Cinética 2 [Modo de Compatibilidade] · CINÉTICA ENZIMÁTICA Padronização de Ensaios...

CATÁLISE ENZIMÁTICA

CINÉTICAEquilíbrio e Estado Estacionário

Tempo

Velocidade: período inicial

CINÉTICAControle da velocidade de reações

As medidas de velocidade inicial (v0) são obtidas com a variação da concentração de S

Obtenção de várias medidas de v0 para a construção de um gráfico

Determinação da inclinação (tangente) A análise gráfica leva a determinação de vários

parâmetros cinéticos

PRODUTO

FORMADO

PRODUTO

FORMADO

PRODUTO

FORMADO

Tempo

Velocidade: período inicial

CINÉTICAControle da velocidade de reações

Vo refere-se a quantidade de produto formado na unidade de tempo

O ensaio envolve a adição de todos oscomponentes, incluindo S e E

Após a adição da E, a absorbância (Abs) é monitorada em função do tempo

Abs vs tempo pode ser monitorada e a inclinação determinada

Inclinação = Abs/unidade de tempo (min) Lembrar: A = cl (mudança [P])

Determinação da velocidade inicial de uma reação catalisada por enzima a partir da inclinação instantânea em t = 0 no consumo de substrato ou formação do produto

[S]

Tempo

[P]

Tempo

CINÉTICAControle da velocidade de reações

CINÉTICAControle da velocidade de reações

Gráfico da conversão de S em P, na reação catalisada por uma enzima

Considerações Importantes:

A enzima deve permanecer estável no curso de tempo de todas as

medidas cinéticas

As taxas iniciais são usadas como medidas de velocidades de reação

A velocidade de reação não pode ser dependente da concentração de

enzima

A produção de produto é linear com o tempo durante o tempo de

intervalo usado

CINÉTICAControle da velocidade de reações

A concentração de substrato excede em muitas vezes a concentração de

enzima, ou seja, a concentração de S é praticamente constante durante

o ensaio

Uma única enzima é capaz de formar um produto

Não existe produção considerável de produto na ausência de enzima

Não existe cooperatividade. A ligação do substrato ao sítio de ligação na

enzima não influencia a afinidade ou atividade de um sítio adjacente

Nem substrato nem produto atuam como moduladores alostéricos ou

alteram a velocidade de reação enzimática

CINÉTICAControle da velocidade de reações

CINÉTICA ENZIMÁTICAConstantes Cinéticas

kcat

kcat/KM

KM

½Vmax

v0

MEDIDASCINÉTICAS

CINÉTICA ENZIMÁTICAConstantes Cinéticas

É a constante de Michaelis-Menten, que se refere à concentraçãode substrato necessária para atingir a metade da Vmax na reaçãoenzimática, em condições de saturação de S. O KM representa aconcentração de S na qual metade dos sítios ativos da enzimaencontra-se saturado por moléculas de S, no estadoestacionário. KM é uma constante de dissociação aparente e estárelacionada com a afinidade da enzima pelo S, sendo o produtode todas as constantes de equilíbrio e dissociação até a etapairreversível da reação. Quanto menor o valor de KM, maior será aafinidade da enzima pelo S.

O valor de KM varia consideravelmente de uma enzima paraoutra, e de uma enzima em particular, para S diferentes. Seuvalor é expresso em concentração molar (e.g., M, mM, µM).

KM

CINÉTICA ENZIMÁTICAConstantes Cinéticas

É uma constante de velocidade de primeira ordem quecorresponde à etapa mais lenta da reação catalítica. O valor dekcat é referido como o número de ciclos ou renovação (termo doinglês, turnover number), que corresponde ao número máximode mols de S convertidos em P por mols de enzima por unidadede tempo (e.g., define o número de ciclos catalíticos que ocorrepor unidade de tempo). Esta condição é encontrada somentequando a enzima está saturada pelo S.

O valor de Vmax é expresso em concentração molar de S ou P porunidade de tempo (e.g., M/min, µM/min), ao passo que kcat emtempo (e.g., min-1, s-1).

kcat

CINÉTICA ENZIMÁTICAConstantes Cinéticas

Essa razão define a eficiência catalítica de uma enzima e possuiunidades de velocidade de segunda ordem. É bastante utilizadapara avaliar a eficiência de diferentes enzimas, bem como paracomparar o emprego de diferentes S para uma enzima emparticular. A especificidade do S resulta preferencialmente dediferenças no estado de transição da reação catalisada emcomparação as interações de ligação do estado fundamental. Arazão kcat/KM reflete os efeitos de S nas duas constantescinéticas e fornece um limite menor para a constante develocidade de segunda-ordem e ligação do S.

kcat/KM

Medida Direta da eficiência da enzima na transformação do substrato

Kcat/KM : Eficácia na transformação do substrato ligadoEficiência na ligação do substrato

CINÉTICA ENZIMÁTICAParâmetros Cinéticos

KM

kcat/KMv0

Vmax

UNIDADES

µM s-1

µM

kcat s-1

µM-1s-1

µM s-1

A velocidade de uma reação enzimática depende da concentração deenzima

Podemos observar este efeito através de um gráfico das curvas deformação de P na presença de concentrações crescentes de enzima (ondea concentração de S é mantida constante)

CINÉTICAControle da velocidade de reações

CINÉTICA ENZIMÁTICAPadronização de Ensaios

Formação de P em função de concentrações crescentes de enzima

CINÉTICA ENZIMÁTICAPadronização de Ensaios

Efeito da concentração de enzima na velocidade inicial de reação catalisada por enzima

Verifica-se que vo cresce linearmente com a concentração de enzima em condições padrões de reação.(no intervalo de [E] = 8 [E1])

O efeito da variação da concentração de S na velocidade de reaçãotambém é um fator importante a ser considerado no controle dereações enzimáticas.

Podemos observar este efeito através de um gráfico das curvas deprogresso de formação de P em função de concentrações crescentesde S, onde a concentração de enzima é mantida constante.

CINÉTICAControle da velocidade de reações

CINÉTICA ENZIMÁTICAPadronização de Ensaios

Formação de P em função de concentrações crescentes de substrato

CINÉTICA ENZIMÁTICAPadronização de Ensaios

Efeito da concentração de S na velocidade inicial de reação catalisada por enzima

A variação de v0 em função da concentração de S émostrada na Figura, cuja representaçãocaracterística é de uma hipérbole. Cada medida dev0 é determinada experimentalmente através dasinclinações dos gráficos de concentração de P emfunção do tempo.

Podem ser identificadas três regiões distintas nacurva de progresso de reação. Na primeira região,em concentrações muito baixas de S ([S] < 0,01KM), a velocidade apresenta um perfil cinético deprimeira ordem. Com o aumento na concentraçãode S, em uma região intermediária do gráfico, avelocidade apresenta uma dependência curvilíneaem relação à concentração de S. Na terceira regiãodo gráfico, observa-se a ocorrência de um patamarmáximo caracterizado por altas concentrações de S,com perfil cinético de ordem zero, no qual v0 éindependente da concentração de S. Neste ponto, aenzima encontra-se saturada pelo S, e v0 torna-seigual à velocidade máxima (Vmax).

CINÉTICA ENZIMÁTICAPadronização de Ensaios

Em 1913, Leonor Michaelis e Maud Menten demonstraram que as reaçõesenzimáticas ocorrem em duas etapas.

Na primeira etapa, ocorre a formação de um complexo E●S, ao passo que, emuma segunda etapa, observa-se a dissociação deste complexo para a formação deP e a liberação da enzima livre. Este modelo assume que as reações cinéticas sãoconduzidas sob condições experimentais do chamado estado estacionário (doinglês, steady-state), que se refere ao intervalo de tempo no qual o complexo E●Sé mantido em um nível constante elevado.

Em outras palavras, o equilíbrio entre enzima, S, e E●S é estabelecido de formamuito rápida em relação à reação subsequente sofrida pela espécie de E●S. Assim,o complexo E●S estará em equilíbrio com a enzima e S, o que significa que k1 >>k-1 e k2.

CINÉTICA ENZIMÁTICAPadronização de Ensaios

Representação gráfica do equilíbrio rápido entre enzima, S, e E•S, no estadoestacionário (a corresponde ao período de indução e b a vo).

CINÉTICA ENZIMÁTICAPadronização de Ensaios

As análises cinéticas no estado estacionário permitem uma interpretaçãoconveniente do curso de reações enzimáticas, sendo alcançada no laboratório emcondições experimentais apropriadas, mantendo-se a concentração de S emgrande excesso em relação à concentração de enzima ([S] >> [E0]). Desta forma,a enzima está presente em quantidades catalíticas e a variação da concentraçãode S (consumo) pode ser considerada desprezível. O gráfico da figura anteriormostra que as inclinações das curvas de progresso de enzima e E•S podem serconsideradas desprezíveis (com exceção de um breve período de indução daordem de milésimos de segundo).

Isso indica que estas espécies podem ser consideradas constantes na unidade detempo (sendo [S] >> [E]T, onde [E]T é a concentração total de enzima).

A equação abaixo apresenta uma descrição quantitativa do esquema de Michaelis-Menten sob condições do estado estacionário, que pode ser caracterizadagraficamente por uma curva de reação na forma de uma hipérbole.

Equação de Michaelis-Menten para a velocidade de reação catalisada por uma enzima.

CINÉTICA ENZIMÁTICAPadronização de Ensaios

CINÉTICA ENZIMÁTICAPadronização de Ensaios

Determinação experimental de KM e Vmax na cinética de Michaelis-Menten

Embora a interpretação destegráfico seja relativamente simples,existem tratamentos matemáticos egráficos que permitem a obtençãorápida dos parâmetros cinéticos. Ométodo tradicional baseia-se narepresentação linear da equação deMichaelis-Menten através de umareta do tipo y = ax + b

Gráfico da velocidade inicial versus concentração de substrato para uma reação catalisada por uma enzima. Regiões de reação de primeira ordem e de ordem zero apresentam dependência linear e independência da concentração de substrato, respectivamente

CINÉTICAControle da velocidade de reações

Vel

ocid

ade

(nM

min

-1)

Região de ordem zero

Região de primeira ordem

CINÉTICA ENZIMÁTICAPadronização de Ensaios

Recíproco da equação de Michaelis-Menten

Este tratamento dá origem a um gráfico de 1/vo (em y) em função de 1/[S] (em x)com uma reta de inclinação igual a KM/Vmax, que intercepta o eixo de ordenadas noponto 1/Vmax e o eixo das abcissas no ponto -1/KM

Este gráfico, chamado de Lineweaver-Burk ou de duplo-recíproco (i.e., umarepresentação gráfica dos recíprocos de vo e [S]), permite a determinação simples edireta de Vmax e KM, parametros que só poderiam ser estimados por aproximação apartir do gráfico de Michaelis-Menten. O valor de kcat, por sua vez, pode ser obtidodividindo-se Vmax pela concentração de enzima empregada nos experimentos (kcat =Vmax/[E]).

CINÉTICA ENZIMÁTICAPadronização de Ensaios

CINÉTICA ENZIMÁTICAPadronização de Ensaios

kcat = Vmax/[ET]

Este gráfico, chamado deLineweaver-Burk ou de duplo-recíproco (i.e., umarepresentação gráfica dosrecíprocos de vo e [S] deacordo com a equaçãoanterior), permite adeterminação simples e diretade Vmax e KM, parâmetros quesó poderiam ser estimados poraproximação a partir dográfico de Michaelis-Menten. Ovalor de kcat, por sua vez,pode ser obtido dividindo-seVmax pela concentração deenzima empregada nosexperimentos.