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AF060BiotecnologiaVegetalProfessoresresponsáveis:
Prof.JoãoCarlosBespalhokFilho
Prof.LuizAntonioBiasiProfa.RenataFaierCalegarioProf.BrunoPortelaBrasileiroProfa.DaniellaN.M.Carneiro
Doutoranda:CarolinaS.SchuchovskiAugusto
CulturadeTecidosVegetaisv Tópicos:
v Organizaçãodolaboratóriov MeiosdeCultura(componentese
preparo)v Assepsiav Organogênese
v Embriogênese
Organizaçãodolaboratório
Finalidadedolaboratóriov Pesquisa:
v Estudodediversastécnicas,variedadedeespéciestrabalhadas,ensino
Finalidadedolaboratóriov Comercial:
v Biofábricas:produçãoemlargaescala,eficiência,custoreduzido
TécnicasuVlizadasv Micropropagação
v Culturademeristemas:ápicesmeristemáVcoslivresdevírus
v TransformaçãogenéVca:introduçãodeumasequênciadefinidadeDNA
v Culturadeóvulos:haploides
v CulturadeembriõeszigóVcos(resgatedeembriões):superaradormênciadassementes,estudododesenvolvimentodoembrião,recuperarhíbridosrarosdecruzamentosincompaYveis
v Protoplastos:célulassemparedecelular,estudosnomelhoramentogenéVco
Altocusto;Mãodeobraespecializada;AltocustodemateriaisContaminação;Oxidação;
Grandenºdemudas;Controledascondiçõesdetrabalho;
Livresdedoenças;Crescimentorápido;
MulVplicarplantasquenãoproduzemouproduzempoucassementes.
Mudasmicropropagadasv Vantagensedesvantagens
Etapasdoprocessoinvitrov Estabelecimentoinvitro
v Desenvolvimentodoexplante,seguindoarotaescolhida
v Transferênciadasplantasparaoambienteexterno
Etapasdoprocessoinvitro
CarcaterísVcasimportantesv AmbienteassépVco
v Temperaturaeiluminaçãocontrolados
Estruturabásicav Saladelimpeza
v Saladepreparodemeio
v Saladetransferência
v Saladecrescimento
v Outrasdependências
Estruturadeapoio
v Casadevegetaçãov Câmaradenebulização
v Temperaturacontrolada
v Telado
Estruturabásicav Saladelimpeza
v Descartemeiodecultura
v Lavagemdevidraria
v Autoclavagemdeáguaemeiodecultura
Estruturabásica
v Saladelimpeza
Estruturabásicav Saladelimpeza
v Piasfundas
v Locaisparaarmazenarvidrossujos
v Lavagem
v Detergente
v Hipocloritodesódio(NaClO)
v Estufaparasecagem
v Descartedematerial
v Produtosquímicosemeiodecultura
Estruturabásicav Saladepreparodemeio
v Preparodesoluçõesemeiosdecultura
Estruturabásicav Saladetransferência
v LocaldemanipulaçãoassépVcadasculturas
Estruturabásicav Saladetransferência
Estruturabásicav Saladecrescimento
Estruturabásicav Saladecrescimento
Estruturabásicav Saladecrescimento
v Prateleirasv Lâmpadas
v Timerv Luminosidade-16h
v Temperaturacontrolada:
v Arcondicionado:23ºC±2ºC
Estruturadeapoiov Casadevegetação
v CâmaradenebulizaçãoeclimaVzada
Estruturadeapoiov Casadevegetação
v CâmaradenebulizaçãoeclimaVzada
Estruturadeapoiov Telado
Equipamentosv Autoclave:
v Esterilizaçãoa121ºCepressão1,05km/cm2
Equipamentosv Autoclave:
v Manuais,automáVcas
v Horizontais,VerVcais
Equipamentosv Deionizador:
v Remoção:v Minerais
v íonsnasresinas
v Nãoremovesubstânciasorgânicas
Equipamentosv DesVlador:
v Remoçãode:v Minerais
v Subst.orgânicas
v Aquecer,ferver,evaporar,condensarecoletar
Equipamentosv Ultra-purificador–
sistemaMilliQ:v Resinaseficientespara
remoçãominerais
v ReVradadeparYculasorgânicas(filtrodemembrana0,22µm)
Equipamentosv FornodeMicroondas:
Equipamentosv Estufadesecagem:
v Fornoelétricocomum
v Secagemdevidaria
Equipamentosv Geradoresdeeletricidadee
estabilizadoresdevoltagem:v GaranVadefornecimentoininterruptode
eletricidade
v Proteçãoaosaparelhos
Equipamentosv Refrigeradorefreezer:
v Soluçõesestoque,Reguladoresdecrescimento,Vitaminas,Materialvegetal
Equipamentosv Balança:
v Macronutrientes,precisão0,1g
v Balançadeprecisão:v Altocusto;
precisãode0,1mg
Equipamentosv AgitadormagnéVco
Equipamentosv MedidordepH:
v Calibraçãoperiódicacomsoluçõesestoque
Equipamentosv Câmaradefluxolaminar:
Equipamentosv Câmaradefluxolaminar:
v ImprescindívelparaostrabalhosdemanipulaçãoassépVca
Equipamentosv Câmaradefluxo
laminar:v Arpassapor
umfiltrobacteriológico
v AmbientecompressãoposiVva
Equipamentosv Câmaradefluxolaminarcomluzultra-
violeta:v Ligar20minutosantes
v Desligaraluz
v Nãopermanecernasala
v Queimaduras
v Altamentemutagênica
Equipamentosv Dispensadordemeio
decultura:
Equipamentosv Microscópio
estereoscópico:
Equipamentosv Agitador
orbital:
Equipamentosv Lamparinadeálcooloubico-de-bunsen
Equipamentosv Micropipetas
Equipamentosv Ar-condicionado
Equipamentosv Biorreatoresdeimersãotemporária
Equipamentosv Biorreatoresdeimersãotemporária:
v MulVplicaçãoemlargaescala
Equipamentosv Fotografia:
Utensíliosv Frascosdecultura:
Utensíliosv Suportesparatubosdeensaio
v Pinças,bisturis
v Bandejas
v Frascosparaáguaeparareagentes
v Béquer,erlenmeyer,proveta,pipeta,placadepetri
v Outrosmateriais:papeltoalha,alumínio,filmeplásVco,eVquetas
Segurançaemlaboratóriov Regrasaseremrigorosamenteseguidas
v Evitaracidentes
v Evitarprejuízoshumanosemateriais
Segurançaemlaboratóriov Usodeguarda-pódealgodão
v Usodecalçadosfechados
v Lavarasmãoscomdetergenteantesdoiníciodostrabalhos
v Laboratóriosemprefechadoelimpo
v Nãocomerenãobebernolaboratório
Segurançaemlaboratóriov Nuncausarmaterialeutensíliosdo
laboratórioparacomerouparabeber
v Substânciasinflamáveisdevemsermanipuladaslongedefontesdeaquecimento
v Semprequeusarpipetas,uVlizarpipetadores
Segurançaemlaboratóriov Antesdemanipularqualquerreagente,
informar-sesobreatoxicidade,inflamabilidadeeexplosividadedomesmo
v Cuidadosespeciaisaomanipularsubstânciascompotencialcarcinogênico
v UsarosEPIsadequados:guarda-pó,luvas,máscaras,óculosdesegurança
Segurançaemlaboratóriov Reagentesesoluções:
v ClaramenteidenVficados
v Concentração
v Responsávelpelopreparo
v Datadopreparo
v Todasassubstânciassãotóxicasdependendodasuaconcentração
Segurançaemlaboratóriov Cuidadosnomanuseiodeequipamentos:
v CerVficar-sesempredavoltagemcorreta
v Lerasinstruçõesdeuso
v Emcasodedúvida,perguntaraotécnicoresponsável
Segurançaemlaboratóriov Cuidados:
v Cortecomvidrosquebradosoubisturi
v Queimadurascommaterialdaautoclave
v Incêndiocomálcool(lamparinaouassepsia)
Organizaçãodotrabalhov Cadernodelaboratório
v Fontedeinformações
v TentardescreveraomáximoasaVvidades
v Deveficarnolaboratório
Organizaçãodotrabalhov EspaçomulVusuário
v Necessidadedeprogramaçãopara:v Preparodemeio
v Autoclavagem
v Câmaradefluxolaminar
Segurançaemlaboratóriov Biossegurança:
v Conjuntodemedidasdesegurança
v CTNBio(Comissãotécnicadebiossegurançanacional)
v hop://ctnbio.mcV.gov.br
v OGMs
Segurançaemlaboratóriov Biossegurança:
v CIBio(comissãointernadebiossegurança)
CQB:0114/99SetordeCiênciasAgrárias-UFPRCNPJ: 75.095.679/0001-49 ENDEREÇO:DepartamentodeFitotecniaeFitossanitarismo-RuadosFuncionários,1540CIDADE:CuriVbaUF:PRCEP:80035-050TELEFONES:(41)3350-5716FAX:(41)3350-5684PRESIDENTE:JoãoCarlosBespalhokFilhoEMAIL:bespa@ufpr.brMEMBROS:FlávioZaneoe;FrancineLorenaCuquel;MargueriteG.G.Quorin;LuizAntônioBiasiOBSERVAÇÕES:
Segurançaemlaboratóriov Biossegurança:
v CQBCerVficadodeQualidadeemBiossegurançav credenciamentoqueaCTNBioconcedeàs
insVtuiçõesparadesenvolverprojetoscomOrganismosGeneVcamenteModificados(OGM)
Processo:01200.002080/1999-76Protocolo:23/07/1999CQB:0114/99InsVtuição:SetordeCiênciasAgráriasdaUniversidadeFederaldoParaná-UFPRSituaçãoCQB:ATIVOResponsávelLegal:LuizAntonioBiasiFinalidade:ENSINO;PESQUISAEMREGIMEDECONTENÇÃOAVvidades:PLANTAS;MICROORGANISMOS
MeiodeCultura
Componentesv Água
v Macronutrientes
v Micronutrientes
v Vitaminas
v Carboidratos
v Reguladoresdocrescimento
v Ágarououtrosgelificantes
v pH
Componentesv Macronutrientes:
v Nitrogênio(N)
v Fósforo(P)
v Potássio(K)
v Cálcio(Ca)
v Magnésio(Mg)
v Enxofre(S)
Componentesv Micronutrientes:
v Ferro(Fe)v Manganês(Mn)v Zinco(Zn)v Boro(Bo)v Cobre(Cu)v Molibdênio(Mo)v Outros
v CobaltoeIodo
Componentesv VitaminaseInositol
v Tiamina
v ÁcidoNicoYnico
v Piridoxina
v Glicina
v MioInositol
Componentesv Carboidratos
v Sacarose
Componentesv Reguladoresdocrescimento
v Auxinasv AIA,AIB,2,4-D,ANA
v Citocininasv CIN,BAP,TDZ,2iP,Zea
v Giberelinasv GA3
v ÁcidoAbscísicov ABA
Componentesv Agentesgelificantes
v Ágarv 6a10g/L
v Gelrite/phytagelv 1a2g/L
Componentesv pH
v Deveficarnafaixade5a5,8
v AjustarpHadicionandosoluçãodeNaOH(base)ouHCl(ácido)
v pHinfluencia:v Disponibilidadedenutrientes
v Consistênciadogel
MeioMSv MurashigeeSkoog(1962)
v MaisuVlizadonaculturadetecidos
v Ricoemnitrogênio
MeioMS-composição
Preparov Soluçõesestoque:preparoe
armazenamento
Preparov Preparodomeiodecultura
v Adiçãodassoluçõesestoquev Completarovolumedesejadocomáguav Adiçãodasacarose,mioinositolv Adiçãodoreguladordecrescimentov ControledopHv Adiçãodeágaresolubilização
v Distribuiçãonosfrascos,fechamento
v Autoclavagemdomeio
Assepsia
Assepsiav Eliminaçãodemicroorganismospresentesnotecidovegetal,medianteaplicaçãodeagentesquímicose~sicos,semdanificarestestecidos.
Assepsia
Assepsiav Lavagemcomáguacorrente
Assepsiav Imersão:
v HipocloritodeSódio(NaClO)v Etanolv CloretodeMercúrio(HgCl2)v Detergentes(Twin20)v Dentrodacâmara
Assepsiav Lavagemcomáguaesterilizada(dentrodacâmaradefluxolaminar)
Assepsiav Asconcentraçõesvariamdeacordocomotempoqueomaterialseráexpostoaoproduto
ConcentraçãoTempo
AssepsiadaAmora-pretav Exemploexperimentodeassepsia
v segmentosnodais1,5cmv soluçãoetanol(70%)+Tween20(0,1%):30segundosv tratamentos:
v semimersãoemhipocloritodesódio(0,5%)(testemunha)v 10minutosdeimersãoemNaOCl(0,5%)v 20minutosdeimersãoemNaOCl(0,5%)
v 30minutosdeimersãoemNaOCl(0,5%)
v 3lavagensemáguadeionizadaeesterilizadav meioMS+5µMBAPv duração:60dias
AssepsiadaAmora-preta
TRATAMENTOS NÚMERO DE OBSERVAÇÕES (nº)
CONTAMINAÇÃO (%)
Sem imersão 60 96,7b (1)
10 minutos 60 83,3a
20 minutos 60 78,3a
30 minutos 60 66,7a
Coeficiente de variação (%) 11,78 (1) Médias seguidas por letras distintas na coluna diferem estatisticamente entre si a 5% de
probabilidade pelo teste de Tukey.
RotasMorfogênicas
RotasMorfogênicasv Organogênese
v Formaçãodeumórgão
v Embriogênesev Formaçãodeumembrião
Organogênese
Organogênesev ProcessodeformaçãodeumórgãoaparVrdeumtecidov Gema/Brotov Raiz
DiretaouIndiretav Direta
v Semformaçãodecalo
v Indiretav Formaçãodecalo(massacelularnão
diferenciada)
Fatoresqueafetamaorganogênese
v Espécie/genóVpo
v Explantev JuvenilxMaduro
v Meiodeculturav Reguladordecrescimentov Tipoeconcentraçãov Gemas:citocininas(BAP,cineVna)v Formaçãoderaízes:auxinas
Aplicaçõesdaorganogênese
v Micropropagação
v Organogênesedireta
v TransformaçãogenéVca
EmbriogênesesomáVca
EmbriogênesesomáVca
v ProcessodeformaçãodeumembriãoaparVrdeumtecidosomáVco
v EmbriãosomáVcoébipolarv Ápicecaulinarv Radicular
EmbriogênesesomáVca
v Embriogênesediretav Semformaçãodecalo
EmbriogênesesomáVca
v Embriogêneseindiretav Comformaçãodecalo
Estágiosdedesenvolvimento
v Globular,cordiforme,torpedoecoVledonar
Estágiosdedesenvolvimento
v Indução(indireta)v Auxinas(2,4-D)–desdiferenciação–
formaçãodocaloembriogênico
v Formaçãodoembriãov ReVrada/Diminuiçãoda
concentraçãodeauxinas
Fatoresqueafetam
v Espécie/genóVpo
v Explante
v Meiodeculturav Altaconcentraçãodesais,
principalmenteNitrogênio
v Luzv Induçãogeralmenteéfeitanoescuro
Aplicações
v SementessintéVcas
v TransformaçãogenéVca
Muito obrigada! carolina.sschu@gmail.com.com
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