Aula 2 métodos de estudo da célula

Métodos de estudo da célula

Dimensões das estruturas celulares e

subcelulares

• Célula vegetal: ± 50µm

• Célula animal: ± 10-20µm

• Bactérias: ± 1-2µm

• Vírus: ± 0,05µm• Vírus: ± 0,05µm

• Núcleo: ± 3-6µm

• Mitocôndrias: ± 0,5µm

• Ribossomos: ± 25nm

• Membrana: ± 10nm

Como visualizar células e diferentes estruturas celulares?diferentes estruturas celulares?

Métodos de investigação da estruturacelular

Microscopia óptica (ou microscopia de luz)Descobrimento da célula e formulação da teoria celular

Técnicas citoquímicasTécnicas citoquímicasIdentificação e localização de diversas moléculasconstituintes das células

Microscopia eletrônicaGrande poder de resolução; detalhes da estrutura celular

Separação de organelas celulares

Estudo celular em Microscopia Óptica

MonoMono--ocularocular BinocularBinocular Múltiplos observadoresMúltiplos observadores

Constituído de: parte mecânica + parte óptica (Lembra da prática?)

Parte Óptica � 3 sistemas de lentesCondensador � projeta a luz sobre as células

Objetiva � recebe o cone de luz, projeta uma imagem aumentada

Ocular � recebe imagem da objetiva e amplia

Limites de Resolução

Estudo celular em Microscopia Óptica

• Exames de tecido à fresco

• Exame de tecidos mortos ou preservados

• Problemas• Problemas

– Células transparentes

– Células pequenas e complexas

• Visualização: coloração

Estudo celular em Microscopia ÓpticaExames de tecido à fresco

• Corte fino ou transparente para ser posto nalâmina

Estudo celular em MicroscopiaExames de tecido à fresco

• Espalhamento - células de mucosa bucal

azul de metileno

Estudo celular em MicroscopiaExames de tecido à fresco

• Esfregaço – células sanguíneas

Estudo celular em MicroscopiaExames de tecido à fresco

• Esmagamento – cromossomos e núcleo eminterfase

Estudo celular em MicroscopiaCORTES HISTOLÓGICOS

• Cortes extremamente finos para permitir a fixaçãona lâmina

Estudo celular em MicroscopiaFIXAÇÃO E PREPARAÇÃO DE CORTES

�� FIXAÇÃOFIXAÇÃO DEDE TECIDOSTECIDOS

�� Formol,Formol, GlutaraldeídoGlutaraldeído,, MisturasMisturas fixadorasfixadoras......

�� PREPARAÇÃOPREPARAÇÃO DEDE CORTESCORTES HISTOLÓGICOSHISTOLÓGICOS�� PREPARAÇÃOPREPARAÇÃO DEDE CORTESCORTES HISTOLÓGICOSHISTOLÓGICOS�� CortesCortes dede tecidotecido�� DesidrataçãoDesidratação�� DiafanizaçãoDiafanização�� InfiltraçãoInfiltração // ImpregnaçãoImpregnação�� CortesCortes emem µµmm�� ColoraçãoColoração�� MontagemMontagem

�� VisualizaçãoVisualização

DesidrataçãoDesidratação DiafanizaçãoDiafanização InfiltraçãoInfiltraçãoFixaçãoFixação

MicrotomiaMicrotomiaColoraçãoColoraçãoMontagemMontagem

Fixação - promove a preservação das característicasmorfológicas e macromoléculas dos tecidos oucélulas.

• Função → impedir a autólise ou degradaçãobacteriana do material biológico a ser analisado

• Facilitar os processamentos posteriores de coloração → muitos corantes apresentam maiorafinidade pelo substrato fixado → promover o enrijecimento dos orgãos e tecidos.

• Aumentar o contraste na microscopia eletrônica

Fixadores → agentes químicos das mais diversasfunções orgânicas;

– Reagem quimicamente com os componentescelulares, promovendo a sua estabilização.

– Principais componentes celulares que podem ser preservados → proteínas, ácidos nucléicos, polissacarídeos e lipídios → os fixadores atuamsobre estas macromoléculas tornando-as insolúveis.

• Desidratação → retirada lenta de água

• Bateria de álcool com concentrações crescentes: 70%, 80%, 90% e 100% → o tempo vai depender do material e do material de inclusão.

• A água deve ser toda retirada por não ser missível em• A água deve ser toda retirada por não ser missível emXILOL ou em ÓLEO DE CEDRO → diafanização → clareamento do material

• Inclusão em parafina → dar maior consistência aomaterial.

• Microtomia → corte do material em micrótomo.

Coloração para Microscopia Óptica

• Corantes básicos ou catiônicos (+) - Liga-se a moléculas com carga (-)

BASOFILIA → a estrutura corada é BASÓFILA

Ex: Azul de Metileno, Azul de Toluidina, Hematoxilina, Orceína, lugol, Verde-janus B, violeta de genciana

Núcleo → DNA e RNANúcleo → DNA e RNA

Citoplasma → proteínas e carboidratos

• Corantes ácidos ou aniônicos (-) - Liga-se a moléculas com carga (+)

ACIDOFILIA → a estrutura corada é ACIDÓFILA

Ex: Eosina, Ácido Periódico Schiff (PAS), ácido ósmico

Citoplasma e núcleo → proteínas com carga (+)

NEUTROS - Efeito tintorial sobre as estruturas que não revelamacidofilia nem basofilia. Ex: Vermelho neutro.

Quanto ao papel fisiológico:

VITAIS - Coram a célula sem determinar sua morte. Ex: Verde-janus B, azul de metileno, vermelho neutro, Sudan III.

NÃO-VITAIS - Determinam a morte celular. Ex: Hematoxilina, eosina, lugol,

Coloração para Microscopia Óptica

NÃO-VITAIS - Determinam a morte celular. Ex: Hematoxilina, eosina, lugol, vermelho escarlate, violeta de genciana.

Quanto às propriedades tintoriais:

ORTOCROMÁTICOS - Conferem a célula a mesma cor que apresentam in

vitro. Exemplos: Azul de metileno, verde-janus B, vermelho neutro.

METACROMÁTICOS - Dão a célula coloração diferente da que apresentam in vitro. Exemplos: Laranja de acridina, tionina, azul de toluidina.

Coloração para Microscopia de Fluorescência

Envolve a aplicação de técnicas citoquímicas

Reação com anticorpos ou corantes fluorescentescorantes fluorescentes

Radiação ultravioleta como equivalente a fonte de luz em microscopia óptica

Microscópio Eletrônico

Potencial de aumento muito maior que o óptico

Inventado em 1932 e vem sendo aperfeiçoado desde entãoentão

Intervalo de aumento �1.000x a 200.000x.

Poder de resolução = 1nm (200x maior que o MO)

Microscópio Eletrônico

• Feixes de elétrons ao invés de luz (óptica)

No microscópio eletrônico não há lentes de cristal e sim bobinas, chamadas de lentes chamadas de lentes eletromagnéticas;

• As lentes eletromagnéticas ampliam a imagem gerada pela passagem do feixe de elétrons no material e projetam-na sobre uma tela, onde é formada a imagem

Obtenção dos cortes para M.E.

+ solução de sais de urânio e chumbo

• Não é possível observar material vivo neste tipo de microscópio;

• O material a ser estudado passa por um complexo processo:

– Desidratação

– Fixação– Fixação

– Inclusão em resinas especiais (muito duras)

– Cortes ultrafinos obtidos através das navalhas de vidro-ultramicrótomo;

A imagem do objeto é formada simultaneamente à passagem do feixe de luz através dele.

Bastante difundido no estudo de materiais biológicos, permite definição de imagens intracelulares, permitindo estudos de morfologia celular, aspectos gerais das organelas e também da interação de parasitas com células.

•Tipos de microscópios eletrônicos:

–Transmissão – MET - usado para a observação de cortes ultrafinos;

–Varredura – MEV - capaz de produzir imagens de alta ampliação usado para a observação de superfícies;

Fagocitose

Célula animal

Célula vegetal

Cloroplasto

Mitocôndrias

Cloroplasto

Complexo de Golgi

Um feixe de elétrons bombardeia a superfície do

material “varrendo-a”; então, elétrons secundários ou refletidos são utilizados

para obter imagens tridimensionais.

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

tridimensionais.

Capaz de produzir imagens de alta ampliação e

resolução aumentos 10x a 400.000x com grande profundidade de focoPoder de resolução de

10nm.

As imagens fornecidas pelo MEV possuem um caráter virtual;

O que é visualizado no monitor do aparelho é a transcodificação da energia emitida pelos elétrons, ao

contrário da radiação de luz

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

contrário da radiação de luz

A topografia de objetos sólidos pode ser examinada com grande facilidade, as micrografias têm aspecto

tridimensional;

Ataque de leveduras à Salmonella

Diferentes formas de grãos de pólen

MEV MET

�� CENTRIFUGAÇÃOCENTRIFUGAÇÃO

�� PermitePermite isolarisolar organelasorganelas dede homogeneizadoshomogeneizados celulares,celulares, paraparaanálisesanálises químicas,químicas, físicasfísicas ee biológicasbiológicas;;

SEPARAÇÃO DE ORGANELAS CELULARESSEPARAÇÃO DE ORGANELAS CELULARES

�� OO isolamentoisolamento dede umauma organelaorganela dependedepende dede::-- seuseu coeficientecoeficiente dede sedimentaçãosedimentação;;-- densidadedensidade ee viscosidadeviscosidade dada soluçãosolução..

�� CentrifugaçãoCentrifugação FracionadaFracionada;;

�� CentrifugaçãoCentrifugação ContraContra GradienteGradiente..

Para iniciar a purificação, inicialmente é necessário extrair a proteína de interesse

para um meio líquido, exceto se ela já estiver naturalmente presente em um meio

líquido (sangue, suor, água do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc).

células

Homogeneização

Material na

fonte

por ultra-som com

detergente

Vários métodos são

possíveis para transformar

células, órgãos, tecidos em

um homogenado, ou extrato

bruto, como mostra a figura.

tecidos

Homogeneização

(para romper tecidos e células)

por pressão

(prensa francesa)

liquefação

(Potter)

Homogenado

ou

Extrato bruto

Material de partida

Centrifugação FracionadaCentrifugação Fracionada

Centrifugação Contra GradienteCentrifugação Contra Gradiente

Cromatografia

• Separação de macromoléculas, como proteínas e ácidos nucléicos

• “Filtragem” de um macerado celular em uma matriz porosa, por meio da interação das macromoléculas com a matrizmacromoléculas com a matriz– Interação de Troca iônica: dependente de cargas

– Interação hidrofóbica

– Filtração em gel: dependente do tamanho e forma

– Interação por afinidade: enzima-substrato ou antigeno-anticorpo.

Cromatografia

Matriz

Tubos coletores

�� CromatografiaCromatografia dede TrocaTroca IônicaIônica

-A matriz da coluna cromatográfica écarregada + OU –

- Proteínas ligam ao suporte porinteração de carga.

�� CromatografiaCromatografia dede InteraçãoInteração HidrofóbicaHidrofóbica

- A matriz da colunacromatográfica é composta porpartículas com superfíciehidrofóbica;

- Proteínas hidrofóbicasinteragem com o suporte eretardam sua passagem.

Cromatografia Cromatografia de Filtração em Gelde Filtração em Gel

- A matriz da colunacromatográfica é composta porpartículas porosas, atuandocomo uma peneira para acomo uma peneira para apassagem de proteínas;

CromatografiaCromatografia dede AfinidadeAfinidade

- A matriz da colunacromatográfica é composta porantígenos (ou substratos paraenzimas) ligados;

- Proteínas ligam ao suportepor bioafinidade eespecificidade.

Eletroforese

DeterminaDetermina oo tamanhotamanho dasdasproteínasproteínas;;

IdentificaIdentifica fragmentosfragmentos dedediferentesdiferentes tamanhostamanhos dedeDNADNA clivadoclivado ouou sintetizadosintetizado..DNADNA clivadoclivado ouou sintetizadosintetizado..

SeparaçãoSeparação dasdasmacromoléculasmacromoléculas porpor cargacarga(+(+ ouou --)) ee tamanhotamanho (do(domaiormaior parapara oo menor)menor)

Proteínas de diferentes tamanhos e cargas

Fragmentos de DNA de diferentes tamanhos

-- HibridizaçãoHibridização exex situsitu

Resumindo... Existem diversas formas de se explorar a célula:

Ponto de vista morfológico: Microscopia

óptica fluorescência

eletrônica (transmissão e varredura)

Ponto de vista das organelas e seus constituintes:Ponto de vista das organelas e seus constituintes:

Centrifugação: isolamento de organelas

fracionada e com gradiente

Cromatografia: isolamento de macromoléculas

Troca iônica Interação hidrofóbica

Filtração em gel Afinidade

Eletroforese: análise das macromoléculas