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isolamento de fungos do solo
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MATERIAIS E MÉTODOS
________________________________________________Materiais e Métodos 30
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
3.1.1 Fases estacionárias para cromatografia
- Cromatografia em coluna de vidro:
Sílica gel 60 (63-200 µm) – MERCK
Sílica gel 60 H (70-230 µm) – MERCK
Sílica gel tipo flash (35-70 µm) – ACROS
Sephadex LH 20 - SIGMA
- Cromatografia em camada delgada preparativa:
Sílica gel 60 PF254 (5-25 µm) – MERCK
(placas de vidro: 20 x 20 cm, 1 mm de espessura) Placa comercial em sílica gel (5-17 µm)– ALDRICH
(placas de vidro: 5 x 20 cm, 1 mm de espessura)
- Cromatografia em camada delgada analítica:
Sílica gel 60 HF 254 – MERCK
(placas de vidro: 3 x 10 e 5 x 10 cm, 0,25 mm de espessura)
Sílica silanizada 60 HF 254 – MERCK
(placas de vidro: 3 x 10 e 5 x 10 cm, 0,25 mm de espessura)
3.1.2 Solventes
- para cromatografia:
Solventes P. A. – SINTH , VETEC e MALLINCKODT
Solventes grau cromatográfico - MALLINCKODT e MERCK
- para RMN:
Solventes deuterados - ACROS e ALDRICH
(acetona, água, clorofórmio, DMSO, metanol e piridina)
________________________________________________Materiais e Métodos 31
3.1.3 Equipamentos
§ Capela de fluxo laminar
- VECO VL FS – 09 M
§ Autoclaves verticais
- PHOENIX AV 75
§ Estufa de incubação
- FANEM Ltda – 347 CD
§ Mesa agitadora
- INNOVA T.M.4300 – New Brunswick Scientific
§ Estufa com ar circulante
- Soc. FABBE. Ltda
§ Microscópio
- OLYMPUS CH-2
§ Espectrômetro de RMN
- BRUKER DPX-300 MHz
- BRUKER DRX-400 MHz
- BRUKER DRX-500 MHz
________________________________________________Materiais e Métodos 32
§ Espectrômetro de Massas
- CG-EM: Shimadzu QP 5000 (coluna D 3-5; 25 m X 0,25 mm X 0,25 µm)
- ESI-EM: Micromass Quattro LC (ionização por electronspray)
§ Evaporador
- BÜCHI - modelo rotavapor R
§ Cromatógrafo a gás-CG
- Hewlett Packard HP 5890- série II (coluna HP-1; metilsilicone 100%; 25 m X 0,25 mm X 0,25 µm)
§ Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência-CLAE
- Shimadzu SHIM-PAK- Diode array detector (coluna CLC - ODS (M), 250 mm X 4,6 mm)
§ CLAE – Reciclante
- Shimadzu LC- GAV (U.V.-SPD-10AV) (coluna Shodex Asahipak GS-310 26 500 mm X 1,5 mm)
§ Espectrofotômetro no UV-VIS
- Shimadzu PC 1520 - Diode Array Spectrophotometer
§ Espectrofotômetro no Infravermelho
- Nicolet - Protege 460
§ Estufa de secagem e esterilização
- FANEM Ltda
________________________________________________Materiais e Métodos 33
3.1.4 Microrganismos
Os fungos foram isolados de amostras de solo brasileiro (P. viridicatum
da região do Rio Miranda-MS e os demais da região de São Carlos-SP) pela
Profa. Dra. Suraia Said, identificados na Fundação Tropical de Pesquisa
“André Tosello” e foram mantidos através de repiques sucessivos, a 4°C, em
meio PDA ("Potato Dextrose Agar") no Laboratório de Enzimologia Industrial
da FCFRP-USP.
3.2 Métodos
3.2.1 Condições de cultivo
Inicialmente, as espécies de Penicillium foram cultivadas em diferentes
meios de cultura semi-sólidos para seleção dos meios (tabela 4, p.32) nos
quais os fungos apresentaram maior produção de conídios.
Os fungos foram repicados, em duplicata, em tubos de ensaio
contendo cerca de 5,0 mL dos meios de cultura solidificados com inclinação
semelhante (garantindo mesma superfície de contato para multiplicação dos
conídios) e incubados a 30°C por 7, 10 e 16 dias. Em seguida, os conídios
produzidos foram coletados adicionando-se cerca de 5 mL de água estéril à
superfície da cultura e raspando-se levemente, formando uma suspensão de
conídios, que foram contados em Câmara de Neübauer (figura 7, p. 33).
Após a seleção do fungo, P. verrucosum foi cultivado em duas etapas.
Inicialmente em uma pré-cultura e em seguida na cultura fermentativa onde
as condições de cultivo foram variadas.
________________________________________________Materiais e Métodos 34
Tabela 4. Constituintes dos meios de cultura semi-sólidos
Meio YES, descrito por Larsen et al. (2000)
Extrato de levedura 20 g/L Merck
Sacarose 150 g/L Vetec
MgSO4. 7H2O 0,5 g/L Reagen
Ágar 20 g/L Oxoid
Meio CYA, descrito por Malmstrom et al. (2000)
Extrato de levedura 5 g/L Merck
Caldo de Czapek * 35 g/L -
Ágar 15 g/L Oxoid
Meio MEA, descrito por Kozlovsky et al. (2000)
Extrato de malte 20 g/L Merck
Peptona 1 g/L Oxoid
Glicose 20 g/L Synth
Ágar 20 g/L Oxoid
Meio AVEIA, descrito por Malmstrom et al. (2000)
Farinha de aveia 30 g/L Nestlé
Ágar 15 g/L Oxoid
Meio PDA, descrito por Nam et al. (2000)
PDA (Potato Dextrose Agar) 39 g/L Oxoid
* Caldo de Czapeck, descrito por Alviano et al. (1992) (tabela 2)
Cerca de 5 x 106 a 1 x 107 conídios por mL de P. verrucosum foram
inoculados em 60 mL de meio pré-fermentativo (tabela 5, p. 33) e incubados
inicialmente por 24 e 48 horas sob agitação constante (120 rpm) a 30°C. Em
seguida a massa micelial foi assepticamente coletada por filtração a vácuo.
Com objetivo de selecionar a melhor condição para produção de metabólitos
secundários ativos, a massa micelial obtida do meio pré-fermentativo foi
inoculada em 120 mL de 4 diferentes meios fermentativos (tabela 5, p. 33) e
________________________________________________Materiais e Métodos 35
incubada por 48, 72 e 144 horas sob agitação constante (120 rpm) a 30°C.
Novamente o fluido da cultura foi separado da massa micelial por filtração a
vácuo. Procedimento ilustrado na figura 8 (p. 36).
Figura 7. Fluxograma de seleção do meio de cultura semi-sólido que favorece a conidiogênese para cada espécie de Penicillium estudada
Tabela 5. Constituintes dos meios líquidos de cultura
Meio Pré-fermentativo, descrito por Jackson et al. (1993)
Pó de milho (fubá) 2,5 g/L Yoki
Glicose 10 g/L Synth
Farinha de aveia 10 g/L Nestlé
Pasta de tomate 40 g/L Quero
P. viridicatum
P. verrucosum
P. ochrochlorum
P.waksmanii
P.simplicissimum
Repique em duplicata para cada tempo de incubação
Meio
MEA
Meio
CYA
Meio
YES
Meio
PDA
Meio
AVEIA
Incubação a 30°C
7 dias7 dias 16 dias16 dias10 dias10 dias
5mL H2O estérilRaspagem, agitação, filtração
Suspensão conidial
Diluição
Contagem em Câmara de Neübauer
________________________________________________Materiais e Métodos 36
CaCl2. 2H2O 10 g/L Merck
Sol. traço de elementos de Jackson 10 mL/L -
- Solução traços de elementos de Jackson
FeSO4. 7H2O 1 g/L Reagen
MnCl2. 4H2O 1 g/L Carlo Erba Reagente
CuCl2. 2H2O 0,025 g/L Divisã0 QM
CaCl2. 2H2O 0,1 g/L Merck
H3BO3 0,56 g/L Reagen
(NH4)6.MoO2.4H2O 0,019 g/L Mallinckrodt
ZnSO4. 7H2O 0,2 g/L Mallinckrodt
Meio Fermentativo de Jackson, descrito por Jackson et al. (1993)
Glicerol 15 g/L Sigma
Melaço de cana de açúcar 15 g/L Usina da Pedra*
Peptona 6 g/L Oxoid
Extrato de levedura 1,5 g/L Merck
NaCl 30 g/L Synth
KH2PO4 0,6 g/L Synth
MgSO4. 7H2O 5 g/L Reagen
CuSO4. 5H2O 0,001 g/L Reagen
FeSO4. 7H2O 0,003 g/L Reagen
Meio Fermentativo de Vogel, descrito por Vogel (1956)
Glicose 20 g/L Synth
Solução salina de Vogel 20 g/L -
- Solução salina de Vogel concentrada 50 vezes
Na3 C6H5O7. 2H2O 125 g/L Synth
KH2PO4 250 g/L Synth
NH4NO3 100 g/L Nuclear
CaCl2. 2H2O 5 g/L Merck
MgSO4. 7H2O 10 g/L Reagen
Sol. traço de elementos de Vogel 5 mL/L -
________________________________________________Materiais e Métodos 37
Solução de biotina 1 ml/L -
- Solução traços de elementos de Vogel
H3C6H5O7. H2O 5 g Reagen
ZnSO4. 7H2O 5 g Mallinckrodt
Fe (NH4)2(SO4)2. 6H2O 1 g Synth
CuSO4. 5H2O 0,25 g Reagen
MnSO4. H2O 0,05 g Reagen
H3BO3 0,05 g Reagen
Na2MoO4. 2H2O 0,05 g Mallinckrodt
H2O destilada 95 mL -
- Solução de biotina
Biotina 0,005 g Sigma
Álcool 50% 100 mL Synth
Meio Fermentativo de Czapeck, descrito por Alviano et al. (1992)
Sacarose 30 g/L Vetec
NaNO3 2 g/L Vetec
K2HPO4 1 g/L Henrifarma
MgSO4. 7H2O 0,5 g/L Reagen
KCl 0,5 g/L Reagen
FeSO4. 7H2O 0,01 g/L Reagen
pH=5
Meio Fermentativo de Takeuchi, descrito por Takeuchi et al. (1989)
Amido 25 g/L Synth
Sacarose 20 g/L Vetec
Casamino ácido 10 g/L Fisher Scientific
KH2PO4 5 g/L Synth
MgSO4. 7H2O 2,5 g/L Reagen
* Ribeirão Preto- SP.
________________________________________________Materiais e Métodos 38
Figura 8. Fluxograma das condições de cultivo de Penicillium verrucosum
3.2.2 Obtenção dos extratos brutos
A massa micelial foi inicialmente extraída com MeOH por 24 horas
resultando num primeiro extrato metanólico. Seqüencialmente a massa foi
seca em estufa com ar circulante a 40°C, triturada, pesada e extraída com
CH2Cl2 e MeOH por processo de maceração durante 5 dias. Foram feitas 3
repetições consecutivas para cada solvente. O fluido da cultura foi submetido
a partição líquido-líquido com AcOEt por 3 vezes consecutivas, resultando
em um extrato orgânico e um aquoso (figura 9, p. 37).
Suspensão de conídios
5 X 106 à 1 X 107 conídios/mL
60 mL meio pré-fermentativo (MPF)
120 mL meio Takeuchi
Incubação a 30°C; 120 rpm
24 horas 48 horas
48 horas 72 horas 144 horas
120 mL meio Vogel
120 mL meio Czapeck
120 mL meio Jackson
A
B
C
A- Filtração e transferência da massa micelial para cada meio de cultura.
B- Incubação do meio pelos 3 tempos distintos a 30°C; 120rpm
C- Filtração a vácuo para cada condição de cultivo
B B B
A
C C
CCC
B
CC
B
CC
B
CC
Total = 23 condições de cultivo
*Perda: MPF 48 h., Vogel 144 h.
Massa micelial Fluido da cultura
B
CCC
________________________________________________Materiais e Métodos 39
Após o processo de extração tanto da massa micelial quanto do fluido
da cultura, os solventes foram evaporados até a secura em rotaevaporador
ou liofilizados.
Figura 9. Fluxograma de obtenção dos extratos brutos intra e extra celular de P. verrucosum
As condições de cultivo e rendimentos obtidos para os 115 extratos
brutos produzidos em pequena escala encontram-se na tabela 6 (p. 38).
Todos os extratos brutos obtidos em pequena escala foram avaliados
quanto a sua atividade tripanocida, atividade inibitória da enzima GAPDH de
T. cruzi e enzima APRT de L. tarentolae.
Massa micelial
Suspenção em MeOH24 horasFiltração
Massa micelial
Secagem a 40°C
Ressuspenção em MeOH
Ultra-som por 30 minutos
Extração por 5 dias (3 vezes consecutivas)
Filtração
Extrato Me MeOH - 2
Massa micelial
Ressuspenção em CH2Cl2
Extração por 5 dias (3 vezes consecutivas)
Extrato MaMeOH- 1
Extrato MaMeOH- 1
Extrato Dc
CH2Cl2
Fluido da cultura
Partição líquido-líquido com AcOEt
Extrato AqAquoso
Extrato Ac AcOEt
Cultura de Penicillium verrucosum
Total = 115 extratos brutos*Perda: MPF 48 h., Vogel 144 h.
________________________________________________Materiais e Métodos 40
Tabela 6. Quantidade dos 115 extratos brutos obtidos das 23 condições de cultivo de P. verrucosum em pequena escala
N° Condição
de cultivo Peso (mg)
N° Condição de cultivo
Peso (mg)
N° Condição de cultivo
Peso (mg)
Ac1 F1 242 C3 484 32,0 Dc41 M 24 J 72 22,1 Ma81 M 48 V 144 *
Ac2 F 24 C 72 8,4 Dc42 M 24 J 144 5,5 Aq82 F 48 V 48 672,3
Ac3 F 24 C 144 43,2 Me43 M 24 J 48 56,6 Aq83 F 48 V 72 885,2
Ma4 M 24 C 48 56,6 Me44 M 24 J 72 105,1 Aq84 F 48 V 144 *
Ma5 M 24 C 72 343,3 Me45 M 24 J 144 135,3 Me85 M 48 V 48 151,8
Ma6 M 24 C 144 156,7 Ac46 F 24 T 48 5,6 Me86 M 48 V 72 94,4
Aq7 F 24 C 48 1485,9 Ac47 F 24 T 72 8,1 Me87 M 48 V 144 *
Aq8 F 24 C 72 1153,0 Ac48 F 24 T 144 51,9 Dc88 M 48 V 48 1,2
Aq9 F 24 C 144 273,8 Ma49 M 24 T 48 229,3 Dc89 M 48 V 72 6,4
Dc10 M 24 C 48 8,9 Ma50 M 24 T 72 311,1 Dc90 M 48 V 144 *
Dc11 M 24 C 72 26,0 Ma51 M 24 T 144 234,7 Ac91 F 48 J 48 16,3
Dc12 M 24 C 144 5,5 Aq52 F 24 T 48 2364,0 Ac92 F 48 J 72 12,1
Me13 M 24 C 48 83,7 Aq53 F 24 T 72 1251,8 Ac93 F 48 J 144 11,1
Me14 M 24 C 72 111,0 Aq54 F 24 T 144 747,4 Ma94 M 48 J 48 723,2
Me15 M 24 C 144 27,8 Dc55 M 24 T 48 37,9 Ma95 M 48 J 72 459,4
Ac16 F 24 V 48 37,8 Dc56 M 24 T 72 23,0 Ma96 M 48 J 144 482,3
Ac17 F 24 V 72 44,5 Dc57 M 24 T 144 5,4 Aq97 F 48 J 48 1910,6
Ac18 F 24 V 144 28,0 Me58 M 24 T 48 172,9 Aq98 F 48 J 72 2630,5
Ma19 M 24 V 48 153,6 Me59 M 24 T 72 149,8 Aq99 F 48 J 144 2756,8
Ma20 M 24 V 72 175,1 Me60 M 24 T 144 94,4 Me100 M 48 J 48 222,7
Ma21 M 24 V 144 99,7 Ac61 F 48 C 48 4,3 Me101 M 48 J 72 123,0
Aq22 F 24 V 48 528,1 Ac62 F 48 C 72 3,7 Me102 M 48 J 144 206,5
Aq23 F 24 V 72 318,4 Ac63 F 48 C 144 4,8 Dc103 M 48 J 48 9,0
Aq24 F 24 V 144 412,6 Ma64 M 48 C 48 205,0 Dc104 M 48 J 72 7,4
Dc25 M 24 V 48 6,8 Ma65 M 48 C 72 237,5 Dc105 M 48 J 144 4,8
Dc26 M 24 V 72 3,2 Ma66 M 48 C 144 231,2 Ac106 F 48 T 48 6,4
Dc27 M 24 V 144 1,9 Aq67 F 48 C 48 1555,0 Ac107 F 48 T 72 14,5
Me28 M 24 V 48 40,9 Aq68 F 48 C 72 1186,3 Ac108 F 48 T 144 5,3
Me29 M 24 V 72 54,5 Aq69 F 48 C 144 309,4 Ma109 M 48 T 48 469,8
Me30 M 24 V 144 10,2 Me70 M 48 C 48 194,4 Ma110 M 48 T 72 357,5
Ac31 F 24 J 48 23,7 Me71 M 48 C 72 203,2 Ma111 M 48 T 144 415,8
Ac32 F 24 J 72 15,8 Me72 M 48 C 144 156,9 Aq112 F 48 T 48 1443,4
Ac33 F 24 J 144 59,9 Dc73 M 48 C 48 40,5 Aq113 F 48 T 72 1189,0
Ma34 M 24 J 48 284,1 Dc74 M 48 C 72 52,7 Aq114 F 48 T 144 889,8
Ma35 M 24 J 72 477,8 Dc75 M 48 C 144 11,6 Me115 M 48 T 48 214,7
Ma36 M 24 J 144 349,9 Ac76 F 48 V 48 3,6 Me116 M 48 T 72 210,2 Aq37 F 24 J 48 1349,9 Ac77 F 48 V 72 5,2 Me117 M 48 T 144 361,8
Aq38 F 24 J 72 1647,4 Ac78 F 48 V 144 * Dc118 M 48 T 48 23,8
Aq39 F 24 J 144 3715,5 Ma79 M 48 V 48 123,8 Dc119 M 48 T 72 93,4
Dc40 M 24 J 48 31,1 Ma80 M 48 V 72 330,9 Dc120 M 48 T 144 52,0 1 Origem: M= massa micelial e F= fluido da cultura; 2 Tempo de incubação na pré-cultura: 24 e 48 horas; 3 Meio de cultura fermentativo: C= Czapeck, J= Jackson, V= Vogel e T= Takeuchi; 4 Tempo de incubação no meio fermentativo: 24, 48 e 72 horas (meios de cultura e procedimentos previamente descritos (p..32-39). * perda da massa micelial durante o processo de filtração a vácuo.
________________________________________________Materiais e Métodos 41
3.2.3 Perfis cromatográficos via CLAE
Cerca de 30 extratos brutos, de origem intra e extracelular, tiveram seu
perfil cromatográfico determinado via CLAE. As condições de trabalho
incluem coluna CLC - ODS (M), 25 cm X 4,6 mm, partículas de 5 µm,
detecção simultânea a 220, 254 e 270 nm a temperatura ambiente de 22 a
25°C. As amostras foram filtradas em membrana millipore de 0,45 µm e 20 µl
de uma solução a 1 mg/mL foram analisadas em 60 min. de eluição, fase
H2O - MeOH 30% , fluxo de 0,5 mL/min e sistema de integração
computadorizado com software CLASS-VP versão 5,02.
A escala do eixo das ordenadas (mAU) e do eixo das abcissas (min)
foram expandidas para visualizar a presença dos picos de baixa intensidade
de absorção e ampliar a visualização de cada pico em seu tempo de
retenção.
3.2.4 Aumento da produção dos extratos Ac47 e Me59
Os extratos Ac47 e Me59 foram selecionados para fracionamento
cromatográfico. Inicialmente foram produzidos em escala intermediária.
Porém, após os fracionamentos preliminares do extrato Ac47 verificou-se que
a quantidade não era suficiente para isolamento das substâncias, portanto o
fungo foi novamente cultivado em escala ampliada (tabela 7, p. 40).
________________________________________________Materiais e Métodos 42
Tabela 7. Produção em diferentes escalas do extrato bruto Ac47 e Me59
Escala de produção
Quantidade de cultura fermentada (L)
Quantidade de extrato Ac (mg)
Quantidade de extrato Me (mg)
Pequena 0,12 8,1 149,8 Intermediária 2,80 448,3 2.170,0
Ampliada 9,60 1.751,0 4.358,1
3.2.5 Fracionamento cromatográfico de Ac47 e Me59
3.2.5.1 Extrato Ac47 produzido em escala intermediária (i)
O extrato Ac47i foi fracionado através de diversos processos
cromatográficos: coluna líquida a vácuo (CLV) usando como fase
estacionária (FE) sílica gel 60 H e fase móvel (FM) hexano, hexano:AcOEt
nas proporções 5%,10%,20%, 30%, 50% e 80% além de AcOEt:MeOH 50%
e MeOH, originando 10 frações. Destas frações, Ac47.6i foi fracionada por
cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) usando como FM
hexano:AcOEt 1:1, originando 5 frações. A fração Ac47.9i foi fracionada em
coluna flash isocrática com FM CH2Cl2:MeOH 9:1, originando 17 frações,
das quais, Ac47.9.8i foi fracionada por CCDP comercial usando como FM
CH2Cl2:MeOH 9:1, originando 4 novas frações (figura 10, p. 41).
Os espectros de RMN1H das frações Ac47.9.9i e Ac47.9.10i
apresentaram-se muito semelhantes portanto as duas frações foram
reunidas e novamente separadas por lavagens consecutivas com MeOH e
CHCl3, originando Ac47.b1i e Ac47.b2i respectivamente. A fração Acb1i foi
fracionada por CLAE reciclante nas condições especificadas na figura 11 (p.
41).
________________________________________________Materiais e Métodos 43
Figura 10. Fluxograma de fracionamento do extrato Ac47i de P. verrucosum
Figura 11. Fluxograma de fracionamento de Ac47.9.9i e Ac47.9.10i
Ac47.9.9i
6,8 mg
Ac47.9.10i
5,7 mg
Lavagem com MeOH
Ac47.b1i
8,9 mg
MeOH
Resíduo
3,6 mg
Lavagem com CHCl3
Ac47.b2i
1 mg
Resíduo
2,6 mg
CLAE reciclante
Coluna polimérica 500 X 21,5mm
Fluxo = 5mL/min. (10 ciclos)
FM= MeOH:CH2Cl2 50%
λ = 254 nm, 365 nm
20 Fr.
Frações analisadas via RMN1H
AC47i
448,3 mg
CLV (FE = sílica gel 60 H)
13 X 5 cm (h X ø)FM = Hexano, Hex:AcOEt 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 80%, AcOEt, AcOEt:MeOH 50%, MeOH10 Fr.
Ac47.6i
16,2 mg
CCDP (20 X 20cm)
FM= Hex : AcOEt 50%
5 Fr.
Ac47.6.1i
1,7 mg
Coluna em sílica flash40 X 2 cmFM = CH2Cl 2:MeOH 9:117 Fr.
CCDP 5 X 20cm
FM = CH2Cl 2:MeOH 9:1
4 Fr.
Ac47.9i
200 mg
Ac47.6.2i
1,1 mg
Ac47.6.3i
1,2 mg
Ac47.6.5i
3,1 mg
Ac47.6.4i
2,2 mg
Ac47.9.8i
2,9 mg
Ac47.9.9i
6,8 mg
Ac47.9.10i
5,7 mg
Ac47.9.8.1i
0,7 mg
Ac47.9.8.2i
1,6 mg
Ac47.9.8.3i
0,4 mg
Ac47.9.8.4i
0,8 mg
________________________________________________Materiais e Métodos 44
3.2.5.2 Extrato Ac47 produzido em escala ampliada
O extrato Ac47, produzido em escala ampliada, também foi submetido
a processos cromatográficos, inicialmente por CLV usando como FE sílica
gel 60 H e FM Hexano, Hexano:AcOEt nas proporções 5%,10%, 20%, 30%,
50% e 80% além de AcOEt, AcOEt:MeOH 50% e MeOH. A fração Ac47.9 foi
fracionada novamente por CLV usando como FE sílica gel 60 H e FM
CH2Cl2, CH2Cl2:MeOH nas proporções 5%,10%, 20%, 30%, 50% e 80% e
MeOH, originando 8 frações (figura 12, p. 42). As frações Ac47.9.2, Ac47.9.3
e Ac47.9.4 foram submetidas a novos processos cromatográficos. Para a
fração Ac479.2 utilizou-se coluna flash isocrática (CHCl3:MeOH 9:1),
procedimento ilustrado na figura 13 (p. 43).
Ac471,75 g
CLV (FE = sílica gel 60 H)
9 X 9 cm
FM = Hexano, Hex:AcOEt 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 80%, AcOEt, AcOEt:MeOH 50%, MeOH
10 Fr.
Ac47.9683,2 mg
CLV (FE = sílica gel 60 H)
18 X 4 cm
FM = CH2Cl2, CH2Cl2:MeOH 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, MeOH
8 Fr.
Ac47.9.1
4 mg
Ac47.9.2
98,3 mg
Ac47.9.3
269,4 mg
Ac47.9.4
131 mg
Ac47.9.5
62,2 mg
Ac47.9.6
25,7 mg
Ac47.9.7
10,7 mg
Ac47.9.8
13,7 mg
________________________________________________Materiais e Métodos 45
Figura 12. Fluxograma de fracionamento do extrato Ac47
Figura 13. Fluxograma de fracionamento de Ac47.9.2
Para a fração Ac47.9.3 utilizou-se coluna em sílica gel com FM
CHCl3:MeOH 9:1, originando 14 frações, das quais Ac47.9.3.8 foi separada
em CLAE reciclante nas condições especificadas na figura 14 (p. 43).
Coluna em sílica gel
15 X 2 cm
FM = CHCl3:MeOH 9:1
14 Fr.
Ac47.9.3.8
35,7 mg
CLAE reciclante
Coluna polimérica 500 X 21,5mm
Fluxo =3mL/min. (12 ciclos)
FM = MeOH:CH2Cl2 50%
λ = 225 nm, 276 nm
9 Fr.
Ac47.9.3.8.1
2 mg
Ac47.9.3.8.2
0,8 mg
Ac47.9.3.8.3
0,8 mg
Ac47.9.3.8.4
1,4 mg
Ac47.9.3.8.5
1,1 mg
Ac47.9.3.8.6
0,8 mg
Ac47.9.3.8.7
0,9 mg
Ac47.9.3.8.8
0,7 mg
Ac47.9.3.8.9
0,7 mg
Ac47.9.3
269,4 mg
Ac47.9.2
98,3 mg
Coluna em sílica flash
19 X 2 cm
FM = CHCl3:MeOH 9:1
9 Fr.
Ac47.9.2.1
0,2 mg
Ac47.9.2.2
3,2 mg
Ac47.9.2.3
48,3 mg
Ac47.9.2.4
32,6 mg
Ac47.9.2.5
9,7 mg
Ac47.9.2.6
2,5 mg
Ac47.9.2.7
1,6 mg
Ac47.9.2.8
1,5 mg
Ac47.9.2.9
2,7 mg
________________________________________________Materiais e Métodos 46
Figura 14. Fluxograma de fracionamento de Ac47.9.3
A fração Ac47.9.4 foi fracionada inicialmente por coluna em Sephadex
LH 20 usando como FM MeOH, originando 8 frações das quais duas
(Ac47.9.4.4 e Ac47.9.4.5) foram separadas em CLAE reciclante nas
condições especificadas na figura 15 (p. 44). Na CLAE foram geradas 9 e 13
frações respectivamente. Destas frações foi isolada uma substância que
corresponde a fração Ac47.9.4.4.7 e Ac47.9.4.5.12 que apresentaram
espectro de RMN 1H iguais e foram reunidas de acordo com a figura 15 (p.
44).
Figura 15. Fluxograma de isolamento da substância F1
Ac47.9.4
131 mg
CLAE reciclanteColuna polimérica 500 X 21,5mm Fluxo =5mL/min. (6 ciclos)FM= MeOH:CH2Cl2 50%λ = 225 nm, 276 nm9 Fr.
Coluna em Sephadex LH 20
40 X 4 cm
FM= MeOH
8 Fr.
Ac47.9.4.4
34,9 mg
Ac47.9.4.5
24,3 mg
CLAE reciclanteColuna polimérica 500 X 21,5mm Fluxo =3mL/min. (22 ciclos)FM= MeOH:CH2Cl2 50%λ = 225 nm, 276 nm13 Fr.
Ac47.9.4.4.7
1,8 mg
Ac47.9.4.5.12
1 mg
RMN1H RMN1H
Substância F1
2,8 mg
________________________________________________Materiais e Métodos 47
Em todos os fracionamentos utilizou-se cromatografia em camada
delgada (CCDA) em sílica gel ou sílica silanizada para reunião de frações
semelhantes, escolha de FM, entre outros procedimentos.
3.2.5.3 Extrato Me59 produzido em escala ampliada
Inicialmente o extrato Me59 foi particionado com solventes orgânicos,
originando 5 frações (figura 16, p. 45).
Figura 16. Fluxograma de partição líquido-líquido do extrato Me59
A fração Me59.1 foi fracionada por CLV, usando como FE sílica gel
60H e FM hexano, hexano:AcOEt nas proporções 5%,10%, 20%, 30%, 50%
Me59
4,36g
Fração Hidroalcoólica
CH2Cl2
Suspensão em MeOH:H2O 1:3Partição líq-líq com CH2Cl2
Me59.5
194,7 mg
ConcentraçãoSuspensão em MeOHPartição líq-líq com Hex
Me59.1
335,6 mg
Partição líq-líq com AcOEt
Me59.4
56 mgFração
Hidroalcoólica
Partição líq-líq com n-BuOH
Me59.3
1,44 g
Me59.2
1,81 g
Me59.1- MeOH
Me59.2- n-BuOH
Me59.3- Aquoso
Me59.4- AcOEt
Me59.5- Hex
________________________________________________Materiais e Métodos 48
e 80% além de AcOEt, AcOEt:MeOH 50% e MeOH, originando 9 novas
frações. A fração Me59.1.9 foi fracionada novamente por coluna em
Sephadex LH 20 usando como FM MeOH, originando 6 frações das quais
uma, Me59.1.9.2, foi fracionada por CCDP usando como FM
nBuOH:AcOH:H2O 6:1:3 (figura 17,p. 46).
A fração Me59.2 também foi fracionada por CLV usando como FE
sílica gel 60 H e FM AcOEt, AcOEt:(MeOH:H2O/1:1)1%, 2%, 3%, 5%, 10%,
20%, 50%, 80%, 100%, originado 10 frações. Para a fração Me59.2.1 utilizou-
se coluna flash isocrática (Hex:Me2CO:AcOH 9:1:0,3), seguida de CCDP para
Me59.2.1.3 usando como FM Hex:Me2CO:AcOH 19:1:0,6 (figura 18, p. 47).
Figura 17. Fluxograma de fracionamento de Me59.1
Me59.1
335,6 mg
CLV (FE = sílica gel 60 H)18 X 5 cmFM = Hex, Hex:AcOEt 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 80%, AcOEt, AcOEt:MeOH 50%, MeOH9 Fr.
M59.1.9
205,4 mgColuna em Sephadex LH 20
28 X 2 cm
FM= MeOH
6 Fr.
Me59.1.9.2
13,9 mgCCDP (5 X 20cm)
FM= n-BuOH:AcOH:H2O 6:1:3
6 Fr.
Me59.1.9.2.1
5,4 mg
Me59.1.9.2.2
0,3 mg
Me59.1.9.2.3
5,2 mg
Me59.1.9.2.4
2,3 mg
Me59.1.9.2.5
1,6 mg
Me59.1.9.2.6
2,8 mg
________________________________________________Materiais e Métodos 49
A fração Me59.2.8 foi acetilada e purificada por CCDP originando a
substância M3a, conforme a figura 18 (p. 47). Além disso, esta fração
também foi esterificada com diazometano, originando a mistura de
substâncias M2, analisada por CG/EM.
Figura 18. Fluxograma de fracionamento de Me59.2
Usando coluna em sephadex LH 20, FM H2O:MeOH 7:3, a fração
Me59.3 originou 5 novas frações e a substância M3. Para Me59.3.2 e
Me59.3.3 foi utilizado fracionamento em coluna em sílica gel com FM
H2O:Me2CO 4:1. Da fração Me59.3.3. foram isolada a substância M5 e a
Me59.2
1,81 g
Me59.2.1
259,5 mg
Me59.2.8
242,2 mg
Me59.2.1.3
127,2 mg
CLV (FE = sílica gel 60 H)
20 X 5 cm
FM = AcOEt, AcOEt:(MeOH:H2O/1:1)1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 20%, 50%, 80%, 100%
10 Fr.
Coluna em sílica flash
22 X 2 cm
FM = Hex:Me2CO:AcOH 9:1:0,3
7 Fr.
CCDP 3X (20 X 20cm)
FM= Hex:Me2CO:AcOH 19:1:0,6
2 Fr.
Me592.1.3.1
77 mg
Me59.2.1.3.2
62,7 mg
Acetilação 40mg
(piridina/anidrido acético)
12 horas.Extração com AcOEt
Me59.2.8.1
30 mg
CCDP (20 X 20cm)
FM= Me2CO:Hex 9:1
2 Fr.
Me59.2.8.1.2
13,9 mg
CCDP (20 X 20cm)
FM= MeOH:Me2CO 1:1
2 Fr.
Substância M3a
8,2 mg
diazometano
Coluna em sílica gel22 X 2 cmFM = MeOH:CHCl3 Mistura de
substâncias M2
32 mg
CG/EM
Ésteres metílicosde ácidos
graxos
________________________________________________Materiais e Métodos 50
substância M4 que foi acetilada e purificada por coluna em sílica gel,
originando a substância M4a, conforme a figura 19 (p. 48).
Figura 19. Fluxograma de fracionamento de Me59.3
Me59.3
1,44 g
Coluna em Sephadex LH 20
44 X 2,5 cm
FM= MeOH:H2O 7:3
6 Fr.
Me59.3.2
18 m g
Me59.3.3
183,1 mgColuna em sílica gel
13 X 1 cm
FM = H2O:Me2CO 4:1
3 Fr.
Me59.3.2.1
8,4 m g
Me59.3.2.2
2,2 m g
Me59.3.2.3
10 m g
Substância M3
187,7 mg
Substância M5
16,3 mg
Substância M4
118,3 mgAcetilação 30mg
(piridina/anidrido acético)
12 horas.Extração com AcOEt
Coluna em sílica gel18 X 1 cmFM = Hex:Me2CO 3:2
Substância M4a
10,2 mg
Coluna em sílica gel
22 X 2 cm
FM = H2O:Me2CO 4:1
6 Fr.
Me59.4
56 mgCCDP (20 X 20cm)
FM= CHCl3 :AcOEt 7:3
6 Fr.
Mistura de substâncias M6
30 mg
Transesterificação 30mg
(MeOH/H2SO4 )
2 horas em refluxo.Extração com Hex
Mistura de substância M6b
5,5 mg
CG/EM
Ésteres metílicos
dos ácidos graxos
________________________________________________Materiais e Métodos 51
Figura 20. Fluxograma de fracionamento de Me59.4
A fração Me59.4 foi fracionada em CCDP usando como FM
CHCl3:AcOEt 7:3, gerando 5 frações e a mistura de substâncias M6 que foi
transesterificada originando a mistura de substâncias M6b que foi analisada
via CG-EM (figura 20, p. 48).
3.2.6 Reações químicas efetuadas em algumas substâncias
- Acetilação
As reações de acetilação foram feitas com 1,0 mL de anidrido acético
e 0,5 mL de piridina para 30 mg da substância M4 e 40mg da fração
Me59.2.8. As misturas reacionais foram deixadas em agitação por 14 horas
à temperatura ambiente. A mistura reacional foi vertida sobre água gelada e
os produtos extraídos com AcOEt. A fase orgânica foi lavada com solução
de ácido acético 10%. O solvente foi evaporado após a secagem com sulfato
de sódio anidro (Santos, 2001).
- Transesterificação de triglicerídeos
A transesterificação foi feita com 30 mg da mistura de substâncias M6
que foi solubilizada em 2,0 mL de MeOH. Pedaços de porcelana e 30µl de
H2SO4 foram adicionados à mistura reacional que foi refluxada por 2 horas
sob agitação ocasional. A extração foi feita com hexano após adição de
________________________________________________Materiais e Métodos 52
20,0mL de H2O e a fase orgânica foi lavada com solução bicarbonatada 5%,
seca com sulfato de sódio e rotaevaporada até a secura (Santos, 2001).
- Esterificação com diazometano
A fração Me59.2.8 foi esterificada com uma solução de diazometano.
Para isso foi adicionada uma solução de diazometano em éter ao substrato
até não ser mais observada a eliminação de gás de N2.
A solução de diazometano foi preparada dissolvendo-se 2,14g de p-
toluilsulfonilmetilnitrosamida (diazald) em 30 mL de éter etílico (em balão de
destilação) e resfriando-se a solução em banho de gelo. Foi adicionada uma
solução de 0,4 g de KOH em 10,0 mL de etanol. Após 5 minutos a solução
etérea de diazometano foi destilada com aquecimento por banho de óleo. O
reagente foi recolhido sobre éter etílico resfriado em banho de gelo (Pupo,
1997).
3.2.7 Elucidação estrutural das substâncias
A elucidação das estruturas químicas foi feita através das técnicas
espectroscópicas: IV, EM, RMN1H, RMN13C, COSY 1H1H, HMBC, HMQC.
3.2.8 Ensaios antiparasitários in vitro para avaliação da atividade
tripanocida
Esse ensaio foi realizado pelo Prof. Dr. Sérgio de Albuquerque
(FCFRP-USP). O bioensaio foi realizado em amostras sangüíneas coletadas
________________________________________________Materiais e Métodos 53
de ratos albinos Swiss no sétimo dia de parasitemia após a infecção com a
linhagem Y de T. cruzi (Silva & Nussenzweig, 1953). O sangue infectado foi
diluído a uma concentração de 2x106 tripomastigotas/mL. Os ensaios foram
realizados em microplacas (96 orifícios) com 400 µL de sangue em triplicata.
Para extratos brutos a concentração utilizada nos ensaios foi de 500 µg/mL e
1 mg/ml. Para substâncias puras a concentração foi de 8, 32 e 128 µM. As
placas foram incubadas a 4oC e o número de parasitas contados após 24
horas, de acordo com o procedimento descrito por Brener, 1962. Sangue
infectado com o mesmo volume de DMSO foi usado como controle negativo e
a violeta de genciana foi usada como controle positivo (250 µg/mL).
3.2.9 Ensaios de inibição das atividades enzimáticas
As enzimas utilizadas neste trabalho são obtidas de forma
recombinante a partir dos plasmídeos inseridos em bactérias Escherichia coli.
A preparação e a purificação das enzimas são feitas rotineiramente de
acordo com os procedimentos estabelecidos no Laboratório de Cristalografia
de Proteínas e Biologia Estrutural do Instituto de Física de São Carlos da
Universidade de São Paulo. O procedimento para GAPDH já foi descrito
(Souza et al., 1998).
- Enzima GAPDH de T. cruzi
________________________________________________Materiais e Métodos 54
Os ensaios foram realizados no Laboratório de Química Farmacêutica
da FCFRP-USP e foram feitos conforme procedimento previamente descrito
(Vieira et al., 2001), pela medida espectrofotométrica de NADH formado em
340 nm durante 30 s. A mistura reacional contém (volume final 1 mL): 50 mM
tampão Tris-HCl pH 8,6 com 1 mM EDTA e 1mM β-mercaptoetanol, 30 mM
arseniato de sódio, 2,5 mM NAD, 0,3 mM gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e 1,5
µg de enzima. A reação é iniciada pela adição do substrato.
Para o teste de inibição, as soluções dos extratos (1 mg/mL) foram
preparadas em DMSO e 100 µL foi adicionado à mistura reacional.
Substâncias puras são inicialmente testadas em 100 µg/ml e esta
concentração é diminuída até a obtenção de aproximadamente 50% de
inibição (IC50). A concentração final de DMSO usada foi 10% e este volume
foi subtraído do volume do tampão. Substâncias puras são inicialmente
testadas em 100 µg/mL e esta concentração é diminuída até a obtenção de
aproximadamente 50% de inibição (IC50). Ensaios controle foram feitos na
ausência de extratos, onde um volume equivalente de DMSO foi adicionado.
As medidas foram feitas em triplicata e considerou-se o valor da média.
- Enzima APRT de L. tarentolae
Os ensaios foram realizados no Laboratório de Cristalografia de
Proteínas e Biologia Estrutural do Instituto de Física de São Carlos da
Universidade de São Paulo. Utilizou-se a enzima APRT de L. tarentolae,
clonada e caracterizada por Thiemann e colaboradores em 1998 e estes
________________________________________________Materiais e Métodos 55
ensaios foram feitos de acordo com a modificação de um procedimento
previamente descrito (Tuttle & Krenistsky, 1990) pela medida
espectrofotométrica da formação de AMP. Os ensaios de atividade foram
acompanhados por 60 segundos e o comprimento de onda utilizado é 259
nm. A mistura reacional contém (volume final de 0,5 mL): tampão Tris - HCl
100 mM (pH 7,4); MgCl2 5 mM; Adenina 100 mM; PRPP 560 mM e APRT 7,5
µg. Para o teste de inibição, as soluções dos extratos (1 mg/ml) foram
preparadas em DMSO e 100µL foi adicionado à mistura reacional. A
concentração final de DMSO usada foi 10% e este volume foi subtraído do
volume do tampão. Ensaios controle foram feitos na ausência de extratos,
onde um volume equivalente de DMSO foi adicionado. As medidas foram
feitas em triplicata e considera-se o valor da média.
Os resultados obtidos para GAPDH e APRT foram avaliados conforme
procedimento previamente descrito (Vieira et al., 2001). Todas as medidas
são feitas em triplicata, onde se calcula a média e em seguida aplica-se a
fórmula:
onde:
∆t = min.
εNADH= 6,22 mM-1 cm-1
εAMP= 1,24 mM-1 cm-1
volumes expressos em mililitros (mL)
Atividade específica =(U/mg)
∆Abs
∆t (min)
_________ x volume da cubeta
__________________________________
εNADH, AMP
Ax vol. enzima na cubeta x [enzima]
________________________________________________Materiais e Métodos 56
A atividade específica das enzimas (unidade/mg) é calculada através
de medidas espectrofotométricas da formação do produto (NADH) pela
diferença de absorbância entre os tempos específicos de reação para cada
enzima.
Através da atividade específica é possível calcular a porcentagem de
inibição da enzima GAPDH de T. cruzi (tabela 13, p. 61) e enzima APRT de
L. tarentolae (tabela 15, p. 65) frente aos extratos brutos testados. Pela
fórmula:
As enzimas foram armazenadas a 4°C e utilizadas nos experimentos
nas concentrações de 0,3 mg/mL para GAPDH e 0,9 mg/mL para APRT .
% = 100 X U/mg (controle) – U/mg (amostra) U/mg (controle)
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