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Eletroforese de DNA

Gabriel M. Matos

Nicolas Conceição

Eletroforese

• Usada para separar, identificar e purificar fragmentos de DNA;

• Bastante sensível, capaz de detectar até 20 pg de DNA;

• Permite a recuperação dos fragmentos após a separação.

Eletroforese em gel de agarose

Eletroforese em gel de agarose

Etapas da eletroforese

1) Preparo do Gel

Agarose ou Poliacrilamida

2) Migração

3) Visualização dos fragmentos

Tipos de géis

Agarose: Separa fragmentos de tamanhos muito distantes (100 –

3.000 pb)

Poliacrilamida: Maior resolução. Separa fragmentos com até 1 pb

de diferença.

A escolha da matriz de separação usada depende

principalmente do tamanho dos fragmentos analisados.

Tipos de géis

Agarose: polímero linear composto por resíduos de galactose

unidos por ligações glicosídicas.

Tipos de géis

Algas rodophytas utilizadas na extração do ágar

A porcentagem utilizada é medida em peso/volume

Tipos de géis

A agarose não é solúvel em temperatura ambiente e precisa ser aquecida e

resfriada para formação do gel (Gelificação)

32 - 45°C80 - 95°C

Tipos de géis

Concentração do

gel ( w/v %)

Faixa de separação

de DNA (kb)

0.3 5 – 60

0.6 1 – 20

0.7 0.8 – 10

0.9 0.5 – 7

1.2 0.4 – 6

1.5 0.2 – 3

2.0 0.1 – 2

Sambrook et al., “Molecular Cloning” 3 ed - 2000

1% 0,3%

Tipos de géis

Tipos de tampões

Solução Tampão:

• Manter pH estável (H+ e OH- podem influenciar na carga líquida

da molécula)

• Maior força iônica (carrega mais corrente que a água)

Tipos de tampões

• Tris-Acetato e EDTA – TAE

• Tris-Borato e EDTA - TBE

• Tris-Fosfato e EDTA - TPE

Qual escolher??

Tipos de tampões

• Tris-Acetato e EDTA – TAE

Melhor resolução para fragmentos maiores.

• Tris-Borato e EDTA - TBE

• Tris-Fosfato e EDTA - TPE

Tipos de tampões

Diferença entre gel feito com Tampão e Água

Tipos de tampões

• Gel-Loading Buffer: usado para aumentar a densidade da

amostra e dar cor a amostra;

Azul de Bromofenol (migra mais rápido)

Xileno Cianol

Sacarose / Glicerol / Ficoll

Tipos de tampões

Corrida

Corrida

Os ácidos nucleicos apresentam

uma carga líquida negativa.

Com aplicação de uma corrente

elétrica eles migram em direção

ao polo positivo

Corrente elétrica

Corrida

Corrida

Migração

Fatores que influenciam a migração em um gel de agarose:

• Tamanho da molécula de DNA;

Migração

Fatores que influenciam a migração em um gel de agarose:

• Tamanho da molécula de DNA;

• A concentração de Agarose;

Poliacrilamida

Poliacrilamida: Formado pela polimerização de monômeros de

acrilamida e bis-acrilamida.

Maior poder de resolução (até 1 pb)

Poliacrilamida

Poliacrilamida: Formado pela polimerização de monômeros de

acrilamida e bis-acrilamida. Dependente de radicais livres (PAS e

TEMED)

Poliacrilamida

Poliacrilamida: Formado pela polimerização de monômeros de

acrilamida e bis-acrilamida.

Visualização dos fragmentos

PCR

Eletroforese

Visualização

Visualização dos fragmentos

PCR

Eletroforese

Visualização

• Colorimétrico

• Fluorescência

Visualização dos fragmentos

• CorantesNitrato de prata

Alta sensibilidade

Visualização dos fragmentos

• CorantesNitrato de prata

Alta sensibilidade

Prata

DNA

Redução da prata

Cor

Visualização dos fragmentos

• CorantesNitrato de prata

Alta sensibilidade

Prata

DNA

Redução da prata

Cor

Visualização dos fragmentos

Fluorescência

Visualização dos fragmentos

Intercalantes de DNA

Visualização dos fragmentos

• Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA

Intercalantes de DNA

Visualização dos fragmentos

• Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA

Intercalantes de DNA

A T

C G

A T

Visualização dos fragmentos

A T

C G

A T

• Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA

Intercalantes de DNA

Visualização dos fragmentos

A T

C G

A T

• Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA

Intercalantes de DNA

Visualização dos fragmentos

• Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA

• Fluorescência mais visível quando ligados ao DNA

Intercalantes de DNA

Visualização dos fragmentos

Água age como uma molécula “quencher”

absorvendo a fluorescência.

• Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA

• Fluorescência mais visível quando ligados ao DNA

Intercalantes de DNA

Visualização dos fragmentos

• Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA

• Fluorescência mais visível quando ligados ao DNA

• Como emitem fluorescência?

Intercalantes de DNA

Visualização dos fragmentos

A T

C G

A T

Intercalantes de DNA

Visualização dos fragmentos

• Absorvem luz em um comprimento deonda e emitem em um comprimentomenor (menos energia)

• Podem ser utilizados antes ou depois da eletroforese

Visualização dos fragmentos

A T

C G

A T

A T

C G

A T

A T

C G

A T

A T

C G

A T

A T

C G

A T

A T

C G

A T

• Podem ser utilizados antes ou depois da eletroforese

Visualização dos fragmentos

Brometo de Etídio

• Intercalante muito utilizado para visualização do DNA

Visualização dos fragmentos

• Intercalante muito utilizado para visualização do DNA

• Excitação em luz UV

• Emissão em luz laranja/vermelho

Brometo de Etídio

Visualização dos fragmentos

Visualização dos fragmentos

• Intercalante muito utilizado para visualização do DNA

• Pico de excitação em 285 nm (luz UV)

• Pico de emissão em 605 nm (luz laranja/vermelho)

• É considerado tóxico

Brometo de Etídio

Visualização dos fragmentos

• Blue Green• SYBR Green• GelRed• GelGreen

Intercalantes alternativos

Visualização dos fragmentos

Mas isso é do tamanho

esperado?

Visualização dos fragmentos

Mas isso é do tamanho

esperado?

Visualização dos fragmentos

Interpretação de Resultados

Presença ou ausência

Interpretação de Resultados

Presença de fragmentos de diferentes tamanhos

500 pb

300 pb

Interpretação de Resultados

Expressão diferencial de determinado gene

Interpretação de Resultados

Expressão diferencial de determinado gene