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Métodos rápidos para a determinação de agrotóxicos em insumo farmacêutico ativo vegetal

Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) Departamento de Química, Setor de Química Analítica

Centro de Pesq. em Cromatografia e Espectrometria de Massas (CPCEM)

Laboratório de Análises de Resíduos de Pesticidas (LARP)

Renato Zanella

LARP-UFSM (www.ufsm.br/larp)

Universidade Federal de Santa Maria (UFSM)

Centro de Pesq. em Cromatografia e Espectrometria de Massas (CPCEM)

Laboratório de Análises de Resíduos de Pesticidas (LARP)

Renato Zanella, Martha B. Adaime, Osmar D. Prestes

LARP

http://www.ufsm.br/larp

UFSM Total estudantes: 29055

Pós-graduação: 4980 (161 PPGQ)

LARP-UFSM: acreditado CGCRE/INMETRO - ISO/IEC 17025

Atuação: Desenvolvimento e aplicação de métodos para determinação de

agrotóxicos, medicamentos veterinários, hormônios, PCBs, fármacos,

Poluentes emergentes, POPs ... em alimentos, amostras ambientais ...

Áreas de interesse/Cooperações: Química, Agronomia, Alimentos, Saúde,

Veterinária, Biologia, Bioquímica, Engenharia Ambiental ...

3

Rede de Laboratórios de Resíduos e Contaminantes (RRC) Instituída pela Portaria Interministerial MAPA/MCT nº 902, de 22.09.2008.

Capacitação de laboratórios de ensaio e análise de resíduos e contaminantes em

produtos de origem vegetal e animal, destinados a consumo e processamento

contribuindo para a estruturação prioritária do Plano Nacional de Controle de Resíduos

e Contaminantes (PNCRC) e outros planos e programas oficiais, de forma a ampliar a

oferta de serviços e pessoal capacitado na área de resíduos e contaminantes

atendendo às normas internacionais.

Rede Nacional de Análises de Alimentos (RENALI) Chamada Pública MCT/FINEP - Ação Transversal - SIBRATEC - 01/2008.

Composta por 71 laboratórios. O Núcleo de Coordenação da RENALI-SIBRATEC possui

um representante da região Nordeste (LACEN-PE), um da região Sudeste (IAL-SP), e

representantes da região Sul (CIENTEC, UFSM/LARP e SENAI-SC).

O objetivo principal é apoiar as Micro, Pequenas e Médias empresas no atendimento às

demandas de prestação de serviço de metrologia, normalização e avaliação de

conformidade, visando a superação de exigências técnicas para o acesso aos

diferentes mercados, a proteção a saúde, assim como para atender demandas

estratégicas para o desenvolvimento do país.

4

“insumo farmacêutico ativo vegetal (IFAV): matéria prima

ativa vegetal, ou seja, droga ou derivado vegetal, utilizada no

processo de fabricação de um fitoterápico”

AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA

DIRETORIA COLEGIADA

RESOLUÇÃO - RDC N 26, DE 13 DE MAIO DE 2014

Dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos e o registro

e a notificação de produtos tradicionais fitoterápicos.

5

O Codex Alimentarius define agrotóxico como sendo

toda e qualquer substância utilizada com o propósito

de prevenir, destruir, atrair, repelir ou controlar

qualquer peste, incluindo espécies indesejáveis de

plantas ou animais

Agrotóxicos

http://www.codexalimentarius.net/pestres/data/reference/glossary.html

Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (FAO)

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Um pouco da história dos agrotóxicos

• Romanos, Gregos – enxofre e arsênio (insetos)

• Séculos XVI-XIX – Nicotina e piretro

• 1939 – Síntese do DDT. Combate malária, tifo, piolhos

• 1943 – Início da Revolução Verde: incremento no uso de

fertilizantes, irrigação e agrotóxicos - produtividade

aumentou.

• Organoclorados: proibidos desde 1970 na Suécia e

desde 1985 no Brasil.

7

1962: "Primavera Silenciosa“ de Rachel

Carson. Amplo uso do DDT poderia ser a

principal causa da redução populacional de

diversas aves. Primeira manifestação ecológica

contra o uso indiscriminado do DDT.

Organoclorados

Organofosforados

Carbamatos

Piretróides

Sulfoniluréias

Triazinas

…

Diferentes

propriedades

físico-químicas

> 1000 compostos > 100 classes

AGROTÓXICOS

8

Agrotóxicos AGRICULTURA

CONTAMINAÇAO DOS ALIMENTOS E MEIO

AMBIENTE

9

Como o meio ambiente é

contaminado por agrotóxicos ?

10

Deriva, evaporação/precipitação, uso indevido

APLICAÇÃO DIRETA

CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL

11

Aspectos toxicológicos

Aspectos econômicos

12

Por que analisar resíduos e contaminantes

em alimentos e fitoterápicos?

Como analisar resíduos e contaminantes em

alimentos e em amostras ambientais?

Necessidade: Desenvolvimento de métodos sensíveis e abrangentes

(com inclusão de novos compostos) para determinação de resíduos e

contaminantes em matrizes diversas. Grande desafio atual !!!

13

Esquema genérico de uma análise

entrada saída

Informação

inicial

Coleta de

amostra

Preparo de

amostra Análise

cromatográfica

Análise

dos dados

Resultado

analítico

processo

HPLC, GC ...

14

• Desejável:

• Rápido

• Sensível

• Barato

• Fácil

Rapidez

Sensibilidade Custo

Facilidade

Desafio Analítico no Desenvolvimento de Métodos

15

16

Parte I Fundamentos do Preparo de Amostras

Cap. 1 - Introdução ao preparo de amostras

Cap. 2 - Princípios básicos do preparo de amostras

Cap. 3 - Precipitação de proteínas e hidrólise de conjugados

Cap. 4 - Planejamento de experimentos aplicado ao preparo de amostras

Parte II Técnicas Clássicas ou Convencionais

Cap. 5 - Extração líquido-líquido

Cap. 6 - Extração por headspace

Cap. 7 - Filtração e diálise

Parte III Técnicas de Extração em Fase Sólida

Cap. 8 - Princípios da extração em fase sólida

Cap. 9 - Dispersão da matriz em fase sólida

Cap. 10 - Preparo de amostras empregando polímeros de impressão molecular

Cap. 11 - Preparo de amostras empregando meios de acesso restrito (RAM)

Parte IV Técnicas Miniaturizadas

Cap. 12 - Microextração em gota única, imersão direta, headspace, microextração líquido-líquido-líquido

Cap. 13 - Microextração em gota diretamente suspensa e microextração em gota sólida

Cap. 14 - Microextração líquido-líquido dispersiva

Cap. 15 - Microextração em fase líquida com fibras ocas

Cap. 16 - Microextração em fase sólida

Cap. 17 - Microextração sortiva em barra de agitação

Cap. 18 - Microextração em sorvente empacotado (MEPS)

Parte V Técnicas Mecanizadas/Automatizadas

Cap. 19 - Técnicas com acoplamento e comutação de colunas

Cap. 20 - Automação do preparo de amostras em sistemas de análises em fluxo

Cap. 21 - Microextração em fase sólida no capilar acoplada à cromatografia líquida (in-tube SPME-LC)

Parte VI Outras Técnicas

Cap. 22 - Extração por fluido supercrítico (SFE)

Cap. 23 - Preparo de amostra empregando campo elétrico

Cap. 24 - QuEChERS

Cap. 25 - Preparo de amostras aplicado a biomacromolécula

Preparo de Amostras para Análise de Compostos Orgânicos. LTC, RJ, 2015

Preparo de amostra

GC-MS/MS e LC-MS/MS

Cromatografia acoplada à Espectrometria de Massas em série

limpeza do extrato

(clean-up)

Extração

17

Determinação de resíduos de agrotóxicos, medicamentos veterinários,

hormônios, PCBs, POPs ... em alimentos e amostras ambientais

Evolução dos Métodos Multirresíduo

Demanda crescente em analisar

um maior número de compostos

Reduzir o custo das análises

Grande variedade de matrizes

Desenvolvimento de Métodos

Multirresíduo Abrangentes

18

19

LC-MS/MS (triple quadrupole)

LC QTOF MS

(quadrupole time-of-flight)

Determinação de resíduos de agrotóxicos, medicamentos veterinários,

hormônios, PCBs, POPs ... em alimentos e amostras ambientais

GC-MS (ion trap) GC-MS/MS (triploquadrupole)

GC-ECD/NPD

20

Determinação de resíduos de agrotóxicos, medicamentos veterinários,

hormônios, PCBs, POPs ... em alimentos e amostras ambientais

21

Muito importante: equipe capacitada para estabelecer e aplicar métodos

multirresíduo de análise em diversas matrizes

Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de

Massas em série (LC-MS/MS)

22

Técnicas de Análise

Técnicas de Análise

Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de

Massas em série (GC-MS/MS)

Impacto Eletrônico Cromatografia Gasosa

23

Quantificação por LC-MS/MS

2.5 3.0 3.5 4.0 minutes

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

MCounts

Metomil

Tiametoxam

1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 minutes

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00 2A

175 200 225 250 275 m/z

0%

25%

50%

75%

100%

181

211

292

1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 minutes

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

MCounts

90 100 110 120 130 140 150 160 m/z

0%

25%

50%

75%

100%

88 106

163

24

qualidade necessária,

confiabilidade GARANTE

Validação de Métodos Analíticos

LINEARIDADE

PRECISÃO

EXATIDÃO

LOD / LOQ

EFEITO MATRIZ

ROBUSTEZ 25

Matrix effect

0

100000000

200000000

300000000

400000000

500000000

600000000

700000000

800000000

900000000

0 50 100 150 200

Carne suína

Fígado suíno

Carne de frango

Filé de peixe

Analytical curves from salbutamol prepared in solvent

and in blank matrix extract

LC-MS/MS

in solvent

26

Matrix effect

Solvent standard

Matrix matched

0

50000000

100000000

150000000

200000000

250000000

300000000

0 50 100 150 200

Are

a (

co

un

ts)

Concentration (µg L-1)

Solvent curve

Matrix matched

Comparison of the analytical curves obtained in solvent and in the

blank of the matrix for bisphenol A, as well as its chromatograms

GC-MS/MS

27

Revisões do método QuEChERS

28

Revisões do método QuEChERS

p. 355 – 379, 2012

Renato Zanella, Osmar D. Prestes, Caroline do A.

Friggi, Manoel L. Martins, Martha B. Adaime (2012).

An Overview About Recent Advances in Sample

Preparation Techniques for Pesticide Residues

Analysis in Cereals and Feedstuffs, Pesticides -

Recent Trends in Pesticide Residue Assay, Dr. R.P.

Soundararajan (Ed.), ISBN: 978-953-51-0681-4,

InTech, DOI: 10.5772/48752.

29

2003 (Original) 2007 (AOAC 2007.01) 2008 (CEN 15662)

Anastassiades et al. Lehotay et al. Anastassiades et al.

QuEChERS methods

Si NHNHPSA

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Extração em Fase Sólida Dispersiva (d-SPE)

NÃO NECESSITA:

Cartuchos e tubos coletores

Sistema de vácuo/pressão

Condicionamento

Controle de vazão

Solvente para eluição

Não há evaporação do solvente

Sulfato de Magnésio Remove o excesso de água da amostra

Amina primária/

secundária (PSA)

Remove ácidos orgânicos, ácidos graxos,

açúcares e pigmentos Antociânicos

Sorvente C18 Remove gorduras, esteróis e outros interferentes

não polares

Carbono Grafitizado

(GCB)

Remove os pigmentos da amostra

Remove pesticidas planares !!!

Sais e Sorbentes utilizados em d-SPE

31

32

Extração em Fase Sólida Dispersiva (d-SPE)

Seleção depende do tipo de amostra

33

Exemplos de métodos analíticos

desenvolvidos no LARP-UFSM

34

35

Mariela S. Viera, Tiele M. Rizzetti, Manoel L. Martins,

Osmar D. Prestes, Martha B. Adaime, Renato Zanella

In this study, the QuEChERS method followed by ultra-high performance

liquid chromatographic coupled to tandem mass spectrometry (UHPLC–

MS/MS) was developed for the determination of 73 pesticides in different

types of plants. A modified QuEChERS method optimized by a 23 full factorial

design was established. Results presented satisfactory recoveries that

ranged from 66 to 120%, with relative standard deviations (RSDs) ≤ 20%. The

method shown limits of detection (LOD) between 4.8 to 48 µg kg-1 and limits

of quantification (LOQ) between 16 to 160 µg kg-1. The proposed method was

applied to different kinds of plants and 20 pesticides residues were found and

quantified.

Multiresidue analysis of pesticides in plants by

QuEChERS method and ultra-high performance liquid

chromatography coupled to tandem mass spectrometry

Prof. Dr. Renato Zanella

SIMULTANEOUS DETERMINATION OF PESTICIDES AND ANTIBIOTICS RESIDUES

IN HONEY SAMPLES BASED ON ULTRA-HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY-TANDEM MASS SPECTROMETRY

Federal University of Santa Maria (UFSM)

Chemistry Department, Santa Maria - RS, Brazil

Research Center for Chromatography and Mass Spectrometry

Laboratory of Analysis of Pesticides Residues

36

37

Pesticides and antibiotics bees honey

Introduction

Pesticides, like neonicotinoids (imidacloprid, clothianidin, thiamethoxam, …), are

harmful to bees. They are associated with colony collapse disorder, resulting in low

pollination of food crops leading to a decrease of production.

Antibiotics, like macrolides and sulfonamides, are applied in bee colonies for the

treatment of bacterial diseases, leading to high residues in honey.

Goals

38

• Development and validation of a multiresidue method for

simultaneous determination of pesticides and antibiotics in honey

Modified QuEChERS for sample preparation

Determination by ultra-high performance liquid chromatography

with tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS)

• Method application in honey samples from different regions.

Experimental

39

Acephate Clorpirifós

etílico

Etrimfós Isoxaflutol Oxadixil Propoxur Tilosina

Acetamiprid Clorpirifós

metílico

Fempropatrina Lincomicina

cloridrato

Paraoxon

etílico

Salinomicin Tolclofós

metílico

Atrazine Clotianidina Fempropimorfe Linurom Ppenconazol Simazine Triadimefom

Azinfós etílico Diclorvós Fenarimol Malationa Picoxistrobina Sulfacloropiridazina Triazofós

Azinfós

metílico

Dietofencarbe Fipronil Mepaniprim Piraclostrobina Sulfadiazina Triclorfom

Azoxistrobina Difenoconazol Flusilazol Mepronil Pirazofós Sulfadimetoxina Trifloxistrobin

Boscalida Dimetoato Flutolanil Metacrifós Piridato Sulfametazina Triflumizol

Bromofós

etílico

Dimoxistrobina Fluvalinato Metalaxil Pirimetanil Sulfametoxazol

Carbaril Diniconazol Fosmet Metidationa Pirimicarbe Sulfaquinoxalina

Cardendazim Diurom Furazolidona Metolaclor Pirimifós etílico Sulfatiazol

Carbofuram Emamectina

benzoato

Hexaconazol Metsulfurom

metílico

Pirimifós

metílico

Tebuconazol

Carbofuram 3-

OH

Epoxiconazol Imazalil Mevinfós Profenofós Terbutilazina

Carboxim Eritromicina

ABC

Imidacloprid Monolinurom Profoxidim Tiacloprido

Ciproconazol Etofenprox Iprovalicarbe Ometoato Propargito Tiametoxam

79 pesticides and 13 antibiotics

40

UHPLC-MS/MS Xevo TQ Waters conditions

Column Acquity UPLC BEH C18 (100 x 2.1 mm, 1.7 μm);

ESI+/ESI-, capillar voltage: 2 kV;

Dessolvatation temperature: 500 °C;

Dessolvation gas (N2): 600 L h-1;

Spray flow-rate: 80 L h-1;

Colission gas (argon): 0.15 mL min-1;

Source temperature: 150 °C;

Injection volume: 10 μL.

Experimental

41

UHPLC-MS/MS parameters (SRM transitions, ...)

42

Evaluation of sample preparation

40 °C, 5 min

atrazine d5, Vortex 2 min

4 g MgSO4 +

1 g NaCl +

0.5 g C6H6Na2O7 1,5 H2O +

1 g C6H5Na3O7 2H2O

d-SPE Clean-up

PSA

C18

Oasis HLB

Florisil

5 mL McIlvaine buffer 0.1 mol L-1, pH 4

+ 5 mL acetonitrile

5 g sample

Vortex 2 min

Centrifugation

(2137 x g, 6 min)

Vortex 2 min

Spike

Experimental

Factorial design

EDTA, citric acid and

Na2HPO4 in water

Modified

QuEChERS

Results and discussion

43

Clean-up efficience with different sorbents

3328

2218

6

16

1

39

47 50

6067

72

86

2017 20

1419

4 5

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Com

posto

s

R < 70% R 70-120% R > 120%

C18

PSA + C18

Florisil + C18

PSA + Florisil

OASIS HLB

PSA

Florisil

Nu

mb

er

of

co

mp

ou

nd

s

44

The proposed method

Results and discussion

45

• The developed method was effective for simultaneous

determination of pesticides and antibiotics in honey samples.

• Detection of the compounds using UHPLC-MS/MS provided

good sensitivity and selectivity.

• Method LOD from 0.03 to 0.6 μg kg-1

• The main feature is the simplicity in the execution of sample

preparation, combined with low solvent consumption and cost.

Conclusions

Resíduos de 74 agrotóxicos 46

DETERMINAÇAO DE RESÍDUOS DE AGROTÓXICOS EM SUCO DE LARANJA

Resíduos de 40 compostos 48

Resíduos de 81 agrotóxicos

49

50

51

AGROTÓXICOS E COMPOSTOS RELACIONADOS EM AR:

TRAPEAMENTO EM SORVENTE POLIMÉRICO E USO DE GC-MS/MS

Samile Martel, Manoel L. Martins, Renato Zanella

Lab. de Análises de Resíduos de Pesticidas (LARP)

Depto. de Química, Univ. Federal de Santa Maria

Degradação química

Degradação biológica

APLICAÇÃO DE AGROTÓXICOS

INTRODUÇÃO

MANUAL

PULVERIZAÇÃO

MECÂNICA

AÉREA

TERRESTRE

MECÂNICA

TERRESTRE

Volatilização

Deriva

Lixiviação

Escoamento superficial

Transporte Transformação

Volatilização durante e após a aplicação.

Perda de 30 a 50% na aplicação

53

DISPOSITIVO DE AMOSTRAGEM

54

LOQ do método: 3 μg m-3 (34 compostos)

6 μg m-3 (14 compostos)

GC-MS/MS

48 AGROTÓXICOS E COMPOSTOS RELACIONADOS

http://www.ufsm.br/ppgq

55

www.redracal.org

Presidida pelo LARP-UFSM

Membro do Comitê Executivo

www.ufsm.br/larp

renato.zanella@ufsm.br

Obrigado!