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ANALÍTICA AVANÇADA – 2S 2011

Aula 6Aula 6

Espectrofotometria no Espectrofotometria no UVUV--VisVis

FLUORESCÊNCIA MOLECULARFLUORESCÊNCIA MOLECULAR

Prof. Rafael Sousa

Departamento de Química Departamento de Química -- ICEICErafael.arromba@ufjf.edu.brrafael.arromba@ufjf.edu.br

Notas de aula: www.ufjf.br/baccan

Luminescência xx Fluorescência Molecular

Sal cozinhaSal cozinha

Espectro de emissão obtido para uma amostra de “sal de cozinha”Espectro de emissão obtido para uma amostra de “sal de cozinha” 2

Perfil dos espectros de emissão

Espécies atômicasEspécies atômicas(gasoso)(gasoso)

Espectro de linhasEspectro de linhas

HH

HgHg

NeNe

Espécies molecularesEspécies moleculares(líquido, sólido ou gasoso)(líquido, sólido ou gasoso)

Espectro de bandasEspectro de bandas

Um espectro de emissão contínuas de bandas é constituído por muitas linhas Um espectro de emissão contínuas de bandas é constituído por muitas linhas próximas que são muito difíceis de próximas que são muito difíceis de serem serem resolvidasresolvidas

�� Um espectro de emissão (que pode ser de fluorescênc ia) está Um espectro de emissão (que pode ser de fluorescênc ia) está intimamente relacionado com a composição da amostra intimamente relacionado com a composição da amostra

(desde que as espécies emitam)(desde que as espécies emitam) 3

Perfil dos espectros de emissão

SÓLIDOSSÓLIDOS AQUECIDOS DÃO ORIGEM A AQUECIDOS DÃO ORIGEM A ESPECTROS DE EMISSÃO ESPECTROS DE EMISSÃO CONTÍNUOS:CONTÍNUOS:

Fenômeno radiativoFenômeno radiativodo “corpo negro”do “corpo negro”

As emissões observadas devemAs emissões observadas devem--se mais à se mais à temperatura aplicadatemperatura aplicada do que do que à composição dos materiaisà composição dos materiais

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Característica dos espectros de emissão

POTÊNCIA DA RADIAÇÃO EMITIDA É PROPORCIONAL À POTÊNCIA DA RADIAÇÃO EMITIDA É PROPORCIONAL À CONCENTRAÇÃO DAS ESPÉCIES QUE EMITEM CONCENTRAÇÃO DAS ESPÉCIES QUE EMITEM

P = kCP = kC Princípio da Princípio da análise quantitativaanálise quantitativa

Tinta branca com Tinta branca com 0,2 % m/v 0,2 % m/v de de branqueador ópticobranqueador óptico

Tinta branca com Tinta branca com 0,4 % m/v 0,4 % m/v de de branqueador ópticobranqueador óptico

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TIPOS DE Luminescência Molecular

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Sistemas Luminescentes

• Fotoluminescência

Fluorescência e a fosforescência: processos de excitação similares (absorção de fótons) MAS com decaimentos diferentesMAS com decaimentos diferentes

• Quimiluminescência

Emissão de luz formada no decorrer de uma reação química

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ENTENDENDO a FotoluminescênciaENTENDENDO a Fotoluminescência

Absorção: 10-14 a 10-15 s

Fluorescência: 10-5 a 10-8 s

Fosforescência: 10-4 a 10 s

Fluorescência Fosforescência

Estado Fundamental

Estado Excitado SingletoSingleto Estado Excitado TripletoTripleto

Fluorescência Fosforescência

Transições eletrônicas “permitidas” Transições eletrônicas “permitidas” �� Regras de seleção (Quântica)Regras de seleção (Quântica) 8

� A molécula pode voltar ao seu estado fundamental por uma combinação de várias etapas (processos de desativação):

� Processos radiativos

• Fluorescência � RELEVÂNCIA ANALÍTICA

Fosforescência• Fosforescência

� Processos não radiativos (aumento T do solvente)

• Relaxação vibracional

• Conversão interna

• Conversão externa (colisões)9

•• Pode ocorrer em sistemas químicos gasosos, líquidos e sólidosPode ocorrer em sistemas químicos gasosos, líquidos e sólidos

�������� TIPOS:TIPOS:

•• Fluorescência de ressonância:Fluorescência de ressonância:

��λλλλλλλλemisemis = = λλλλλλλλabsabs

(mais observada mais para espécies (mais observada mais para espécies atômicasatômicas que moleculares)que moleculares)

DETALHANDO a FotoluminescênciaDETALHANDO a Fotoluminescência

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•• Fluorescência com deslocamento StokesFluorescência com deslocamento Stokes: λ : λ emisemis > λ > λ absabs (fóton absorvido (fóton absorvido perde energia por inúmeras vibrações microscópicas)perde energia por inúmeras vibrações microscópicas)

DETALHANDO a FotoluminescênciaDETALHANDO a Fotoluminescência

Existem semelhanças Existem semelhanças entre os espectros de entre os espectros de

ExEx.: .: QuininaQuinina, tanto a absorção em 250 , tanto a absorção em 250 nmnm quanto em 350 quanto em 350 nmnm resultam na resultam na emissão em 450 emissão em 450 nmnm

entre os espectros de entre os espectros de excitação e o de absorção excitação e o de absorção (“imagens especulares”)(“imagens especulares”)

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FOTOLUMINESCÊNCIA EM DIAGRAMAS DE ENERGIA (Diagrama de Jablonski):

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Diagrama de Jablonski Simplificado

- “Overlap” de níveis eletrônicos- Não háNão há mudança de spin

- “Overlap” de níveis eletrônicos- HáHá mudança de spin

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Fenantreno: T1� S0 lenta 10-5 -10 s (fosforescência)

OutroOutro exex. (. (emissãoemissão nãonão ressonanteressonante):):

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Fatores que afetam a fluorescência

• Estrutura molecular– conjugação, rigidez, ...

DETALHANDODETALHANDO a Fotoluminescênciaa Fotoluminescência

– conjugação, rigidez, ...

• Ambiente químico– Concentração, pH, viscosidade, presença de O2

• Temperatura

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Ex.: Fluorescência e Estrutura

• A substituição em anéis aromáticos afeta a intensidade relativa de fluorescência e os valores

dos λmax de absorção/emissão

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• Empiricamente, observa-se que a rigidez da estrutura favorece a fluorescência.

Bifenil, Φ ≅ 0,2

Ex.: Fluorescência e Estrutura

Bifenil, Φ ≅ 0,2

Fluoreno, Φ ≅ 1 ΦZn-complexo >>> Φhidroxiquinolina

Rigidez ���� diminui a velocidade da relaxação não radiativa 17

• Estruturas aromáticas condensadas e/ou com alto grau de conjugação apresentam alta eficiência quântica

Ex.: Fluorescência e Estrutura

Heterocíclicos: não fluorescem

Heterocíclicos condensados fluorescem

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• Solvente e Temperatura

– Aumento de T ouou diminuição de viscosidadediminuição de viscosidade do solvente levam a um aumento no número de colisões e portanto aumenta a probabilidade de conversão externas (supressão colisional), diminuindo a “eficiência” da fluorescência

Sobre os outros farores que afetam:

colisional), diminuindo a “eficiência” da fluorescência

• pH

– A fluorescência de compostos aromáticos com funcionalidades ácidas ou básicas apresenta forte dependência com o pH.

• Ex.: anilina/anilínio e fenol/fenolato

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• Oxigênio dissolvido

– Oxigênio e outras espécies paramagnéticas tendem a diminuir a fluorescência pelo aumento do cruzamento intersistemas (fosforescência)

– Também é possível a oxidação da espécie

Sobre os outros farores que afetam:

– Também é possível a oxidação da espécie fluorescente

• Outras moléculas em solução

– Moléculas com átomos pesados (tetrabrometo de carbono e iodeto de etila) aumentam a velocidade de inversão de spin 20

Característica da Moléculas Luminescêntes

� Rendimento quântico ou eficiência quântica Φ:

É a razão entre o número de moléculas luminescentes e o número total de moléculas excitadase o número total de moléculas excitadas

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Intensidade de Fluorescência e Concentração

• A fluorescência é diretamente proporcional a concentração da espécie fluorescente, desde que em baixas concentrações (A < 0,05)

F = K.cF = K.c

• Desvios da linearidade:� Altas concentrações Altas concentrações

- Auto-supressão (quenching)

- Auto-absorção

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Intensidade de Fluorescência e Concentração

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Fluorescência e Análise Química

Métodos diretosMétodos diretos::

ANALITO + COMPLEXANTE ANALITO + COMPLEXANTE �� COMPLEXO FLUORESCENTECOMPLEXO FLUORESCENTE

Métodos Métodos inindiretosdiretos::

ANALITO ANALITO fluorecentefluorecente + REAGENTE + REAGENTE �� PRODUTO menos FLUORESCENTEPRODUTO menos FLUORESCENTE

Determinações inorgânicasDeterminações inorgânicas::

COMPLEMENTA a espectrofotometria no COMPLEMENTA a espectrofotometria no UVUV--VisVis pois a maioria dos metais de pois a maioria dos metais de transição geralmente não foram complexos fluorescentes (decaimento não transição geralmente não foram complexos fluorescentes (decaimento não radiativo muito eficiente), enquanto os outros metais podem formar produtos radiativo muito eficiente), enquanto os outros metais podem formar produtos fluorescentesfluorescentes

Aplicações para compostos orgânicos e inorgânicos:Aplicações para compostos orgânicos e inorgânicos:

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Fluorescência e Análise QuímicaAlguns exemplosAlguns exemplos

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Fluorescência e Análise Química

Determinações orgânicasDeterminações orgânicas: PRINCIPAL APLICAÇÃO: PRINCIPAL APLICAÇÃO

Ácidos Ácidos nucleicosnucleicos, alcalóides, aminoácidos, coenzimas, esteróis, , alcalóides, aminoácidos, coenzimas, esteróis, fármacosfármacos, flavonóides, metabólitos, porfirinas, proteínas, , flavonóides, metabólitos, porfirinas, proteínas, vitaminas, ...vitaminas, ...

Aplicações:Aplicações:

vitaminas, ...vitaminas, ...

Na detecção Na detecção de de cromatógrafoscromatógrafos e equipamentos de eletroforese e equipamentos de eletroforese capilar favorecendo a obtenção de capilar favorecendo a obtenção de LDsLDs de 10de 10--99 a 10a 10--1212 mol Lmol L--11 !!

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Instrumentação: Esquema Geral

•• Os componentes dos instrumentos para medir a Os componentes dos instrumentos para medir a fotoluminescência são fotoluminescência são similaressimilares aos encontrados nos aos encontrados nos fotômetros e espectrofotômetros UV/Visfotômetros e espectrofotômetros UV/Vis

•• MAS a fonte de radiação necessita ser MAS a fonte de radiação necessita ser mais intensa mais intensa que que aquelas utilizadas na absorção molecularaquelas utilizadas na absorção molecularaquelas utilizadas na absorção molecularaquelas utilizadas na absorção molecular–– arco de mercúrioarco de mercúrio–– arco de xenônioarco de xenônio--mercúriomercúrio–– laserslasers

•• A maioria dos equipamentos emprega a ótica de duplo feixe A maioria dos equipamentos emprega a ótica de duplo feixe para compensar flutuações na potência da fontepara compensar flutuações na potência da fonte�� EspectrofluorímetrosEspectrofluorímetros corrigidoscorrigidos

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Instrumentação: Esquema Geral

•• ComponentesComponentes similaressimilares a um a um UVUV--VisVis

•• “Detector” a 90 “Detector” a 90 oo emem relaçãorelação•• “Detector” a 90 “Detector” a 90 emem relaçãorelaçãoaoao feixefeixe incidenteincidente

•• ObservaObserva--se ambos se ambos ososespectrosespectros de de excitaçãoexcitação e e emissãoemissão

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Componentes da Instrumentação

•• Fontes de radiação Fontes de radiação -- LâmpadasLâmpadas

-- “Lasers” (sensibilidade)“Lasers” (sensibilidade)

•• XenônioXenônio:: produzproduz umum•• XenônioXenônio:: produzproduz umum

espectroespectro continuocontinuo entreentre

250250 ee 600600 nmnm tendotendo umum

máximomáximo aa 470470 nmnm

Espectro de emissão de uma lâmpada de Xenônio

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Fontes de radiação

•• MercúrioMercúrio::

-- AltasAltas pressãopressão:: máximosmáximos emem 365365,, 398398 nm,nm, ……,, 734734 nmnm..

-- BaixaBaixa pressãopressão:: máximomáximo emem 254254 nmnm..

Componentes da Instrumentação

Espectro de emissão de uma lâmpada de Mercúrio de alta pressão

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Componentes da Instrumentação

•• Filtros e monocromadoresFiltros e monocromadores

–– FluorímetrosFluorímetros x x EspectrofluorímetrosEspectrofluorímetros

•• Detectores (transdutores)Detectores (transdutores)

–– FotomultiplicadorasFotomultiplicadoras

–– Arranjo de diodos...Arranjo de diodos...31

Metodologias: Absorção vs Emissão

MétodoMétodo LimiteLimite de de detecçãodetecção(mol L(mol L--11))

CustoCusto VantagemVantagem

UVUV--VisVis 1010--55 a 10a 10--88 “universal”“universal”UVUV--VisVis 1010--55 a 10a 10--88 “universal”“universal”

FluorescênciaFluorescência 1010--77 a 10a 10--99 Gama Gama seletaseletade de espéciesespécies

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Para responder na aula

6.1)6.1) Que fatores físicos levam uma espécie química Que fatores físicos levam uma espécie química (atômica ou molecular) emitir radiação?(atômica ou molecular) emitir radiação?

6.2)6.2) Por que a fluorescência é mais utilizada na análise Por que a fluorescência é mais utilizada na análise química do que a química do que a fosforecênciafosforecência??química do que a química do que a fosforecênciafosforecência??

6.3)6.3) O comprimento de onda de fluorescência é, exceto O comprimento de onda de fluorescência é, exceto na emissão de ressonância, sempre maior que o de na emissão de ressonância, sempre maior que o de excitação (ou de absorção)?excitação (ou de absorção)?

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Bibliografia consultada

�� “Análise Instrumental”“Análise Instrumental”F Cienfuegos, D Vaitsman; 2000

�� ““VogelVogel -- Análise Química Quantitativa” Análise Química Quantitativa” GH Jeffrey e col., 6a ed., Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2002

�� ““PrinciplesPrinciples ofof Instrumental Instrumental AnalysisAnalysis””�� ““PrinciplesPrinciples ofof Instrumental Instrumental AnalysisAnalysis””DA Skoog, FL Holler, TA Nieman; 5th ed., 1998

�� “Análise Química Quantitativa”“Análise Química Quantitativa”D. Harris; 7 a ed., 2008

�� Tutoriais de fabricantes de espectrofotômetrosTutoriais de fabricantes de espectrofotômetros

�� Slides didáticos fornecidos pelo Prof. Dr. Renato Slides didáticos fornecidos pelo Prof. Dr. Renato RossetoRosseto (UFG)(UFG)

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