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Fisiologia microbiana

Nutrição e crescimento

Nutrição microbianaComponentes necessários às célulasMeios de culturaCondições ambientais

Crescimento populacionalVelocidade de crescimentoTempo de geraçãoMedidas do crescimento

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� N utricionalmente são os mais versáteis e diversificados� A lguns podem viver com poucas substâncias inorgânicas� O utros são tão exigentes quanto o homem

� P ara caracterizar suas propriedades (morfológicas, fisiológicas e bioquímicas) énecessário o cultivo em laboratório:

- Cultivo in vitro : quando se conhece as exigências nutricionais- Cultivo in vivo : quando não se conhece as exigências nutricionais

Exemplo de microrganismos que precisam de hospedeiro para ser cultivado:

- Mycobacterium leprae (causador da hanseníase)

- Glomus clarum (fungo simbionte)

IntroduçãoNutrição de microrganismos

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P ara o cultivolaboratorial(in vitro ) são utilizados meios de cultura quesimulam e até melhoram as condições naturais.

O s elementos químicos principais para o crescimento das células são

denominados macronutrientes (C, N , H, O , S, P ).O carbono é um dos elementos mais importante para o crescimentomicrobiano.

Necessidade de meios de cultura adequados

Com exceção para C O 2, os compostosorgânicos são os que contém carbono

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Macronutrientes : - Necessários em grande quantidade.

- Tem papel importante na estrutura e metabolismo.

Micronutrientes : - Necessários em quantidades mínimas.

- Funções enzimáticas e estruturais das biomoléculas

atéria secaÁgua

¡

N

H

¢

, £

, K, Na ...

célula

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Componentes necessários às célulasMacronutrientes

Fonte de carbono:- Compostos orgânicos (microrganismos heterotróficos):

carboidratoslipídeosproteínas

- Dióxido de carbono (microrganismos autotróficos):É a forma mais oxidada do carbono, assim a fonte de energia deve vir da luz ou de outroscompostos inorgânicos.

Fonte de Nitrogênio:- É elemento necessário em maior quantidade depois do carbono, cerca de 1 2 %.

(constituinte das proteínas, ácidos nucléicos, etc.)

moléculas orgânicas (aminoácidos, peptídeos)

moléculas inorgânicas (NH3, NO 3-, N2)

A capacidade de algumasbactérias em utilizar o

nitrogênio atmosférico (FBN)é de fundamental importânciapara a vida de todos os seres.

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Hidrogênio:- P rincipal elemento dos compostos orgânicos e de diversos inorgânicos (água, sais e

gases)

Função:Manutenção do pHFormação de ligações de H entre moléculas

Fonte de energia nas reações de oxi-redução na respiração

Componentes necessários às células

Oxigênio:

- Elemento comum encontrado nas moléculas biológicas (aminoácidos, nucleotídeos,

glicerídeos)- É obtido a partir das proteínas e gorduras.Na forma de oxigênio molecular (O 2), é requerido por muitos para os processos de geração deenergia.

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P ± Síntese de ácidos nucléicos, ATP

S ± Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas

± Estabilidade dos ácidos nucléicos, bomba de Na/

Mg ± Estabilidade dos ribossomos

Ca ± Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de endósporos

Na ± Requerido em maior quantidade por microrganismos marinhos.Bactérias halofílicas extremas não crescem com menos de 15 % de sal.

Fe ± P apel-chave na respiração, componente dos citocromos e dasproteínas envolvidas no transporte de elétrons.

Componentes necessários às células

Outros macronutrientes:

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Metais em quantidades muito pequenas (traços) na composição de ummeio de cultura:

Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B

Exercem função estrutural em várias enzimas (ativação)

- Nem sempre sua adição é necessária

- Meios sintéticos com compostos de alto grau de pureza e água ultra

pura podem apresentar deficiências desses elementos.

Ex: Mo+6 é necessário para a nitrogenase, a enzima que converte

o N2 para NH3 durante a FBN .

Componentes necessários às célulasMicronutrientes

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Água:- Componente absolutamente indispensável

(com exceção dos protozoários que englobam partículas sólidas)No laboratório de utiliza água destilada, filtrada e deionizada.

Outros aditivos:Função de aumentar a conversão, evitar precipitação de íons, controlar a espuma,provocar inibição, estabilizar o pH:

Quelantes : na autoclavagem ocorre a precipitação dos fosfatos metálicosEDT A, ácido cítrico, polifosfatos.InibidoresEx: produção de ácido cítrico por A spergillus n iger U tiliza-se Fosfato e pH < 2 para reprimir o ácido oxálico

gua e outros aditivos

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Tampões

- Carbonato de cálcio- Fosfatos- P roteínas (peptona)

Indutores: a maioria das enzimas de interesse comercial precisa de indutores.Ex: celulose induz a celulase

pectina induz a pectinaseamido induz a amilase

Antiespumantes: cultivos com aeração ocorre a produção de espuma

± Remoção de células, perda do produto, contaminação ± Redução do volume do meio

álcoois, ácidos graxos, silicones, poliglicóis: reduzem a tensão superficial das bolhas

O utros aditivos

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Meios de cultura

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Meios quimicamente definidos são utilizados para determinar asnecessidades nutricionais

Controle é um meio mínimo com apenas glicose e sais.3 isolados bacterianos sendo testados quanto a necessidade desuplementos orgânicos.

Meio decultura

solidificadocom 1,5 %

de ágar.

Até 1880 os microrganismoseram cultivados em meioslíquidos.Robert och introduziu os meiosde cultura sólidos, os quaispermitiram o estudo de espécies

isoladas (culturas puras).

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Microplacas com diferentesmeios de cultura para

identificação de enterobactérias.

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Meios de cultura para bactérias

� N ormalmente imitam o habitat normal

Ex.Se a bactéria prefere os nutrientes encontrados no sangue, então o sangue é adicionadono meio de cultura.

Meio definido para quimioautotróficas Meio definido para heterotróficas Meio complexo para heterotróficas

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Meios de cultura para fungos

Todos os fungos são heterotróficosGeralmente são utilizados meios ricos contendo grande variedade de compostos orgânicosprovidos pela peptona e extratos de carne ou soja.

Também são utilizadas maiores concentrações de açúcares (4%) e pH menor (3,8 a 5,6) doque os meios para bactérias.

Essa combinação permite inibir o crescimento de bactérias.

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Meios de cultura para protozoários

� O s protozoários são heterotróficos aeróbios com exigências

nutricionais complexasMuitos não são cultivados i n v itro.

O s que são necessitam muitos complementos, como emulsões de tecidos cerebrais, sorofetal, infusão de fígado e células bacterianas.

Ex: Tetrahyme n a pyriformis necessita de um meio contendo 10 aminoácidos, 7 vitaminas esais inorgânicos.

Tetrahyme n a pyriformis não é patogênicomas é utilizado em pesquisas médicas ebiológicas.

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Meios especiais

Meios para anaeróbios: adição de agentes redutores (tioglicolato de sódio)

Meios seletivos: favorece o crescimento de um tipo particular ou suprime outros.

Ex. meio ágar verde brilhante.

Meios diferenciais: para diferenciar microrganismos dentro de uma cultura mista.

Ex. meio com sangue para distinguir as hemolíticas.

Meios seletivos/diferenciais:

Ex. Meio McConkey que contém sais de bile e cristal violeta.

Meios de enriquecimento: se objetiva o aumento de uma determinada espécie sem

inibir as demais.

Ex. isolar bactérias que oxidam fenol, fornecendo fenol como única fonte de carbono.

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MEIO S DE CUL TU R A

Composição elementar média (% do peso seco)

Elemento Bactéria Fungo

Carbono 52 51

hidrogênio 7 7

N itrogênio 13 8,5

Fósforo 2 ,5 0,4-4,5

Enxofre 0,6 0,1-0,5

P otássio 2 ,5 0,2-2 ,5

Sódio 0,75 0,02-0,5Cálcio 0,55 0,1-1,4

Magnésio 0,25 0,1-0,5

Cloro 0,5 -

Ferro 0,1 0,15

Relação C:N média 4:1 6:1

Relação C:N :P :S 85:23:4:1

Passo 1: utilizar dados da composição elementar

Ex: P ara produzir 10 g de células bacterianas sãonecessários de 1,3 g (13%) de Nou 7,2 g d e (NH4)2SO 4 (18% de N)

O bs: Sais com dois componentes [( NH4)2SO 4] podemintroduzir o excesso de um deles.

Com relação ao carbono considerar também fraçãopara energia e manutenção (heterotróficos)

Fração para biomassa : 1,3 x 4 = 5,2 g de C ou 13 gde glicose (40% de C)

Fração para energia e manutenção (45%):Y

X/S= 55% 13/0,45 = 2 8,9 g de glicose

Relação C:N = 2 8,9/7,2 = 4:1

e assim por diante.

Passo 2: otimização

Meios de CulturaComo determinar uma composição inicial para um meio de cultivo?

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TemperaturaO xigêniopHP ressão osmótica, atmosférica, hidrostáticaRadiação eletromagnética

Condições ambientais (fatores abióticos)

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TemperaturaGrupos

1. Psicrófilos ± temperatura ótima abaixo de

15 oC, suscetíveis de crescer a 0 oC.

2. Mesófilos ± temperatura ótima 2 0o- 40

oC,

maioria dos patógenos humanos.

3. Termófilos ± temperatura ótima acima de

45 oC.

A velocidade de crescimento duplica acada aumento de 10 ºC.

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Aeróbio Anaeróbio Facultativo Microaerófilo Anaeróbioaerotolerante

Efeito do oxigênio no crescimento microbiano

Meio gelatinoso comindicador redox :Rosa quando oxidado

Incolor quando reduzido

Durante as reações de redução do O 2 são formados vários intermediáriostóxicos.Ex: H

2O 2, O H° , O 2-

O s microrganismos aeróbios efacultativos utilizam enzimas como acatalase para destruir as formastóxicas

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Sistema para cultivo de anaeróbios

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pH

� A o contrário da temperatura, o pH ótimo para o crescimento encontra-se no valor médio da variação sobre o qual o crescimento acontecerá,

� O s microrganismos são encontrados em todos os ambientes e portanto

em todas as condições de pH.� Q uando cultivados i n v itro , o meio sofrerá alterações à medida que os

metabólitos ácidos ou alcalinos são produzidos.

- Necessário a adição de um tampão ao meio.

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P ressão osmótica

� N ão devem existir grandes diferenças naconcentração de solutos dentro e fora dacélula, pois podem desidratar-se ouromper-se.

Ex: microrganismos marinhos necessitam de teoresde sais mais elevados.

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Em microbiologia crescimento geralmente é o aumento do número de células� N a maioria dos procariotos ocorre a fissão binária : crescimento e divisão

Varia de minutos até diasDepende muito das condições ambientais

CRESCIMENTO MICRO BI ANO

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O padrão de crescimento é o exponencial

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Tratando-se bactérias , algas unicelulares e leveduras que semultiplicam por divisão binária , temos:

2 1 > 2 2 > 2 3> 2 4

O nde N = n° microrganismos ao fim den divisões (gerações)N0 é o número inicial

O número de gerações será:

A velocidade exponencial de crescimento (R) é expressa pelo númerode divisões no tempo:

A recíproca de R é o tempo de geração:

nN = N .2

0n = 3,3(logN- logN )

0

nR =t - t

01 t - tG = =R n

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O ciclo de crescimento

� A fase exponencial reflete apenas uma parte do ciclo de crescimento de umapopulação microbiana

� O crescimento de microrganismos apresenta um ciclo típico com todas asfases de crescimento.

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1) Fase Lag

Período de adaptação da cultura

Mudança de meio, preparação do complexo enzimático

Reparação das células com danos.

2) Fase exponencialFase mais saudável das células onde todas estão se dividindo.

� A maioria dos microrganismos unicelulares apresentam essa fase, mas asvelocidades de crescimento são bastante variáveis:

- P rocarióticos ± crescem mais rapidamente que os eucarióticos- Eucarióticos menores crescem mais rapidamente que os maiores

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3) Fase estacionária :Num sistema fechado (tubo, frasco ou biorreator) o crescimento exponencial nãopode ocorrer indefinidamente.

� O corre a limitação por depleção de nutrientes e acúmulo de metabólitos.

Divisão = morte crescimento líquido nulo

Ainda pode ocorrer catabolismo e produção de metabólitos secundários

4) Fase de morte (declínio):

� A manutenção de uma cultura no estado estacionário por longo tempo conduz as

células ao processo de morte. A morte celular é acompanhada da lise celular

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MED IDAS DO CRESC IMEN TO

Podem ser realizadas pelos seguintes métodos:

1) P eso seco total das próprias célulasfiltração, secagem e pesagem

2 ) P eso de algum componente celular extração, secagem e pesagem

3) Variação no número de célulasa) contagem de células totais (direta)b) contagem de células viáveis (indireta)

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Contagem microscópica direta

Vantagens : método rápido e fácil

Desvantagens:Não distingue as células vivas das mortasP ode-se omitir células pequenasCélulas móveis precisam ser imobilizadas

U tilizam-se câmaras especiais de contagem (lâmina com grade quadriculada)Ex.: Câmara de Neubaue r

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Contagem de células viáveis (indireta)

Contagem das colônias formadas em meio de cultura em placas.

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São empregadas várias diluições decimaisporque é difícil prever o número de viáveis.É contada a placa com 30 a 300 colônias

Diluição das suspensões celulares Amostras concentradas precisam ser diluídas

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MEDID AS DO CRESCIMENTO MICRO BI ANO - O utros métodos

-T

urbidimetria As células dispersam a luz e quanto mais células mais turvo é o meio

P ode ser medida com um espectrofotômetro

O uso da turbidimetria exige a construção de uma curva padrãoTurbidez X quantidade de células

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- Contagem eletrônica