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FABIANA SEIXASemail: fabianak@ufpel.edu.br
BIBLIOTECAS DE DNABIBLIOTECAS DE DNAouou
BANCOS DE DNABANCOS DE DNA
TIPOS DE VETORESTIPOS DE VETORES
• Plasmídios são moléculas de DNA circular, fita dupla, extracromossômico, que ocorrem naturalmente em bactérias e algumas leveduras– pUC18– pBR322– pUP310
Ob.: Utilizados para clonar fragmentos de até 9kb
VETORES PLASMIDIAISVETORES PLASMIDIAIS
- Vírus que infectam bactérias;
- DNA ou RNA;
- Capsídeo
- Biologia do fago
- Utilizados para clonar fragmentos de 9kb a 25 kb
BACTERIÓFAGOBACTERIÓFAGO
-São híbridos entre plasmídios e bacteriófagos;
- Utilizados para clonar fragmentos de 25 a 35 kb;
COSMÍDEOSCOSMÍDEOS
DN
A RE
COM
BIN
ANTE
DN
A RE
COM
BIN
ANTE
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO • É uma coleção de clones que
representam a totalidade do genoma de um determinado organismo
• Consiste de todas as moléculas de DNA recombinantes que foram geradas pela ligação do DNA do organismo a um vetor (plasmideo, bacteriófago ou cosmídeo)
• Servem para isolar DNA específicos de um organismo
São usadas principalmente para procariotos
Em eucariotos usa-se biblioteca genômica para estudo de regiões reguladoras
Independe do tipo de célula utilizada para a obtenção do DNA
CARACTERÍSTICASCARACTERÍSTICAS
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO - Representa todo o genoma de um organismo
BIB
LIO
TEC
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- F
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BIBLIOTECAS DE cDNA
É o conjunto de clones das seqüências É o conjunto de clones das seqüências codificadoras que estão sendo codificadoras que estão sendo expressas pela célula naquele expressas pela célula naquele momento, obtido através da clonagem momento, obtido através da clonagem de moléculas cópias do mRNA.de moléculas cópias do mRNA.
É usada principalmente para células É usada principalmente para células eucarióticas.eucarióticas.
Varia de acordo com o tecido utilizado.Varia de acordo com o tecido utilizado.
BIBLIOTECAS DE cDNABIBLIOTECAS DE cDNA
BIBLIOTECAS DE cDNABIBLIOTECAS DE cDNA
SINTESE DE cDNASINTESE DE cDNA
Purificação do RNA
Hibridização com poly(dT)
Copia do DNA com RT
Degradação do RNA
Síntese de uma fita complementar
BIBLIOTECAS DE cDNABIBLIOTECAS DE cDNA
Clonagem de cDNA em fago Clonagem de cDNA em fago
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
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Biblioteca genômica:Biblioteca genômica:
- Representam uma amostra aleatória de todas as seqüências Representam uma amostra aleatória de todas as seqüências de DNA de um organismode DNA de um organismo
Biblioteca de cDNABiblioteca de cDNA
- Contém moléculas que foram transcritas em mRNAContém moléculas que foram transcritas em mRNA
- Produção de grande quantidade de mRNA por células Produção de grande quantidade de mRNA por células especializadasespecializadas
- Varia de acordo com tipo e estado fisiológico da célulaVaria de acordo com tipo e estado fisiológico da célula
- mRNA é processadomRNA é processado
DIFERENÇAS
BIBLIOTECASBIBLIOTECAS
Seqüenciamento de todos os insertos usando
iniciadores do vetor
Screening
Projetos genoma / transcriptoma
Utilização de bibliotecasUtilização de bibliotecas
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
TRIAGEM DE UMA BIBLIOTECATRIAGEM DE UMA BIBLIOTECA
• Detecção do produto do gene pela Detecção do produto do gene pela utilização de anticorposutilização de anticorpos
• Detecção do DNA através da técnica de Detecção do DNA através da técnica de hibridizaçãohibridização
Triagem de uma biblioteca
Conhecer parte da Conhecer parte da seqüência do geneseqüência do gene
Sequência Sequência completa do genecompleta do gene
Sonda de DNASonda de DNA Utilizar sonda de Utilizar sonda de oligonucleotídeos oligonucleotídeos derivado de uma derivado de uma
proteínaproteína
Codon degeneradoCodon degeneradoConhecer cerca de Conhecer cerca de 6aa contíguos6aa contíguos
AnticorposAnticorpos
1- Detecção do produto do gene pelo uso de anticorpos
Triagem de uma bibliotecaTriagem de uma biblioteca
1- Detecção do produto do gene pelo uso de anticorpos
Triagem de uma bibliotecaTriagem de uma biblioteca
• É a formação de molécula fita dupla, É a formação de molécula fita dupla, através do pareamento de duas fitas de através do pareamento de duas fitas de DNA ou uma de DNA e outra de RNA DNA ou uma de DNA e outra de RNA complementares, mas de origens complementares, mas de origens diferentesdiferentes
• Hibridização Renaturação
2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização
HIBRIDIZAÇÃO HIBRIDIZAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOSDOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Triagem de uma bibliotecaTriagem de uma biblioteca
Marcação da Sonda de DNAMarcação da Sonda de DNA
•Radioativa: Radioativa: 3232P – nick traslationP – nick traslation
•Enzimática: Enzimática: peroxidase, fosfatase alcalinaperoxidase, fosfatase alcalina
SONDA de DNASONDA de DNA
- Seqüência de DNA Marcada- Seqüência de DNA Marcada
Triagem de uma bibliotecaTriagem de uma biblioteca
Marcação da Sonda de DNAMarcação da Sonda de DNA
Radioativa: Radioativa: 3232P – nick traslationP – nick traslation
Atividade Exonucleasica da DNA polimerase
DNA polimerase preenche com nucleotídeos
marcados
Cortar o DNA fita dupla
DNA fita simples
Moléculas de DNA radioativas
Sondas
Triagem de uma bibliotecaTriagem de uma biblioteca
Marcação da Sonda de DNAMarcação da Sonda de DNA
•Enzimática: Enzimática: peroxidase, fosfatase alcalinaperoxidase, fosfatase alcalina
Desnaturação DNA
DNA fita simples
Ligação Fraca
(DNA+ Peroxidase)
Sondas Covalentemente marcada com a enzima
+ peroxidase complexada com polimero positivo
+ glutaraldeído
Triagem de uma bibliotecaTriagem de uma biblioteca
2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização
1
2 3
456
Placas com Colônias
contendo os plasmídeos
Lise das Bactérias – Desnaturação do DNA
SondaFilme de Raio - X
Triagem de uma bibliotecaTriagem de uma biblioteca
2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização
Triagem de uma bibliotecaTriagem de uma biblioteca
Caracterização da seqüência encontrada
• Seqüenciamento de DNASeqüenciamento de DNA
• PCRPCR
• Expressão da sequência codificadoraExpressão da sequência codificadora
Triagem de uma bibliotecaTriagem de uma biblioteca
Southern Blot - DNASouthern Blot - DNA
Northern Blot - RNANorthern Blot - RNA
Western Blot - ProteínaWestern Blot - Proteína
Técnicas de HibridizaçãoTécnicas de Hibridização
• Sonda: seqüência de DNA marcada
Transferência de DNA do gel para a membrana
Southern Blot – RNASouthern Blot – RNASouthern Blot – RNASouthern Blot – RNA
4. Geração de uma sonda marcada
pGEM-T
dATPdGTPdTTP
dCTP
1. Extração do DNA
2. Eletroforese do RNA
3. Transferencia para a menbrana
5. Hibridização
6. Visualização
Northern Blot – RNANorthern Blot – RNANorthern Blot – RNANorthern Blot – RNA
Trabalho Prático 1
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