24
TABELA 9 - Resultados obtidos nas avaliações de Sensibilização Dérmica ..........................25
TABELA 10 - Resultados do teste T de Student para os itens Hidratação, Maciez, Firmeza e
Rugas de Expressão, avaliados nos tempos experimentais ..................................26
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A - Informações Gerais sobre a extração do veneno de abelhas ...............................37
ANEXO B - Protocolos dos ensaios de IDP, IDA e SD ..........................................................38
ANEXO C - Protocolos dos ensaios de avaliação de eficácia na redução dos sinais do
envelhecimento facial .........................................................................................40
ANEXO D - Escala de Fototipos de Fitzpatrick ......................................................................43
ANEXO E - Informações Técnicas sobre as Matérias Primas Usadas ....................................44
ANEXO F - Informações detalhadas sobre Critérios Exclusão de Dados ...............................46
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Aparelho extrator de veneno de abelhas..............................................................15
FIGURA 2 - Placas de vidro coletoras de veneno de abelhas .................................................15
LISTA DE ABREVIATURAS
IDP - Irritabilidade Dérmica Primária
IDA - Irritabilidade Dérmica Acumulada
SD - Sensibilidade Dérmica
UV - Ultra Violeta
DMAE - Dimetilaminietanol
UVA - Ultra Violeta tipo A
UVB - Ultra Violeta tipo B
BHT - Butil Hidroxi Tolueno
ICDRG - International Contact Dermatitis Research Group
GCP - Good Clinical Pratices (Boas Praticas Clínicas)
Sumário
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 1
2. JUSTIFICATIVA ................................................................................................................. 3
3. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 3
3.1. OBJETIVO GERAL ................................................................................................................ 3
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................... 3
4. REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................................... 4
4.1. A PELE E O APARECIMENTO DE RUGAS ............................................................................. 4
4.2. MATÉRIAS-PRIMAS ANTISSINAIS NO MERCADO ................................................................ 7
4.3. FORMULAÇÕES DO MERCADO ............................................................................................ 9
4.4. A MELITINA ....................................................................................................................... 11
5. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................. 13
5.1. FÓRMULA QUANTITATIVA UTILIZADA ............................................................................. 13
5.2. PROCEDIMENTO DE PREPARAÇÃO DA FÓRMULA ............................................................. 14
5.3. EQUIPAMENTOS E MÉTODOS .................................................................................. 14
5.3.1. MÉTODOS PARA EXTRAÇÃO DE VENENO DE ABELHAS .................................................... 14
5.3.2. EQUIPAMENTOS DE EXTRAÇÃO DE VENENO DE ABELHAS ............................................... 15
5.3.3. MODO DE OPERAÇÃO....................................................................................................... 16
5.3.4. RASPAGEM DO VENENO ................................................................................................... 16
5.4. AVALIAÇÃO DERMATOLÓGICA DE COMPATIBILIDADE TÓPICA, IRRITABILIDADE
DÉRMICA PRIMÁRIA (IDP), ACUMULADA (IDA) E SENSIBILIZAÇÃO DÉRMICA (SD) ........... 17
5.4.1. MÉTODO DE TESTE DE IRRITABILIDADE DÉRMICA PRIMÁRIA .......................................... 18
5.4.2. MÉTODO DE TESTE DE IRRITABILIDADE DÉRMICA ACUMULADA ..................................... 19
5.4.3. MÉTODO DE TESTE DE SENSIBILIDADE DÉRMICA – SD .................................................... 19
5.4.4. EQUIPAMENTOS UTILIZADOS NOS TESTES DE IDP, IDA E SD.......................................... 20
5.5. MÉTODO DE AVALIAÇÕES CLÍNICAS NA REDUÇÃO DOS SINAIS DO ENVELHECIMENTO
FACIAL ...................................................................................................................................... 20
5.6. MÉTODO DE AVALIAÇÃO DE EFICÁCIA SUBJETIVA NA REDUÇÃO DOS SINAIS DO
ENVELHECIMENTO FACIAL ...................................................................................................... 22
5.7. MÉTODO DE AVALIAÇÃO DE ATRIBUTOS .......................................................................... 22
6. RESULTADOS ................................................................................................................... 23
6.1. RESULTADO DA AVALIAÇÃO DERMATOLÓGICA DE COMPATIBILIDADE TÓPICA,
IRRITABILIDADE DÉRMICA PRIMÁRIA (IDP), ACUMULADA (IDA) E SENSIBILIZAÇÃO
DÉRMICA (SD).......................................................................................................................... 23
6.2. RESULTADOS DA AVALIAÇÃO CLÍNICA ............................................................................ 26
6.3. AVALIAÇÃO SUBJETIVA .................................................................................................... 27
6.4. AVALIAÇÃO DE ATRIBUTOS FÍSICOS ................................................................................ 28
7. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 29
7.1. SEGURANÇA DE USO .......................................................................................................... 29
7.2. AVALIAÇÃO CLINICA E AVALIAÇÃO SUBJETIVA ............................................................. 29
7.3. AVALIAÇÃO DE ATRIBUTOS FÍSICOS ................................................................................ 30
7.4. DISCUSSÃO GERAL ............................................................................................................. 30
8. CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 31
9. REFERÊNCIAS: ................................................................................................................ 32
10. ANEXOS............................................................................................................................ 37
1
1. INTRODUÇÃO
Antissinais é e sempre será uma importante fonte de pesquisa em cosmetologia como
nos mostra a própria história desta área da ciência.
De acordo com historiadores, os Egípcios foram os primeiros usuários de cosméticos e
produtos de toucador em larga escala. Há relatos de que alguns tipos de minérios foram
utilizados como sombras de olhos, e alguns tipos de extratos vegetais, como por exemplo, a
henna, que foi utilizada como realçadores e auxiliares de beleza, ao disfarçarem
irregularidades da pele, entre eles as rugas (TREVISAN; MENDA, 2011).
Na era Romana, por volta do ano 180 D.C., um médico grego chamado Claudius
Galeno realizou sua própria pesquisa científica na manipulação de produtos cosméticos,
iniciando assim a era galênica dos produtos químico-farmacêuticos. Galeno desenvolveu um
produto chamado Unguentum Refrigerans, também conhecido como Cold Cream1, baseado
em cera de abelha e bórax, e que, provavelmente, era usado também no tratamento antissinais
(SÍLVIA, TANIA REGINA, 2008).
Desde o nascimento, a pele está sujeita ao processo biológico de fenômenos fisiológicos
do envelhecimento (GOBBO, 2010). Esse pode ser classificado como extrínseco ou
intrínseco, sendo o primeiro causado por fatores ambientais tais como: radiação UV e fumo, e
o segundo causado por fatores cronológicos, ou seja, por degradação, ao longo do tempo, dos
componentes do próprio organismo.
Com o aumento da expectativa de vida, o interesse pelo retardo do envelhecimento tem
aumentado, principalmente quando se trata de cuidados estéticos. Hoje, conta-se com uma
moderna tecnologia e recurso que podem maximizar os resultados de tratamentos a fim de se
retardar os efeitos fisiológicos do envelhecimento (SOUZA; JUNIOR, 2008).
Dessa forma, a preocupação com os cuidados da aparência torna a área de pesquisas em
produtos que ofereçam benefícios à sua beleza, muito atrativa. Umas das categorias desses
produtos são os considerados antissinais os quais auxiliam a reduzir linhas de expressões e
rugas, utilizados principalmente na área do rosto.
1 Creme frio formulado a partir de óleo e água. É utilizado para hidratar a pele e suavizar queimaduras solares. O
Creme Protetor Hidratante com Água Termal da La Roche Posay é considerado um cold cream, por exemplo.
2
As rugas são geralmente formadas pela diminuição do colágeno e a perda da retenção de
água celular, que ocorre naturalmente com o avanço da idade. Elas consistem em formação de
sulco na superfície da pele devido à degeneração e diminuição dos tecidos elásticos
(RIBEIRO, 2010).
As fibras de colágeno e as fibras elásticas são responsáveis em manter a aparência de
uma pele rejuvenescida. Estas fibras, por estarem dispostas de uma maneira única na derme,
tem a capacidade de formarem uma rede de sustentação (LIMPIANGKANAN, 2010). Com o
envelhecimento, os níveis de colágeno vão diminuindo (AZULAY, 2008).
Ainda de acordo com (RIBEIRO, 2010), uma boa formulação cosmética para peles
envelhecidas, deve ser capaz de atuar em diferentes fenômenos responsáveis pelo
aparecimento de sinais de envelhecimento. Dessa forma, a formulação deve conter pelo
menos uma mistura de ativos que possam conferir maior hidratação, fotoproteção, redução de
radicais livres e principalmente, os que possuem capacidade de melhorar o metabolismo da
pele. A vitamina C e o DMAE Bitartarato seriam bons exemplos de ativos utilizados
amplamente por formuladores além da vitamina A ou Retinol e a provitamina B5 ou d-
pantenol que são exemplos de ativos capazes de melhorar o metabolismo da pele, pois atuam
diretamente em fenômenos fisiológicos do envelhecimento da pele.
A vitamina C (ácido ascórbico) é um antioxidante que ocorre na natureza, quando
incorporada em formulações cosméticas, é utilizada com o propósito de prevenir e tratar a
pele danificada pelo sol, doando elétrons de modo sequencial, neutralizando os radicais livres
e protegendo as estruturas intracelulares do estresse oxidativo (DRAELOS, 2009). Quando
utilizada topicamente, a vitamina C pode diminuir a quebra do colágeno, aumentar a síntese
de colágeno tipo I, conferir elasticidade e firmeza à pele e reduzir a síntese de melanina
(DRAELOS, 2009; KEDE; SABATOVICH, 2009).
Como comentado acima, outro ativo utilizado na indústria cosmética é o
Dimetilaminoetanol (DMAE) Bitartarato. O DMAE bitartarato é um antioxidante e
estabilizador de membrana capaz de fazer com que a mesma se torne mais resistente ao
estresse oxidativo e se estabilize (PERRICONE, 2001).
A melitina é um peptídeo antimicrobiano isolado do veneno da abelha Apis melífera
(Bee Venon) que tem a característica de romper membranas lipídicas, formar poros, causar
fusão de membranas e hemólise. Esse peptídeo compõe 50% do peso seco do veneno e é
caracterizado por possuir 26 aminoácidos e carga +5 ou +6 quando o resíduo de Glicina é
protonado em pH 7 (RAGHURAMAN; CHATTOPADHYAY, 2006).
3
Considerando a importância de ativos que possuem a capacidade de atuar diretamente
no envelhecimento da pele, como os citados anteriormente, esse trabalho consiste em avaliar e
discutir os estudos realizados em um creme à base de melitina - presente em toxinas de
abelhas (apitoxina). Esse creme contém uma concentração de melitina que tem a capacidade
de simular uma reação fisiológica a uma picada de abelha, porém mais branda. Isso leva ao
organismo desencadear uma reação a essas toxinas, sendo capaz de aumentar o fluxo
sanguíneo, bem como a produção de colágeno, substância que fortalece os tecidos do corpo e
de elastina, proteína que confere flexibilidade (LEE et al., 2004), eliminando as células
mortas e reduzindo as rugas.
2. JUSTIFICATIVA
A ação anti-inflamatória da melitina já foi amplamente estudada e sua aplicação é maior
na área de medicamentos. Considerando a importância de ativos que possuem a capacidade de
atuar diretamente no envelhecimento da pele e a reduzida informação do uso dessa substância
na área cosmética, percebemos uma possível oportunidade de ampliar seu potencial de uso no
mercado cosmético para fins estéticos e dispor aos novos formuladores uma bibliografia
contendo estudos realizados em um produto contendo tal substância.
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Estudo da eficácia antissinais e da inocuidade alergênica da melitina em uma
formulação de creme tipo Cold Cream, caracterizado por ser uma emulsão Óleo em Água
(O/A) e possuir ótimas propriedades de hidratação, permeabilidade cutânea, de ação
intradérmica e por ser ideal para veiculação de ativos hidro e lipossolúveis.
3.2. Objetivos Específicos
(a) Apresentação de uma discussão, com base em levantamentos da literatura técnica a
respeito da melitina, relativos ao seu uso na área Cosmética;
4
(b) Apresentação de resultados da Avaliação Dermatológica de Compatibilidade Tópica
que envolveu testes de Irritabilidade Dérmica Primária (IDP), Acumulada (IDA) e
Sensibilização Dérmica (SD);
(c) Apresentação de resultados de Avaliações Clínica e Subjetiva na redução dos sinais
do envelhecimento facial.
4. REFERENCIAL TEÓRICO
4.1. A Pele e o Aparecimento de Rugas
A pele é um órgão complexo e é considerado como um revestimento protetor de toda a
superfície do corpo (HOARE, 2010). É o maior órgão do corpo humano, chegando a
constituir 16% do peso corporal total. Além de conferir proteção ao corpo, outras funções
podem ser atribuídas a esse órgão: controle de temperatura, sensorial, estética, absorção da
radiação ultravioleta (UV), síntese de vitamina D e eliminação de algumas substâncias
químicas (RIBEIRO, 2010). Do ponto de vista estético, a pele constitui a fachada, ou
aparência que determina o perfil característico do homem e o diferencia de forma única na
natureza. Suas variações são determinantes nas diferentes características raciais, sexuais e
individuais que existem na população humana (CORRÊA, 2012).
Em análises histológicas da pele, é possível observar duas camadas básicas: a epiderme
e a derme. Abaixo dessas, encontra-se uma camada formada por tecido adiposo, conhecida
como hipoderme (RIBEIRO, 2010). A epiderme é separada da derme por um conjunto de
células chamada lâmina basal (CORRÊA, 2012).
A epiderme consiste em uma estrutura formada por diferentes camadas de
queratinócitos (células epiteliais). Essas são estratificadas e sofrem diferenciação à medida
que saem da camada basal até a superfície mais externa da pele. Essas camadas são
conhecidas como basal, espinhosa, granulosa, lúcida e córnea (RIBEIRO, 2010).
A camada basal, também chamada de germinativa, é a única camada de células em que
essas se encontram na fase de divisão celular e proliferação. A camada espinhosa é formada
por células ativas com citoplasma denso e repleto de substâncias como aminoácidos. As
células da camada granulosa possuem núcleos achatados e granulares, mas em fase de maior
diferenciação possuem o núcleo oval. Nelas estão presentes os grânulos de queratohialina. A
camada lúcida é formada por células homogêneas e transparentes e que se encontram mortas.
5
A camada córnea é composta por células mortas, de forma achatada, fina e sem núcleo. É essa
camada que sofre constante esfoliação devido a algum processo mecânico ou químico
(HOARE, 2010).
A derme é formada por um tecido resistente e elástico, proporcionando assim,
resistência física frente à agressão mecânica. Além disso, é responsável pelo fornecimento de
nutrientes à epiderme (RIBEIRO, 2010).
A derme é dividida em duas regiões: papilar e reticular. Ambas são compostas por
células, fibras e substância fundamental amorfa, além de fibroblastos, histiócitos, células
endoteliais e mastócitos. As fibras presentes são as colágenas, reticulares e elásticas
(CORRÊA, 2012).
O colágeno é sintetizado pelos fibroblastos na forma de pro-colágeno, seu precursor.
Esse, quando se encontra no meio extracelular, sofre ação enzimática formando unidades de
tropocolágenos, que se polimerizam formando as fibras de colágeno (RIBEIRO, 2010). Tem a
característica de ser uma fibra de proteína dura, branca e inelástica, encontrada em feixes
paralelos à superfície da pele e é responsável por conferir resistência à pele (HOARE, 2010).
Já a elastina, apesar de ser produzida também pelos fibroblastos, são proteínas amarelas
e estão dispostas de forma que formam uma rede (HOARE, 2010). São muito ramificadas,
retas e altamente resistentes. Geralmente são mais espessas na derme papilar e mais fina na
derme reticular (RIBEIRO, 2010). Por causa dessa formação e características, conferem à pele
a capacidade de se estender e voltar à posição original (HOARE, 2010).
As fibras reticulares são produzidas pelo colágeno proteico e formam uma rede de
ramificações que possuem a função de apoio (HOARE, 2010).
Na derme, estão presentes também glucosaminoglicanas como o ácido hialurônico,
sulfato de heparana, sulfato de condroitina, entre outros. Essas moléculas possuem a
capacidade de se ligarem à um proteína formando um composto conhecido como
proteoglucanas. Esses compostos são altamente hidrofílicos, ou seja, possuem forte
capacidade de se ligarem a moléculas de água. Consequentemente são responsáveis por reter
água na derme, bem como e conferir a turgescência cutânea (RIBEIRO, 2010).
Em condições normais, ou seja, natural, a pele está constantemente se renovando de
forma equilibrada entre a quantidade de componentes produzidos e degradados. Porém, com o
envelhecimento desse órgão, essa dinâmica se encontra prejudicada (PUPO, 2012).
O processo de envelhecimento da pele é um fenômeno biológico (BATISTELA, 2007)
complexo, geralmente classificado como: envelhecimento intrínseco e envelhecimento
6
extrínseco. O primeiro se refere às mudanças ocorridas na pele que são programadas
geneticamente e que ocorre de maneira semelhante em qualquer outro órgão do corpo. O
segundo se refere às exposições repetitivas a substâncias ou situações danosas ao tecido
cutâneo (HIRATA et al, 2004).
O envelhecimento intrínseco é influenciado por quatro processos distintos: controle
metabólico, resistência ao estresse, desregulação gênica e estabilidade genética. Em relação
ao controle metabólico, pode ocorrer interferência pelo descontrole de regulação da secreção
de certos hormônios como o luteinizante e o do crescimento. O estresse oxidativo é
relacionado ao excesso de formação de radicais livres pelo corpo. Esses componentes são
altamente reativos e são de grande importância por participarem e promoverem uma série de
reações necessárias à manutenção do organismo, porém, fabricado em excesso, pode reagir de
forma não equilibrada com o DNA, lipídeos, proteínas e carboidratos. Já a desregulação
gênica e estabilidade genética se referem ao fato de que o próprio envelhecimento intrínseco
causa uma redução na atividade das células da pele devido a alterações de moléculas que
regulam o crescimento de fibroblastos, além do aumento de degradação de fibras elásticas e
colágeno por metaloproteínas, devido à redução de inibidores dessas enzimas (MORAES,
2012). Como o crescimento de fibroblastos no tecido conjuntivo se encontra deficiente, ocorre
consequentemente, a redução da produção do colágeno (PUPO, 2012). Deve-se considerar
também que ocorre o enfraquecimento dos vasos superficiais e redução da superfície de
contato entre a derme e epiderme, desencadeando assim a desnutrição da epiderme
(MORAES, 2012).
O envelhecimento extrínseco está relacionado às alterações cutâneas causadas
principalmente pelo foto-envelhecimento, conhecido como envelhecimento causado por
exposição ao sol. Porém, outros fatores também possuem a capacidade de interferir nesse
processo de envelhecimento, como a exposição à poluição, fumo, radicais livres, entre outros
(RIBEIRO, 2010).
O envelhecimento que ocorre pela idade, ou seja, o intrínseco, geralmente é mais suave,
lento e gradual, apresentando mudanças ou danos estéticos muito pequenos. Já o
envelhecimento proveniente da exposição à fatores ambientais é mais agressivo, sendo
considerado responsável por modificações severas da superfície da pele (BATISTELA,2007).
Não há um processo único de envelhecimento da pele, existem influências multifatoriais,
sendo elas genéticas, metabólicas, adquiridas ou provenientes do ambiente agindo em
diferentes mecanismos (BATISTELA, 2007).
7
A formação de rugas ocorre principalmente devido a fatores externos, como a exposição
aos raios ultravioleta, esse responsável por modificações mais perceptíveis à pele
(BATISTELA, 2007). O tecido conjuntivo de uma pele envelhecida apresenta elasticidade e
turgor inadequados. Isso acontece porque o colágeno não se encontra em sua forma natural e
não podem deslizar entre si facilmente, além de apresentarem estruturas mais rígidas
reduzindo o seu poder de absorver umidade. Além disso, o órgão apresenta quantidades
reduzidas de mucopolissacarídeos que possuem capacidade de se ligar à água presente, que
consequentemente, reduz também o turgor comum de uma pele jovem (HIRATA, et. al,
2004).
De acordo com Ribeiro (2010), todas essas alterações contribuem para a redução da
capacidade da pele em reter água na região da derme, ocorrendo a diminuição do turgor e
tornando a situação favorável à formação de rugas. Além disso, de acordo com Pupo (2012), o
aparecimento de rugas ocorre devido a perda de elasticidade da pele causada pela rápida
degradação do colágeno.
4.2. Matérias-Primas Antissinais no Mercado
Existem no mercado, diversas matérias-primas que possuem propriedade antissinais
e/ou antienvelhecimento. Para possuir tal propriedade, deve-se levar em consideração que a
substância tenha capacidade de atuar em algum fenômeno responsável pelo aparecimento dos
sinais de envelhecimento. Sendo assim, existem os fotoprotetores, os que diminuem a
formação ou ação de radicais livres, os que hidratam a epiderme e principalmente, os que
melhoram o metabolismo dérmico e epidérmico (RIBEIRO, 2010).
É possível associar a proteção da pele contra a radiação ultravioleta, utilizando
sequestradores de radicais livres e substâncias que possuam alguma ação anti-inflamatória,
que reduzem a reação eritematosa (pele avermelhada) e também a peroxidação da membrana
celular por radicais livres. Dessa forma, pode-se minimizar o envelhecimento precoce da pele
(MORAES, 2012).
As substâncias fotoprotetoras, são aquelas que possuem a capacidade de proteger a pele
de absorver as radiações UVB e UVA emitidas pelo sol. É o caso da benzofenona 3, um
composto aromático, com presença de um grupo doador de elétrons. Essa estrutura molecular
permite absorver os raios UVA ao invés da pele (DAVOLOS; et al, 2007). Sua fórmula é
8
C14H12O3 com pico de absorção em 290 nm, usado geralmente em associação a outros filtros
UVB em bloqueadores solares de elevado FPS (MAPRIC, 2014).
Existem trabalhos científicos que demonstram atividade fotoquimioprotetora de
flavonoides presentes em vegetais. O ácido ferúlico (ácido 4-hidroxi-3-metoxi-cinâmico tem
demostrado ação protetora aos fosfolipídios presentes nas membranas dos efeitos da
peroxidação lipídica, ou seja, atua como um anti radical livre. Além disso, confere à pele
proteção contra a formação de eritema induzido por raios UVB (MORAES, 2012).
Os radicais livres estão associados ao envelhecimento da pele, pois possuem a
capacidade de causar alterações estruturais e fisiológicas no organismo. A vitamina A e
vitamina C possuem a propriedade de combater radicais livres sendo conhecidos como
antioxidantes (GUERRA; et al, 1994) e como cofator em reações para produção de colágeno
(RIBEIRO, 2010). Além disso, de acordo com Draelos (2009), a vitamina C é utilizada como
prevenção e para peles danificadas pelo sol, pois tem a capacidade de doar elétrons,
neutralizando radicais livres e protegendo as estruturas intracelulares do possível estresse
oxidativo causado pelos raios UV. Ainda de acordo com Draelos (2009), quando utilizada de
forma tópica, ou seja, presente em formulações de emulsões, pode reduzir a quebra de
colágeno, aumentar a síntese de colágeno conferindo elasticidade e firmeza à pele.
A vitamina A, também conhecida como retinol (C36H60O2), é bem absorvida pela pele
possuindo uma ação moderadora da produção de queratina e estimula o desenvolvimento e
maturação das células da pele. Em formulações cosméticas se encontra associada a vitaminas
D e E e é indicada para pessoas com a pele seca ou sujeita a exposições à intempéries.
Seu efeito cosmético torna a pele mais lisa e macia (MAPRIC, 2013). O retinol e seus
derivados favorecem a manutenção da pele normal devido a sua capacidade de atuar no
processo de hiperqueratinização, na diferenciação das células epiteliais e na síntese de
colágeno. Essa capacidade propicia à pele maciez e consequentemente uma aparência mais
jovem e saudável (CATEC, 2011).
O DMAE ou dimetilaminoetanol é classificado como um antioxidantes e, portanto,
possui a capacidade de estabilizar a membrana celular. Além disso, tem a capacidade de fazer
com que a membrana se torne mais resistente à ação de radicais livres (MAPRIC, 2013). Sua
molécula tem peso molecular de 89,14 e que devido a isso, tende a atravessar a barreira da
pele com facilidade. Estruturalmente, o DMAE é análogo ao neurotransmissor colina e possui
a capacidade de aumentar a biossíntese de acetilcolina tanto no sistema nervoso central quanto
na derme. Na derme, a acetilcolina tem como função ser um citotransmissor se ligando a
9
receptores de células de fibroblastos, queratinócitos e células endoteliais modulando
atividades como proliferação, diferenciação e migração. Além disso, possui capacidade
antioxidante e anti-inflamatória (FIORINI et al, 2008).
O DMAE bitartarato (C4H11NO.C4H6O6) é indicado em formulações com efeito lifting
para o rosto, ou seja, área ao redor dos olhos e pálpebras, além do pescoço. É utilizado
também em formulações antirrugas e antienvelhecimento (MAPRIC, 2013). Pode muitas
vezes ser associado a ativos como o ácido glicólico e a vitamina C, tendo como benefício
associado a prevenção de danos causados pelos raios UV (FIORINI et al, 2008).
Com o envelhecimento, a lubrificação e hidratação da pele ficam prejudicadas. Assim, o
uso de produtos contendo hidratantes e lipídeos ajudam a repor e melhorar essas
características. As matérias-primas comumente utilizadas são os lipídeos vegetais, pois além
de conferirem a lubrificação, causa oclusão da cútis, aumentado a retenção de água e dessa
forma, a hidratação da epiderme. O óleo de buriti é um exemplo desse tipo de matéria-prima
(RIBEIRO, 2010).
O óleo de buriti possui a capacidade de aumentar a elasticidade da pele, bem como
reduzir o ressecamento da pele exposta a radiação solar. Além disso, auxilia na regeneração
dos lipídeos presentes na camada córnea de pele, sendo indicado para formulações antiaging
(MAPRIC, 2013).
A pró-vitamina B5, também conhecida como d-pantenol, é um exemplo de matéria-
prima capaz de melhorar o metabolismo dérmico e epidérmico, pois ao ser aplicado
topicamente, é convertida em ácido pantotênico, um componente natural da pele
(GUIMARÃES, et al, 2011). Além disso, de acordo com (RIBEIRO, 2010), aumenta a
regeneração celular.
O ácido lático e o glicólico, também possuem capacidade de melhorar o metabolismo
dérmico, pois quando usados de forma correta e contínua, podem aumentar a espessura da
pele. Além disso, aumentam a deposição de colágeno e outros componentes do tecido
conjuntivo. Dessa forma, reduzem o aspecto da pele envelhecida (RIBEIRO, 2010).
4.3. Formulações do Mercado
A fim de exemplificar o uso de matérias-primas com propriedades antissinais e/ou
antienvelhecimento, alguns produtos disponíveis no mercado de cosméticos são descritos no
tabela abaixo:
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Tabela 1 - Comparação de produtos contendo ativos antirrugas. Produto Empresa Ativos
SINEIK® Germed®
Acico Hialurônico Hidrolizado;
Diaminobutiroil Dipeptideo;
Palmitoil Tripeptideo -5
NEODERM COMPLEX® ADCOS®
Ácido Glicólico 10%; Niacinamida 4%; Óleo de Semente de Uva; Alantoína
ACTIVE C® LA ROCHE-POSAY® Vitamina C 5%
DMAE PLUS CREME® VALMARI®
Retinol; Extrato de Melancia; PCA Sódio; Algisium C; DMAE
LINE SMOOTHING EYE CREAM®
PALMER’S®
Extrato Oenothera; Shea Butter; Cocoa Butter; Vitamin E; Milk Proteins; Peptides; Retinol
O produto da Germed®, SINEIK
®, de acordo com a propaganda escrita em seu site,
afirma que o produto possui uma associação adequada de ativos emolientes, hidratantes e
regeneradores que auxiliam na prevenção do envelhecimento cutâneo. Utiliza em sua
formulação um peptídeo que mimetiza a ação do veneno de cobra atuando dessa forma como
um potente antirrugas e um outro peptídeo que estimula a síntese de colágeno.
O produto da LA ROCHE POSAY®, ACTIVE C
®, de acordo com a propaganda escrita
no site da empresa, afirma que o produto intensifica a síntese do colágeno, suaviza o aspecto
da pele. Além disso, melhora o seu brilho que é apagado pelo envelhecimento cronológico.
O produto da VALMARI®, DEMAE PLUS CREME
®, de acordo com a propaganda
escrita no site da empresa, afirma que sua fórmula age com efeito firmador e antirrugas. Seu
uso resulta em uma pele tonificada e luminosa.
O produto PALMER’S®, LINE SMOOTHING EYE CREAM
®, de acordo com a
propaganda escrita no site da empresa, afirma que é um rico hidratante para a região dos olhos
contendo uma mistura de ingredientes suaves que atuam como antiaging e hidratante. Além
disso, a sua fórmula suave reduz o aspecto de linhas finas ao redor dos olhos sem causar
irritação.
11
4.4. A Melitina
O veneno da abelha Apis mellifera, também conhecido como apitoxina ou bee venom,
possui componentes com alto peso molecular. A composição exata e completa desse produto,
ainda não está totalmente elucidada, porém, sabe-se que é formado por uma mistura complexa
de aminoácidos, peptídeos, carboidratos, lipídeos, enzimas entre outros. Dentre os compostos
já isolados, um dos mais importantes é a melitina (SILVA, 2009).
A melitina é um peptídeo que compõe 50% do peso seco do veneno da abelha e possui
26 aminoácidos podendo ter carga +5 ou +6 caso o resíduo do aminoácido Gly (glicina) esteja
protonado. Isso ocorre em meio de pH 7 (MANZINI, 2011). A sequência de aminoácidos em
sua forma monomérica é NH2-Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-
Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-CONH2 (WEINBERG, 2011). Abaixo
mostramos a estrutura química da MELITINA a partir do tetrâmero:
MELITINA – (BEE VENOM) -CAS RN: 37231-28-0
Sinônimos: Melitten, Melittin, Forapine, Mellitin, Forapin, Melittin I, Melittin-T, Honeybee
melittin, Bee venon melittin, Melittin (honeybee), Melittin (major), Melittin (apis cerana),
Melittin (major) (8CI), C2H6, PKS043, EINECS 253-417-7,
GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2, LS-89467, LS-89468,
GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2 MELITTIN
Fórmula Molecular: C131H229N39O31 Peso Molecular: 2846,462660 g/mol
Segundo Baker (1995), a melitina possui efeitos sobre a membrana celular devido a sua
afinidade por fosfolipídios. Para Monette (1995), a melitina é um peptídeo catiônico que
12
possui atividade na membrana devido a capacidade de causar micelização de algumas
proteínas, impedindo assim a ruptura da membrana. Já em outros tipos de proteínas presentes
na membrana, é capaz de desempenhar um efeito estabilizador.
A modulação dos efeitos da melitina sobre a estrutura e organização da membrana
depende da natureza do componente lipídico da mesma. Algumas propriedades físicas do
componente lipídico parecem contribuir para a arquitetura resultante da interação
melitina/lipídeo. Não se observa nenhuma lise celular nas membranas quando a melitina
interage com os lipídeos de carga negativa presente na camada bilamelar da célular, em
compensação, a ligação da melitina com lipídeos de carga alterada é prejudicial a vitalidade
celular. Isso indica que há polimorfismos nas macroestruturas melitina/lipídeo (SHARMA,
1993).
O veneno de abelha já possui estudos demonstrando ser efetivo em tratamentos de
alergia, feridas, queimaduras e outras doenças de pele (DUNCAN, 2013). Ainda de acordo
com (DUNCAN 2013) a melitina pode ser aplicada topicamente para acelerar a resolução de
uma ferida devido a sua capacidade de regenerar a pele. Isso porque além de desencadear
outros fatores, causa inibição da produção de metaloproteínas da matriz celular e que é
importante para a redução de danos ao colágeno.
De acordo com o claim descrito pela empresa RODIAL, o veneno de abelha é usado
para imitar a própria picada de abelha na pele. Isso causa um aumento do fluxo sanguíneo na
área aplicada estimulando a produção de colágeno e elastina.
Já para a empresa MANUKA DOCTOR, o claim presente em seu site afirma que os
benefícios incluem: aumento de regeneração celular, redução da aparência de cicatrizes,
auxilia no tratamento e redução de linhas finas e rugas; auxilia na formação de colágeno e
reduz o envelhecimento causado por raios UV.
13
5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.1. Fórmula Quantitativa Utilizada
A fórmula utilizada para a preparação do creme antirrugas tem como base o Cold Cream
onde foi adicionado e estabilizado a melitina (Bee Venon). Vide a tabela 2 abaixo:
Tabela 2: Fórmula utilizada para a preparação do creme antirrugas.
* 0.17% de Bee Venon equivale a aproximadamente 0.085% de MELITINA ativa
s cremes do tipo O/A (óleo em água) apresentam elevado poder de penetração cutânea,
pois devido a suas propriedades umectantes, são capazes de atravessar a barreira lipídica
presente na pele. São fortemente hidrófilos favorecendo a migração iônica por osmose além
de possuírem a capacidade de combinarem com proteínas celulares e dessa forma, serem
excelentes veículos de ativos.
A formulação resultou num creme de cor branca com odor característico do produto
onde o pH variou entre de 4,50 - 6,80, a viscosidade variou entre 50-90.000 cps e densidade
final ficou entre 0,887-0,900 g/mL.
FASE INGREDIENTES – INCI NAME- CAS # % Função
A
CETEARYL ALCOHOL\POLYSORBATE 60
67762-27-0\ 9005-67-8
12,00 Base auto-
emulsionante
CETYL ACETATE\ACETYLATED LANOLIN ALCOHOL
629-70--\ 61788-49-6
3,75 Mistura de Emolientes
OCTYL STEARATE 109-36-4 3.75 Emoliete
ALMOND OIL - SWEET 8007-690 22,85 Emoliente
BUTYLATED,HYDROXYTOLUENE-BHT 128-37-0 0,10 Antioxidante
B
METHYLPARABEN 99-76-3 0,18 Conservante
PROPYLPARABEN 94-13-3 0,15 Conservante
PROPYLENE GLICOL 57-55-6 6,20 Umectante
C AQUA 7732-18-5 50,75 Veículo
D BEE POLLEN EXTRACT
INDEX ABC 3a ED. Pg 1050
0,10 Ativo
BEE VENON 37231-28-0 0,17* Ativo
14
5.2. Procedimento de Preparação da Fórmula
Em recipientes adequados, pesar as matérias-primas de acordo com a fase a qual
pertence. Aquecer a Fase A e a Fase C a uma temperatura de aproximadamente 75 0C. Verter
o conteúdo da Fase C na Fase A sob agitação. Quando a mistura atingir aproximadamente 45
0C, adicionar a Fase B homogeneizada. Manter a agitação por 20 (vinte) minutos. Deixar essa
mistura repousar por no mínimo 24 (vinte e quatro) horas.
Para o preparo da Fase D, com o auxílio de um pistilo e um Gral, triturar o veneno de
abelha junto ao pólen, ambos secos com uma pequena quantidade da mistura obtida
anteriormente. O suficiente apenas até a obtenção de uma mistura uniforme e sem grumos. É
necessário que essa operação seja realizada em ambiente com exaustão (capela de exaustão).
Após a preparação da Fase D, vertê-la sobre o resto da mistura e misturar bem, até que
se obtenha uma mistura uniforme.
O creme acima preparado é envasado em potes de plástico e devidamente identificados
para serem utilizados nos testes de Irritabilidade Dérmica Primária - IDP, Irritabilidade
Dérmica Acumulada - IDA e Sensibilização Dérmica – SD.
5.3. EQUIPAMENTOS E MÉTODOS
5.3.1. Métodos para Extração de Veneno de Abelhas
Utilizando o equipamento de extração de veneno conforme descrito no item abaixo (ver
Figuras 1 e 2), quando as abelhas pousam sobre a placa, recebem um choque e reagem
tentando ferroar o vidro e depositando assim, uma carga de veneno. Liberam também uma
secreção de feromônio, que atrai mais abelhas. O veneno perde seus óleos voláteis e adere à
placa, sob a forma de um pó de cor marfim. Desligado o aparelho esse material é raspado e
conservado sob-refrigeração para não se deteriorar.
O aparelho em uso conjunto com várias placas de vidro eletrificadas terá capacidade de
extrair cerca de 400 gramas de apitoxina por mês, um aumento de capacidade de extração
extraordinária levando-se em conta que cada inseto carrega em seu corpo apenas 10
milionésimos de grama (Anexo A).
15
5.3.2. Equipamentos de Extração de Veneno de Abelhas
O aparelho para extração de veneno de abelhas consiste de um potenciômetro (Figura 1)
que emite choques elétricos de baixa potência suficiente para estimular as glândulas ejetoras
de veneno, que estão situadas na parte posterior das abelhas. Os fios que transmitirão o
choque elétrico são enrolados em uma placa de madeira, a qual possui um entalhe por onde
uma lâmina de vidro se encaixará. Esta lâmina de vidro funciona como uma ¨gaveta¨ e é
colocada na entrada da colmeia, exatamente onde as abelhas devem pousar ao entrarem na
colmeia, o cabo elétrico é conectado ao potenciômetro e o sistema é então ligado ao rede
elétrica. Seus componentes são:
- 1 placa coletoras
- 1 lâmina de vidro
- 1 bateria interna
- 1 caixa eletrônica
- 1 Chicote com 10 plugs RCA (20 metros)
Figura 1 - Aparelho Extrator Figura 2 - Placas Coletoras com lâminas
de vidro
16
5.3.3. Modo de Operação
Colocar o aparelho na entrada (alvado) da colmeia, deixando uma distância de um
centímetro da parede de entrada.
Regular o potenciômetro de choque até que as abelhas comecem a ferroar a lâmina de
vidro. Deixar o aparelho ligado por cerca de 45 minutos, ou até que não haja mais abelhas
sobre a placa coletora, onde aconselha-se a coletar da mesma colmeia após 3 dias. Após um
dia de coleta, limpar os filamentos com um pequeno pano com álcool, tendo o cuidado para
não amassar ou entortar os fios.
Após o tempo de coleta, trocar a lâmina de vidro, e caso ainda não esteja cheia de
veneno, totalmente opaca, colocar em outra colmeia repetindo a operação, ou caso cheia
trocar por outra lâmina limpa.
5.3.4. Raspagem do Veneno
Colocar as lâminas de vidro sobre uma superfície lisa e escura, e com uma espátula de
aço inox, ou lâmina de estilete, proceder a raspagem até que não fique mais veneno grudado,
o veneno deve sair seco, branco ou levemente bege, e deve ser imediatamente transferido para
um recipiente limpo de vidro âmbar ou plástico e proteger com lâmina de alumínio, por fora
do vidro. Após a raspagem, as lâminas de vidro devem ser lavadas com água e sabão neutro, e
depois também ser limpa com álcool e armazenada em lugar seco e limpo.
Considerações:
A mortandade de abelhas neste processo é insignificante, sendo bem menor do que em
uma colheita de mel.
Aconselha-se repetir o processo de três em três dias na mesma colmeia para não
estressar as abelhas. Em época de produção de mel, poderá ocorrer queda de 25 ou 30%. Não
aconselhamos usar o extrator de veneno junto com produção de geleia real.
17
5.4. Avaliação dermatológica de Compatibilidade Tópica, Irritabilidade Dérmica
Primária (IDP), Acumulada (IDA) e Sensibilização Dérmica (SD)
Produtos cosméticos necessitam de ensaios clínicos em humanos, para que as empresas
possam oferecer aos consumidores, o máximo de segurança com o menor risco, garantindo as
melhores condições de uso do produto. A partir das informações pré-clínicas coletadas, deve
haver a comprovação de segurança de uso por humanos. Os ensaios de compatibilidade têm
por objetivo comprovar a inocuidade dos produtos em pele humana. São realizados de modo
geral com apósitos oclusivos ou semi-oclusivos (patch tests) ou em modelos abertos (open
tests). Representam o primeiro contato do produto acabado com um ser humano, e por isso
devem seguir premissas de ordem ética (levantamento prévio de dados pré-clínicos segundo
Resolução 196/96 do MS) e de Boas Práticas Clínicas. Há várias metodologias e critérios de
avaliação na literatura.
O estudo de avaliação de ausência de irritação dérmica primária pode ser considerado
como a primeira etapa clínica. Quando realizado de forma isolada na avaliação de novos
produtos, não é suficiente para comprovação de segurança.
A avaliação de irritação dérmica acumulada tem sido realizada por no mínimo três
semanas de aplicação e 50 voluntários, o que normalmente atende às exigências de todas as
agências regulatórias mundiais. Porém existem outros modelos de avaliação clínica
estabelecidos que permitam um número menor de voluntários em prazos diferentes, desde que
haja uma sustentação técnica adequada.
Em geral, a interpretação dos resultados considera a escala do International Contact
Dermatitis Research Group – ICDRG (DRAIZE, 1965; MAILBACH; EPSTEIN, 1965;
KLIGMAN; WOODING, 1967; WILKINSON, 1970; MARZULLI, 1975; CTFA, 1991;
FISHER, 1995; WALKER et al., 1997; MARZULLI, 2008).
O ensaio de Irritabilidade Dérmica Primaria (IDP) tem como objetivo comprovar a
ausência de potencial de irritação primária ou alergia (sensibilização) do produto.
Esses estudos têm por objetivo comprovar a ausência de reações alérgicas por
sensibilização (reações imunes de hipersensibilidade tardia ou do tipo IV) e contemplam 3
fases: indução, repouso e desafio.
O teste de sensibilização dérmica SD tem as mesmas premissas do teste de
compatibilidade e consiste em uma série de aplicações de forma semi-oclusiva ou oclusiva, de
acordo com o produto a ser avaliado em, no mínimo, 50 voluntários, seguindo a interpretação
18
dos resultados considerando o ICDRG. Para produtos irritantes, deve ser realizado com
amostras diluídas, de forma a não induzir resultados falsos positivos (DRAIZE, 1965;
MAILBACH, EPSTEIN, 1965; AGRUP, 1968; SHELANSKI; SHELANSKI, 1979 DOOMS;
GOOSSENS, 1993; FISHER,1995).
Todos os testes de IDP, IDA e SD foram todos realizados nas dependências da empresa
MEDCIN onde se encontram os originais e os arquivos dos dados.
Todos os protocolos dos ensaios em humanos de IDP, IDA e SD estão descritos no
Anexos 2 e 3.
5.4.1. Método de Teste de Irritabilidade Dérmica Primária
Os ensaios devem contemplar um número mínimo de voluntários (50) com critérios de
inclusão e exclusão previamente padronizados (Anexos 2 e 3) . O produto é aplicado de forma
aberta, semi-oclusiva ou oclusiva, de acordo com o produto a ser avaliado. A duração do
contato e periodicidade das leituras são padronizadas. A interpretação dos resultados deve ser
feita considerando o ICDRG (International Contact Dermatitis Research Group). A avaliação
deve ser feita por dermatologista.
Foram aplicados no dorso dos voluntários apósitos contendo 0,02 mL do produto em
estudo puro, solução fisiológica ou óleo mineral usado como controle. Após dois dias os
apósitos foram retirados e a região foi avaliada. Caso houvesse algum indício de positividade,
realizar-se-ia uma nova avaliação após 30 minutos. Ao final de quatro dias após aplicação,
foram realizadas novas avaliações, conforme cronograma mostrado na Tabela 3.
As avaliações foram realizadas conforme escala de leitura preconizada pelo
International Contact Dermatitis Research Group (ICDRG) e anotadas em uma Brochura de
Investigação contendo a compilação de todos os dados durante o estudo.
Tabela 3. Cronograma do estudo de Irritabilidade Dérmica Primária.
19
5.4.2. Método de Teste de Irritabilidade Dérmica Acumulada
Paralelamente ao estudo de Irritabilidade Dérmica Primária (IDP), foi realizado o estudo
de Irritabilidade Dérmica Acumulada (IDA), aplicando no dorso dos voluntários apósitos
contendo 0,02 mL do produto em estudo puro, solução fisiológica ou óleo mineral, usados
como controle. Estes ensaios seguiram os protocolos conforme Anexo B e C e o cronograma
conforme Tabela 4 abaixo.
Tabela 4. Cronograma do estudo de Irritabilidade Dérmica Acumulada
5.4.3. Método de Teste de Sensibilidade Dérmica – SD
O ensaio de Sensibilidade Dérmica (SD) foi conduzido após a realização dos ensaios de
IDP e IDA, os voluntários ficaram em intervalo por duas semanas e retornaram para a fase de
sensibilização (desafio), na qual foram aplicados apósitos em áreas que não foram ocluídas
anteriormente. Conforme Tabela 5, os voluntários retornaram para as avaliações seguintes.
Completada a última etapa do teste de SD, os voluntários passaram por uma nova
avaliação dermatológica, que comparou as condições iniciais do voluntário com as condições
apresentadas após a participação.
Durante os estudos os voluntários foram instruídos a não agitar ou molhar os apósitos,
não iniciar o uso de produtos tópicos novos durante o período de avaliação, não se expor
diretamente ao sol, comparecer no horário estipulado para reavaliações e comunicar ao
Instituto caso fosse necessário o uso de algum medicamento ou realização de algum
20
tratamento durante o estudo. Estes ensaios seguiram os protocolos conforme Anexos 2 e 3 e o
cronograma apresentado na Tabela 5 abaixo.
Tabela 5. Cronograma do estudo de Sensibilização Dérmica
5.4.4. Equipamentos Utilizados nos Testes de IDP, IDA e SD
Balança semi-analítica.
Utilidades
Apósitos semi-oclusivos compostos por discos de papel de filtro (100% celulose) de 1
cm de diâmetro e fita adesiva semipermeável Micropore®;
Solução fisiológica;
Óleo mineral;
Amostra do produto puro.
5.5. Método de avaliações clínicas na redução dos sinais do envelhecimento facial
Os voluntários foram inicialmente recrutados a partir dos critérios indicados na
SELEÇÃO DOS VOLUNTÁRIOS (Anexo 2 e 3). Somente indivíduos que possuíam os
requisitos necessários segundo os critérios da seleção citados anteriormente, e que
compreenderam, aceitaram e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido foram
incluídos no estudo.
A metodologia aplicada consistiu em avaliar os voluntários segundo os parâmetros de
Hidratação, Maciez, Firmeza e Rugas de Expressão no T-0d inicial, sem o uso do creme e no
T-30d, após 30 dias de uso.
Esta avaliação foi feita por médico dermatologista e seguiu uma escala de 5 notas, ver
Tabela 6 abaixo, para cada item avaliado, definidas previamente para a orientação da análise
21
que foi feita de forma padronizada, no início e ao final do estudo, onde o aumento da nota
representa a melhora do item avaliado.
Tabela 6. Escala para teste de eficácia clinica
Hidratação
NOTAS DESCRITIVO
1 Muito ressecado, esbranquiçado e descamativo 2 Ressecado 3 Levemente Hidratado 4 Hidratado 5 Muito Hidratado, com brilho e luminosidade
Maciez
NOTAS DESCRITIVO
1 Muito leve (comparável com a pele da área pré-tibial) 2 Leve 3 Moderada 4 Intensa 5 Muito Intensa (comparável com a pele da face interna do braço)
Firmeza
NOTAS DESCRITIVO
1 Muito leve 2 Leve 3 Moderada 4 Intensa 5 Muito Intensa
Rugas de Expressão
NOTAS DESCRITIVO
1 Linhas muito intensas (sulcos) 2 Intensa 3 Moderada 4 Leve 5 Ausência de rugas
Após a avaliação clínica inicial T-0d, as amostras foram distribuídas juntamente com
uma cópia do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido contendo as informações
pertinentes ao modo de uso definidas previamente (Anexo 2 e 3).
Após 30 dias de uso do produto investigacional os voluntários retornaram ao Instituto
para nova avaliação clínica feita por medico dermatologista, para verificar a integridade da
22
pele e/ ou mucosa e confirmar a ausência de formação de eritema, edema, descamação,
vesiculação ou outro sinal clínico no local que o produto foi utilizado.
Para fins de comparação, foram avaliados novamente os mesmos parâmetros clínicos,
com relação aos itens: Hidratação, Maciez, Firmeza e Rugas de Expressão.
5.6. Método de avaliação de eficácia subjetiva na redução dos sinais do envelhecimento
facial
Adicionalmente a visita final, os voluntários se auto avaliaram (avaliação subjetiva T30)
com relação aos mesmos itens da avaliação clínica citados acima por meio de uma escala de 0
a 5, conforme Tabela 6.
Uma tolerância de ± 2 dias foi permitida para o retorno dos voluntários na a avaliação
final.
5.7. Método de avaliação de atributos
Os voluntários também responderam um questionário referente a alguns atributos do
produto como segue na Tabela 7 abaixo:
Tabela 7. Avaliação de atributos
QUESITOS PERGUNTAS DIRETAS
Cheiro/Perfume Péssimo ruim Indiferente
bom
excelente \ ideal
Espalhabilidade Muito difícil \ruim Difícil Normal Boa fácil e agradável
Toque na Pele Grudento demais,
pegajoso,
intolerável
Toque
grudento
Toque
indiferente
Toque macio
Textura macia,
diferenciada,
muito agradável
Intenção de
Compra
Com certeza
compraria
Provavel-
mente
compraria
Não sei se
compraria ou
não
Provavelment
e não
compraria
Com certeza não
compraria
23
6. RESULTADOS
6.1. Resultado da Avaliação Dermatológica de Compatibilidade Tópica, Irritabilidade
Dérmica Primária (IDP), acumulada (IDA) e Sensibilização Dérmica (SD)
Como podemos observar na Tabela Resumo 7.1 não houve reações adversas durante o uso do
creme proposto.
Tabela Resumo 7.1: Teste IDP,IDA e SD versus Reação Positiva
TESTE REAÇÃO POSITIVA*
IDP 0
IDA 0
SD 0 *-Numero de sujeitos submetidos ao teste
As Tabelas 8 e 9 abaixo mostram em detalhes os resultados das avaliações
dermatologias de irritabilidade dérmica primaria, acumulada e sensibilização dérmica
respectivamente.
24
TABELA 8: Resultados obtidos nas avaliações de Irritação Dérmica Primária e Acumulada.
Legenda:
Escala de Leitura do ICDRG
A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
F EXCLUIDO
F F
F F
F
F
F
F
F
NÃO SELECIONADO
F
F
F
F
F
F
F
IDP IDA
Dias de Avaliações dos Sítios após Aplicação dos Apósitos
F
Vol.
F
12° 15° 17° 19°5° 10°3° 5° 3° 8°
Sítios Apósitos
A Controle Negativo B Produto Testado
25
Tabela 9: Resultados obtidos nas avaliações de Sensibilização Dérmica.
Legenda:
Sítios Apósitos
A Controle Negativo
B Produto Testado
Escala de Leitura do ICDRG
Dias de Avaliações dos Sítios após Aplicação dos Apósitos
A B A B A B
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
não incluido
F
F
excluido
F excluido
SD
F
Vol. 36° 38° 39°
26
6.2. Resultados da Avaliação Clínica
O Gráfico 1 abaixo mostra as médias das notas obtidas inicialmente (T0) e ao final do
estudo (T30), segundo os critérios de avaliação clínica para os itens: Hidratação, Maciez,
Firmeza e Rugas de Expressão. O percentual de voluntários com algum grau de melhora
observada clinicamente após o uso do produto por 30 dias foi de: 65% para Hidratação, 52%
para Maciez e 4% para Firmeza conforme mostra o Gráfico 2 abaixo:
Todos os 23 voluntários finalizaram o estudo sem apresentar reação constatada ou
referida na pele, sob monitoramento dermatológico. O aumento da média indica melhora para
o item avaliado.
Gráfico 1: Gráfico 2:
Os resultados acima foram tratados estatisticamente utilizando-se o teste T de Student e
conforme mostrado na Tabela 10 abaixo pudemos observar que houve melhora
estatisticamente significativa para os itens: Hidratação e Maciez, após o uso do produto por 30
dias.
Tabela 10: Resultados do teste T de Student: Hidratação, Maciez, Firmeza e Rugas de
Expressão
Item estudado T0 – T30 * Conclusão
Hidratação <0,001 Rejeita a hipótese**
Maciez <0,001 Rejeita a hipótese**
Firmeza 0,328 Não Rejeita a hipótese**
Rugas de
Expressão
0,328 Não Rejeita a hipótese**
2,702,40 2,40
2,30
3,30
3,002,50
2,30
HIDRATAÇÃO MACIEZ FIRMEZA RUGAS DE EXPRESSAO
t-0 t-30MÉDIA DAS AVALIAÇÕES
65%
52%
4%0
HIDRATAÇÃO MACIEZ FIRMEZA RUGAS DE EXPRESSÃO
PERCENTUAL DE VOLUNTÁRIOS COM MELHORA
27
* Nível de Significância: 5%
** Hipótese: não existe diferença entre os tempos experimentais, n = 23.
6.3. Avaliação Subjetiva
Os gráficos 3, 4, 5 e 6 abaixo mostram os resultados das avaliações subjetivas realizadas no
final do estudo (T30), após utilização do produto:
0% 4%
79%
4%
13%
Gráfico 6 > RUGAS DE EXPRESSÃO
LINHAS MUITO INTENSAS INTENSA MODERADA LEVE AUSENCIA DE RUGAS
28
6.4. Avaliação de Atributos Físicos
Os gráficos 7, 8 e 9 mostram os resultados dos atributos físicos do creme compilados dos
questionários recebidos após a avaliação subjetiva com 30 dias de uso.
O gráfico 10 mostra os resultados após compilação da intenção de compra por partes dos
usuários
29
O detalhamento dos resultados informando número de sujeitos que foram desclassificados
desde início ou foram desclassificados durante os teste estão descritos no Anexo F e Tabelas 8
e 9.
7. DISCUSSÃO
7.1. Segurança de uso
O creme contendo Melitina, conforme fórmula expressa no item 3.1, foi avaliado
seguindo o protocolo de Estudo Clínico de Compatibilidade Cutânea Tópica, cujo testes
envolveram: Avaliação da Irritabilidade Dérmica Primária, Irritabilidade Dérmica Acumulada
e Sensibilização Dérmica, nos permitiram considerar que:
Não foi observado potencial de Irritação Dérmica Primária;
Não foi observado potencial de Irritação Dérmica Acumulada;
Não foi observado potencial de Sensibilização Dérmica.
7.2. Avaliação Clinica e Avaliação Subjetiva
Uma análise detalhada dos resultados obtidos na avaliação de Eficácia na Redução dos
sinais do Envelhecimento Facial, demonstrado pelo Estudo Clínico e Subjetivos nas
condições em que a fórmula expressa no item 5.1 foi aplicada nos voluntários é possível
considerar que:
Na avaliação clínica, o uso do produto por 30 dias proporcionou melhora
estatisticamente significativa para os itens Hidratação e Maciez; Para o item Firmeza a
melhora foi marginal e sem significância estatística; Para o item Rugas de Expressão
(ausência ou diminuição) não houve alteração.
De acordo com os resultados da avaliação subjetiva a percepção da maior parte da
população de voluntários avaliados que usaram o produto por 30 dias, proporcionou
resultados positivos para todos os itens avaliados: Hidratação, Maciez, Firmeza e
Rugas de Expressão, conforme demonstrado abaixo:
96% dos voluntários declararam que a pele ficou hidratada ou muito hidratada
56% dos voluntários declararam que a pele apresentou maciez intensa ou muito
30
intensa
21% dos voluntários declararam que a pele ficou com firmeza intensa ou muito
intensa
17% dos voluntários declararam que as rugas de expressão ficaram leves ou
ausentes.
7.3. Avaliação de Atributos Físicos
Na avaliação de atributos, foi possível observar os seguintes resultados positivos:
39% dos voluntários manifestaram que o cheiro/perfume do produto é bom ou
excelente;
82% dos voluntários manifestaram que a espalhabilidade é boa ou fácil;
83% dos voluntários declararam que o toque na pele do produto é macio ou possui
a textura macia;
91% dos voluntários manifestaram que provavelmente ou com certeza comprariam
o produto.
7.4. Discussão geral
O creme proposto não apresentou nenhum indício de alergia ou efeito adverso
conforme ficaram demonstrados nos resultados das avaliações de IDP, IDA e SD.
Entendemos que a concentração de Melitina presente neste creme, que foi da ordem de
0.085% , mostrou-se seguro ao uso.
Nas avaliações clínica e subjetiva o que vimos foram dados positivos para itens como
hidratação da pele e maciez após o uso do produto. A resposta positiva no item hidratação
pode ser atribuída ao tipo de creme que escolhemos para veicular o ativo Melitina, um cold
cream, e esse é reconhecidamente como um creme hidratante de alta performance. No que diz
respeito ao aspecto maciez a resposta positiva poderia ser atribuída a presença do octil
estearato e do óleo de amêndoas presentes na formulação.
Um resultado encorajador foi obtido na avaliação subjetiva onde 17% dos voluntários
declararam que houve uma diminuição das rugas ou até ausência delas após 30 dias de uso.
Não podemos afirmar e tão pouco negar que a presença da Melitina pode ter influenciado
31
nesta resposta, que apesar de ser subjetiva, sem valor estatístico, deve ser levada em
consideração e explorada em trabalhos futuros.
Uma explicação para esta resposta pode ser o mecanismo proposto para a ação da
melitina, que segundo LEE (2004), consiste na capacidade do ativo em simular brandamente
uma picada de abelha e a reação decorrente disso seria a capacidade de aumentar o fluxo
sanguíneo no local bem como a produção de colágeno. Ainda segundo (DUNCAN ,2013), a
melitina causa inibição da produção de metaloproteínas da matriz celular e que é importante
para a redução de danos ao colágeno.
Como sabemos, o colágeno fornece sustentação à pele e é importante para o seu vigor
e sua resistência. Alterações em relação a sua estrutura e quantidade parecem ser fatores
importantes na formação de rugas (GILCHREST; KRUTMANN, 2007).
Outra resposta estimulante foi observada na avaliação de atributo, pois demonstrou
que o produto possui um grande potencial de mercado a ser explorado á medida em que a
intenção de compra foi da ordem de 93%, um índice sem dúvida elevado.
Esse trabalho consiste apenas como um estímulo à procura por novos dados e
resultados. Ainda existem pesquisas que devem ser realizadas para a total elucidação da sua
atividade, testes em outras concentrações de uso entre outras características pertinentes.
8. CONCLUSÃO
O presente trabalho atingiu seu objetivo à medida que demonstrou a inocuidade
alergênica do creme proposto contendo Melitina em todos os indivíduos testados e
demonstrou melhoras significantes em avaliações clínicas de itens como hidratação e maciez
da pele quando comparados ao creme placebo.
Apesar de os resultados do estudo clínico não terem demonstrado eficácia no item
redução de rugas e resultado marginal no item firmeza, o mesmo não ocorreu nas avaliações
subjetivas, os quais tiveram valores relevantes. De certa forma estes valores de avaliação
subjetiva foram corroborados com os resultados das avaliações de atributos os quais se
mostraram elevados, principalmente na intenção de compra do produto.
32
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37
10. ANEXOS
ANEXO A
INFORMAÇÕES GERAIS SOBRE A EXTRAÇÃO DO VENENO DE ABELHAS
O preço de cada grama da apitoxina já alcançou 5 (cinco) vezes mais que o mesmo peso em
ouro no mercado internacional, tornando-a uma fonte de renda adicional ao apicultor, ao invés
de apenas uma ameaça.
Entretanto, o problema estava em como extraí-lo de forma eficiente. O processo utilizado em
laboratório de pesquisa tinha o inconveniente de servir apenas para quando se trabalha com
abelhas mortas e em pequenas quantidades, de forma artesanal, retirando-se o ferrão do inseto
e apertando a extremidade do seu corpo até que saísse toda a apitoxina.
Com a criação de um aparelho, em 1987, desenvolvido por Ciro Gomes Protta, deu então um
primeiro passo para a extração comercial da apitoxina no Brasil, possibilitando a coleta do
veneno de até 10 colmeias simultaneamente.
O mais importante foi que não é necessário sacrificar os insetos. Quando as abelhas pousam
sobre a placa, recebem um choque e reagem tentando ferroar o vidro e depositando assim,
uma carga de veneno. Liberam também uma secreção de ferômonio, que atrai mais abelhas. O
veneno perde seus óleos voláteis e adere à placa, sob a forma de um pó de cor marfim.
Desligado o aparelho esse material é raspado e conservado sob refrigeração para não se
deteriorar.
O aparelho em uso conjunto com várias placas de vidro eletrificadas, terá capacidade de
extrair cerca de 400 gramas de apitoxina por mês, um aumento de capacidade de extração
extraordinária levando-se em conta que cada inseto carrega em seu corpo apenas 10
milionésimos de grama.
O apicultor disposto a produzir apitoxina tem que ser extremamente rigoroso nos cuidados
técnicos para a coleta do material, já que sua procedência, uniformidade e pureza do veneno
serão bastante exigidas.
A apitoxina não pode ser exposta ao ar livre e ao calor por muito tempo, sob o risco de
alteração na sua composição. Por causa disso, cada utilização do tempo tem que ser feita por
um tempo muito curto.
38
ANEXO B
PROTOCOLOS DOS ENSAIOS DE IDP, IDA E SD
A Considerações éticas sobre os testes
Os estudos foram conduzidos de acordo com as normas de Boas Práticas Clínicas (GCP), as
normas internacionais de pesquisa para seres humanos (Declaração de Helsinque) e a
resolução nº. 196 de 10 de Outubro de 1996, do Conselho Nacional de Saúde e suas
complementares.
B Seleção de voluntários
Amostragem populacional:
Foram selecionados 59 voluntários de ambos os sexos de acordo com os critérios de
INCLUSÃO e NÃO-INCLUSÃO listados abaixo para realização do estudo. Os indivíduos
participantes foram identificados pelas quatro primeiras letras do primeiro nome e a primeira
letra do último sobrenome, um número de identificação individual (gerado por sistema
eletrônico) e um número protocolar anotados na Ficha Clínica do Voluntário.
C Critérios de inclusão
Faixa etária: 18 a 60 anos;
Fotótipos: I, II, III e IV (Anexo D);
Pele da região de teste íntegra;
Concordância em obedecer aos procedimentos do ensaio e comparecer à clínica nos
dias e horários determinados para as avaliações médicas e para aplicação e leitura dos
apósitos;
Assinatura de termo de consentimento livre e esclarecido.
D Critérios de não-inclusão
Gestação e lactação;
Uso de drogas antiinflamatórias 30 dias e/ou imunossupressora por até três meses
antes da seleção;
Doenças que causam supressão da imunidade, tais como Diabetes, HIV, etc.;
Antecedentes pessoais de atopia;
39
ANEXO B (continuação)
História de sensibilização ou irritação a produtos tópicos;
Patologias cutâneas ativas (locais e/ ou disseminadas) que possam interferir nos
resultados do estudo;
Uso de novas drogas e / ou cosméticos durante o experimento;
Reatividade cutânea;
Participação anterior em um estudo com o mesmo produto em teste;
Voluntários que apresentam imunodeficiência congênita ou adquirida conhecidas;
Histórico clínico relevante ou atual evidência de abuso de álcool ou outras drogas;
Histórico conhecido ou intolerância suspeita a qualquer ingrediente dos produtos em
estudo (produtos em teste ou comparadores)
E Ficha clínica do voluntário
Foi gerada uma Ficha Clínica para cada voluntário, sendo que todas as páginas foram
identificadas com o número do painel e carimbadas com o número do voluntário (gerado por
sistema eletrônico).
F Termo de consentimento livre e esclarecido
Os indivíduos participantes foram identificados pelas quatro primeiras letras do primeiro
nome e a primeira letra do último sobrenome, um número de identificação individual (gerado
por sistema eletrônico) e um número protocolar anotados no Termo de Consentimento Livre
Esclarecido. Uma cópia do Termo contemplando todas as informações sobre o estudo foi
entregue ao voluntário.
G Duração do teste
Os ensaios de IDP, IDA e SD ao todo duraram seis semanas.
40
ANEXO C
PROTOCOLOS DOS TESTES DE EFICACIA CLINICA E SUBJETIVA
A Considerações éticas sobre os testes
Este estudo foi conduzido de acordo com as normas de Boas Práticas Clínicas (GCP), as
normas internacionais de pesquisa para seres humanos (Declaração de Helsinque) a resolução
nº. 196 de 10 de Outubro de 1996, do Conselho Nacional de Saúde e suas complementares.
B Seleção de voluntários
Amostragem populacional:
Foram necessários 23 (vinte e três) voluntários para participar do estudo, com os seguintes
critérios de inclusão e exclusão listados nos itens abaixo
C Critérios de inclusão
CHECAGEM DOS CRITÉRIOS DE INCLUSÃO
Fototipo de I à IV na escala de Fitzpatrick;
Voluntários do sexo feminino na faixa etária de 35 a 65 anos;
Sinais de envelhecimento cutâneo classificados como grau II, III ou IV na escala de
Larnier;
Concordância em obedecer aos procedimentos do ensaio e comparecer a clínica nos
dias e horários determinados para a aplicação e leituras;
Assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido.
D Critérios de não-inclusão
CHECAGEM DOS CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO
Gestação/lactação ou intenção de engravidar no período do estudo;
Uso de drogas anti-inflamatórias, imunossupressoras, anti-histamínicos e/ ou novas
drogas por até 15 dias antes da seleção;
Antecedentes atópicos ou alérgicos a produtos cosméticos;
Patologias e/ou lesões cutâneas ativas (local e/ou disseminadas) na área de avaliação;
41
ANEXO C (Continuação)
Marcas cutâneas na área experimental que interfiram na avaliação de possíveis reações
cutâneas (distúrbios da pigmentação, má-formações vasculares, cicatrizes, aumento de
pilosidade, efélides e nevus em grande quantidade, queimaduras solares);
Patologias que causam supressão da imunidade, tais como diabetes, HIV, etc.;
Patologias endócrinas tais como tireoidopatias, distúrbios ovarianos ou de glândula
adrenal;
Voluntários portadores de imunodeficiência congênita ou adquirida conhecidas;
Histórico clínico relevante ou atual evidencia de abuso de álcool ou outras drogas;
Histórico conhecido ou intolerância suspeita a produtos da mesma categoria;
Exposição solar intensa até 15 dias antes da avaliação;
Tratamento estético ou dermatológico na área de avaliação até 04 semanas antes da
seleção;
Profissionais diretamente envolvidos na realização do presente estudo;
Outras condições consideradas pelo médico avaliador como razoáveis para
desqualificação da participação do estudo. Se Sim, deverá ser descrito em observação
na ficha clínica.
E Ficha clínica do voluntário
Foi gerada uma Ficha Clínica para cada voluntário, onde todas as páginas foram identificadas
com o número de ensaio e carimbadas com o número do voluntário (gerado por sistema
eletrônico).
F Termo de consentimento livre e esclarecido
Os indivíduos participantes tiveram as quatro primeiras letras do primeiro nome e a primeira
letra do último sobrenome, um número de identificação individual (gerado por sistema
eletrônico) anotados no Termo de Consentimento Livre Esclarecido.
Uma cópia do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido contemplando todas as
informações sobre o estudo foi entregue ao voluntário.
G Duração dos testes
Duração de 30 dias, com tolerância de ± 2dias.
H Orientações durante o uso:
42
ANEXO C (Continuação)
Modo de uso:
- Aplicar uma camada fina do creme sobre a pele friccionando por alguns minutos.
Precauções:
- Manter o produto bem fechado;
- Manter os produtos fora do alcance de crianças;
- Caso ocorra contato com os olhos, enxágue e procure a equipe médica da Medcin.
Durante o período de teste é importante:
- Comunicar ao médico qualquer uso de medicamento ou qualquer outro produto cosmético;
- Evitar a mudança de produtos para higiene. Ex.: Hidratantes corporais, sabonetes,
desodorantes, etc.;
- Comparecer na data combinada;
- Evitar exposição ao sol por motivos de bronzeamento;
- O produto só deverá ser utilizado durante o período de estudo, somente nas semanas
especificadas no modo de uso.
43
ANEXO D
Escala de Fototipos de Fitzpatrick
44
ANEXO E
SOBRE AS MATÉRIAS-PRIMAS UTILIZADAS
Foi utilizado uma pré-mistura de cetearyl alcohol e polysorbate 60 desses componentes
cuja marca comercial é conhecida como POLAWAX®, produzida pela empresa Farmacam.
Dosado em cerca de 30% do material graxo contido na formulação, esse material difere de
maneira significativa dos tipos mais antigos de ceras auto-emulsionantes, visto que suas
propriedades emulsionantes de óleo em água não derivam da presença de tensoativos
aniônicos ou de álcool graxo sulfatado, de álcalis, gomas e similares. É de natureza não-
iônica, não se deteriora com aquecimento de 150 – 152 ºC,é uma cera auto-emulsionante de
alta densidade, produzindo emulsões espessas e sólidas sem a adição de outras ceras
enrijecedoras em concentrações tão baixas quanto 5%, embora uma concentração de 10%
possa proporcionar estabilidade superior.
Foi utilizado uma pré-mistura de cetyl acetate, acetylated lanolin cuja marca comercial é
conhecida como Crodalan®, produzida pela empresa Croda. É uma mistura de emolientes de
álcoois acetilados e álcool de lanolina acetilada, um derivado de lanolina não tensoativo para
aplicações em cuidado pessoal.
Possui cor clara e baixa viscosidade, é um emoliente dotado de excelentes propriedades
de dispersão sobre a pele. É de natureza completamente não pegajosa ou cerosa. Sendo um
derivado do álcool de lanolina, por acetilação. Sua elevada capacidade de dispersão sobre a
pele proporciona uma agradável sensação de maciez. Compõe cerca de 9% da quantidade de
ácidos graxos da formulação.
O octyl stearate é um emoliente; ela confere à pele uma aparência macia e suave,
evitando a perda de água. Além disso, é também um agente espessante. Compõe outros 9% da
quantidade de ácidos graxos da formulação.
O óleo de amêndoas é extraído a partir de amêndoas secas por meio de um processo
chamado prensagem a frio. Possui em sua composição derivados de vitaminas E, A e D.
Também é rico em ácidos oléico e linoléico. É utilizado principalmente como um produto de
cuidado de pele. Alguns benefícios incluem alto poder hidratante e de lubrificação mantendo
a umidade da pele por mecanismo de oclusão. Além disso, possui capacidade de ser absorvido
pela pele podendo restaurar o pH normal da pele e permitir que a pele tenha brilho,
preservando assim a sua umidade.
45
ANEXO E (Continuação)
O BHT ou Butilhidroxitolueno é comercializado sob a forma de cristais brancos finos e
é solúvel em diversos óleos e gorduras. É um dos antioxidantes mais utilizados possuindo um
custo benefício excelente.
O Propileno Glicol USP/EP é completamente miscível em água e muitos materiais
orgânicos como álcoois, ésteres, éteres, aldeídos, assim como muitos óleos e gorduras
vegetais e animais. Esta propriedade é benéfica na solubilização e estabilização de produtos
para cosméticos e alimentos. A sua baixa toxicidade permite que seja utilizado como aditivo
direto em alimentos e produtos farmacêuticos. Tem capacidade de atrair e reter água em um
produto. Em emulsões de cremes para as mãos óleo-em-água (O/A) típicas, o propileno glicol
ajuda a estabilizar a emulsão e também atua hidratando a pele aliviando o ressecamento.
Produtos contra envelhecimento contendo colágeno são desenhados para rejuvenescer a
camada dérmica da pele. A habilidade do propileno glicol em penetrar através da pele pode
aumentar a efetividade de produtos contendo colágeno.
O pólen apícola é um aglomerado de pólen de flores de várias fontes vegetais, os quais
são coletados pelas abelhas e misturados com néctar e secreções das glândulas
hipofaringeanas, como as enzimas α e β-glicosidase. (SERRA-BONVEHÍ et.al, 2001). O
pólen contém nutrientes como carboidratos, proteínas, aminoácidos, lipídeos, vitaminas e
minerais, além de carotenóides, flavonoides e fitosterois (SERRA-BONVEHÍ et.al, 2001)
sendo o motivo da sua utilização como alimento alternativo e/ou suplemento alimentar. (D. C.
et.al, 2006).
O pólen, a própolis e o mel têm recentemente recebido atenção especial entre os
pesquisadores de todo o mundo, devido principalmente as suas propriedades biológicas, como
atividade antibacteriana (PÉREZ-ARQUILLUE et.al, 2006), antifúngica (PÉREZ-
ARQUILLUE et. al, 2001), antiinflamatória (BORELLI et. al., 2002), anticariogênica
(ALMAS et. al, 2002) e imunomodulatória (ORSOLIC, 2003). Estudos têm demonstrado que
a ação biológica do pólen é devida à presença de compostos fenolicos, tais como flavonoides,
ácidos fenolicos e diterpenos fenolicos, que dentre outras propriedades biológicas possuem
ação antioxidante (BOGDANOV, 2004).
46
ANEXO F
INFORMAÇÕES DETALHADAS SOBRE CRITÉRIOS EXCLUSÃO DE DADOS
Irritabilidade Dérmica Primaria
Nenhum dos 58 voluntários iniciantes apresentou reação positiva ao produto ou aos
controles. A voluntária 49 foi excluída, pois fez somente a visita 01 referente a essa fase, não
retornando para as demais visitas do estudo. Concluíram esse período de estudo 57
voluntários, entretanto 06 resultados não foram considerados como válidos devido a 05
ausências (voluntários 05, 24, 26, 27 e 30). A Tabela 6 apresenta os resultados individuais da
Irritação Dérmica Primária.
Irritabilidade Dérmica Acumulada
Nenhum dos 58 voluntários iniciantes apresentou reação positiva ao produto ou aos
controles. A voluntária 49 foi excluída, pois fez somente a visita 01 referente a essa fase, não
retornando para as demais visitas do estudo. 57 voluntários finalizaram e as ausências não
comprometeram os resultados obtidos, conforme representado na Tabela 8.
Sensibilização Dérmica
Finalizaram essa fase 56 voluntários dos 57 que iniciaram. . A voluntária 56 não
compareceu às visitas 10 e 11 pertencentes à Sensibilização Dérmica, assim não houve
aplicação do produto nem tampouco foram coletadas leituras. Não houve prejuízo aos dados
referentes às fases anteriores.
