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Márcia Maria Costa Assunção
FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE FOLHAS DE
BANANEIRA (Musa spp.) E SELEÇÃO DE
ANTAGONISTAS A FITOPATÓGENOS DESSA
CULTURA
RECIFE
Fevereiro/2010
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS
FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE FOLHAS DE
BANANEIRA (Musa spp.) E SELEÇÃO DE
ANTAGONISTAS A FITOPATÓGENOS DESSA
CULTURA
RECIFE
Fevereiro/2010
Márcia Maria Costa Assunção Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos do Departamento de Micologia do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Biologia de Fungos. Área de Concentração: Micologia Aplicada Orientadora: Profª. Drª. Maria Auxiliadora de Queiroz Cavalcanti Co-orientadora: Profª. Drª. Maria Menezes
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE FOLHAS DE BANANEIRA (Musa
spp.) E SELEÇÃO DE ANTAGONISTAS A FITOPATÓGENOS DESSA
CULTURA
Márcia Maria Costa Assunção
COMISSÃO EXAMINADORA
MEMBROS TITULARES ______________________________________________________________________
Profª. Drª. Maria Auxiliadora de Queiroz Cavalcanti (Orientadora) Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
Profº. Drº José Luiz Bezerra Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC)
Profª. Drª. Leonor Costa Maia Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
Profº. Drº João Lúcio de Azevedo Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ)
Profº. Drº Ludwig H. Pfenning Universidade Federal de Lavras (UFL)
SUPLENTES
Profª. Drª. Oliane Maria Correia Magalhães Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
Profº. Drº Rildo Sartori Barbosa Coelho Instituto de Pesquisa Agropecuária (IPA)
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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Dedicatória A meus pais, Francisco Dias da Costa e Marlene Cardoso da Costa in memoria, por
dar-me a vida, amor e respeito ao próximo.
A eles, que jamais esquecerei.
Meu amor eterno.
Ao marido, companheiro de todas as horas, na alegria e na tristeza, Marcos dos Santos
Assunção, pelo amor e ajuda constante, sempre ao meu lado.
A nossa filha Mariane Costa Assunção, nossa maior vitória, alegria de nossas vidas,
sem ela não haveria felicidade.
Por compreenderem minha ausência e meu amor.
Minha dedicação constante.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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Menção Especial
A Profª Drª Maria Auxiliadora de Queiroz Cavalcanti, não apenas pela valiosa
orientação durante a realização deste trabalho, mas pelo conhecimento
científico/micológico, amizade, respeito, presença constante em todos esses anos de
convivência, contribuindo para realizar um sonho, tornou-se uma amiga e um exemplo a
ser seguido. Meus agradecimentos vão muito além da sua orientação e seria impossível
expressá-los com palavras em uma folha de papel.
Logo,
Existem pessoas que lutam um dia e são boas.
Existem pessoas que lutam por algum tempo e são muito boas.
Há pessoas que lutam por muito tempo, e são melhores ainda.
Mas existem aquelas que lutam por toda vida.
Estas são “imprescindíveis.”
Bertold Brecht
Meu eterno reconhecimento
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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Sinceros e especiais agradecimentos
� A Energia Superior que criou todos os seres vivos, principalmente os fungo, sem
os quais não haveria vida na Terra.
� Aos Espíritos de Luz, que nos guiam em todas as jornadas da vida.
� A minha amada família Marcos dos Santos Assunção e Mariane Costa
Assunção, sem eles, este trabalho não seria possível.
� Á Profª Drª Maria Auxiliadora de Queiroz Cavalcanti pelo privilégio de tê-la
como minha orientadora.
� Á Profª Drª Maria Menezes, pelas orientações, disponibilidade, paciência.
Pessoa de caráter, exemplo de força e perseverança, que traz consigo um coração
bondoso, com conhecimentos extraordinários.
� A minha querida irmã Mércia Cardoso Guimarães e família.
� As Professoras Profª Drª Débora Maria Massa Lima e Maria José dos Santos
Fernandes pela identificação do gênero Fusarium e amizade sincera em todos os
momentos.
� À Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Micologia da Universidade
Federal de Pernambuco, sob orientação das Professoras Drª Leonor Costa Maia e
Elaine Malloso, pela oportunidade de realização do Curso de Doutorado em
Biologia de Fungos.
� Aos Professores do Doutorado em Biologia de Fungos, que contribuem na
formação dos alunos.
� A amiga Thaís Emanuelle F. de Lima pela grande ajuda nos gráficos.
� Aos companheiros de laboratório, Thaís Emanuelle F. de Lima, Elaisa Cristina
dos Anjos, Renata G. de Souza, Michelline Lins Silvério e Roger Fagner Melo.
� Aos colegas do Doutorado em Biologia de Fungos, em especial a Raquel e
Marta pelos momentos de descontraçã e amizade.
� A Alexsandra Vaz de Araújo Silva e Mariane Costa Assunção pela valiosa ajuda
nas fotos dos pareamentos.
� Ao Drº Venézio Felipe dos Santos pela análise estatítica, pessoa de grande
conhecimento.
� A Giovanna Guterrez secretária do Departamento de Micologia, sempre disposta
e alegre para ajudar.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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� A Bibliotecária Márcia Solange Mendes Silva de Amorim.
� Á Fundação de Amparo á Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambucoco
(FACEPE) pela concessão da bolsa de estudo (Processo Nº-BPG–0001–
2.12/07).
� A Faculdade de Formação de Professores de Belo Jardim (FABEJA), sob
orientação da Diretora-Presidenta Srª. Bernardina Santos Araújo de Sousa.
� Aos proprietários das áreas de coletas de Belo Jardim Sr. Sebastião da Silva
(sítio Araça), Sr. José Davi de Araújo (sítio Serra dos Ventos), Sra. Dionízia de
Moura Feitosa (sítio Taboquinha) e Sr. Cizenando João da Silva (sítio Freixeira),
que gentilmente disponibilização suas propriedades para as coletas.
� A todos que direta ou indiretamente contribuíram com esta pesquisa.
Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, qualquer um pode
começar agora e fazer um novo fim.
Chico Xavier
MUITO OBRIGADA
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1 Metodologia utilizada para isolamento dos fungos endofíticos de folhas sadias da bananeira (Musa spp.). A. Discos retirados de folhas sadias; B. Distribuição dos discos em BDA suplementado com 250 mg/L de cloranfenicol; C. Crescimento fúngico nas bordas dos discos foliares; D. Fungos endofíticos purificados e isolados ........................................................
55
Figura 2 Representação esquemática, da distribuição dos discos do fungo endofítico (A) e do fitopatógeno (B), na placa de Petri, para ensaio de antagonismo e medição da velocidade de crescimento, pelo método de pareamento ...............
57
Figura 3 Esquema da distribuição dos discos do fungo endofítico (A) e fitopatógeno (B) na placa de Petri, com uma divisória, para ensaio de antagonismo por metabólitos voláteis............................................................................................
60
Figura 4 Frequência dos grupos de fungos endofíticos isolados de Musa spp.................
64
Figura 5 Frequência de ocorrência dos 24 gêneros de fungos endofíticos isolados em folhas de quatro cultivares de bananeiras, no município de Belo Jardim/PE ...
65
Figura 6 Pareamento dos fungos endofíticos contra Fusarium oxysporum f. sp. cubense (na parte inferior da placa de Petri), após 14 dias de crescimento, em meio de BDA......................................................................................................
94
Figura 7 Comparação do crescimento micelial de 20 fungos endofíticos pareados com Fusarium oxysporum f. sp. cubense, cultivados em BDA, aos 14 dias ............
95
Figura 8 Pareamento dos fungos endofíticos contra Colletotrichum musae (na parte inferior da placa), após 14 dias de crescimento, em meio de BDA...................................................................................................................
96
Figura 9 Comparação do crescimento micelial de 20 fungos endofíticos pareados com Colletotrichum musae, cultivados em BDA, aos 14 dias..................................
97
Figura 10 Pareamento dos fungos endofíticos contra Pseudocercospora musae (na parte inferior da placa), após 14 dias de crescimento, em meio de BDA...................................................................................................................
98
Figura 11 Comparação do crescimento micelial de 20 fungos endofíticos pareados com Pseudocercospora musae, cultivados em BDA, aos 14 dias ............................
99
Figura 12 Pareamento dos fungos endofíticos contra Cladosporium musae (na parte inferior da placa), após 14 dias de crescimento, em meio de BDA...................................................................................................................
100 Figura 13
Comparação do crescimento micelial de 20 fungos endofíticos pareados com Cladosporium musae, cultivados em BDA, aos 14 dias ...................................
101
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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Figura 14
Pareamento dos fungos endofíticos contra Deightoniella torulosa (na parte inferior da placa), após 14 dias de crescimento, em meio de BDA................... 102
Figura 15 Comparação do crescimento micelial de 20 fungos endofíticos pareados com Deightoniella torulosa, cultivados em BDA, aos 14 dias .................................
103
Figura 16 Pareamento dos fungos endofíticos contra Mycosphaerella musicola (na parte inferior da placa), após 14 dias de crescimento, em meio de BDA...................................................................................................................
104
Figura 17 Comparação do crescimento micelial de 20 fungos endofíticos pareados com Mycosphaerella musicola, cultivados em BDA, aos 14 dias ............................
105
Figura 18 Teste de volatilidade entre Pseudocercospora musae (colônias na parte inferior das placas). a) Acremonium bacillisporum; b) Acremonium strictum, mostrando inibição de crescimento micelial do fitopatógeno ...........................
106
Figura 19 Teste de volatilidade entre Pseudocercospora musae (colônias na parte inferior das placas). a) Acremonium pollychoroma; b) Alternaria alternata; c) Xylaria sp.; d) Curvularia lunata var. aeria, mostrando produção de exsudato e um halo escuro por parte do fitopatógeno.........................................
106
Figura 20 Teste de inibição entre Pseudocercospora musae (colônias na parte inferior das placas) e a) Fusarium solani; b) Nigrospora oryzae, mostrando produção de exsudato e alterações no crescimento micelial do fitopatógeno........................................................................................................
107
Figura 21 Teste de volatilidade entre Colletotrichum musae (colônias na parte superior das placas). a) Colletotrichum gloeosporioides; b) Nodulisporium gregarium; c) Nigrospora oryzae; d) Alternaria alternata; e) Tritirachium oryzae, mostrando inibição parcial do crescimento micelial do fitopatógeno........................................................................................................
108
Figura 22 Teste por volatilidade entre Mycosphaerella musicola (colônias na parte superior das placas) e: a) Curvularia lunata var. aeria; b) Paecilomyces lilacinus; c) Fusarium solani; d) Xylaria sp., mostrando alterações das colônias do fitopatógeno....................................................................................
109
Figura 23 Teste de volatilidade entre Cladosporium musae (colônias na parte superior das placas) e: a) Alternaria alternata; b) Drechslera hawaiiensis; c) Curvularia eragrostidis, mostrando inibição parcial das colônias do fitopatógeno........................................................................................................
110
Figura 24 Teste de inibição por volatilidade entre Fusarium oxysporum f. sp. cubense (colônias na parte superior das placas) e: a) Nigrospora oryzae; b) Pestalotiopsis maculans; c) Paecilomyces lilacinus; d) Nodulisporium gregarium...........................................................................................................
111
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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LISTA DE TABELAS
Pág.
Tabela 1 Síntese das características gerais dos locais de coleta no município de Belo Jardim/PE ..........................................................................................................
53
Tabela 2 Notas atribuídas ao grau de crescimento dos fungos endofíticos em direção ao fitopatógeno (Bell et al., 1982).....................................................................
59
Tabela 3 Unidades formadoras de colônias (UFC) e frequência de ocorrência (%) dos fungos endofíticos isolados dos discos foliares de bananeira (Musa spp.), em quatro coletas realizadas no município de Belo Jardim/PE ..............................
67
Tabela 4 Unidades formadoras de colônias e frequência de ocorrência (%) de fungos endofíticos em folhas de bananeira (Musa spp) ................................................
75
Tabela 5 Fungos endofíticos isolados, de discos foliares de bananeira (Musa spp.), em relação à idade fenológica das folhas ................................................................
78
Tabela 6 Número de UFC e Frequência de ocorrência (%) de fungos endofíticos em bananeiras nas quatro áreas de coletas, no município de Belo Jardim/PE...........................................................................................................
79
Tabela 7 Unidades formadoras de colônias de fungos endofíticos isolados em quatro áreas de coletas (Araçá, Freixeira, Serra dos Ventos e Taboquinha), no município de Belo Jardim/PE e categorias de constância (S=Acidental, A=Acessória e C=Constante) ............................................................................
81
Tabela 8 Número de espécies de fungos endofíticos associados e comuns e índice de similaridade entre as áreas de coleta, no municípiode Belo Jardim/PE ............
82
Tabela 9 Frequência de ocorrência e unidades formadoras de colônias (%) de fungos endofíticos em folhas de quatro cultivares de bananeira (Musa spp.)....................................................................................................................
84
Tabela 10 fungos endofíticos isolados (UFC) em quatro cultivares (‘Nanicão’, ‘Pacovan’, ‘Prata-Anã’ e ‘Maçã’), do município de Belo Jardim/PE................
85
Tabela 11 Número de espécies associadas e comuns e índice de similaridade de fungos endofíticos (segundo Sørensen), isolados em quatro cultivares de bananeira (‘Pacovan’, ‘Prata-Anã’, ‘Nanicão’ e ‘Maçã’), no município de Belo Jardim/PE .......................................................................................................... 86
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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Pág. Tabela 12 Número de fungos endofíticos isolados de bananeira (Musa spp.) no
município de Belo Jardim/PE, em quatro coletas, na estação chuvosa e de estiagem .............................................................................................................
87
Tabela 13 Índice da velocidade de crescimento micelial (IVCM) dos fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira, em cultivo individual, aos 14 dias de incubação, em meio de BDA .............................................................................
89
Tabela 14 Índice da velocidade de crescimento micelial dos fitopatógenos isolados, de folhas de bananeira com sintomas, em cultivo individual, aos 14 dias de incubação, em meio de BDA .............................................................................
90
Tabela 15 Classificação dos fungos endofíticos em relação à inibição de fitopatógenos, segundo teste de antagonismo, em cultivo pareado, por 14 dias, em meio de BDA ..................................................................................................................
92
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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RESUMO
FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE FOLHAS DE BANANEIRA (Musa spp.) E SELEÇÃO DE ANTAGONISTAS A FITOPATÓGENOS DESSA
CULTURA
A bananeira (Musa spp.) está presente em todas as regiões tropicais e subtropicais,
sendo a banana a fruta mais conhecida e cultivada. No Brasil a bananicultura é
atividade de importância econômica e social. O fungo endofítico habita o interior dos
tecidos aéreos do hospedeiro, pelo menos durante uma fase do seu ciclo de vida,
desempenhando variadas e estreitas relações ecológicas, sem demonstrar sintomas
visíveis. Com o objetivo de isolar, identificar e avaliar o potencial antagônico dos
fungos endofíticos de folhas de bananeiras contra os fitopatógenos Cladosporium
musae, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Colletotrichum musae, Deightoniella
torulosa, Pseudocercospora musae e Mycosphaerella musicola, através de testes in
vitro, foram realizadas quatro coletas seguindo-se de isolamento e identificação de
fungos endofíticos de folhas sadias (nova, intermediária e velha) de quatro cultivares
de bananeira (‘Pacovan’, ‘Nanicão’, ‘Prata-Anã’ e ‘Maçã’), do município de Belo
Jardim/Pernambuco, no período chuvoso e de estiagem. No total, foram identificadas
40 espécies de fungos endofíticos originadas de 751 colônias a partir de 1728 discos
foliares. Apresentaram maior frequência de ocorrência em relação ao número de
unidades formadoras de colônias: Acremonium polychoroma, Alternaria alternata,
Cladosporium cladosporioides, Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum.
musae, Deightoniella torulosa, Fusarium solani, Nigrospora oryzae, Nodulisporium
gregarium, Paecilomyces lilacinus, Pestalotiopsis maculans, Guignardia musae. A
maior frequência de colonização por fungos endofíticos foi verificada em folhas
velhas, no cultivar ‘Pacovan’. Maiores índices de frequência foram registrados no
período chuvoso. Nigrospora oryzae, Pestalotiopsis maculans e Nodulisporium
gregarium apresentaram mais eficiência nos testes de antagonismo in vitro contra os
fitopatógenos testados.
Palavras-chave: Fungo endofítico, Musa spp., antagonismo, metabólitos voláteis
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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ABSTRACT
ENDOPHYTIC FUNGI ISOLATED FROM LEAVES OF BANANA TREE (Musa spp.) AND SELECTION OF ANTAGONISTIC ISOLATES A GAINST FUNGAL
PATHOGENS OF THAT CULTURE
The banana (Musa spp.) is present in all tropical and subtropical regions and is the best
known and most cultivated fruit crop worldwide. In Brazil, the banana cultivation is an
activity of economic and social importance. Endophytic fungi live inside the aerial
tissues of the host, at least during one phase of its life cycle, performing many intimate
ecological relationships without producing disease symptoms. In order to isolate,
identify and evaluate the potential antagonistic of fungal endophytes of healthy leaves
of banana plants against the pathogens Cladosporium musae, Fusarium oxysporum f.
sp. cubense, Colletotrichum musae, Deightoniella torulosa, Pseudocercospora musae e
Mycosphaerella musicola, through “in vitro” assaus, four samples were taken followed
by isolation and identification of fungal endophytes of healthy leaves (new,
intermediate and old) from four varieties of banana (‘Pacovan’, ‘Nanicão’, ‘Prata-Anã’
and ‘Maçã’), in the municipality of Belo Jardim/Pernambuco, during the rainy and dry
seasons. In total, 40 species of fungal endophytes were isolated from 751 colonies from
1728 leaf discs. The following fungal species showed higher frequency of occurrence in
relation to the number of colony forming unis: Acremonium polychoroma, Alternaria
alternata, Cladosporium cladosporioides, Colletotrichum gloeosporioides,
Colletotrichum musae, Deightoniella torulosa, Fusarium solani, Nigrospora oryzae,
Nodulisporium gregarium, Paecilomyces lilacinus, Pestalotiopsis maculans and
Guignardia musae. The highest frequency of colonization by endophytic fungi was
detected in old leaves of the cultivar ‘Pacovan’. Higher rates of frequency were
registered during the rainy period. Nigrospora oryzae, Pestalotiopsis maculans e
Nodulisporium gregarium showed better performance in tests of antagonism in vitro
against the pathogens.
Key-words: Endophyte fungi, Musa spp., antagonism, volatile metabolites.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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SUMÁRIO
Pág.
AGRADECIMENTOS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 17
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ....................................................................... 19
2.1. AGRICULTURA .................................................................................................. 19
2.2. BANANICULTURA ............................................................................................. 20
2.2.1. Origem, evolução e morfologia da bananeira.......................................................... 21
2.2.2. Exigências climáticas da bananeira......................................................................... 23
2.2.3. Utilidades da bananeira........................................................................................... 24
2.3. FUNGOS ENDOFÍTICOS .................................................................................. 25
2.3.1. Conceitos de fungos endofíticos.............................................................................. 25
2.3.2. Importância do estudo dos fungos endofíticos........................................................ 26
2.3.3. Entrada, dispersão e transmissão dos fungos endofíticos........................................ 27
2.3.4. Isolamento e identificação de fungos endofíticos................................................... 28
2.3.5. Interação fungo endofítico /hospedeiro .................................................................. 29
2.3.6. Especificidade do fungo endofítico pelo hospedeiro .............................................. 31
2.3.7. Fungos endofíticos de ambientes tropicais ............................................................. 32
2.3.8. Ocorrência de fungos endofíticos em Musa spp. .................................................... 33
2.4. INTERAÇÃO PLANTA/FITOPATÓGENO .................................................... 34
2.4.1. Principais fitopatógenos da bananeira .................................................................... 35
2.5. CONTROLE BIOLÓGICO ................................................................................ 37
2.5.1. Conceito de controle biológico ............................................................................... 38
2.5.2. Fungos antagonistas ................................................................................................ 39
2.5.3. Controle biológico de fitopatógenos por fungos endofíticos.................................. 41
2.6. FUNGOS ENDOFÍTICOS PRODUTORES DE SUBSTÂNCIAS ANTIMICROBIANAS ......................................................................................... 42
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
15
Pág.
2.6.1 Produção de enzimas extracelulares ....................................................................... 44
2.6.2. Produção de metabólitos por fungos ...................................................................... 45
2.6.3. Metabólitos voláteis ................................................................................................ 46
2.7. MÉTODOS DE SELEÇÃO DE ANTAGONISTAS IN VITRO ....................... 47
2.8. MECANISMO DE AÇÃO ANTAGONISTA CONTRA FITOPATÓGENO 49
2.8.1. Antibiose ................................................................................................................. 49
2.8.2. Competição por espaço e nutrientes ....................................................................... 50
2.8.3. Indução de resistência ............................................................................................. 50
3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................ 52
3.1. Áreas de coletas ...................................................................................................... 52
3.2. Cultivares utilizadas para isolamento dos fungos endofíticos................................. 53
3.3. Isolamento de fungos endofíticos............................................................................ 53
3.4. Identificação dos fungos endofíticos....................................................................... 55
3.5. Seleção de antagonistas in vitro ............................................................................. 56
3.5.1. Obtenção de fungos endofíticos e fitopatógenos utilizados para teste de
antagonismo in vitro ...............................................................................................
56
3.5.2. Determinação do índice de velocidade de crescimento micelial de fungos
endofíticos e fitopatógenos in vitro, em cultivo individual ....................................
56
3.5.3. Seleção de fungos endofíticos isolados contra fungos fitopatogênicos
selecionados, in vitro ..............................................................................................
57
3.5.3.1. Teste de antagonismo, em culturas pareadas .......................................................... 57
3.5.3.2. Efeito in vitro de metabólitos voláteis, produzidos por fungos endofíticos, sobre
o crescimento micelial de fitopatógenos.................................................................
59
3.6. Análise estatística ................................................................................................... 60
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 63
4.1. Fungos endofíticos isolados de folhas sadias de bananeiras .................................. 63
4.2. Fungos endofíticos isolados por estádios fenológicos das folhas de bananeiras .... 75
4.3. Fungos endofíticos isolados por áreas de coletas ................................................... 79
4.4. Isolamento de fungos endofíticos por cultivares .................................................... 83
4.5. Influência da sazonalidade na ocorrência dos fungos endofíticos .......................... 86
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
16
Pág.
4.6. Índice da velocidade de crescimento dos fungos endofíticos e fitopatógenos,
individualmente .........................................................................................................
88
4.7. Avaliação da atividade antagônica dos fungos endofíticos contra fitopatógenos, in
vitro, em cultura pareada ...........................................................................................
91
4.7.1. Comportamento antagônico dos fungos endofíticos isolados, em relação a
Fusarium oxysporum f. sp. cubense...........................................................................
92
4.7.2. Comportamento antagônico dos fungos endofíticos isolados, em relação a
Colletotrichum musae.................................................................................................
95
4.7.3. Comportamento antagônico dos fungos endofíticos isolados, em relação a
Pseudocercospora musae...........................................................................................
97
4.7.4. Comportamento antagônico dos fungos endofíticos isolados, em relação a
Cladosporium musae..................................................................................................
99
4.7.5. Comportamento antagônico dos fungos endofíticos isolados, em relação a
Deightoniella torulosa................................................................................................
101
4.7.6. Comportamento antagônico dos fungos endofíticos isolados, em relação a
Mycosphaerella musicola...........................................................................................
103
4.8. Produção de metabólitos voláteis por fungos endofíticos contra Pseudocercospora
musae..........................................................................................................................
105
4.9. Produção de metabólitos voláteis por fungos endofíticos contra Colletotrichum
musae..........................................................................................................................
107
4.10. Produção de metabólitos voláteis por fungos endofíticos contra Mycosphaerella
musicola......................................................................................................................
108
4.11. Produção de metabólitos voláteis por fungos endofíticos contra Cladosporium
musae.........................................................................................................................
109
4.12. Produção de metabólitos voláteis por fungos endofíticos contra Fusarium
oxysporum f. sp. cubense................................................. ..........................................
110
5. CONCLUSÕES ........................................................................................................ 113
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 115
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
17
1. INTRODUÇÃO
A produção mundial de bananas (Musa spp.) em 2007 foi de aproximadamente
59.496.958 toneladas, sendo o continente asiático o maior produtor (FAO, 2009). O
Brasil destaca-se mundialmente, com produção de 7.098.353 toneladas e área plantada
de 519.187 hectares (IBGE, 2009), colocando-se como segundo maior produtor e
segundo em área plantada no mundo, perdendo apenas para a Índia (FAO, 2009). Os
estados de São Paulo, Bahia, Pará, Santa Catarina, Minas Gerais e Pernambuco são os
mais importantes, tanto em área colhida quanto em produção (IBGE, 2009). O Nordeste
é responsável por 35% da produção nacional de bananas (Soares et al., 2008). Segundo
Silva et al. (2002), as cultivares ‘Prata’ e ‘Pacovan’ são responsáveis por 60% da área
cultivada no Brasil e ‘Nanicão’ corresponde a 47% da produção mundial (Arias et al.,
2004).
Típica planta tropical, a bananeira exige temperaturas entre 20°C e 35ºC, elevada
umidade relativa e precipitações bem distribuídas para produção e desenvolvimento. O
Brasil apresenta condições favoráveis à bananicultura (Alves, 1999), atividade agrícola
de maior expressão econômica e social, contribuindo para a dieta alimentar da
população, principalmente dos mais carentes e reduzindo a fome no mundo (CEAGESP,
2005).
Os fungos constituem os maiores problemas da bananicultura (Silva et al., 2002),
sendo numerosas as investigações sobre enfermidades foliares de origem fúngica,
porém, escassos os relacionados com fungos endofíticos (Urdaneta et al., 2002), que
habitam internamente os tecidos vegetais sem causar danos aparentes (Petrini, 1986). A
maioria dos estudos com fungos endofíticos se concentra em países de clima temperado
(Rodrigues & Petrini, 1997).
Os microrganismos endofíticos habitam o interior de tecidos vegetais pelo menos
durante um período do ciclo de vida, aparentemente sem causar doença (Petrini, 1991),
sendo encontrados especialmente em partes aéreas (Gange et al., 2007). Estudos
moleculares (Rosenblueth & Martínez-Romero, 2006) revelaram riqueza de espécies
endofíticas promovendo aumento da resistência a condições de estresse, alterações
fisiológicas, produção de fitormônios, toxinas, fármacos, imunossupressores,
antitumorais e enzimas (Azevedo et al., 2007), crescimento vegetal, controle de
fitopatógenos, remoção de contaminantes, solubilização de fosfato e assimilação de
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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nitrogênio (Cerigioli, 2005). Por desempenharem variadas e estreitas relações, sem
demonstrar sintomas visíveis, há necessidade de isolamento e cultivo desses fungos em
laboratório (Azevedo & Araújo, 2007).
O uso indiscriminado de agroquímicos contribui para alterar ou eliminar fungos
endofíticos essenciais à manutenção do equilíbrio planta/endófito/ambiente (Glienke,
1995). Forma de aplicação, surgimento de fitopatógenos resistentes e pressões sócio-
econômicas (Johnson & Sanghote, 1994), levam à necessidade do desenvolvimento de
métodos alternativos de controle, que não comprometam a qualidade dos frutos e a
saúde humana. Tratamentos biológicos são utilizados como alternativa aos fungicidas
(CEPEA, 2008), destacando-se os fungos antagonistas, utilizados com êxito, em outras
culturas, em substituição ao controle químico (Sponholz et al., 2004).
Substâncias químicas, produzidas por plantas ou microrganismos, oferecem
novas oportunidades para diversificar o controle de doenças na agricultura, onde fungos
contribuem de forma positiva. A agricultura alternativa busca medidas de proteção das
plantas contra fitopatógenos e o controle biológico aparece como alternativa racional e
necessária à agricultura (Santos et al., 2008).
Considerando a importância da bananicultura para o país e para o mundo, e o
impacto que fungos endofíticos podem apresentar no controle de doenças, à realização
de pesquisas voltadas à associação endófito/planta é relevante podendo contribuir para o
aumento da produção com melhoria ambiental.
O presente trabalho teve por objetivos: isolar e identificar fungos endofíticos de
folhas sadias de bananeiras; analisar a similaridade desses fungos considerando
cultivares, áreas de estudo e efeito da sazonalidade; verificar o índice de crescimento
dos fungos endofíticos e de fitopatógenos da bananeira isoladamente, em meio de
cultura; avaliar o potencial antagônico de fungos endofíticos selecionados, contra
fitopatógenos da bananeira, observando a possível produção de metabólitos voláteis
pelos fungos endofíticos.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1. AGRICULTURA
A agricultura originou-se da domesticação de plantas, inicialmente em vários
locais, promovendo mudança na maneira como o homem obtinha seu alimento. O
extrativismo passou a dar lugar à agricultura, transição conhecida como Revolução
Agrícola (Flannery, 1973). A atividade agrícola, documentada pela história e registros
arqueológicos, tem sido inseparável da sociedade humana (Harlan, 1992). Pouco é
conhecido a respeito da dieta dos primeiros homens, mas é aceito que eram caçadores e
coletavam frutas como fonte de alimento. A agricultura modificou a sociedade,
formando a classe dos proprietários de terra, aumentando o impacto do homem sobre a
natureza, substituindo ecossistemas naturais pela produção agrícola (Borém & Milach,
1999).
A globalização do consumo de frutas e procura por produtos naturais saudáveis
requerem segurança na qualidade. No campo, a produtividade das frutas está
relacionada à aplicação de fungicidas, podendo aumentar o nível de contaminantes
químicos. Rotação de cultura, adubação verde e controle biológico levam a uma
agricultura produtiva e equilibrada. Processos biológicos que ocorrem no sistema
solo/planta, efetivado por microrganismos, constituem a base sobre a qual a agricultura
agroecológica se sustenta (Oliveira et al., 2003).
O Brasil tem na agricultura uma das bases mais potentes de economia,
garantindo o fornecimento de cereais, oleaginosas, hortaliças e frutas (Coelho et al.,
2003). É um dos três maiores produtores mundiais de frutas, com produção que supera
34 milhões de toneladas. A cadeia produtiva das frutas abrange 2,2 milhões de hectares,
gera 4 milhões de empregos e um Produto Interno Bruto (PIB) agrícola de US$ 11
bilhões. Em relação às frutas tropicais, o Brasil tem se destacado como importante
produtor e consumidor, expandindo o agronegócio e buscando adequação ao mercado
consumidor. No entanto, o volume de exportação é pequeno, devido a barreiras
comerciais e fitossanitárias, deficiências internas de organização da produção e
comercialização (IBRAF, 2009).
2.2. BANANICULTURA
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
20
A produção mundial de frutas em 2007 foi em torno de 690.756.513 toneladas
(Nascente, 2007) e a fruta mais produzida foi a banana, com 105,69 milhões de
toneladas, seguida pela melancia e uva (FAO, 2009). A banana é produzida
comercialmente na Austrália, África, Israel, Índia, Uganda, China, Filipinas, Jordânia,
Líbano, Marrocos, Turquia, Egito, Ilhas Canárias (Espanha), Taiwan e Brasil e cultivada
em 124 países, localizados, sobretudo nas regiões tropicais e subtropicais (TodaFruta,
2008).
O Brasil tem destaque no cenário mundial, com produção de 7.208.143 milhões
de toneladas, em área plantada de 527.258 mil hectares (IBGE, 2008), o que o coloca
em segundo lugar em produção e área colhida (FAO, 2006). Embora seja o segundo
maior produtor, sua participação no mercado internacional é pequena, devido à precária
estrutura comercial, baixa qualidade de produção, danos pós-colheita e fatores
fisiológicos e microbiológicos (Rangel et al., 2002).
A banana é cultivada em todos os estados brasileiros, desde a faixa litorânea até
os planaltos do interior (Brasil et al., 2000). A forma como é cultivada varia, desde
plantio sem uso de tecnologia, na maioria dos estados (Souza & Torres Filho, 1999) até
com tecnologias modernas (CEPEA, 2008). A bananicultura brasileira apresenta
características que a diferenciam das regiões produtoras do mundo, tanto em relação à
diversidade climática, quanto ao uso de cultivares e forma de comercialização (Silva,
2000).
O Nordeste brasileiro produz 34% do total nacional, representando a região com
maior potencial para produção de frutas tropicais (SEBRAE, 2005). A região apresenta
atividades com perspectivas, devido às condições edafoclimáticas favoráveis e grande
disponibilidade de área (Lima et al., 2001), permitindo produção de todos os tipos de
frutas: banana, citros, maçã, mamão, manga, melão e uva (Agrosoft Brasil, 2009).
Porém, o mercado nordestino é pouco exigente na qualidade da banana, com produção
de baixa qualidade e poucos investimentos na cultura, favorecendo o surgimento de
doenças e influenciando de forma negativa a qualidade dos frutos (TodaFruta, 2008).
O estado de Pernambuco é o sétimo produtor da Região Nordeste, com 418
toneladas de banana e quinto em área plantada com 39.822 hectares e área colhida em
torno de 36.656 hectares (IBGE, 2008). Os municípios de Petrolina, Vicência, São
Vicente Ferrer, Santa Maria da Boa Vista e Quipapá são os maiores produtores
(Montarroyos, 2005).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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O município de Belo Jardim possui 400 hectares em área plantada, com
rendimento médio em torno de 25.000 mil kg/ha e produção de 10.000 toneladas
(FIBGE, 2008). A agricultura é a atividade econômica predominante no município,
praticada por pequenos agricultores, sem ocorrência de áreas mecanizadas devido a
solos com declividade, mão-de-obra familiar, com exploração semi-extrativista.
2.2.1. Origem, evolução e morfologia da bananeira
Bananeiras produtoras de frutos comestíveis são da Classe Monocotiledoneae,
Ordem Scitaminales, Família Musaceae, Subfamília Musoideae, Gênero Musa e Seção
Eu-musa, com origem em duas espécies silvestres, M. acuminata Colla (genoma A) e
M. balbisiana Colla (genoma B) (Simmonds & Shepherd, 1955). A palavra banana é
originária das línguas serra-leonesa e liberiana (África), incorporada pelos portugueses
(Dantas et al., 1999).
Tanto o velho testamento como o alcorão, dos árabes, consideram a bananeira
como “árvore do pecado” (Gomes, 1983; Corrêa, 1984). Textos budistas de cerca de
600 a.C, citam que Alexandre, o Grande, comeu banana na Índia em 327 a.C e em 650,
os islâmicos trouxeram banana para a Palestina (CODEVASF, 2008). Os árabes no
século VII levaram-a para a África, onde o seu uso foi difundido. Colombo encontrou
bananeiras nas Antilhas e Vicente Pinzón, na América do Sul (Gomes, 1983).
A determinação da idade por carbono radioativo dos sedimentos arqueológicos
incluindo fitolitos fósseis indica que Eu-musa apareceu pela primeira vez no pântano
Kuk, na Ásia, há aproximadamente 10.000 anos (Golson, 1991). Lentfer & Denham
(2003), na Austrália, realizando estudos arqueológicos e paleoambientais, investigaram
a origem e o desenvolvimento da agricultura na Nova Guiné, com ênfase na banana, e
encontraram fitolitos que permitiram a identificação de Eu-musa, Australimusa,
Ingentimusa e Ensete.
Segundo Corrêa (1984), sua origem é provavelmente na Índia, Malásia e
Filipinas, onde a planta é cultivada há mais de 4.000 anos; provas históricas comprovam
sua Antiguidade e o quase desaparecimento de suas sementes, que eram grandes, hoje
minúsculas e estéreis, devido à dificuldade da fecundação das espécies. Para Lebot
(1999), sua origem foi na Nova Guiné, havendo cruzamentos locais entre M. acuminata
com M. balbisiana silvestre. Devido ao valor comercial e de subsistência, a banana foi
introduzida nos trópicos e subtrópicos (Jeger et al., 1995). Diversos autores indicam que
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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sua origem foi no Sudeste Asiático (Dantas et al., 1999; Ploetz, 2001; Jesus et al.,
2004).
A história e a origem da banana no Brasil são discutidas. A maioria dos autores
considera que a banana foi introduzida nas Américas pelos portugueses. Apesar dos
primeiros registros, no território brasileiro, datarem de 1570, existem evidências de que
índios a cultivavam na Amazônia chamando-a de “pacoba” (Corrêa, 1984; Moreira,
1999).
As primeiras plantações de banana no Brasil datam de 1925, quando o agrônomo
Felisberto Cardoso de Camargo iniciou o plantio com 12 variedades, no Instituto
Agronômico de Campinas (IAC). Em 1931 ocorreram os primeiros experimentos de
fertilizantes e em 1948 surgiu o primeiro híbrido no país (Lima, 2005).
As cultivares de banana apresentam três níveis cromossômicos: diplóide,
triplóide e tetraplóide, respectivamente com dois, três e quatro múltiplos do número
básico de cromossomos e genoma de 11 (x = n). Por meio de cruzamentos
experimentais pode-se constatar que bananeiras triplóides originaram-se a partir de
hibridações entre diplóides e tetraplóides foram gerados a partir de cruzamentos entre
triplóides e diplóides (Dodds, 1943).
Na evolução das bananeiras comestíveis participaram as espécies diplóides
selvagens Musa acuminata e M. balbisiana, de modo que cada cultivar deve conter
combinações variadas de genomas completos dessas espécies parentais. Esses genomas
são denominados pelas letras A (M. acuminata) e B (M. balbisiana), de cujas
combinações resultam os grupos AA, BB, AB, AAA, AAB, ABB, AAAA, AAAB,
AABB e ABBB (Simmonds & Shepherd, 1955).
Morfologicamente, a bananeira consiste de caule curto e subterrâneo (rizoma),
que constitue órgão de reserva, onde se inserem raízes adventícias e fibrosas de um
sistema radicular fasciculado. O pseudocaule é resultante da união das bainhas foliares,
que termina na copa das folhas longas e largas, com nervura central desenvolvida. Do
centro da copa emerge a inflorescência com brácteas ovaladas de coloração roxo-
avermelhada, onde nascem as flores. O grupo de flores reunidas forma uma penca, com
número variável de frutos (Dantas et al., 1999).
O pseudocaule da bananeira é um estipe, formado pelas bainhas das folhas
superpostas. O meristema terminal produz folhas e sucessivamente vão aparecendo
folhas em forma helicoidal e em conjunto, formando o tronco da bananeira ou
pseudocaule, constituído por superposições de folhas, que nascem enroladas abrindo-se
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
23
paulatinamente. Cada pseudocaule produz uma inflorescência (cacho). A produção fica
assegurada pelo desenvolvimento de outros rebentos lançados pelo rizoma. A
propagação da bananeira é via vegetativa, com plantio de partes do rizoma portadores
de brotos. As bainhas se fixam sobre o rizoma descrevendo círculos concêntricos, em
torno da gema apical de crescimento (Coelho et al., 2001). O caule e o pseudocaule
oferecem apoio á planta e armazena reservas amiláceas, permitindo ás folhas
alcançarem maior altura, para melhor captação de luz solar (Belálcázar, 1998). As raízes
são amareladas e duras (Lavillé, 1964).
O tamanho da bananeira depende da espécie, da cultivar, de condições
edafoclimáticas e de tratos culturais (Soffner, 2001).
2.2.2. Exigências climáticas da bananeira
Planta natural da zona tropical, a bananeira é cultivada entre 35°N e 35°S e
altitudes não superiores a 1500 m. O efeito da altitude está relacionado com fatores
climáticos (temperatura, pluviosidade, umidade relativa e luminosidade), influenciando
na produção da cultura (Soto Ballestero, 1992). A bananeira é exigente quanto ao
cultivo; luminosidade, fertilidade do solo, umidade e densidade populacional são
essenciais para sua produção (Moura et al., 2002).
A temperatura influi diretamente nos processos respiratórios e fotossintéticos da
planta. Em condições de clima favorável, a bananeira apresenta crescimento contínuo e
rápido; em condições adversas (baixas temperaturas e déficit hídrico) seu crescimento é
lento (Alves, 1999). A banana exige temperaturas entre 10ºC e 40ºC; baixas
temperaturas podem ocasionar a "queima" da planta ou dos frutos em crescimento
("chilling" ou "friagem") (Rangel et al., 2002).
O vento causa desde pequenos danos até a destruição do bananal (Moreira,
1999), ventos secos provocam transpiração excessiva das folhas, podendo causar
fendilhamento, reduzindo a fotossíntese, rompimento do sistema radicular e
tombamento das plantas (Souza & Torres Filho, 1999).
Regiões onde a umidade relativa média anual situa-se acima de 80% são mais
favoráveis à bananicultura. Sob condições de baixo teor de umidade as folhas tornam-se
mais coriáceas, com vida curta (Cordeiro & Mesquita, 2000).
Área foliar, ângulo e forma da folha influem no aproveitamento da luminosidade
(Alves, 1999). Superposição de folhas causa problemas na captação de luz, sobretudo
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
24
quando a intensidade luminosa é baixa, por nebulosidade ou excesso de plantas por
unidade de área (Spedding, 1979).
2.2.3. Utilidades da bananeira
Descrita no século XVIII pelo botânico sueco Carollus Linnaeus, a banana (Musa
sapientum) foi chamada “o fruto do homem inteligente.” A casca protege a polpa, que
tem sabor inigualável e traz benefícios ao organismo (Cordeiro, 2006). A bananeira é
contemporânea do homem primitivo, supondo-se ter sido a primeira planta a fornecer
alimento ao homem (Simmonds, 1966). A banana pode ser consumida in natura ou
produtos industrializados, constituindo parte integrante da alimentação da população
mundial (Souza & Torres Filho, 1997).
A banana apresenta poderes curativos, e é utilizada em caso de desnutrição,
contusões, problemas intestinais, renais e tuberculose (Balbach & Boarim, 1992). É
fruta constante na dieta dos brasileiros devido às características sensoriais, valor
nutritivo e baixo custo. Um fruto supre cerca de 25% da ingestão diária de ácido
ascórbico, vitaminas A e B e minerais como potássio, sódio e ferro. Alimento
energético, com carboidratos facilmente assimiláveis (Medina et al., 1995), apresenta
em média, por 100 g da fruta: 108,2 calorias; 1,2 g de proteína; 0,2 g de gordura; 25,4 g
de carboidratos; 9 mg de cálcio; 27 mg de fósforo; 0,6 mg de ferro; 50 mg de vitamina
A e 11 mg de vitamina C (Nascente, 2007).
Gomez (1967) apresenta a possibilidade nutricional do rizoma e do pseudocaule
da bananeira como alimento humano. Do pseudocaule podem-se extrair fibras para
fabricação de tecidos, alimento para animais doméstico e humano (Moreira, 1999).
A primeira experiência brasileira utilizando bananeira como anti-helmíntico foi
relatada por Vaitsman (1954). Amorin (1987) avaliou sua ação anti-helmíntica sobre
camundongos infectados com oxiurídeos (Syphacia obvelata e Aspiculuris tetraptera),
obtendo resultados positivos. Golin (2000) indica sua utilização como fitoterápico e
forrageira, devido às qualidades nutricionais. Anjaneyalu et al. (1997) demonstraram
que o amido presente no pseudocaule é semelhante ao de cereais e tubérculos.
Apresentam tanino em sua constituição, composto que poderia ser responsável pela
atividade anti-helmíntica (Guarrera, 1999). Olivo et al. (2007) realizaram estudos sobre
o uso da bananeira no controle de parasitas, e concluíram que o consumo das folhas
apresenta efeito anti-helmíntico. Os autores recomendam mais estudos, visando
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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proporcionar técnicas de manejo seguras para utilização da bananeira no controle de
parasitas de animais domésticos.
2.3. FUNGOS ENDOFÍTICOS
2.3.1. Conceito de fungos endofíticos
Na tradução literal, a palavra endófito é derivada do grego (éndon + phytón),
significa 'no interior da planta' e abrange bactérias, fungos, algas, vírus e insetos que
convivem de forma simbiôntica com a planta hospedeira (Schulz & Boyle, 2005). A
aplicabilidade do termo endofítico é referida para bactérias e fungos (Gunatilaka, 2006)
que habitam o interior das plantas durante todo seu ciclo de vida ou parte dele, sem
causar sintomas de doença (Petrini, 1991). A primeira referência de microrganismos
endófitos foi por De Bary (1866, apud GamboaGaitan, 2006) que, ao estudar gramíneas,
considerou endófitos os fungos que vivem no interior dos tecidos das plantas e epifíticos
os que vivem sobre a superfície. Fidalgo & Fidalgo (1967) definem fungo endofítico
como apenas aquele que vive no interior do tecido vegetal. Apesar do termo 'endófito'
ser empregado para todos os organismos que habitam plantas, micologistas têm
utilizado o termo ' fungo endofítico ' para os que habitam plantas sem causar sintomas
visíveis de doença (Schulz & Boyle, 2005).
Segundo Carroll (1986), microrganismos endofíticos são aqueles que, em pelo
menos uma fase de seu ciclo de vida, colonizam o interior de tecidos vegetais aéreos,
sem causar dano aparente. Para Kloepper & Beauchamp (1992), o termo mais adequado
é 'endofítico' podendo ser definido como 'microrganismos que ocorrem no interior dos
tecidos das plantas e aparentemente não causam sintomas de doenças ao hospedeiro'.
Em 1988, Carroll restringiu o termo endofítico a organismos que causam infecção
assintomática nos tecidos internos de plantas, excluindo fitopatógenos, mutualistas e
micorrizas.
Diversos autores (Petrini, 1991; Wilson, 1995; Yates et al., 1997; Hallmann et
al. 1997; Reinhold-Hurek & Hurek, 1998; Azevedo et al., 2007) definem de maneira
mais ou menos idêntica o 'termo endófito', utilizado em trabalhos realizados desde o
século passado.
Guo et al. (2008) conceituam fungos endofíticos aqueles que residem
internamente nos tecidos das plantas, sem causar efeito negativo imediato, sendo
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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encontrados em todas as espécies vegetais examinadas até o momento e reconhecidos
como fontes potenciais de novos produtos naturais para exploração na medicina,
agricultura e indústria.
Os fungos endofíticos se beneficiam grandemente em colonizar plantas devido
aos tecidos internos proporcionarem ambiente protegido das adversidades do meio (raio
ultravioleta, chuvas, flutuações de temperatura, disponibilidade de nutrientes e
competição com outros fungos). Logo, endofitismo pode ser visto como forma de
sobrevivência. Desta íntima associação, muitas vezes mutualística, existe a hipótese de
que fungos endofíticos podem exercer efeitos benéficos nos seus hospedeiros (Mcinroy
& Kloepper, 1995).
Vários autores tentaram ao longo dos anos conceituar fungos endofíticos,
ocorrendo confusão a respeito da amplitude e aplicação do termo, porém todos esses
conceitos requerem mais estudos. O significado deste termo tem variado de acordo com
o avanço do conhecimento nesta área.
2.3.2. Importância do estudo dos fungos endofíticos
O estudo dos fungos endofíticos tem despertado interesse devido ao seu potencial
biológico, econômico e ecológico. O conhecimento atual sobre suas potencialidades
estimula pesquisas, como: tolerância ao ataque de insetos (Clay, 1988); aumento da área
foliar (Read & Camp, 1986); alterações ecológicas causadas pela chuva ácida (Helander
& Rantio-Lehtmäki, 1990); tolerância ao período de estiagem (West et al., 1990);
resistência a doenças (Stovall & Clay, 1991); uso como vetores alternativos para
introdução de genes nas plantas (Murray et al., 1992); quando cultivados in vitro,
podem produzir antibióticos (Stierle et al., 1993), criptocandina, lipopeptídeo,
antimicótico (Strobel et al., 1999); anticancerígeno (Wang et al., 2000), fitohormônio,
toxina, imunossupressor, antitumoral e enzima (Strobel, 2003); promoção do
crescimento vegetal (Neto et al., 2003); agente no controle biológico de pragas e
doenças de espécies cultivadas (Azevedo et al., 2007); aumento da resistência a
condições de estresse e alterações fisiológicas do hospedeiro (Strobel, 2003); remoção
de contaminantes, solubilização de fosfato e assimilação de nitrogênio (Rosenblueth &
Martinez-Romero, 2006); modelo para estudos ecológicos e de biodiversidade (Zhang et
al., 2006) e indicadores de deficiência nutricional da planta (Blodgett et al., 2007).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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Estudos realizados por Stierle et al. (1993) despertaram o interesse
biotecnológico para o potencial dos fungos endofíticos, ficando evidente que Taxomyces
andreanea, isolado da planta Taxus brevifolia, é capaz de produzir taxol, um
antitumoral. Trabalhos posteriores mostraram que Pestalotiopsis microspora isolado de
T. wallachiana, também produz taxol (Strobel et al., 1996). Com a descoberta de que
fungos endofíticos podem produzir taxol, visualizou-se um processo mais eficiente e
menos dispendioso para produção deste fármaco (Neto et al., 2003).
É importante compreender o papel que os fungos endofíticos desempenham nos
tecidos internos de seus hospedeiros, em ambientes tropicais, onde a diversidade
fúngica é maior.
2.3.3. Entrada, dispersão e transmissão dos fungos endofíticos
Folhas representam porta de entrada para fungos, por possuírem tecidos frágeis,
expostos e presença de estômatos (Souza et al., 2004). O ciclo de vida dos fungos tem
início quando estes entram em contato com a superfície da folha (Carroll, 1988),
germinam e penetram pela cutícula, estômatos (Herre et al., 2005) e secretam enzimas
hidrolíticas (Espósito & Azevedo, 2004). O sucesso da entrada depende da
diferenciação do micélio em apressório, que por força mecânica penetra no tecido. A
melanina tem participação nesse processo, pois apressórios não pigmentados não são
funcionais, tornando o fungo incapaz de penetrar (Dean, 1997). Fungos apresentam
preferência por folhas, representando bioquimicamente hábitats dinâmicos e locais da
fotossíntese (Arnold, 2005). Dentro da planta os fungos podem permanecer próximos ao
local de entrada ou disseminarem-se pelo sistema vascular (Zinniel et al., 2002),
podendo ser intracelulares, limitados a poucas células, intercelulares, localizados inter
e/ou intracelularmente, podendo se desenvolver em qualquer tecido do vegetal (Johri,
2006).
Fungos endofíticos podem ser transmitidos verticalmente quando penetram pelas
sementes ou raiz, horizontalmente quando penetram através dos estômatos ou
diretamente na parede celular utilizando apressórios e haustórios (Saikkonem et al.,
2004). Rodrigues & Samuels (1990) isolaram fungos endofíticos em folhas não
expandidas de Licuala ramsayi e sugeriram sua ocorrência devida à transmissão por
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
28
sementes. White Jr. et al. (1996) afirmam que Acremonium e Xylaria são transmitidos
verticalmente através das sementes, como outros endófitos mutualísticos.
2.3.4. Isolamento e identificação de fungos endofíticos
O conhecimento da comunidade endofítica começa no isolamento, realizado a
partir de folha, caule, raíz e estruturas florais. Silva et al. (2006) isolaram fungos
endofíticos de folhas, caule e raízes de pinha e graviola, observando variação nas taxas
de colonização em cada parte da planta. Segundo Araújo et al... (2005), plantas
amostradas devem representar da melhor forma possível a variabilidade do hospedeiro,
levando em consideração efeitos climáticos e fases fisiológicas da planta (crescimento,
florescimento e senescência).
Para isolamento do fungo endofítico, por ser assintomático, é necessária
eliminação dos epifíticos, realizando desinfestação, que varia de hospedeiro para
hospedeiro, dependendo da espessura da epiderme (Pereira, 1993). Plantas com folhas
espessas necessitam de desinfecção superficial mais rigorosa em relação às folhas
delicadas, onde maior tempo de exposição aos agentes desinfetantes pode eliminar os
fungos endofíticos (Mendes & Azevedo, 2007). Alguns apresentam crescimento
micelial lento, podendo crescer sobrepostos aos de crescimento mais rápido, ou mesmo,
nem crescer (Guimarães, 1998).
Fator importante para isolamento é a composição do meio de cultura que
estimula o crescimento dos fungos e a produção de compostos bioativos. Os meios mais
utilizados são: extrato de malte, batata-dextrose-ágar e extrato da planta de onde o fungo
foi isolado (Arnold, 2005), sendo acrescentado antibiótico para inibir o crescimento de
bactérias (GamboaGaitan, 2006). Deve-se levar em consideração a idade da planta,
tecidos utilizados, local e época da coleta (Azevedo, 1998).
A técnica mais utilizada para isolamento de fungos endofíticos é a desinfestação
superficial do material vegetal, variando a concentração e tempo de exposição das
substâncias utilizadas. Guo et al., (2001) apresentam técnica alternativa (técnica
molecular PCR) e conseguiram identificar fungos endofíticos pela extração de DNA a
partir de tecido do hospedeiro, sem precisar do crescimento fúngico em meio de cultura.
Técnicas utilizadas para avaliar a comunidade endofítica em plantas não permitem o
estudo de microrganismos não cultiváveis, restringindo os estudos a espécies cultivadas,
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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sendo necessário desenvolvimento de técnicas de biologia molecular, permitindo o
estudo dos fungos endofíticos em seu habitat (Lavaca et al., 2006).
GamboaGaitan (2006) sugere que a melhor amostragem dos fungos endofíticos
em uma espécie vegetal, é obtida em poucas amostras de muitas plantas. A maioria dos
autores não menciona a importância do tamanho das amostras; porém, trabalhos com
várias espécies tropicais indicam que a subdivisão na folha proporciona maior
diversidade fúngica, sendo importante o tamanho dos segmentos. Maior quantidade de
espécies é obtida dos menores fragmentos; reduzindo o tamanho da amostra e
explorando maior superfície da folha obtem-se melhores resultados.
A maioria dos fungos endofíticos é Ascomycota e seus anamorfos, representando
grupo antigo que coevoluiu com as plantas (Heckman et al., 2001), mas também há
Basidiomycota e Zygomycota. O uso de meios de cultura inespecíficos pode ser o
motivo da menor frequência de registros de Basidiomycota (Berbee, 2001) e
Zygomycota.
Dentre os fungos endofíticos mais frequentemente isolados estão: Colletotrichum
gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. in Penz., Cladosporium Link ex Fr., Phomopsis
(Sacc.) Bubák., Fusarium Link:Fr. e Xylaria L. (Araújo et al. 2001; Photita et al. 2001).
2.3.5. Interação fungo endofítico /hospedeiro A ausência de clorofila determinou a obtenção de alimento elaborado a partir do
meio, obrigando fungos a estabelecerem associações com organismos autotróficos e
heterotróficos (Menezes & Oliveira, 1993). A natureza destas associações é diversa e
exibe vários graus de interdependência nutricional (Petrini, 1986).
De Bary (1866, apud Pinto-Coelho, 2006) criou o termo simbiose para designar
toda e qualquer associação permanente entre indivíduos de espécies diferentes que
exerce influência recíproca no metabolismo. O termo simbiose significa literalmente
viver juntos e usualmente é empregado para descrever a biologia de pares de
organismos que vivem juntos, se beneficiando (Pinto-Coelho, 2006).
Nas comunidades bióticas de um ecossistema as formas de interação entre seres
vivos, denominadas relações ecológicas, se diferenciam pelos tipos de dependência que
os organismos mantêm entre si, podendo ser relações harmônicas ou desarmônicas
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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(Lopes, 2004). Interações planta/ fungo endofítico não são fixas em tempo ecológico,
evolutivo ou geograficamente, variando de mutualismo para antagonismo (Faeth &
Bultman, 2002), dependendo da filogenia, genética e condições abióticas dos
integrantes (Gehring et al., 1997). Na maioria dos casos, o hospedeiro ganha vantagem
na colonização pelo fungo. Este benefício é baseado no equilíbrio entre exigências do
invasor e resposta da planta. Se a interação torna-se desequilibrada, aparecem sintomas
da doença ou o fungo é excluído pelas reações de defesa da planta (Kogel et al., 2006).
A seleção da planta hospedeira é crucial para isolamento do fungo endofítico e
obtenção de compostos bioativos. A planta deve ser selecionada com base em seu
ambiente, histórico etnobotânico, endemismo, longevidade e áreas de maior
biodiversidade (Strobel et al., 2004).
A relação planta/ fungo endofítico pode ser: simbiótica, antagônica ou neutra.
Nas interações simbióticas, os fungos produzem ou induzem produção de metabólitos
primários e secundários que conferem vantagens à planta, como diminuição de
herbívoros e insetos e aumento da tolerância ao estresse abiótico (Araújo, 1996).
Neutralismo é, por definição, ausência de interação (Thompson, 1999). Em
comunidades ecológicas, muitos encontros são apenas oportunos, sem maiores
consequências para os indivíduos envolvidos (Costa, 2003). Fungos endofíticos
tropicais podem ser habitantes neutros, passageiros, ecologicamente sem importância ou
importantes habitantes de tecidos vegetais. O neutralismo pode ser a base da origem de
muitas interações. O encontro entre integrantes de duas espécies inicialmente é neutro e
com o passar das gerações a interação pode permanecer como tal ou evoluir (Arnold &
Lutzoni, 2007).
Os fungos endofíticos não induzem sintomas de doença entretanto, mantêm
mecanismos bioquímicos e genéticos requeridos para infecção e colonização das
plantas. De acordo com o comportamento dentro do tecido vegetal, fungos endofíticos
são divididos entre os que: 1) crescem ativamente dentro do hospedeiro, resultando em
extensa colonização; 2) crescem ativamente dentro do hospedeiro, colonizando apenas
áreas limitadas; 3) crescem pouco dentro do hospedeiro, ficando quiescente até a
senescência do vegetal; 4) crescem pouco dentro do hospedeiro, permanecendo
metabolicamente ativos (Rodrigues & Redman, 1997).
Saikkonen (2006) sugere que a natureza mutualística entre fungos
endofíticos/plantas está relacionada a diferenças genéticas dos envolvidos em resposta
às condições ambientais, espaço, estrutura e idade do hospedeiro.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
31
2.3.6. Especificidade do fungo endofítico pelo hospedeiro
Em geral as plantas apresentam em seu interior fungos endofíticos, alguns mais
frequentes em determinado tipo vegetal, designados dominantes, em contraposições a
outros mais raros. Segundo Rodrigues & Petrini (1997) condições climáticas podem
influênciar a colonização de plantas por fungos endofíticos.
Entre os simbiontes, especificidade não parece viável, visto que a probabilidade
de contato entre os parceiros é baixa. No entanto, nos trópicos podem existir casos
específicos de fungos endofíticos e hospedeiros naturais (Lodge & Cantrell, 1995).
Padrão de dominância de espécies foi verificado por Petrini et al. (1982), onde o fungo
isolado com maior frequência em um hospedeiro foi menos frequente no outro. Carroll
(1988) sugere que existem fungos endofíticos que apresentam especificidade por um
gênero ou família. San Martín & Rogers (1989), no México e Laessøe & Lodge (1994),
em Porto Rico, observaram especificidade de Xylaria axifera que só produz corpos
frutíferos em Schefflera caribeñas. Segundo estes autores a colonização das folhas de
uma planta hospedeira acontece quando, em condições naturais, o fungo enfrenta
competição de outros microrganismos. Rodrigues (1994) observou que alguns
endosimbiontes de palmeiras preferem tecidos foliares. Fisher et al. (1995), isolaram da
árvore tropical Gynoxis oleifolia (Asteraceae), fungos endofíticos apenas na raiz,
enquanto outras espécies foram isoladas da casca e folhas. Bayman et al. (1998)
isolaram fungos endofíticos em orquídeas, em florestas tropicais, e não encontraram
especificidade dos fungos pelos hospedeiros. Uma possível explicação é a grande
quantidade de espécies de plantas e espaçamento entre indivíduos de uma mesma
espécie. Os autores concluíram que a preferência por tecido vegetal não é universal para
plantas tropicais. Sieber et al. (1991) levantaram a hipótese de que cada espécie vegetal
desenvolve uma comunidade endófita específica.
Fisher & Petrini (1990) observaram especificidade entre tecidos do hospedeiro e
fungos endofíticos, isolando-os somente da casca. Rodrigues (1991) isolou fungos
endofíticos apenas dos vasos condutores, enquanto outros ocorreram na nervura central
das folhas. Pereira (1993) cita os gêneros Colletotrichum e Xylaria como fungos
endofíticos comuns em hospedeiros tropicais sem padrão de dominância, chamando-os
de endófitos ubíquos.
Segundo Rodrigues (1994) pouco se sabe sobre a distribuição de fungos
endofíticos em tecidos do mesmo vegetal, podendo-se encontrar diferentes espécies em
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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cada folha; esta preferência por diferentes tecidos vegetais pode ser interpretada como a
capacidade dos fungos utilizarem substratos específicos.
Gamboa & Bayman (2001) observaram que a especificidade hospedeiro/ fungo
endofítico nos trópicos, apresenta muitas especulações, baseadas em poucas
observações. O problema é o fato de muitos fungos endofíticos não serem identificados
por não esporularem em meios artificiais. A especificidade de tecidos permite melhor
repartição do recurso disponível, diminuindo a competição entre endosimbiontes
(GamboaGaitan, 2006).
2.3.7. Fungos endofíticos de ambientes tropicais
Florestas tropicais têm maior complexidade estrutural do que outros biomas, com
microclimas e microhabitas tanto horizontal como verticalmente (Lodge & Cantrell,
1995). É comum encontrar comunidades de fungos endofíticos que variam de acordo
com os estratos dentro do dossel. Estudos sugerem que existem diferenças na
composição das comunidades verticais endofíticas de diferentes espécies na mesma
floresta (Gamboa, 1998).
A diversidade vegetal em países de clima tropical, como o Brasil, é imensa.
Estima-se que cada espécie vegetal possua fungos endofíticos ainda não classificados e
com propriedades pouco conhecidas (Downing et al., 2000). A diversidade fúngica é
importante na decomposição da matéria orgânica, ciclagem de nutrientes, agregação do
solo e controle de fitopatógenos (Kennedy, 1999).
Hywel-Jones (1993) estima entre 1.5 e 13.5 milhões de fungos. Estimativas
mundiais do número total de espécies de fungos variam entre 1 e 1.5 milhões (Rossman,
1994). Dreyfuss & Chapela (1994) estimam cerca de 1,3 milhões somente de espécies
endofíticas nos trópicos. O cálculo do número total de espécies é baseado em razão
aritmética, entre número de espécies de plantas e fungos, utilizando a relação 6:1
(Lodge et al., 1996). Nenhuma planta estudada deixou de apresentar fungos endofíticos,
fundamentando a conclusão de Sieber et al. (1988) de que a presença dos fungos
endofíticos é fenômeno geral e comum.
A composição de fungos endofíticos é diferente entre zona temperada e tropical,
sendo provável que durante a evolução biológica a relação planta/ fungo endofítico
tenha se originado independentemente, considerando as diferenças climáticas e
biológicas destas regiões (GamboaGaitan, 2006).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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Segundo Hawksworth (2001), a diversidade de fungos é maior em florestas
tropicais, devido à grande quantidade de plantas, onde endófitos, sapróbios (Aptroot,
2001) e fitopatógenos se associam (Shivas & Hyde, 1997). Arnold (2005) concluiu que
fungos endofíticos tropicais podem ser hiperdiversificados. Interações biológicas,
ambiente e fatores históricos, influenciam a distribuição das plantas em florestas
tropicais e a presença dos fungos endofíticos pode estar condicionada à distribuição das
plantas tropicais (Fine et al., 2004). Segundo Piontelli et al. (2006), a presença universal
de fungos endofíticos é influenciada pelo tipo de vegetação, condições climáticas e
latitude. Comunidades de latitudes altas são caracterizadas por apresentar poucas
espécies de Ascomycota, considerando que fungos endofíticos tropicais apresentam
pequeno número de gêneros com grande número de espécies. Fungos endofíticos de
plantas tropicais têm variedade de hospedeiros e apresentam espécies raras, sendo
importante recuperar, identificar e elucidar os papéis ecológicos destes fungos de
florestas tropicais (Arnold & Lutzoni, 2007).
Investigações sobre fungos endofíticos tropicais foram realizadas por diversos
autores, entre os quais Dreyfuss & Petrini (1984); Rodrigues & Samuels (1990); Pereira
et al. (1993); Fisher et al. (1994); Rodrigues (1994); Fisher et al. (1995); Wright (1996).
2.3.8. Ocorrência de fungos endofíticos em Musa spp.
Estudos envolvendo fungos endofíticos em fruteiras são poucos no Brasil, com
relatos em açaizeiro (Euterpe oleracea Mart.) (Rodrigues 1994), coqueiro (Cocus
nucifera L.) (Mariano, 1997), citrus (Citrus limon L.) (Araújo et al. 2001; Dúran et al.
2005), cajá (Spondias mombin L.) (Rodrigues & Samuels 1999) e graviola (Silva et al.,
2006).
Simmonds (1963) isolou fungos endofíticos da raiz de bananeira, sendo
Colletotrichum o gênero mais comum. Brown et al. (1998) isolaram 24 espécies de
fungos endofíticos de folhas de bananeiras, em Hong Kong e na Austrália. Pereira et al.
(1999) isolaram 16 gêneros em folhas de bananeira (Musa acuminata), de três regiões
do estado de São Paulo. Xylaria sp., Colletotrichum musae (Berk. & M.A. Curtis) Arx e
Cordana musae (Zimm.) Höhn., foram os mais frequentes, confirmando que Xylaria é
comum em hospedeiros tropicais; a distribuição dos endófitos foi semelhante nas três
localidades. Segundo Carroll & Petrini (1983) Xylaria é capaz de utilizar celulose e
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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lignina, sendo poderoso decompositor de matéria orgânica após a morte das plantas. O
papel biológico das Xylariaceae é pouco estudado (Petrini & Petrini, 1985), existindo
também espécies fitopatogênicas (Rogers, 1979).
Pocasangre et al. (2000) isolaram 132 endófitos da raiz e rizoma de bananeiras,
de oito localidades da América Central, principalmente representantes dos gêneros
Fusarium, Trichoderma, Verticillium e Acremonium.
Photita et al. (2001) isolaram 61 endófitos de Musa acuminata, na Tailândia.
Xylaria e Guignardia cocoicola Punith. foram mais frequentes nas folhas e ausentes em
raiz e pecíolo. Colletotrichum gloeosporioides, C. musae, G. cocoicola, Mycelia sterilia
e Xylaria sp., foram os mais comuns. Vários endófitos isolados são fitopatógenos
estabelecidos de bananeira, dando apoio à hipótese de que o fungo endofítico é um
fitopatógeno em estado latente.
Cao et al. (2002) isolaram de folhas de bananeira (Musa acuminata), na China,
os seguintes endófitos: Gloeosporium musae, Myxosporium spp., Deightoniella torulosa
(Syd.) M.B. Ellis, Alternaria tenuis Nees, Sphaceloma spp., Aureobasidium spp.,
Meliola spp., Uncinula spp., Penicillium spp., Aspergillus spp., Sarcinella spp.,
Cladosporium sp., Cephalosporium sp. e Mycelia sterilia.
2.4. INTERAÇÃO PLANTA/FITOPATÓGENO
Plantas exibem resistência natural ao ataque de fitopatógenos e a ocorrência de
doenças é mais exceção que regra. A interação fitopatógeno/hospedeiro é luta entre dois
organismos pela própria sobrevivência, em que células vegetais reagem à penetração
através de mecanismos estruturais e/ou bioquímicos (Pascholatti & Leite, 1995).
Interações planta/fitopatógeno são de interesse para a humanidade, uma vez que
grande parte da economia mundial tem por base a utilização de vegetais, que sofrem
danos devido ao ataque de fitopatógenos. A devastação de uma espécie cultivada devido
à ação dos fungos tem como consequência a fome e a extinção do vegetal (Barbiere &
Carvalho, 2001).
O conhecimento de condições favoráveis aos fitopatógenos na interação
patógeno/hospedeiro é importante. O estádio fenológico em que o hospedeiro se torna
mais suscetível, a faixa de temperatura e a porcentagem de umidade relativa do ar, para
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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estabelecimento da doença deve ser definido para cada patossistema (Borges Neto et al.,
2000).
Relações planta/fitopatógeno são classificadas como: compatíveis (patógeno
virulento e hospedeiro suscetível) e incompatíveis (patógeno avirulentos e hospedeiro
resistente). Nas interações incompatíveis, o sistema de defesa da planta é ativado,
conduzindo à resistência, mas é tardiamente ativado ou não ativado em interações
compatíveis, condicionando a doença (Resende et al., 2003). Para ocorrência da doença
é necessário uma planta suscetível, um patógeno virulento e um ambiente favorável
(Agrios, 2005).
Bocchese et al. (2003) sugerem que onde o fungo se desenvolve pode ser fator
importante na virulência, e a interação fitopatógeno/hospedeiro é determinada
geneticamente, através dos mecanismos de ataque do fitopatógeno e defesa da planta.
As enzimas lipase, amilase e protease secretadas por fungos estão relacionadas com a
virulência. A relação virulência/atividade enzimática desempenha importante papel na
interação fitopatógeno/hospedeiro.
A comunidade endofítica, cuja composição varia em função do hospedeiro e das
condições ambientais, tem indivíduos que se inter-relacionam dentro da planta, em
equilíbrio harmônico. O desequilíbrio dessa harmonia afeta o comportamento de todos
os integrantes da comunidade, dando condições para que fungos oportunistas
manifestem seu potencial patológico (Maki, 2006).
De acordo com Chillet et al. (2006), o aumento na temperatura e períodos
chuvosos estão diretamente associada ao desenvolvimento da infecção por
Colletotrichum musae, resaltandos que a temperatura é fator preponderante ao
patossistema, acelerando as perdas provocadas pelo fitopatógeno.
Plantas coevoluíram com fungos e vários produtos excretados por elas favorecem
seu crescimento. Esta associação constante gerou a interdependência entre fungos
endofíticos /hospedeiro, onde a ocorrência de doenças é resultado do desequilíbrio
ecológico, microbiológico e nutricional da planta (Menezes, 2008).
2.4.1. Principais fitopatógenos da bananeira
Fitopatógenos estão entre os principais problemas fitossanitários da
bananicultura brasileira. As perdas podem chegar a 100%, quando o controle não é
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
36
efetuado corretamente. Danos nas folhas são os mais sérios problemas. Fungos
comprometem a fotossíntese, tamanho do fruto e número de pencas provocando redução
no crescimento das plantas. As doenças fúngicas afetam todo ciclo vegetativo e
produtivo das bananeiras, sendo fatores limitantes da produção (Costa Rabelo, 2007).
Muitas são as causas de perdas em pós-colheita, dentre elas, os de ordem
fitossanitária merecem especial atenção, haja vista ser um dos limitadores à
comercialização do fruto in natura, principalmente as ocasionadas por fungos que
podem chegar até 90% do total das perdas (Gullino, 1994). Duas doenças são
importantes na fase de pós-colheita: podridão da coroa, causada por Fusarium roseum,
Verticillium theobromae e Colletotrichum musae e antracnose, causada por C. musae
(Cordeiro & Matos, 2000).
Mesturino (1988) citou vários fungos associados a podridões em banana, na
Califórnia: Penicillium spp., Alternaria triticina, Cladosporium oxysporium,
Acremonium spp., Fusarium spp. e Eupenicillium, Acremonium strictum, Alternaria sp.,
Cladosporium sp., Curvularia brachyspora, Pestalotiopsis cruenta, Phoma joliana,
Verticillium theobromae, Aspergillus niger, A. flavus e A. fumigatus.
Lutchmeah & Santchurn (1991) realizaram levantamento da incidência de fungos
em banana cv. 'Naine', em Mauritius e constataram que Colletotrichum musae foi o
mais frequente, seguido por Fusarium spp., F. pallidoroseum, B. theobromae e C.
gloesporioides.
Dentre as doenças fúngicas que causam perda na qualidade e produtividade da
banana produzida no Brasil e no mundo, destacam-se: a Sigatoka amarela, causada por
Mycosphaerella musicola (Pseudocercospora musae), a Sigatoka negra, provocada por
M. fijiensis (Paracercospora fijiensis), o mal-do-panamá (Fusarium oxysporum f. sp.
cubense) e a antracnose (Colletotrichum musae) (Cordeiro & Kimati, 1997). M. fijiensis
constitui o principal fator de queda na produtividade dos bananais, com reduções de até
100% na produção comercial de bananas. O fungo necessita de condições ambientais
adequadas para seu desenvolvimento, sendo a temperatura a que afeta diretamente seu
ciclo. Regiões com elevadas temperaturas e umidade são propícias para sua
disseminação (Júnior et al., 2007).
No Brasil, a antracnose e a podridão da coroa são as principais doenças que
ocorrem em pós-colheita de banana, afetando a qualidade dos frutos. Outros
fitopatógenos estão associados a essas podridões em diferentes locais e épocas do ano,
como Thielaviopsis paradoxa (De Seynes) Höhn., Botryodiplodia theobromae Pat.,
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
37
Verticillium theobromae (Turconi) E.W. Mason & S. Hughes, Penicillium spp.,
Alternaria triticina Prasada & Prabhu, Alternaria sp., Cladosporium oxysporum Berk.
& M.A. Curtis, Cladosporium sp., Acremonium spp., Fusarium spp., Eupenicillium sp.,
Acremonium strictum W. Gams, Curvularia brachyspora Boedijn, Pestalotiopsis
cruenta (Syd.) Steyaert, Phoma jolyana Piroz. & Morgan-Jones, Aspergillus niger
Tiegh., A. flavus Link e A. fumigatus Fresen. (Alves et al., 1995).
A antracnose afeta folhas jovens e as lesões servem como porta de entrada para
fitopatógenos secundários, agravando a doença. Colletotrichum é um dos mais
importantes gêneros de fitopatógenos, especialmente nas regiões tropicais e subtropicais
do mundo (Mafacioli et al., 2006).
Moraes et al. (2006) determinaram a ocorrência e a frequência de fungos em
banana Prata Anã e o agente causal das podridões em pós-colheita de frutos, em Minas
Gerais, Brasil. Colletotrichum musae, Trichoderma harzianum, Fusarium equisetii,
Penicillium sp. Aspergillus parasiticus, Trichothecium roseum, Colletotrichum
acutatum, Alternaria sp., Cladosporium musae e Curvularia lunata foram os mais
frequentes. O modo de infecção latente, causada por Colletotrichum musae, parece
favorecer, primeiramente, a colonização interna dos tecidos e, posteriormente, a ação
dos fungos oportunistas, que aceleram as podridões.
Assunção et al. (2007) isolaram de folhas de bananeiras, das cultivares
‘Pacovan’, ‘Prata’ e ‘Nanicão’, com sintomas, em Pernambuco, Brasil, os seguintes
fitopatógenos: Pseudocercospora musae, Colletotrichum musae, Fusarium oxysporum,
Deightoniella torulosa e Cladosporium musae.
Medeiros et al. (2008) encontraram alta incidência de manchas e/ou podridões
que comprometeram a qualidade das bananas comercializadas em três estabelecimentos,
em Mossoró, Brasil; os fungos mais encontrados foram Colletotrichum gloeosporioides,
C. musae, Lasiodiplodia theobromae, Fusarium spp., Verticillium theobromae.
A correta identificação dos fitopatógenos da bananeira apresenta-se como objeto
para escolha dos tratamentos a ser utilizado, permitindo recuperação da cultura,
diminuindo os prejuízos.
2.5. CONTROLE BIOLÓGICO
A preocupação dos ambientalistas, autoridades governamentais e exigências dos
países importadores de frutas in natura têm sido crescentes quanto à qualidade do
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
38
produto (Lapeyre & Mourichon, 1998). Busca-se produção de alimento barato, de
melhor qualidade, sem destruir o ambiente. Alternativa viável e racional é a utilização
do controle biológico nos países em desenvolvimento e com áreas agricultáveis, como o
Brasil (Carvalho et al., 1999).
Produtos químicos têm sido usados na agricultura para proteção contra
fitopatógenos. Entretanto, seus efeitos nocivos têm estimulado a redução de seu uso e
adoção de métodos naturais menos agressivos. Os efeitos dos agroquímicos são: alto
custo, resíduos nos frutos, poluição ambiental, intoxicação do homem e animais,
resistência dos fitopatógenos, contaminação de fontes de água e destruição da
microflora do solo (Vilas Boas et al., 2002). O controle biológico se baseia em métodos
ambientalmente corretos, podendo fazer parte do controle integrado de doenças
(Grigoletti Jr. et al., 2000). Uso indiscriminado de fungicidas, inseticidas e adubações
desequilibradas causam desvios metabólicos nas plantas, reduzindo a biodiversidade
dos ecossistemas (Menezes, 2008).
Para obter um processo saudável de produção agrícola, uma vez que doença de
planta é sinônimo de desequilíbrio, o controle biológico deve ser acompanhado por
outras medidas que tenham por objetivo equilibrar os agroecossistemas (Lucon, 2008).
2.5.1. Conceito de controle biológico
Os primeiros relatos sobre controle biológico datam de 1.200 a.C. , quando
chineses faziam pontes de bambu entre uma árvore e outra, facilitando a passagem de
formigas predadoras de lagartas. O controle biológico com fungos endofíticos teve
início no Havaí, em 1967, com Acremonium sp., contra Kolomona surattensis (erva
daninha), ocorrendo assim, o primeiro controle biológico de sucesso (Trujillo, 2005).
Segundo Carvalho et al. (1999), o controle biológico não é nova descoberta ou
tecnologia, sendo utilizado há mais de 120 anos e os fungos foram os primeiros
microrganismos explorados para o controle biológico (Azevedo et al., 2007), devido à
produção de metabólitos secundários (Pinto et al., 2002).
Baker & Cook (1974) definem controle biológico como 'redução da densidade de
inóculo ou das atividades determinantes da doença provocada por um fitopatógeno ou
parasita nos estados de atividade ou dormência, por um ou mais organismos, realizado
naturalmente ou através da manipulação do ambiente, hospedeiro ou antagonista, ou
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
39
introdução em massa de um ou mais antagonistas'. Definição simplificada por Cook &
Baker (1983) como 'controle biológico é a redução da soma de inóculo ou das
atividades determinantes da doença provocada por um fitopatógeno, realizada por um
ou mais organismos que não o homem'. Controle biológico é o controle de um
microrganismo através da ação direta de outro microrganismo antagônico, o qual pode
atuar por meio de antibiose, parasitismo, competição, predação ou hipovirulência
(Bettiol & Ghini, 1995). Para Hanson & Hilje (1993), controle biológico parte do
princípio de que na natureza todo organismo tem um ou mais antagonistas que o
eliminam ou competem com ele. Segundo Grønvold et al. (1996), controle biológico é a
utilização de antagonistas naturais, para diminuir a um limite economicamente aceitável
os fitopatógenos. O princípio básico do controle biológico está na ação exercida por
determinados microrganismos, que eliminam, impedem ou reduzem o desenvolvimento
de fitopatógenos (Menten, 1996). Em espécies cultivadas, o controle busca reduzir o uso
de agroquímicos (Azevedo et al., 2007).
Definições de biocontrole diferem entre autores, porém, controle biológico pode
ser definido como a supressão das atividades de um organismo prejudicial por um ou
mais organismos, referidos como inimigos naturais.
2.5.2. Fungos antagonistas
Sikora (1992) define o termo 'antagonista' como microrganismos que atuam
como parasitos, predadores e competidores que repelem, inibem ou matam nematóides,
insetos e fitopatógenos. Os antagonistas dependem das condições ambientais e
mecanismos que atuam no controle de doenças (Howell, 2003).
O termo antagonista emprega-se a agentes biológicos com potencial para
interferir nos processos vitais dos fitopatógenos. Desta forma o nicho ecológico
ocupado pelos fungos endofíticos favorece o controle biológico, pois neste local
competem por nutrientes e espaços com fitopatógenos, produzem substâncias tóxicas ou
induzem a planta a desenvolver resistência às doenças (Melo & Azevedo, 1998). Para
manutenção do sistema biológico, a população fúngica é regulada por antagonistas que
ocorrem na natureza. Na ausência de antagonistas, a população pode aumentar (Mota et
al., 2003).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
40
Uma das dificuldades na utilização de antagonistas para controle de
fitopatógenos é a impossibilidade de controle nas condições ambientais (Wilson &
Pusey, 1985). Um fungo pode ser excelente antagonista em laboratório e não
demonstrar atividade na natureza, por não colonizar o hospedeiro (Andrews, 1985).
Casos de controle eficiente foram realizados em condições controladas de casa de
vegetação (Oliveira et al., 2003).
Fungos endofíticos isolados de tecidos de plantas apresentam elevado potencial
como agentes de biocontrole contra fitopatógenos, insetos (Azevedo et al., 2007) e
nematóides (Hallmann et al., 1998). Gêneros citados como controladores de
fitopatógenos são: Acremonium, Anthostomella, Chrysporium, Cladosporium,
Colletotrichum, Coniothyrium, Lasiodiplodia, Libertella, Nodulisporium,
Phaeosphaeria, Phialophora, Phoma, Phomatospora, Phomopsis, Scopulariopsis,
Verticillium e Xylaria (Petrini et al., 1992).
Os seguintes fungos são citados como antagonistas contra fitopatógenos:
Gliocladium no controle de Phytophthora (Smith et al., 1990), Trichoderma harzianum
no controle da vassoura-de-bruxa do cacaueiro (De Marco et al., 2000). Dicyma
pulvinata no controle do mal-da-serigueira (Mello et al., 2005). Vale salientar que em
90% dos antagonistas utilizados há participação de diferentes espécies do gênero
Trichoderma (Benitez et al., 2004). O comportamento desses fungos como antagonistas
é essencial para seu uso em biocontrole, pois podem atuar utilizando vários mecanismos
(Küçuk & Kivanç, 2003).
No Brasil o controle biológico começou a ser utilizado com Metarhizium
anisopliae (Metschn.) Sorokīn, no controle da cigarrinha da cana-de-açucar (Athayde et
al., 2001). Na cultura do cacau, Trichoderma tem sido utilizado para o controle de
Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer, agente causal da vassoura de bruxa, mostrando
ser importante estratégia para redução de compostos químicos (Neto et al., 2003).
As chances de obtenção de microrganismos com potencial antagônico são
aumentadas com isolamentos no próprio ambiente onde serão usados tornando-os
adaptados a sobreviver (Betiol, 1997). Em muitos casos a seleção de antagonistas é
baseada unicamente em ensaios in vitro considerando seu baixo custo e rapidez;
entretanto, há baixa correlação dos resultados obtidos em condições de laboratório com
os observados nas condições de campo. A seleção baseada unicamente em ensaios de
campo, embora possa resultar em dados consistentes, demanda muito espaço
(Macagnan, 2005).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
41
Trabalhos sempre mencionam cautela a respeito de metodologias de seleção de
fungos endofíticos e sua inconsistente atividade em condições de campo (Cook, 1993).
Entretanto, não é possível eliminar testes de laboratório como ferramenta para
determinar o possível modo de ação do antagonista (Barretti et al., 2000).
O êxito da maioria dos fungos se deve à alta capacidade de reprodução,
habilidade para sobreviver em condições desfavoráveis, eficiência no uso de nutrientes,
promoção de crescimento e indução dos mecanismos de defesa das plantas (Sikora &
Pocasangre, 2008).
Existem perspectivas para utilização de fungos antagônicos no controle de
fitopatógenos de plantas tropicais. A substituição de fungicidas por fungos endofíticos
constitui fator favorável para a agricultura, em termo de segurança alimentar.
2.5.3. Controle biológico de fitopatógenos por fungos endofíticos
Na natureza ocorrem interações contínuas entre fitopatógenos e antagonistas,
onde o controle biológico funciona naturalmente (Silva & Mello, 2007). A estreita
relação fungos endofíticos /hospedeiro torna-os candidatos naturais, utilizados como
agentes de controle de doenças, por ocuparem o mesmo nicho ecológico dos
fitopatógenos (Hallmann et al., 1997).
A identificação correta do agente causal das doenças constitui base para a
estratégia de controle; o desenvolvimento dessas estratégias requer conhecimento do
ciclo de vida do fitopatógeno, tipo de inóculo, forma de dispersão, modo e momento em
que a infecção ocorre e mecanismos do hospedeiro que regulam a infecção (Johnson &
Sangchote, 1994). Segundo Neto et al. (2003), fungos endofíticos desempenham função
na sanidade vegetal por atuarem como agentes controladores de fitopatógenos. A
capacidade de fungos não patogênicos ou hipovirulentos em proteger plantas contra
fitopatógenos tem sido relatada com importância no desenvolvimento de práticas para a
agricultura (Nel et al., 2006).
Pesquisas demonstram importância e eficiência de alguns fungos no controle
biológico de fitopatógenos, apresentando as seguintes vantagens: alta capacidade
reprodutiva, ciclo de vida curto, coloniza somente o hospedeiro, produz estruturas de
resistência e sobrevive por longo período na ausência do hospedeiro (Kendrick, 1995).
Raramente o controle biológico erradica fitopatógenos, porém, melhora a qualidade de
vida do ambiente. Fungos endofíticos usados no biocontrole são seguros, não poluem,
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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atacam apenas seu alvo, são compatíveis com práticas agrícolas e efetivos em termos de
custos. Ao contrário do químico, não apresenta efeito imediato (Bettiol & Ghini, 1995).
Estudos utilizando fungos endofíticos no controle de fitopatógenos são citados
como medida de controle biológico. Christensen et al. (1991) testaram isolados de
Acremonium, provando in vitro ação inibitória contra os fitopatógenos Puccinia
coronata, Colletotrichum graminicola e Drechslera erythrospila. Reis et al. (1995)
utilizaram Trichoderma spp. na forma de pó biológico para controle de Fusarium
oxysporum f. sp. phaseoli, em casa de vegetação, obtendo resultados positivos na
redução da doença.
A agricultura alternativa busca medidas de proteção das plantas contra
fitopatógenos, utilizando o controle biológico, através dos fungos endofíticos.
2.6. FUNGOS ENDOFÍTICOS PRODUTORES DE SUBSTÂNCIAS
ANTIMICROBIANAS
A indústria farmacêutica tem estudado o potencial dos metabólitos fúngicos para
desenvolvimento de novos fármacos (Singh et al., 2004). A busca de substâncias
naturais para o homem é uma das atividades mais antigas. No Brasil as plantas têm sido
os organismos vivos mais investigados como fonte de produtos naturais (Bras-Filho,
1994). Microrganismos, organismos marinhos e insetos também são fontes de
substâncias para a humanidade (Natori et al., 1981). Como o Brasil ocupa destaque na
biodiversidade, espera-se a descoberta de novas substâncias.
Os fungos endofíticos contribuem para seu hospedeiro, produzindo substâncias
que fornecem proteção e sobrevivência à planta. Estes compostos, uma vez isolados,
podem ter potencial para uso na medicina, agricultura e indústria. Antibióticos,
antimicóticos, imunossupressores e antineoplásicos são alguns exemplos do que foi
encontrado após o isolamento e cultivo desses fungos. Perspectivas de encontrar novos
medicamentos eficazes para tratamento de doenças em seres humanos, plantas e animais
são grandes (Strobel et al., 2004).
Fungos endofíticos são capazes de produzirem anti-helmínticos e inseticidas
(Espósito & Azevedo, 2004), apresentando potencial a ser explorado na agricultura
(Zou & Tan, 2001). Schulz et al. (2002) sugerem que a associação entre fungos
endofíticos e seus hospedeiros conduza à produção de metabólitos secundários com
atividade antimicrobiana e anti-herbicida.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
43
Diversos autores relatam à ação antimicrobiana de substâncias produzidas por
fungos endofíticos como Rodrigues et al., (2000), Liu et al. (2001), Stinson et al.
(2003), Bao & Lazarivits (2001), Huang et al., (2001), Strobel (2003), Rodrigues et al.
(2004), Chareprasert et al. (2006).
Fisher et al. (1984) isolaram fungos endofíticos de Ericaceae com atividades
antifúngicas e antibacteriana. Gallagher et al., (1994) isolaram de Lupinus angustifolius,
na Austrália, Phomopsis leptostromiformis (J.G. Kühn) Bubák, produtor de fomopsina,
toxina hepatocarcinógena.
Li et al., (1997) citam Pestalotiopsis guepinii (Desm.) Steyaert, endofítico de
Wolemia nobilis (Araucaraceae), como produtor de taxol. Os autores sugerem que o
fungo tenha adquirido à 'habilidade' de produzir taxol, transferindo-a para W. nobilis.
Peláez et al., (1998) isolaram fungos endofíticos de plantas medicinais, na
Espanha, onde 27% das espécies produziram compostos antimicrobianos.
Rodrigues et al., (2000) pesquisaram compostos bioativos, produzidos por
endófitos isolados da planta medicinal Spondias mombin L. (Anacardiaceae).
Guignardia sp., Phomopsis sp. e Pestalotiopsis guepinii, foram testados contra
actinomicetos, bactérias, leveduras e fungos filamentosos, inibindo o crescimento de
todos os microrganismos.
Liu et al., (2001) constataram atividade antifúngica dos fungos endofíticos
isolados de Artemisia annua sobre os fitopatógenos Gaeumannomyces graminis var.
tritici J. Walker, Fusarium graminearum Schwabe, Rhizoctnia cerealis, Phytophthora
capsici, Helminthosporium sativum e Gerlachia nivalis (Ces. ex Berl. & Voglino) W.
Gams & E. Müll.
Huang et al. (2001) testaram à atividade antitumoral e antifúngica de fungos
endofíticos das plantas medicinais Taxus mairei, Cephalataxus fortunei e Torreya
grandis, na China. Constataram que 52,3% dos isolados inibiram o crescimento de
Fusarium sp. e Paecilomyces.
Cafêu et al. (2005) realizaram estudos químicos dos extratos produzidos por
Xylaria sp., isolada de Palicourea marcgravii obtendo as seguintes substâncias: 7-
declorogriseofulvina, citocalasina B e griseofulvina, que apresentaram atividade
antifúngica contra Cladosporium cladosporioides (Fres) G.A. de Vries e C.
sphaerospermum Penz.
De estudos realizados em folhas saudáveis de Cryptocarya mandioccana, da
Floresta Atlântica, resultou o isolamento de Colletotrichum gloeosporioides; dessa
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
44
espécie foram isoladas substâncias deoxiscitalona e tetralona, com atividade antifúngica
contra Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum Penz. comparável a
atividade da nistatina (Inácio et al., 2006). Os autores sugerem que a atividade
apresentada pelos metabólitos secundários produzidos por C. gloeosporioides esteja
relacionada à função de proteção da planta contra fitopatógenos, demonstrando
significado ecológico do estudo dos fungos endofíticos.
Gallo et al. (2007) isolaram Papulospora sp. e Curvularia lunata var. aeria,
endofiticamente das folhas de Smallanthus sonchifolius (planta medicinal), que testadas
in vitro sobre células humanas apresentaram elevada citotoxicidade inibindo a
proliferação celular em mais de 75%.
No Brasil vários autores citam a produção de fármacos por fungos endofíticos
como Xylaria sp., Fusarium moniliforme, Colletotrichum sp., Guignardia sp. e
Phomopsis sp. (Gomes, 2008).
Efeitos atribuídos aos fungos endofíticos revelam sua potencialidade como
produtores de metabólitos secundários, apresentando potencial econômico na medicina,
agricultura, indústria alimentícia e farmacêutica (GamboaGaitan, 2006).
2.6.1. Produção de enzimas extracelulares
Produção de enzimas é comum em fungos, tornando-os importantes sob o ponto
de vista industrial. Fungos necessitam de sistema enzimático para degradação de
substâncias, cujos subprodutos utilizam na sua alimentação. As principais fontes
biológicas de enzimas são: fungos filamentosos (60%), bactérias (24%), animal (6%),
planta (4%), levedura (4%), e Streptomyces (2%) (Zaks & Dodds, 1998).
A hifa dos fungos filamentosos está capacitada para utilizar substratos através do
crescimento e penetração. Os fungos são capazes de secretar enzimas, quebrar
compostos macromoleculares e utilizar os produtos para seu crescimento e
metabolismo. Produzem enzimas extracelulares importantes na degradação e transporte
de nutrientes para a célula e no processo de patogênese (Bateman & Basham, 1976),
podendo a produção de enzima extracelular ser indicativa da característica patogênica
dos fungos (Silva et al., 2006).
Diversos autores como Chet (1992); Chet & Inbar (1994); De La Cruz et al.
(1995); Lima et al. (1999); De Marco et al. (2000), apresentam informações sobre
desempenho das enzimas micolíticas na hidrólise da parede de fitopatógenos.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
45
Estudos in vitro mostram que tanto o fungo endofítico como a planta secreta
metabólitos tóxicos para ambos, fato estranho numa interação assintomática; na
interação de patogenicidade o fungo produz metabólito tóxico e em resposta a planta
produz metabólitos de defesa (Agrios, 2005). Schulz & Boyle (2005) concluíram que
colonização assintomática é consequência da interação antagônica balanceada entre o
vegetal e o fungo. Estes autores relatam que fungos endofíticos produzem exoenzimas
necessárias para infectar o hospedeiro e a maioria é capaz de produzir micotoxinas
fitotóxicas. O hospedeiro pode agir com as mesmas defesas contra um fitopatógeno,
com produção de metabólitos e respostas mecânicas, havendo uma estreita harmonia
entre virulência fúngica e defesa da planta. Se esse equilíbrio é afetado, tanto por
diminuição na defesa da planta como por aumento da virulência fúngica, ocorre a
doença.
Espécies de Trichoderma produzem exoglucanases e endoglucanases, celobiase e
quitinase, enzimas utilizadas na degradação e lise da parede celular de fitopatógenos
(Papavizas, 1985). Enzimas hidrolíticas extracelulares produzidas por Trichoderma são
consideradas de importância determinante na habilidade antagonista desse fungo
(Thrane et al.., 2000). O papel de cada proteína parece ser diferente. Quitanases,
celulases, glucanases e proteases quebram as estruturas dos fitopatógenos,
características comuns em agentes de biocontrole (Lorito et al.., 1996). As espécies de
Trichoderma são economicamente importantes devido à produção de enzimas
industriais e antibióticos.
2.6.2. Produção de metabólitos por fungos
fungos endofíticos, fitopatógenos, entomopatógenos, rizosféricos, leveduras do
solo e isolados de organismos marinhos, são os seres vivos que mais fornecem
metabólitos (Takahashi & Lucas, 2008). Fungo endofítico tem capacidade de produzir
alcalóide, peptídeo, esteróide, terpenóide, isocoumarin, quinona, fenilpropanóide,
lignana, fenól, ácido fenólico, composto alifático e lactona (Gallo et al., 2007).
Constituem importantes fontes de substâncias químicas com potencial biológico.
Metabólitos secundários são micromoleculares, não apresentam funções básicas e
sua produção depende do tipo de organismo (Nosov, 1994). A pesquisa de metabólitos
secundários provenientes de fungos endofíticos teve início com plantas medicinais
(Rodrigues & Samuels, 1999).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
46
Metabólitos secundários produzidos por fungos endofíticos podem controlar
fitopatógenos (Fisher et al., 1986). A produção de antibióticos como metabólito
secundário é comum para fungos (Bélanger et al., 1995); seu efeito mostra similaridade
com uso de fungicidas, sua produção e permanência na superfície da folha podem
proporcionar eficiente controle de fitopatógenos. Muitos metabólitos secundários
acumulados pelas plantas são induzidos por fitopatógenos, denominados fitoalexinas
(Desjardins et al., 1989).
Evidências sugerem que fungos endofíticos possuem grande diversidade
genética, implicando importância prática com relação à descoberta de novos metabólitos
secundários bioativos (Hellwing et al., 2002).
A grande vantagem da utilização química de metabólitos fúngicos em relação às
demais fontes, é o fato de que microrganismos podem ser cultivados em larga escala em
fermentadores, não havendo prejuízo ao ecossistema, com a retirada de plantas, nem
problemas éticos como os que podem advir da prospecção de metabólitos bioativos a
partir de insetos, anfíbios e outras espécies animais (Takahashi & Lucas, 2008).
Fungos endofíticos podem ser utilizados como fontes de metabólitos primários
(Stamford et al., 1998) e secundários que inibem o desenvolvimento de fitopatógenos
(Li et al., 2001). Considerando-se a grande diversidade fúngica e especificidade pelo
hospedeiro, existem poucos trabalhos em relação aos metabólitos produzidos pelos
fungos endofíticos (Santos et al., 2008).
2.6.3. Metabólitos voláteis
Vários fungos utilizados no controle biológico de fitopatógenos podem sintetizar
metabólitos capazes de promover a fungistase. Esses metabólitos podem ser de natureza
volátil ou não volátil e os primeiros têm maior facilidade de difusão no solo (Junior &
Abreu, 2000).
De acordo com Dennis & Webster (1971a,b), metabólitos voláteis são os gases
etileno, cianeto de hidrogênio, acetaldeído, acetona, etanol e dióxido de carbono, que
afetam o crescimento microbiano. Mangenot & Diem (1979), citam CO2 e amônia como
substâncias voláteis produzidas por antagonistas, e seus efeitos em fungos pode ser
estimulante ou inibitório.
Trichoderma e Acremonium produzem substâncias voláteis e não voláteis (White
Jr. & Cole, 1985), inibindo o crescimento de fungos (Hawker, 1950). A principal
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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substância isolada de Trichoderma é trichodermin (Hutchinson & Cowan, 1972),
eficiente contra fitopatógenos, atuando na produção de metabólitos voláteis e não
voláteis (Claydon et al., 1987). Sunesson et al. (1995) identificaram em Cladosporium
cladosporioides e Paecilomyces variotii, metabólitos voláteis (hidrocarbonetos, álcoois,
cetonas, éteres, ésteres, compostos contendo enxofre, e terpenos), in vitro. Strobel et al.
(2001) isolaram Muscador albus, produtor de substâncias voláteis (álcoois, ésteres,
cetonas, ácidos e lipídios), inibindo fungos. No entanto, em conjunto agem
sinergicamente contra plantas, humanos, fungos e bactérias patogênicas.
Muscodor albus isolada de Cinnamomum zeylnicum (canela) apresentou ação
fungicida, fungistática, bactericida e bacteriostática por emissão de compostos voláteis,
tornando-se importante no controle de doenças pós-colheita (Ezra & Strobel, 2003).
Stinson et al. (2003) isolaram Gliocladium sp. de Eucryphia cordifolia, na
Patagônia, produtor de compostos voláteis, letal para Pythium ultimum Trow e
Verticillum dahliae Kleb. Strobel et al. (2007) isolaram Muscodor albus de Guazuma
ulmifolia (Sterculiaceae), no Equador. O fungo produziu compostos voláteis
(cariofileno; feniletil álcool, ácido acético, éster; bulneseno e ácido propanóico), com
atividade antibiótica. Segundo os autores o fungo pode ser útil na medicina, na
agricultura e na indústria.
Strobel et al. (2008) isolaram Gliocladium roseum em folhas de Eucryphia
(Ulmo) (cordifolia), que produziu hidrocarbonetos voláteis in vitro contra Muscodor
albus. Os autores sugerem que a produção de substâncias voláteis de alta energia é de
interesse, como fonte alternativa de combustível.
2.7. MÉTODOS DE SELEÇÃO DE ANTAGONISTAS IN VITRO
Segundo Díaz & Labrador (1974), para ser eficaz o antagonista deve ser
geneticamente estável, efetivo em baixas concentrações de fácil reprodução em meio de
cultivo artificial, não tóxico para seres vivos e o ambiente, resistente aos pesticidas,
compatível com tratamentos químicos e físicos e ativo contra fitopatógenos.
A seleção de fungos antagônicos pode ser realizada in vitro ou in vivo, em
condições controladas ou condições naturais. Os principais métodos de seleção de
fungos endofíticos in vitro são: pareamento de cultura, papel celofane e placa
sobreposta. A maioria dos trabalhos abrange uma seleção inicial em laboratório, para
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
48
posteriormente testar in vivo, em casa de vegetação e no campo sob condições
controladas (Mariano, 1993).
Métodos de seleção in vitro podem ser qualitativos e quantitativos. Os
qualitativos são realizados simultaneamente ao isolamento dos antagonistas, com
finalidade de abreviar o processo de seleção. A partir de amostras de solo ou tecidos
vegetais sadios, os antagonistas são pré-selecionados para ensaios quantitativos. Para
seleção de biocontroladores, os métodos qualitativos são menos utilizados que os
quantitativos. Entre os quantitativos, estão os métodos do ágar em placa, do ágar em
lâmina e meio líquido. Dependendo dos objetivos do estudo, pode-se optar pelos
métodos da cultura pareada, do papel celofane e da placa sobreposta (Pileggi, 2006).
O método da cultura pareada ou pareamento é comumente utilizado em estudos
de antagonismo in vitro. Consiste em diversas formas de plaqueamento de antagonista e
fitopatógeno em placas de Petri, contendo meios de cultura adequados ao crescimento
de ambos. Em se tratando de dois fungos, deve-se observar a taxa de crescimento, a fim
de que ocorra igualdade de condições competitivas (Pileggi, 2006).
Microrganismos selecionados como antagonistas, para serem utilizados em
campo, devem possuir especificidade de ação, alta capacidade reprodutiva e suportar
condições ambientais no local em que o controle será realizado. As formulações devem
oferecer segurança aos seres vivos, ao ambiente e ser efetivos para o fitopatógeno
(Grønvold et al., 1996). Critérios de seleção são importantes na escolha de antagonistas,
determinando chances de sucesso do controle biológico. Geralmente a seleção de
antagonistas é baseada em ensaios in vitro considerando seu baixo custo e rapidez
(Bettiol, 1997).
Métodos in vitro são práticos, servem como seleção preliminar para avaliar a
capacidade antagonista e indicar o comportamento do antagonista com relação à sua
capacidade de adaptação, crescimento e reprodução in vitro. Existem restrições com a
realização desses testes para seleção, pois, na maioria das vezes, os resultados positivos
obtidos in vitro, ou em condições controladas, não coincidem ou, às vezes, são opostos
àqueles obtidos in vivo (Grigoletti Jr. et al., 2000).
A seleção baseia-se em evidências de que o fungo endofítico interfere no
desenvolvimento do fitopatógeno, destruindo ou inibindo (Rubini et al., 2005).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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2.8. MECANISMO DE AÇÃO ANTAGONISTA CONTRA FITOPATÓGENO
Fungos endofíticos podem agir de maneira antagônica, neutra ou benéfica para o
hospedeiro, exibindo graus de interdependência fisiológica e ecológica. Metabólitos
produzidos por fungos podem ser neutros, ter ação antagônica para o hospedeiro ou
importante na produção de fármacos (Pimentel et al., 2006).
Quando o agente de biocontrole é um fungo endofítico, o mecanismo se dá como
resultado de sua habilidade para produzir metabólitos que impedem a germinação dos
conídios, inibindo a ação do fitopatógeno (Benítez et al., 2004).
O antagonismo acontece quando dois microrganismos vivem em um mesmo
ambiente e um deles produz alguma substância que inibe o crescimento do outro
(Brock, 2000). O controle biológico exercido por um ou mais fungos, age reduzindo o
inóculo e a capacidade do fitopatógeno em causar doença (Romeiro, 1995).
Mecanismos básicos de ação dos antagonistas para controlar o crescimento dos
fitopatógenos são: antibiose, competição por espaço e nutrientes, micoparasitismo,
predação, indução de resistência e secreção de substâncias antibióticas (Fernández-
Larrea, 2001). Os mecanismos podem ser influenciados pela temperatura e substratos
que limitam o crescimento do fungo (Howell, 2003), podendo ocorrer simultaneamente
durante o processo de vida do antagonista (Martins-Corder & Melo, 1998).
Os antagonistas não possuem um único modo de ação, e a multiplicidade é
importante para a seleção, pois ao possuir vários modos de ação, são reduzidos os riscos
de resistência do fitopatógeno (Estay, 2006).
2.8.1. Antibiose
Antibiose é o antagonismo entre dois organismos no qual um ou mais
metabólitos são produzidos por um dos organismos envolvidos com efeito negativo
sobre o outro, inibindo atividades celulares vitais (germinação de conídios). Fenômeno
responsável pela atividade biocontroladora de muitos organismos (Guerrero, 2004).
No controle biológico exercido por antibiose existe relação entre densidade de
inóculo dos biocontroladores e efetividade do controle, quer o controle seja exercido por
fungos ou bactérias (Silva et al., 2008).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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2.8.2. Competição por espaço e nutrientes
Competição por nutrientes está envolvida em situações na qual o antagonista
consome nutriente tornando-os indisponíveis aos fitopatógenos que deles necessitam
para desencadear o processo de patogênese (Edwards & Blakeman, 1984). Köhl &
Fokkema (1998) consideraram a competição por nutrientes importante mecanismo de
biocontrole a ser explorado no controle de fitopatógenos que apresentam fase saprofítica
antes de sua penetração no hospedeiro e que fitopatógenos biotróficos não são afetados
por esse mecanismo de biocontrole.
Os microrganismos que têm capacidade de competir por sítios de infecção e usar
nutrientes disponíveis podem deslocar o fitopatógeno por impedir a germinação de
propágulos ou sua infecção (Punja & Utkhede, 2003).
2.8.3. Indução de resistência
Na planta devem existir mecanismos gerais de resistência, que lhes permitam
manter-se sem sintomas de doenças em presença de grande número de potenciais
agentes patogênicos. Os mecanismos de resistência das plantas às doenças podem
agrupar-se em barreiras morfológicas ou estruturais físicas e barreiras químicas
(Ingham, 1973).
Entende-se por resistência induzida, proteção cruzada ou proteção induzida, a
inoculação prévia no hospedeiro com alguns microrganismos não patogênicos ou raças
avirulentas de vários fitopatógenos para proteger o hospedeiro contra inoculação
subsequente de raças virulentas (Toda Fruta, 2008).
A indução de resistência envolve ativação de mecanismos de defesa latente
existente nas plantas, em resposta ao tratamento com agentes bióticos ou abióticos
(Hammerschmidt & Dann, 1997). Esses mecanismos de resistência induzidos podem ser
estruturas, como papila, lignificação e tilose ou bioquímicos, como acúmulo de
fitoalexinas e proteínas relacionadas à patogênese (Pascholati & Leite, 1995). Essa
ativação pode ser obtida pelo tratamento com agentes bióticos (Stangarlin & Pascholati,
2004) ou abióticos (Hijwegnwn et al., 1996). Moléculas e agentes de origem biótica ou
abiótica, capazes de ativar ou induzir resposta de defesa nas plantas, são chamados de
elicitores (Smith, 1996).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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A principal característica de indução de resistência está na ação do indutor
sentido no metabolismo do hospedeiro, modificando-o para atuar nas fases de pós-
penetração do fitopatógeno. O fenômeno da resistência não pode ser considerado como
estático ou absoluto. As plantas apresentam diferentes graus de resistência em função da
idade, órgão, nutrição e temperatura. O agente indutor pode ser: ativador químico, luz
ultravioleta, compostos naturais de plantas e microrganismos antagonistas (Benhamou
& Belanger, 1998).
Pêlos e ceras na superfície dos tecidos, espessura e dureza da cutícula, parede
externa das células epidérmicas, tamanho e forma dos estômatos, presença e
distribuição de esclerênquima, são considerados barreiras físicas à entrada do
fitopatógeno (Rodrigues, 1980). Em bananeiras a produção de ceras pelas folhas e
densidade de estômatos na cutícula é citada como mecanismos de resistência à Sigatoka
negra (Ortiz & Vuylsteke, 1994).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Áreas de coletas O município de Belo Jardim situa-se na microrregião do Vale do Ipojuca,
integrando a mesorregião do Agreste Pernambucano. Ocupa 754Km² e 0,77% da área
total do Estado (CONDEPE/FIDEM, 2005). Do ponto de vista climático a região é
considerada intermediária entre áreas de clima úmido (Zona da Mata) e seco (Sertão)
(Cabral et al., 2004).
As microrregiões apresentam clima influenciado pela altitude, devido à posição
elevada de suas terras. O clima, segundo a classificação de Köppen, é do tipo Bshs,
quente semi-árido, com temperatura média em torno de 26ºC, sendo o mês de julho com
as mais baixas temperaturas, 18ºC. A precipitação pluviométrica média anual é de 955,6
milímetros, índice elevado para a região semi-árida, justificado pela presença de
microclimas correspondentes aos brejos e altitude média em torno de 650m acima do
nível do mar (SECTMA-PE, 2008). Período médio chuvoso ocorre de março a julho e
período de estiagem de setembro a fevereiro (Salgueiro, 2005).
A vegetação é formada por Floresta subcaducifólia. A área é considerada brejo de
altitude, devido à presença de fragmentos de floresta tropical úmida similar à Mata
Atlântica, com ambientes considerados "pequenas ilhas de florestas isoladas",
apresentando taxas pluviométricas e higrométricas mais elevadas que nas áreas de
caatinga (Tabarelli & Santos, 2004).
O solo é classificado como Podzólico Amarelo e Vermelho-Amarelo (PA e PV),
com variadas profundidades e texturas, presença de cascalhos, relevo movimentado. O
município está situado sobre o planalto da Borborema, com presença de superfícies
antigas e elevadas, trabalhadas pelo processo erosivo (CONDEPE/FIDEM, 2005). A
geologia é referida ao Pré-Cambriano Indiviso (Ministério de Minas e Energia, 1973) e
ao Quaternário (Reis, 1999).
Foram realizadas quatro coletas, duas no período chuvoso e duas no período de
estiagem, nos anos de 2007 e 2008 nos sítios Araçá, Frexeira, Serra dos Ventos e
Taboquinha, todos microprodutores de banana do município de Belo
Jardim/Pernambuco (Tabela 1).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
53
Tabela 1. Síntese das características gerais dos locais de coleta no município de Belo
Jardim/PE
Local/mês de coleta/período
Coordenadas geográficas
Altitude
Cultivares
Araçá (Abril/2007) - chuvoso
8º16’51”S, 36º25’14”W
715
‘Nanicão’/’Pacovan’
Freixeira
(Setembro/2007) - estiagem
8º16’02”S, 36º25’17”W
897
‘Nanicão’/’Prata-Anã’
Serra dos Ventos (Janeiro/2008) - estiagem
8°19’00”S, 36°25’00”W
900
‘Prata-Anã’ /’Maçã’
Taboquinha (Março/2008) - chuvoso
8º26’00”S, 39º50’36”W
617
‘Pacovan’/’Pacovan’
3.2. Cultivares utilizadas para isolamento dos fungos endofíticos
‘Pacovan’, ‘Prata-Anã’, ‘Nanicão’ e ‘Maçã’ foram as cultivares selecionadas
para coleta das amostras por serem as mais utilizadas no município e mais difundidas no
Brasil.
Em cada localidade foram selecionados quatro espécimes de bananeira, adultas,
em fase de produção, de diferentes cultivares e retiradas três folhas sadias de cada
planta (nova, intermediária e velha), totalizando 12 folhas/coleta. A determinação dos
estádios fenológicos das folhas, foi realizada com base na posição das mesmas no
pseudocaule, denominadas de folhas novas as dispostas na parte superior (folha vela ou
zero), folhas intermediárias (N°1) encontradas logo abaixo das folhas novas e folhas
velhas (N°2), situadas na parte inferior das intermediárias. As folhas coletadas estavam
aparentemente sadias, sem manchas ou qualquer tipo de lesão causada por insetos ou
danos mecânicos. As folhas foram acondicionadas separadamente, em sacos de papel,
os quais foram fechados e etiquetados, com o objetivo de reduzir a contaminação
externa e evitar o aquecimento das amostras, que foram transportadas até 24 horas ao
laboratório para processamento, após a coleta.
3.3. Isolamento de fungos endofíticos No laboratório, cada folha foi lavada com água corrente e sabão neutro, sem ferir
as amostras, processo que tem por objetivo eliminar comunidades microbianas externas,
mantendo viável a população interna do tecido vegetal.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
54
A técnica de isolamento foi por fragmentação do tecido vegetal (Araújo et al.,
2005). Com auxílio de um furador de rolha metálico esterilizado de 6mm de diâmetro,
foram feitos 36 discos por folha, num total de 108 discos por planta, obtendo-se assim
216 discos para cada cultivar, perfazendo um total de 1728 discos em quatro coletas
realizadas. Os discos foliares foram retirados aleatoriamente, procurando explorar maior
área foliar.
Para isolamento dos fungos endofíticos foi adotado método padrão onde, tecidos
vegetais são desinfestados superficialmente através de lavagens por imersão.
Primeiramente, 1 minuto, em álcool a 70% v/v, para quebra da tensão superficial; 1
minuto, em hipoclorito de sódio (NaOCl) a 3% e duas lavagens consecutivas em água
destilada esterilizada, para retirar resíduos dos agentes esterilizantes, em seguida,
colocados para secar em papel de filtro esterilizado (Pereira et al., 1993). Para conhecer
o grau de contaminação por fungos, retirou-se 0,1 ml da última água da lavagem e
semeou-se em placas contendo BDA (batata-dextrose-ágar).
Após desinfestação, com auxílio de uma pinça flambada e em câmara asséptica,
seis discos foliares foram tranferidos equidistantes para placas de Petri, contendo meio
BDA, suplementado com solução do antibiótico cloranfenicol 250mg/L, para evitar
crescimento de bactérias, em seguida incubados a 23ºC±2ºC, sendo examinada
diariamente, até 30 dias. À medida que surgiam as colônias, as mesmas foram
purificadas em placas de Petri e posteriormente repicadas para tubos de ensaio,
contendo BDA (Figura 1).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
55
Figura 1. Metodologia utilizada para isolamento dos fungos endofíticos de folhas
sadias da bananeira (Musa spp.). A. Discos retirados de folhas sadias; B. Distribuição
dos discos em BDA suplementado com 250 mg/L de cloranfenicol; C. Crescimento
fúngico nas bordas dos discos foliares; D. Fungos endofíticos purificados e isolados
3.4. Identificação dos fungos endofíticos
Identificações em nível de gênero e espécie foram realizadas em culturas puras
dos fungos cultivadcs em meios BDA, MA e V8 contidos em placas de Petri. Quando
necessário, utilizou-se a técnica de cultivo em lâmina (Riddell, 1950). A caracterização
morfológica foi procedida através de observações das características macroscópica das
colônias e microscópica das estruturas reprodutivas com base em referências
(A) (B)
(C)
(D)
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
56
bibliográficas especializadas (Barnett & Hunter, 1972; Ellis, 1976; Sutton, 1980;
Dennis, 1957; Sivanesan, 1984; Hanlin & Menezes, 1996).
3.5. Seleção de antagonistas in vitro
3.5.1. Obtenção de fungos endofíticos e fitopatogênicos utilizados para teste de
antagonismo in vitro
Para determinação de antagonistas, serão selecionados aleatoriamente 20 fungos
endofíticos isolados de folhas sadias de bananeira de quatro cultivares coletadas no
município de Belo Jardim/Pernambuco. Representantes de seis espécies fitopatogênicos:
Cladosporium musae, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Colletotrichum musae,
Deightoniella torulosa, Pseudocercospora musae e Mycosphaerella musicola foram
obtidos de isolamentos originados de folhas de bananeiras com sintomas visíveis,
coletadas no município de Belo Jardim/Pernambuco (Assunção et al., 2007).
3.5.2. Determinação do índice da velocidade do crescimento micelial de fungos
endofíticos e fitopatogênicos in vitro, em cultivo individual
Para cultivo individual, utilizaram-se discos de 6mm de diâmetro retirados das
margens das colônias dos fungos endofíticos selecionados e de fitopatógenos, com sete
dias de cultivo, com auxílio de um furador esterilizado. Os discos foram transferidos
para placas de Petri, contendo BDA, a 1cm da borda, incubadas a temperatura de
23±2°C, por 14 dias.
Na avaliação do crescimento micelial foi observada a dimensão do diâmetro das
colônias, aos sete e 14 dias, dos fungos endofíticos e fitopatógenos, com auxílio de
régua milimetrada, no sentido colônia até sua borda. Os dados foram utilizados no
cálculo do índice da velocidade de crescimento micelial (IVCM), conforme a fórmula
de Maguire (1962), modificada por Oliveira (1991), para construção das curvas de
crescimento. O índice da velocidade de crescimento foi avaliado como: muito lento,
lento, rápido e muito rápido, de acordo com o diâmetro das colônias (Oliveira, 1991).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
57
Onde: IVCM = Índice da velocidade de crescimento micelial (cm/dia).
D = diâmetro da colônia no 14° dia de incubação
Da = diâmetro da colônia no 7° dia de incubação;
N = número de dias após a inoculação.
3.5.3. Seleção de fungos endofíticos isolados contra fungos fitopatogênicos
selecionados, in vitro
A ação dos fungos endofíticos contra os fitopatógenos foi avaliada a partir dos
seguintes testes:
3.5.3.1. Teste de antagonismo, em culturas pareadas
A avaliação da atividade antagônica dos fungos endofíticos contra os
fitopatógenos, foi realizada pelo método de culturas pareadas em placas (Dennis &
Webster, 1971a, b), que consiste no confronto direto do antagonista e fitopatógeno em
placas de Petri de 9mm de diâmetro, em meio BDA. Cada placa recebeu dois discos de
micélio/conídios de 6mm de diâmetro, em pontos equidistantes, a 1cm da borda da
placa, sendo um de um fungo fitopatogênico e outro de fungo endofítico (Figura 2).
Após o pareamento, as placas foram incubadas em condições de laboratório a 23±2ºC,
por 14 dias.
Figura 2. Representação esquemática, da distribuição dos discos dos fungos endofíticos
(A) e fitopatógenos (B), em BDA, para ensaio de antagonismo e medição da velocidade
de crescimento, pelo método de pareamento
IVCM ‗ D – Da N
A B
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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Discos contendo micélio/conídios dos fungos endofíticos e fitopatógenos foram
obtidos de colônias cultivadas em meio de BDA, durante sete dias, mantidas a
temperatura de 23±2ºC. Após esse período foram retirados discos da borda das colônias,
com auxílio de um furador de rolha metálico (6mm de diâmetro).
Os testes foram realizados em duplicata, e como testemunha foram cultivados
isoladamente fitopatógenos e fungos endofíticos, semeando-se um disco de micélio
(6mm de diâmetro) a 1cm das bordas de cada placa de Petri, em meio BDA; as placas
foram mantidas em condições de laboratório a 23±2ºC, por 14 dias.
A avaliação da capacidade antagonística dos fungos endofíticos e fitopatógenos,
diferenciando níveis de antagonismo, com observações no 14° dia, de acordo com o
crescimento pareado em placas de Petri, foi baseada na metodologia estabelecida por
Bell et al. (1982), utilizando uma escala de notas com valores de 1 a 5. Para análise
estatística, as notas foram transformadas em percentagens de colonização, com: 100, 75,
50, 25 e zero, para as notas 1, 2, 3, 4 e 5 respectivamente (Tabela 2). Uma placa
contendo apenas um disco de 6mm de diâmetro com micélio/conídio, serviu de
controle. O período de tempo necessário para que o micélio do fitopatógeno tomasse
toda a superfície da placa, foi o parâmetro para indicar o momento de avaliar a inibição,
realizada através de análise visual, e em apenas uma repetição por isolado.
As interações onde houve um halo de inibição ou inibição à distância, sem
contato micelial, foram também levadas em conta para efeito de seleção das espécies
com potencial antagonístico.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
59
Tabela 2. Notas atribuídas ao grau de crescimento do fungo endofítico em direção ao
fitopatógeno (Bell et al., 1982)
Notas Grau de crescimento do fungo endofítico sobre o
fungo fitopatogênico no meio de cultura
Nível 1
O antagonista cobriu 100% da superficie da placa.
Supressão total do crescimento micelial por parte do
antagonista
Nível 2
O antagonista cobriu 75% da superficie da placa.
Nível 3
Antagonista e fitopatógeno colonizam cada um 50%
da superfície da placa.
Nível 4
O antagonista cobriu ao menos 25% da superficie da
placa.
Nível 5
O fitopatógeno cobriu a totalidade da superficie,
anulando o antagonista. Ausência de supressão
micelial por parte do antagonista.
3.5.3.2. Efeito in vitro de metabólitos voláteis, produzidos por fungos endofíticos,
sobre o crescimento micelial de fitopatógenos
Para investigar a possibilidade de produção de substâncias inibidoras voláteis,
foram usados 20 fungos endofíticos contra seis fitopatógenos, utilizando-se, o método
de Dick & Hutchinson (1966), com algumas modificações, utilizando-se placas
descartáveis com uma divisória, impedindo o contato direto entre fungos endofíticos e
fitopatógenos.
O método utilizado consiste em discos de micélio de 6mm de diâmetro dos
fitopatógenos e prováveis antagonistas, inoculados separadamente em BDA no lado de
cada compartimento da placa de Petri, permitindo a evolação de metabólitos voláteis
(Figura 3).
As testemunhas (placa controle) foram representadas pelo crescimento micelial
dos fitopatógenos individualmente, em cada compartimento da placa, em meio BDA,
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
60
mantidas a temperatura de 23±2ºC, por sete dias. Para avaliação do crescimento micelial
mediu-se o diâmetro das colônias.
Figura 3. Esquema da distribuição dos discos do fungo endofítico (A) e fitopatógeno
(B) em placa de Petri, com uma divisória, para ensaio de antagonismo por metabólitos
voláteis
Para os testes relacionados à seleção de antagonistas contra fitopatógenos in
vitro, foi adotado o delineamento inteiramente casualizado (DIC), em esquema fatorial
6 X 20, cujos tratamentos corresponderam às condições dos seis fitopatógenos e 20
fungos endofíticos, totalizando 120 tratamentos. Cada tratamento constou de duas
repetições, sendo cada repetição correspondente a uma placa de Petri. Testemunhas
constaram do cultivo individual no meio BDA, dos fungos endofíticos e fitopatógenos,
para termo de comparação da inibição e produção de metabólitos voláteis.
Avaliações do potencial de antagonismo e comparação da velocidade de
crescimento micelial radial dos fungos endofíticos contra os fitopatógenos foram
realizadas medindo-se raios das colônias (cm) dos fitopatógenos e fungos endofíticos,
aos 14 dias, comparando-se com testemunhas, incubadas em meio BDA. Para as
avaliações referentes aos efeitos dos metabólitos voláteis, foram realizadas observações
no crescimento micelial de cada fungo envolvido e possíveis alterações morfológicas
das colônias (bordas e pigmentação).
3.6. Análise estatística
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC) em arranjo
fatorial 4×1, correspondendo a quatro cultivares de bananeira (‘Nanicão’, ‘Pacovan’,
Divisória da placa de Petri
A
B
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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‘Prata-Anã’ e ‘Maçã’) X uma parte da planta (folha), com seis repetições, sendo a
unidade experimental constituída por uma placa com seis discos foliares. Após
crescimento, as colônias foram contadas, identificadas e avaliadas, quanto a:
1. Frequência de ocorrência de cada espécie (FO), calculada por cada unidade
formadora de colônias da espécie, idade fenológica das folhas (nova, intermediária e
velha) e período de coleta (chuvoso e estiagem), expresso pela fórmula (Araújo et al.,
2005).
Onde: FO = Frequência de ocorrência da espécie analisada
Ni = Número de fragmentos foliares com crescimento fúngico da espécie
N = Número total de fragmentos foliares plaqueados A frequência de cada espécie foi expressa em termos percentuais na seguinte
classificação (Schnittler & Stephenson, 2000):
- Abundante: ≥ 3,0%
- Comum: ≥ 1,5% < 3,0%
- Ocasional: ≥ 0,5% < 1,5%
- Rara: < 0,5%
Os fungos endofíticos foram agrupados em categorias de constância, utilizando-
se a fórmula (Dazoz, 1983):
Onde: P = Número de coletas em que o fungo foi encontrado
N = Número total de coletas
Foram consideradas as seguintes categorias de constância:
- Espécie constante (C) presença ≥ 50%
- Espécie acessória (A) presença entre ≥ 25% e < 50%
- Espécie acidental (S) presença quando < 25%
FO ‗ Ni X 100 N
C ‗ P X 100 N
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
62
2. Índice de similaridade de Sørensen (Müller-Dombois, 1981), aplicado para
verificar similaridade entre as quatro áreas de coletas, e as quatro cultivares, cuja
fórmula é expressa em:
Onde: S = Similaridade;
a = Número de espécies ocorrendo em A
b = Número de espécies ocorrendo em B
W = Número de espécies comuns às duas áreas ou substratos
Para comparação entre Índices de similaridade, utilizou-se o método de treliça
(Silveira Neto et al., 1976).
3. O Teste do Qui-Quadrado de Aderência ou Ajustamento (Snedecor & Cochran,
1980), foi utilizado para testar se existe diferença significativa em relação à idade
fenológica das folhas, e cultivares analisadas.
Onde: X² = Qui-Quadrado
Fo = Frequência observada para cada classe
Fe = Frequência esperada para classe
S ‗ 2w X 100
a + b
X² ‗ Σ (Fο – Fe)²
Fe
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Fungos endofíticos isolados de folhas sadias de bananeiras
Foram isolados representantes de 40 espécies de fungos endofíticos originados de
751 colônias, a partir de 1728 discos foliares (Tabela 3). A taxa de colonização dos
isolados, nas quatro cultivares de banana foi considerada alta (751), provavelmente
devido à eficiência da metodologia utilizada e á boa sanidade das cultivares. Segundo
Abreu (2005) e Gamboa et al. (2002), a taxa de colonização por fungos endofíticos é
alta quando em torno de ±600 isolados. Resultados diferentes em relação ao isolamento
de fungos endofíticos de Musa spp. foram obtidos por Brown et al. (1998), que isolaram
apenas 24 espécies do total de 1600 discos foliares, em Hong Kong e Austrália; Pereira
et al. (1999) que isolaram 16 espécies em 2400 fragmentos, em São Paulo, Brasil;
Photita et al. (2001), os quais isolaram 61 espécies a partir de 7500 fragmentos, na
Tailândia; Cao et al. (2002) que isolaram 14 espécies em 200 fragmentos, na China.
A composição de espécies pode variar de acordo com fatores abióticos e bióticos
(Faeth & Fagan, 2002), hospedeiro, distribuição geográfica, idade da planta, condições
ecológicas, sazonalidade, altitude e precipitação (Soares et al., 2007). De acordo com
Moreira et al. (2009), a taxa de colonização por fungos endofíticos muda entre espécies
e tecidos de plantas.
A não identificação de alguns fungos é resultado da falta de esporulação em
meios de cultura artificiais (Wang et al., 2005). Alguns isolados fúngicos foram
desconsiderados por não produzirem estruturas de reprodução nos meios de cultura
utilizados. Lacap et al. (2003) desconsideraram os isolados não esporulados,
denominando-os de micélio estéril. Segundo os autores a falta de esporulação é devida,
provavelmente, ao pouco tempo no laboratório e tipo de substrato utilizado. Petrini
(1981) também cita o tempo como fator importante na indução da esporulação, podendo
os fungos esporular dois, três ou 14 meses depois do isolamento. A presença de fungos
que não esporulam é comum entre isolados endófitos.
As 40 espécies de fungos endofíticos identificadas estão distribuídas em três
grupos: 32 anamorfos (80%), sete Ascomycota (17,5%) e um Basidiomycota (2,5)
(Figura 4).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
64
80%
17,50%2,50%
Anamorfo Ascomycota Basidiomycota
Figura 4. Frequência dos grupos de fungos endofíticos isolados de Musa spp
A predominância dos anamorfos nas áreas estudadas reflete sua importância
como decompositores de substratos foliares, fato verificado em diversos trabalhos
(Watson et al., 1974; Maia, 1983; Kuter, 1986; Schoenlein-Crusius, 1993; Venedikian
& Godeas, 1996; Wellbaum et al., 1999; Venedikian et al., 2001, Grandi & Silva,
2006). Através da ação enzimática os fungos atuam como decompositores da matéria
orgânica, facilitando a reincorporação de nutrientes ao solo, constituindo papel
importante para manutenção do equilíbrio dos ecossistemas, através da ciclagem de
nutrientes (Grandi & Gusmão, 2002), penetrando no vegetal durante o crescimento das
raízes, ao sofrerem abrasões (Azevedo, 1998). Encontrados na natureza na forma
assexual, alguns apresentam fase sexual (teleomórfica), representada pelos Filos
Ascomycota e Basidiomycota (Kirk et al., 2008).
Wilson et al. (1991) informaram que em sua maioria os fungos endofíticos são
Ascomycota, ocorrendo em menor frequência Basidiomycota e seus anamorfos. Para
Ploetz (1999), ascósporos são estruturas de disseminação mais importantes em
bananais, embora conídios também os sejam. A fase sexuada permite a sobrevivência do
fungo, quando as condições ambientais não são favoráveis. Fungos endofíticos isolados
de altas latitudes são caracterizados por apresentarem poucas espécies de Ascomycota
(Arnold, 2007).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
65
A baixa frequência de Basidiomycota é devida provavelmente, ao meio de
cultura e técnicas utilizadas para isolamento, neste trabalho. Chareprasert et al. (2006) e
Conti (2007) obtiveram baixa ocorrência de Basidiomycota em folhas de Melia
azedarach, Samanea saman e Borreria verticillata, respectivamente. Segundo
Promputtha et al. (2005), o isolamento de Basidiomycota é negligenciado, devido ao
fato das pesquisas não utilizarem caules maduros como fonte de fungos endofíticos.
Crozier et al. (2006) sugerem que as técnicas utilizadas não contribuem para o
isolamento de Basidiomycota, e segundo Thomas et al. (2008) estes recebem pouca
atenção em relação aos Ascomycota.
Dos 24 gêneros de fungos endofíticos, Colletotrichum (23,7%) foi o mais
frequente, diferindo neste aspecto, quanto à frequência de ocorrência dos demais
(Figura 5).
Segundo Arnold & Lutzoni (2007), fungos endofíticos tropicais são
representados por pequeno número de gêneros, com grande número de espécies,
divergindo dos resultados deste trabalho, visto que, nas folhas de bananeira foram
isolados 24 gêneros e 40 espécies.
Figura 5. Frequência de ocorrência dos 24 gêneros de fungos endofíticos isolados em
folhas de quatro cultivares de bananeira, no município de Belo Jardim/PE
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
Col
leto
trichu
mCla
dosp
oriu
mDeigh
toni
ella
Acr
emon
ium
Nig
rosp
ora
Cur
vula
ria
Nod
ulispo
rium
Pae
cilo
myc
esGlo
mer
ella
Alter
naria
Gui
gnar
dia
Fus
ariu
mPes
talo
tiop
sis
Xylar
iaDre
sche
rella
Tritirac
hium
Spor
miella
Scol
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ium
Pho
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Cor
dana
Myc
osph
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lla
Pap
ulos
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Per
icon
ia
Schi
zoph
yllu
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ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
66
Os fungos endofíticos mais abundantes foram: Colletotrichum musae, C.
gloeosporiodes, Deightoniella torulosa, Nigrospora oryzae, Cladosporium
cladosporioides, Acremonium polychoroma, Nodulisporium gregarium, Paecilomyces
lilacinus, Alternaria alternata, Guignardia mangifera, Fusarium solani e Pestalotiopsis
maculans. Oito espécies foram comuns, sete ocasionais e treze raras (Tabela 3).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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Tabela 3. Unidades formadoras de colônias (UFC) e frequência de ocorrência (%) dos
fungos endofíticos isolados dos discos foliares de bananeira (Musa spp.), em quatro
coletas realizadas no município de Belo Jardim/PE
Fungos endofíticos isolados
UFC
Frequência de
ocorrência (%)
♥ Acremonium bacillisporum (Onions & G. L. Barron) W. Gams 10 1,3 ♣ A. strictum W. Gams 2 0,2 ◘ A. polychromum (J.F.H. Beyma) W. Gams 40 5,3 ◘ Alternaria alternata (Fr.) Keissl. 31 4,1 ◘ Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries. 42 5,7 ▲C. musae Mason 13 1,7 ♣ C. oxysporum Berk. & Curt. 3 0,4 ♣ C. tenuissimum Link 1 0,1 ♣ Colletotrichum dematium (Pers. ex Fr.) Grove 4 0,5 ◘ C. gloeosporioides (Penz.) Sacc. 66 9,0 ◘ C. musae (Berk & M.A.Curtis) Arx. 108 14,3 ♣ Cordana musae (Zimm.) Höhnel 1 0,1 ▲Curvularia eragrostidis (Henn.) J. A. Mey. 20 2,6 ♣ C. lunata var. aeria (Bat., J.A. Lima & C.T. Vasconc.) M.B. Ellis 4 0,5 ♥ C. oryzae Bugnic. 5 0,6 ♥ C. pallescens Boedijn 8 1,0 ♥ C. prasadii R. L. Mathur & B. L. Mathur 7 0,9 ◘ Deightoniella torulosa (Syd.) M. B. Ellis 53 7,0 ▲Drechslera hawaiiensis (Bugnicourt) Subram. & Jain ex M. B. Ellis
19 2,5
◘ Fusarium solani (Mart.) Sacc. 25 3,3 ♥ F. oxysporum E.F. Sm. & Swingle 5 0,6 ▲Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & H. Schrenk 19 2,5 ▲G. musarum Petch 15 2,0 ◘ Guignardia mangifera A.J. Roy 30 4,0 ♣ Mycosphaerella musicola R. Leach ex J.L. Mulder 1 0,1 ◘ Nigrospora oryzae (Berkeley & Broome) Petch 50 6,6 ◘ Nodulisporium gregarium (Berk. & Curt.) J. A. Meyer 40 5,3 ◘ Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson 35 4,6 ♣ Papulospora halima Anastasiou 1 0,1 ♣ Periconia digitata (Cooke) Sacc. 1 0,1 ◘ Pestalotiopsis maculans (Corda) Nag Raj 22 3,0 ♣ Phoma capitulum Pawar Mathum & Thirum 1 0,1 ♣ P. sorghina (Sacc.) Boerema, Dorenb. & Kesteren 1 0,1 ♣ P. tracheiphila (Petri) L.A. Kantsch. & Gikaschvili 1 0,1 ♣ Schizophyllum commune Fr. 1 0,1 ♥ Scolecobasidium humicola G.L. Barron & L.V. Busch 10 1,3 ▲Sporormiella mínima (Auersw.) S.I. Ahmed & Cain 12 1,5 ▲Tritirachium oryzae (Vincens) de Hoog 14 2,0 ▲Xylaria sp. Hill ex Schrank 20 2,6 ♥ Xylaria aff. hypoxylon (L.) Grev. 9 1,2 Total de UFC 751 100 Frequência total de ocorrência - 43,5 ♣ = Rara; ♥ = Ocasional; ▲= Comum; ◘ = Abundante.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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Algumas das espécies identificadas neste trabalho, também foram isoladas como
fungos endofíticos em folhas de Musa acuminata. Colletotrichum gloeosporioides, C.
musae, Xylaria sp., e Nigrospora oryzae foram referidos em bananeiras na Austrália,
China e Tailândia (Brown et al., 1998; Photita et al., 2001); Alternaria alternata,
Cladosporium cladosporioides, Fusarium solani e Glomerella cingulata referidas em
Hong Kong e Austrália (Brown et al., 1998); Cordana musae foi referida isolada na
Tailândia (Photita et al., 2001) e Deightoniella torulosa na China e Tailândia (Photita et
al., 2001; Cao et al., 2002). Alguns autores procedem à identificação na maioria das
vezes até o nível de gênero, o que impede comparação em nível específico. Entretanto,
pode-se observar que algumas espécies identificadas pelos autores acima mencionados,
coincidem com as isoladas na presente pesquisa.
No Brasil Pereira et al. (1999) isolaram Xylaria sp., Colletotrichum musae,
Cordana musae, Nigrospora oryzae e Sporormiella minima.
Colletotrichum musae, Deightoniella torulosa, Cladosporium musae, Fusarium
oxysporum, Cordana musae e Mycosphaerrella musicola, isoladas como endófitos no
presente trabalho, também são citadas como fitopatógenos estabelecidos em bananeira
(Mesturino, 1988; Jimenez et al., 1993; Johnson & Sanghote, 1994; Pineda et al., 1997;
Rivas & Rosales, 2003; Surridge, 2003; Moraes et al., 2006).
Segundo Petrini (1991), tecidos assintomáticos de vegetais no início da
senescência permitem que sapróbios se estabeleçam, iniciando a decomposição.
Evidências sugerem que fungos endofíticos evoluíram diretamente de fitopatógenos
(Carroll, 1988) e a sua fase latente representa condição específica para que o
fitopatógeno não desenvolva sintomas nem cause alterações na fisiologia do hospedeiro
(Romero et al., 2001). Schulz & Boyle (2005) supõem que não há interações neutras
entre fungo endofítico /hospedeiro, havendo equilíbrio antagônico, ocorrendo virulência
por parte do fitopatógeno para causar infecção, e resistência por parte da planta para
limitar o desenvolvimento dos fungos e da doença.
De acordo com Sinclair (1991) ocorre dificuldade em estabelecer limites entre
fungos endofíticos e fitopatógenos latentes. Infecção latente é o estado em que o
hospedeiro é infectado pelo fitopatógeno, sem mostrar sintomas. A infecção é regida por
condições ambientais, nutricionais ou maturidade do hospedeiro ou do fitopatógeno.
Brown et al. (1998) apoiam a idéia de que fitopatógenos podem passar parte de sua vida
como endófitos. De acordo com Photita et al. (2004), fungos endofíticos de Musa
acuminata, podem estar latentes em seu hospedeiro muito antes do aparecimento dos
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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sintomas da doença, sendo complexa e a conceituação de um fungo como endófito ou
como fitopatógeno.
Acremonium é habitante comum do solo e serrapilheira, sendo isolado também
do ar e de diversos substratos (Maia, 1983; Kiffer & Morelet, 1997). Rai et al. (1988)
relataram que algumas espécies possuem forte atividade celulolítica in vitro. Pocasangre
et al. (2000) isolaram Acremonium sp. como fungo endofítico de raízes de bananeira, na
América Central.
Alternaria é habitante do filoplano e colonizador primário nas folhas (Watson et
al., 1974), com distribuição cosmopolita, inclusive na Antártica (Rosa et al., 2009),
apresentando habilidade fitopatogênica em diversos hospedeiros (Rubini et al., 2005).
Alternaria tem como característica comum baixa capacidade ou mesmo ausência de
esporulação em meio de cultura. Vários trabalhos indicam diferentes métodos para
induzir esporulação com variações quanto à luz utilizada, meios de cultura,
temperaturas e idade das colônias (Silva & Melo, 1999). Devido à presença da parede
celular espessa e melanização, Alternaria alternata é resistente à radiação ultravioleta e
tolerante à dessecação (Dickinson, 1981). Produz conídios pigmentados e
multicelulares, permitindo sua permanência na folha durante o processo de senescência,
resistindo a condições adversas (Stone et al., 1996). Sobrevive tanto epifiticamente
quanto endofiticamente nos tecidos das folhas em início de decomposição (Ghizelini et
al., 2006). Alguns autores isolaram A. alternata como espécie endofítica dominante em
folhas de diferentes hospedeiros: tais como: Glycine max (L.) Merr., na Argentina
(Larran et al., 2002); Tectona grandis L. e Samanea saman Merr., na Tailândia
(Chareprasert et al., 2006); Triticum aestivum L., na Argentina (Larran et al., 2007);
Citros (Corrêa, 2008).
Cladosporium é considerado colonizador saprofítico primário (Dickinson, 1976),
ubíquo (Domsch et al., 1980) e fitopatógeno (Brown et al. 1998), presente tanto
epifiticamente quanto endofiticamente durante os primeiros estágios de decomposição
(Petrini, 1991). Descrito por Sadaka & Ponge (2003) como habitante da superfície foliar
e colonizador interno de folhas jovens e senescentes. Apresenta capacidade de crescer
em vários substratos (Zeng et al., 2006). Cladosporium musae atua como antagonista e
sob condições favoráveis torna-se fitopatógeno (De Vries, 1952). Considerado parasito
fraco, causa doenças em folhas velhas de bananeiras, cultivadas em locais de elevada
umidade (Ploetz et al., 1994). C. cladosporioides é fungo comum, com ocorrência
registrada em todas as partes do mundo. Encontrado no ar e alimentos, como endofítico
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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ou como sapróbio com função biológica importante na decomposição de matéria
orgânica, sendo forte competidor com outros microrganismos (Ellis, 1976; Samson et
al., 2000). Isolado em folhas de helicônias como endófito, principalmente quando as
folhas iniciam a senescência (Pereira, 1993), e em folhas sadias de cafeeiro (Chaves et
al., 2002). Fisher et al. (1993) isolaram C. tenuissimum como endófito de folhas de
Eucalyptus nitens, na Austrália e na Inglaterra.
Segundo Freeman et al. (1998) é frequente a ocorrência de mais de uma espécie
de Colletotrichum associada a um mesmo hospedeiro. Caracteres morfológicos, como
forma, tamanho dos conídios, apressórios e hospedeiros são utilizados para definir
espécies de Colletotrichum (Sutton, 1992), porém a biologia molecular é considerada
ferramenta indispensável para diferenciar espécies. Relatado como fungo endofítico em
outros vegetais (Glienke, 1995; Fröhlich et al., 2000; Larran et al., 2001; Cannon &
Simmons, 2002; Arnold et al., 2003; Pimentel et al., 2006; Wang et al., 2008). Devido
ao fácil cultivo e à rápida identificação Colletotrichum destaca-se como gênero
dominante (Pileggi, 2006). Colletotrichum gloeosporioides e C. musae foram isolados
no presente trabalho como abundantes, entretanto C. dematium teve ocorrência rara.
Segundo Menezes (2002), C. musae é específico para Musa spp.
Espécies de Curvularia são sapróbias ou fitopatógenas, ocorrendo em áreas
tropicais e subtropicais, isoladas do solo, ar, matéria orgânica, plantas e animais,
incluindo seres humanos (Freire et al., 1998). Na presente pesquisa foram isoladas cinco
espécies de Curvularia, sendo Curvularia eragrostides de ocorrência comum, C.
oryzae, C. pallescens e C. prasadii ocasionais. Farr et al. (1989) relataram que C.
pallescens ocorre em substratos de gramíneas e comumente isolada do solo e de
vegetais em decomposição. C. lunata é referido como endófito de folhas de Glycine
max (soja), na Argentina (Larran et al., 2002). C. lunata var. aeria foi isolada neste
trabalho como rara.
Fusarium tem ampla distribuição geográfica, ocorrendo em regiões tropicais,
subtropicais e temperadas, em diferentes zonas climáticas do planeta, com distribuição
influênciada pela chuva (Ventura & Costa, 2006). Algumas espécies têm íntima
associação com seus hospedeiros (Burgess et al., 1994). Em relação ao seu habitat
Fusarium pode ser agrupado em: a) do solo, b) da parte aérea de vegetais, c) misto, do
solo e parte aérea. Como habitante do solo, está associado às doenças de raízes.
Habitantes da parte aérea, raramente ocorrem no solo, infectando partes aéreas de
tecidos específicos das plantas (Ventura et al., 2004). Fungo agressivo, responsável pela
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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síndrome da queda dos frutos de várias fruteiras (Mota & Gasparotto, 1998) e
competidor saprofítico em solos (Pugh & William, 1968). Espécies de Fusarium são
comumente isoladas como fungos endofíticos, em ambientes tropicais (Rodrigues &
Samuels, 1990; Bills & Polishook, 1992; Fisher et al., 1994; Suryanaryanan &
Kumaresan, 2000; Photita et al., 2001; Cao et al., 2002; Larran et al., 2002). Fusarium
oxysporum sobrevive na matéria orgânica, produzindo estruturas de resistência que
permitem ao fungo atravessar períodos desfavoráveis no solo durante vários anos (Blum
et al., 2006). Fusarium solani apesar de habitar o solo, nas regiões tropicais tem
ocorrido nas partes aéreas das plantas, demonstrando que o ambiente afeta o processo de
dispersão (Ventura et al., 2004).
Segundo Sivanesan (1984), os principais hospedeiros de Guignardia, fungo
sapróbio ou semiparasita, são folhas de Musa. Meredith (1968) e Liberato et al. (2009)
isolaram Guignardia mangifera de folhas velhas e frutos de bananeiras. Punithalingam
(1981) refere que espécies de Guignardia pouco se diferenciam pelas medidas dos ascos
e ascósporos, sendo a principal separação feita com base no carárter especificidade
quanto ao hospedeiro. Representantes do gênero são isolados de diferentes espécies de
plantas e caracterizados como endófitos (Carroll & Carroll, 1978; Petrini, 1986; Madriz
et al., 1991; Nag Raj, 1993; Rodrigues & Samuels, 1999; Penna, 2000; Glienke-Blanco
et al., 2002; Okane et. al., 2003; Silva & Pereira, 2007; Wickert et al., 2009). De acordo
com Costa (2003), Guignardia é um dos fungos endofíticos mais isolados em vegetais
tropicais. Entretanto, há maior número de trabalhos que tratam este gênero como
fitopatógeno de culturas com importância econômica (Corrêa, 2008). Liberato et al.
(2009) citam que G. citricarpa pode causar infecções assintomáticas em folhas de
bananeira.
Glomerella, gênero cosmopolita, é abundante nos trópicos, com ampla gama de
hospedeiros (Holliday, 1980); encontrado como parasita ou sapróbio em plantas
vasculares (Hanlin & Menezes, 1996), demonstra certa especificidade por determinados
tecidos vegetais (Clay & Schardl, 2002). G. cingulata (Anamorfo: Colletotrichum
gloeosporioides) é citado como endófito em folhas de outros vegetais: Glycine max (L.)
Merr., na Argentina (Larran et al., 2002); Viguiera arenaria (Asteraceae), no Brasil
(Guimarães, 2007). G. musarum (Anamorfo: Colletotrichum musae), tem ampla
distribuição geográfica, ocorrendo onde a bananeira é cultivada (Wardlaw, 1972).
Economicamente é importante por causar prejuízos em pós-colheita (Jeffries et al.,
1990).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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Segundo Brown et al. (1998), Nigrospora oryzae está adaptado à existência
endofítica. A maioria das espécies possui hábito sapróbio (Tomé, 2005). Salazar &
García (2005) isolaram N. oryzae endofítica de folhas de rosa (Rosa hybrida), na
Colômbia.
Nodulisporium gregarium anamorfo de fungos xilariaceos, é comumente
encontrado nos trópicos como endofítico (Rodrigues & Samuels, 1990; Rodrigues,
1991; Lodge et al., 1996; Bayman et al., 1998).
Paecilomyces lilacinus, espécie dominante no solo (Jatala, 1986), é considerado
sapróbio capaz de utilizar grande faixa de substratos e parasita oportunista com pouca
especificidade de hospedeiro (Goettel et al., 2001). A adaptabilidade à ampla faixa de
pH do solo, torna-o competitivo em solos (Jacobs et al., 2003). A espécie tem
habilidade para colonizar endofiticamente raízes de cevada (Llopez-Lorca et al. 2002) e
de soja (Nunes, 2008). Na China, espécies de Paecilomyces foram isoladas de raízes de
Musa acuminata (Cao et al., 2002) e de folhas de Camptotheca acuminate (Lin et al.,
2007). Neste trabalho se destaca entre as espécies geradoras de antibiose.
Segundo Kohlmeyer & Kohlmeyer (1979), Papulospora, gênero sapróbio
(Gallardo & Piontelli, 2007), geralmente cresce sobre madeira em decomposição de
árvores de espécies temperadas como Arbutus menziesii, Abies alba e outras.
Papulospora halima foi isolada como endofítico de vários vegetais (Fell & Hunter,
1979; Cuomo et al.; 1985; Stchigel et al.; 2007). Gallo et al. (2007) isolaram
Papulospora immersa como endófito de Smallanthus sonchifolius (Poeppig &
Endlicher) H. Robinson (Asteraceae), em São Paulo, Brasil.
Periconia, gênero de clima temperado e tropical é encontrado em vegetais em
decomposição em ecossistemas terrestres (Romero, 1994; Fisher et al., 1995; Photita et
al., 2001; Yanna et al., 2002), de água doce e mangue (Alias & Jones, 2000; Sarma &
Vittal, 2000) e marinhos (Morrison-Gardiner, 2002). Romero et al. (2001) citam o
gênero como fitopatógeno e endofítico. Photita et al. (2003) isolaram Periconia digitata
(32%) como a espécie mais frequentemente associada a folhas em decomposiçao de
Musa acuminata, na Tailândia. Neste trabalho P. digitata foi isolada como espécie rara.
Pestalotiopsis é um gênero complexo, cuja classificação em nível de espécie é
dificultada pela grande variação morfológica (Jeewon et al., 2003). Amplamente
distribuída no mundo com espécies isoladas em regiões subtropicais e tropicais (Wei et
al., 2007), ocorre em vários substratos (Wang et al., 2005). A maioria das espécies é
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
73
fitopatógena (Zhang et al., 2003), mas há outras sapróbia em restos vegetais (Osono &
Takeda, 2000; Tang et al. 2003). O fungo não apresenta especificidade por hospedeiro
(Wei et al., 2005). Wei et al. (2007) isolaram Pestalotiopsis como fungo endofítico, em
folhas velhas de Podocarpaceae, na China. Rodrigues & Samueles (1990) isolaram
Pestalotiopsis sp. em folhas de Licuala ramsayi (Muell.) Domin (palmeira tropical), na
Austrália, especulando que embora tenha sido isolado endofiticamente, foi
provavelmente transportado pelo ar. No presente trabalho, P. maculans foi isolada como
espécie abundante.
Echandi (1957) cita que espécies de Phoma colonizam folhas mesmo na ausência
de ferimentos, penetrando diretamente pela epiderme. Fungo ubíquo é encontrado em
plantas, solo, seres humanos, animais e no ar. Espécies de Phoma têm ocorrência
limitada por condições ambientais, como: temperatura, umidade relativa do ar,
intensidade luminosa e altitude (Salgado et al., 1997). Pinto et al. (1992) e Oliveira &
Cavalcanti (2005) isolaram P. capitulum do solo da praia de Boa Viagem e de Candeias,
Pernambuco/Brasil. Boerema et al. (2004) isolaram de ambiente marinho e de solo
salino, e de floresta de carvalho, na Índia. Segundo os autores é provavelmente um
fungo "halofílico" que habita o solo. Zimowska (2007) isolou Phoma capitulum como
fungo endofítico de Leonurus motherwort cardiaca L., na Polônia. P. tracheiphila tem
ampla distribuição na região mediterrânea (Mendes & Freitas, 2005). Noronha (2002)
relata não haver registro de P. tracheiphila no Brasil e Estados Unidos. Phoma
sorghina, presente em regiões tropicais e subtropicais, ocorre em vegetais,
principalmente gramíneas (Punithalingam, 1981). Phoma sorghina é citada como
sapróbio (Gruyter & Noordeloos, 1992), endofítico (Suryanarayanan et al., 2005;
Borges & Pupo, 2006) e fitopatógeno facultativo (Pazoutová, 2009). Phoma capitulum,
P. tracheiphila e P. sorghina apresentaram ocorrência rara nesta pesquisa.
A distribuição de Sporormiella minima é influenciada por herbívoros, tipo de
vegetação e condições climáticas (Caretta et al., 1994). Apresenta habitat coprófilo
(Piontelli et al., 2006), sendo isolada também do solo (Davis & Shafer, 2006), de
madeira, folhas em decomposição, raramente em humanos (Barr, 2000) e como endófito
de diferentes vegetais (Suryanarayanan et al., 1998; Pereira et al., 1993; Freire et al.,
2000; Kumaresan & Suryanarayanan, 2002; Costa, 2003). Costa (2003) isolou-o de
espécies de manguezal: Aviccenia schaueriana Stapf., Laguncularia racemosa Gaerth. e
Rhizophora mangle L., no Brasil. Espécies coprófilas exercem intenso antagonismo
entre si, competindo pelo substrato, e produzindo substâncias antifúngicas (Takahashi &
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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Lucas., 2008). Ascósporos de S. minima foram encontrados em amostras antigas de solo
e sedimentos, sendo instrumentos úteis na paleoecologia (Burney et al., 2003). Raper &
Bush (2009) sugerem que ascósporos indicam presença e abundância de
megaherbívoros da pré-história. Esta espécie inibiu alguns fitopatógenos de bananeira
por meio de antibiose, neste trabalho.
Schizophyllum commune foi único Basidiomycota isolado como endófito em
folha velha tendo, formado basidiocarpo e grampo de conexão em meio BDA. Fisher et
al. (1993) isolaram como endófito de folhas de Eucalyptus nitens, na Austrália.
Dentre os fungos endofíticos, Xylaria é o gênero com maior frequência de
isolamento e diversidade ecológica em regiões tropicais (Rodrigues-Heerklotz &
Pfenning, 2009). Apesar de ter apresentado estromas típicos da fase teleomórfica em
meio de cultura no presente trabalho tornou-se difícil sua identificação ao nível de
espécie, pela ausência de ascomas férteis no estroma. De acordo com Petrini & Petrini
(1985), Xylaria leva até seis meses para esporular, nas melhores condições, tornando-se
problemática sua identificação, em meios de cultura. Resultados semelhantes foram
obtidos por Lodge et al. (1996); Arnold et al. (2000); Davis et al. (2003), em relação à
esporulação de Xylaria. Rodrigues (1994) identificou espécies de Xylaria através de
estruturas reprodutivas em meio de cultura, sendo um dos poucos autores que conseguiu
este efeito. Rodrigues & Samuels (1999) relatam maior frequência de Xylaria em
plantas tropicais, em relação às regiões temperadas. Davis et al. (2003) isolaram Xylaria
sp. como fungo endofítico de hepática, na Jamaica.
Vários trabalhos registram Xylaria como endófito em folhas de diferentes
espécies vegetais, em várias localidades (Petrini et al., 1982; Clay, 1987; Bertoni &
Cabral, 1988; Clay, 1989; Petrini & Fisher, 1990; Rodrigues, 1991; Fisher & Petrini,
1992; Pereira et al., 1993; Rodrigues, 1994; Lodge et al., 1996; Rodriguez & Samuels,
1999; Arnold et al., 2000; Cannon & Simmons, 2002; Glienke-Blanco et al., 2002;
Suryanarayanan et al., 2005; Gao et al., 2005; Salazar & García, 2005; Silva et al.,
2006; Pileggi, 2006; Pimentel et al., 2006; Chareprasert et al., 2006; Gama et al., 2008;
Osono, 2008; Magalhães et al., 2008; Wang et al., 2008), demonstrando que a
distribuição do gênero como fungo endofítico não está restrita a determinadas regiões e
hospedeiros. Pouquíssimos trabalhos estão relacionados ao isolamento de Xylaria em
folhas sadias de bananeira com registros apenas no Brasil (Pereira et al. 1999); Hong
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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Kong e Austrália (Brown et al., 1998) e Tailândia (Photita et al., 2001), tornando-se
necessários mais estudos.
4.2. Fungos endofíticos isolados por estádios fenológicos das folhas de bananeiras
A frequência de colonização dos fungos endofíticos nas folhas novas foi 21%,
nas intermediárias 36% e nas velhas 42%. Folhas novas, intermediárias e velhas,
apresentaram respectivamente 159, 271 e 321 UFC (Tabela 4). As folhas velhas
destacaram-se pela maior frequência de colonização, em comparação com as novas e
intermediárias, com diferença estatisticamente significativa, ocorrendo aumento na
diversidade fúngica. Este padrão de aumento de riqueza de fungos em relação à idade
foliar foi observado em outras espécies vegetais por vários autores (Fisher et al., 1986;
Arnold et al., 2000; Frohlich et al., 2000; Bussaban et al., 2001; Photita et al., 2001;
Gamboa & Bayman, 2001; Kumaresan & Surynaraynan, 2002; Arnold et al., 2003;
Arnold & Herre, 2003; Chareprasert et al., 2006; Pimentel et al., 2006; Conti, 2007;
Osono, 2008). Brown et al. (1998) observaram em folhas jovens de Musa acuminata,
em Hong Kong, menor taxa de colonização (29,6%) em relação às folhas velhas.
Fatores ecológicos, idade da folha (Petrini, 1991) e tipo de tecido (Fisher et al.,
1995) podem afetar a comunidade de fungos endofíticos, sugerindo que estes se
estabelecem dentro das folhas em condições específicas de temperatura, umidade,
altitude e idade fenológica.
Tabela 4. Unidades formadoras de colônias e frequência de ocorrência (%) de fungos
endofíticos em folhas de bananeira (Musa spp.)
Idade fenológica das folhas UFC Frequência de ocorrência (%)
Novas 159c 21
Intermediárias 271b 36
Velhas 321a 43
UFC 751 - UFC = Unidades formadoras de colônias. * Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas na coluna, não diferem entre si (P<0,0001). Soma das Categorias = 751 Qui-Quadrado = 59,977 Grau de Liberdade = 2 (p) = 0,0000
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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A população endofítica é encontrada com maior frequência nas partes mais
velhas da planta em relação às mais novas. Meredith (1968) isolou Guignardia musae
em folhas velhas da bananeira, no Havaí. Stover (1972) isolou Deightoniella torulosa
de folhas jovens e velhas de bananeira. Wilson & Carroll (1999) descrevem alta
frequência de fungos em folhas velhas de Quercus garryana. Kumaresan &
Surynayanan (2002) observaram que a colonização por Cladosporium cladosporioides e
Sporormiella minima, aumentou à medida que a folha envelhecia.
As diferenças na diversidade de fungos endofíticos com a idade fenológica das
folhas, segundo Soares et al. (2007) podem, estar relacionada, com particularidades nas
características morfológicas, nutricionais e químicas de cada fase do desenvolvimento
foliar. Para Moreira et al. (2009) é devido à existência de inúmeros metabólitos
liberados em maior quantidade nas folhas velhas.
Folhas posssuem nutrientes orgânicos e inorgânicos e representam porta de
entrada para fungos (Souza et al., 2004). A preferência dos fungos endofíticos para
colonizar um determinado tecido reflete sua capacidade de utilizar certo substrato
específico (Rodrigues & Samuels, 1990). A química da folha influencia as interações
competitivas entre endófitos, modificando a composição de espécies endofíticas (Arnold
et al., 2003). A preferência por folhas, das espécies endofíticas, deve-se ao fato dos
tecidos foliares serem um substrato bioquimicamente dinâmico em função da
fotossíntese (Arnold, 2005).
Vários fatores podem levar à redução na quantidade de fungos endofíticos em
folhas novas, entre estes: superposição de folhas, excesso de plantas por unidade de
área, concentrações fenolíticas, taninos e ambientes ensolarados (Spedding, 1979). Área
foliar, ângulo e forma da folha influem no aproveitamento da luminosidade (Alves,
1999).
À medida que o vegetal envelhece ocorre translocação de nutrientes para regiões
de crescimento. O processo de senescência modifica o nicho ecológico, permitindo
desenvolvimento de fungos adaptados à vida saprobiótica (Mattos et al., 2009). Fungos
de ocorrência em folhas velhas são considerados sapróbios primários, colonizadores
iniciais depois da abscisão foliar (Frankland, 1998). Assim, o primeiro estágio de
decomposição começa ainda no vegetal (Ghizelini et al., 2006).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
77
Hyde & Alias (2000) relataram que diferentes partes do vegetal abrigam
diferentes fungos, indicando que certos fungos endofíticos podem ter preferência por
diferentes tipos de tecido.
As diferenças refletem a heterogeneidade dos microhabitats nas folhas e as
necessidades de cada fungo endofítico por determinadas condições nutricionais e
crescimento (Tabela 5).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
78
Tabela 5. Fungos endofíticos isolados de discos foliares de bananeira (Musa spp.), em
relação à idade fenológica das folhas
Estádio fenológico das folhas fungos endofíticoF Novaª Intermediáriaª Velhaª
Acremonium bacillisporum + +♣ + A. strictum - - + A. polychoroma +♣ + + Alternaria alternata + + +♣ Cladosporium cladosporioides +♣ + + C. musae + + +♣ C. oxysporum - + - C. tenuissimum + - - Colletotrichum dematium + + +♣ C. gloeosporioides + + +♣ C. musae + + +♣ Cordana musae - - + Curvularia eragrostidis + +♣ - C. lunata var. aeria - + - C. oryzae - - + C. pallescens + - - C. prasadii + + +♣ Deightoniella torulosa + + +♣ Drechslera hawaiiensis + +♣ + Fusarium solani + +♣ + F. oxysporum +♣ - + Glomerella cingulata + + +♣ G. musarum - + +♣ Guignardia mangifera + + +♣ Mycosphaerella musicola + - - Nigrospora oryzae + +♣ + Nodulisporium gregarium - + +♣ Paecilomyces lilacinus + +♣ + Papulospora halima + - - Periconia digitata - + - Pestalotiopsis maculans - + +♣ Phoma capitulum - + - P. tracheiphila + - - P. sorghina + - - Schizophyllum commune - - + Scolecobasidium humicola + + +♣ Sporormiella mínima + + +♣ Tritirachium oryzae +♣ + + Xylaria sp. - + +♣ Xylaria aff. hypoxylon - - +♣ Total de ocorrência 27 28 29 (ª) Os sinais mais (+) e menos (-) representam presença ou ausência na folha, respectivamente. (♣) Maior ocorrência de colônias fúngicas.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
79
4.3. Fungos endofíticos isolados por áreas de coletas
Taboquinha foi o local com maior frequência de isolados de fungos endofíticos
de bananeira (40%), seguido dos sítios Freixeira (27%), Araçá (19%) e Serra dos
Ventos com menor frequência de isolados (14%) (Tabela 6). Em relação às unidades
formadoras de colônias (UFC) de fungos endofíticos em bananeiras, observou-se por
ordem decrescente: Taboquinha (305), Freixeira (200), Araçá (143) e Serra dos Ventos
(103). Resultados semelhantes foram obtidos por Brown et al. (1998) ao isolarem
fungos endofíticos de folhas de Musa spp., em localidades diferentes, em Hong Kong e
na Austrália. Segundo os autores, as condições ambientais afetam a diversidade de
fungos endofíticos. Cannon & Simmons (2002) sugerem que fatores geográficos podem
ser mais importantes na determinação da composição endofítica. Segundo Lehtonen et
al. (2005) a fertilidade do solo é fator chave na interação planta/ fungo endofítico.
A maior produtividade da bananeira em Taboquinha pode estar relacionada às
condições físicas, químicas e biológicas das plantações, influenciada pelo solo e clima
da região. É provável que a maior ocorrência de fungos endofíticos (305 UFC), tenha
relação com essas características.
Os sítios Freixeira e Serra dos Ventos apresentam clima do tipo Bshs, quente
semi-árido, influenciado pela altitude devido à posição elevada de suas terras. São áreas
topográficas, com leve declividade e afloramento de rochas, solo com lixiviação, não
havendo consórcio com outras frutíferas. As áreas encontram-se em estado de
degradação, substituída pela monocultura. É provável que esses fatores tenham
influenciado na UFC dos fungos endofíticos.
Tabela 6. Número de UFC e Frequência de ocorrência (%) de fungos endofíticos em
bananeiras nas quatro áreas de coletas, no município de Belo Jardim/PE
Áreas de coleta Períodos de coletas UFC Frequência de ocorrência (%)
Araçá Chuvoso 143 19
Freixeira Estiagem 200 27
Serra dos Ventos Estiagem 103 14
Taboquinha Chuvoso 305 40
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
80
A comunidade endofítica varia em função do hospedeiro e das condições
ambientais, e as espécies se inter-relacionam dentro da planta, buscando o equilíbrio. O
desequilíbrio afeta o comportamento das espécies endofíticas, dando condições para que
fungos oportunistas manifestem seu potencial patológico (Maki, 2006). Fatores
climáticos, interação planta/ fungo endofítico, correspondência genômica e ambiente
podem mudar a natureza endofítica, transformando o fungo em fitopatógeno oportunista
(Moricca & Ragazzi, 2008).
Das 40 espécies de fungos endofíticos identificados nas folhas, 30 foram
registradas em bananeiras do sítio Taboquinha e 21 em bananeiras do sítio Araçá; 16
espécies foram registradas nos demais sítios. Apenas três espécies foram comuns às
quatro áreas (Tabela 7).
A distribuição das espécies por classes de constância revelou não haver
predominância de classe: 14 espécies foram consideradas acidentais (35%), 12
acessórias (30%) e 14 constantes (35%) (Tabela 7).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
81
Tabela 7. Unidades formadoras de colônias de fungos endofíticos isolados em quatro
áreas de coleta (Araçá, Freixeira, Serra dos Ventos e Taboquinha), no município de
Belo Jardim/PE e categorias de constância (S=Acidental, A=Acessória e C=Constante)
Áreas de coleta
Fungos endofíticos isolados
Araçá
Freixeira
Serra dos Ventos
Taboquinha
Categoria de
constância
Acremonium bacillisporum 2 4 2 2 C A. strictum 0 0 0 2 S A. polychoroma 0 4 3 34 C Alternaria alternata 15 4 0 13 C Cladosporium cladosporioides
12 8 2 20 C
C. musae 4 6 3 0 C C. oxysporum 0 0 0 3 S C. tenuissimum 1 0 0 0 S Colletotrichum dematium 1 0 0 3 A C. gloeosporioides 14 10 6 35 C C. musae 13 73 0 20 C Cordana musae 0 1 0 0 S Curvularia eragrostidis 10 0 0 10 A C. lunata var. aeria 0 0 0 5 S C. oryzae 0 0 0 5 S C. pallescens 1 0 4 3 C C. prasadii 6 0 0 1 A Deightoniella torulosa 11 4 0 38 C Drechslera hawaiiensis 16 2 0 0 A Fusarium solani 6 0 5 14 C F. oxysporum 0 0 3 2 A Glomerella cingulata 4 0 0 15 A G. musarum 4 5 0 7 C Guignardia mangifera 12 9 0 9 C Mycosphaerella musicola 0 0 0 1 S Nigrospora oryzae 4 0 20 25 C Nodulisporium gregarium 0 35 0 3 A Paecilomyces lilacinus 0 0 33 0 S Periconia digitata 2 0 0 0 S Papulospora halima 0 0 0 2 S Pestalotiopsis maculans 3 12 0 8 C Phoma capitulum 1 0 0 0 S P. tracheiphila 0 0 1 0 S P. sorghina 0 0 0 2 S Schizophyllum commune 0 0 0 2 S Scolecobasidium humicola 0 0 2 8 A Sporormiella minima 0 0 5 7 A Tritirachium oryzae 0 0 4 10 A Xylaria sp. 0 18 2 0 A Xylaria aff. hypoxylon 0 5 4 0 A
Número de UFC 143 200 103 305 0 = Não ocorrência
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
82
Verificou-se que as populações de fungos endofíticos mais similares,
comparadas pelo Índice de Sørensen, foram dos sítios Araçá/Taboquinha (62%),
seguidas pelos de Araçá/Freixeira (59%), Freixeira/Taboquinha (47%). As populações
de Serra dos Ventos/Taboquinha (43%) e Araçá/Serra dos Ventos e Freixeira/Serra dos
Ventos (37%), apresentaram similaridade menor. Três espécies foram comuns às quatro
áreas de coletas: Acremonium bacillisporum, Cladosporium cladosporioides e
Colletotrichum gloeosporioides (Tabela 7). Segundo Müller-Dombois & Ellenberg
(1974), duas comunidades podem ser consideradas similares quando o índice de
Sørensen for superior a 50%, caso observado em três áreas estudadas.
Provavelmente estes resultados são devidos às diferenças existentes nas
cultivares de bananeira e condições ambientais entre as quatro áreas de coletas,
refletindo características de cada ambiente. Segundo Polishook et al. (1996), uma
mesma espécie vegetal tende a ter alta similaridade entre si, comparada a amostras de
diferentes espécies vegetais em uma mesma área. O predomínio de uma espécie está
ligado aos fatores climáticos e físico-químicos dos substratos na área investigada
(Marques et al., 2008).
Tabela 8. Número de espécies de fungos endofíticos associadas e comuns e índice de
similaridade entre as áreas de coleta, no município de Belo Jardim/PE
Áreas de coleta N° de espécies
Índice de similaridade
de Sørensen (%)
Associados a Araçá 21 _
Associados a Freixeira 16 _
Associados a Serra dos Ventos 16 _
Associados a Taboquinha 30 _
Comuns Araçá/Freixeira 11 59
Comuns a Araçá/Serra dos Ventos 7 37
Comuns a Araçá/Taboquinha 16 62
Comuns a Freixeira/Serra dos Ventos 6 37
Comuns a Freixeira/Taboquinha 11 47
Comuns a Serra dos Ventos/Taboquinha 10 43
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
83
4.4. Isolamento de fungos endofíticos por cultivares
As cultivares ‘Maçã’, ‘Prata-Anã’, ‘Nanicão’ e ‘Pacovan’ apresentaram
respectivamente 17,8%, 19,6%, 22,0% e 40,6% do percentual total de isolados, sendo o
de maior percentual de colonização no cultivar “Pacovan” devido provavelmente às
condições ambientais do local da coleta (Tabela 9).
Conforme Borges et al. (2000) ocorrem diferenças entre cultivares, até mesmo
dentro do grupo genômico. Aspectos como altura da planta, tamanho, formato das
folhas e suscetibilidade às doenças variam de cultivar para cultivar (Coelho et al.,
2002). Alguns fatores interferem qualitativa e quantitativamente na diversidade dos
fungos endofíticos, destacando-se: hospedeiro, distribuição geográfica, condições
ecológicas, sazonais, altitude, precipitação, idade do vegetal e o tempo até serem
submetidas ao isolamento (Peixoto Neto et al., 2004).
Em relação ao Teste do Qui-Quadrado (X²), como o valor de P<0,01, rejeita-se a
hipótese de nulidade (Ho), isto é, a hipótese de ser a mesma a porcentagem das
cultivares em relação às idades fenológicas das folhas. As cultivares ‘Maçã’ (165),
‘Nanicão’ (147) e ‘Prata-Anã’ (134) não apresentaram diferenças estatisticamente
significativas, quando comparadas, entretanto, com a cultivar ‘Pacovan’ (305), a
diferença é altamente significativa. A frequência de ocorrência em relação à idade
fenológica das folhas nova (159), intermediária (271) e velha (321) diferiu
significativamente. Em relação às frequências observadas e esperadas das idades das
folhas das cultivares observaram-se diferenças significativas (Tabela 9).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
84
Tabela 9. Frequência de ocorrência e unidades formadoras de colônias (%) de fungos
endofíticos em folhas de quatro cultivares de bananeira (Musa spp.)
Cultivares Idade fenológica das folhas ‘Maçã’ ‘Prata-Anã’ ‘Nanicão’ ‘Pacovan’
UFC(%)
Nova 32(34,93)
28(28,37)
13(31,12)
86(64,57)
159c
Intermediária 62(59,54)
42(48,35)
52(53,05)
115(110,06)
271b
Velha 71(70,53)
64(57,28)
82(62,83)
104(130,37)
321a
UFC 165
22,0% 134
17,8% 147
19,6% 305
40,6% 751
UFC = Unidades formadoras de colônias. * Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas na coluna, não diferem entre si (P<0,0001). Qui-Quadrado (X²) = Σ (Fο – Fe)/Fe, Tabela de Contingência = 4 X 3 Qui-Quadrado (X²) = 31,065 ** Graus de Liberdade = 6 (p) < 0,0001
A Tabela 10 mostra as unidades formadoras de colônias (UFC) de fungos
endofíticos isolados em cada cultivar, com destaque para a cultivar “Pacovan”, com 305
UFC. O número de espécies associadas às cultivares ‘Pacovan’, ‘Prata-Anã’, ‘Nanicão’
e ‘Maçã’ foi, respectivamente: 29, 27, 20 e 25. Cladosporium cladosporioides,
Colletotrichum gloeosporioides, Curvularia eragrostidis, Deightoniella torulosa,
Fusarium solani e Nigrospora oryzae foram comuns as quatro cultivares.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
85
Tabela 10. Fungos endofíticos isolados (UFC) em quatro cultivares de bananeira
(‘Nanicão’, ‘Pacovan’, ‘Prata-Anã’ e ‘Maçã’), no município de Belo Jardim/PE
UFC
Fungos endofíticos
Nanicão
Pacovan
Prata-Anã
Maçã
Acremonium bacillisporum 4 4 0 2 A. strictum 0 2 0 0 A. polychoroma 0 35 3 2 Alternaria alternata 10 18 3 0 Cladosporium cladosporioides 4 20 5 13 C. musae 1 0 6 6 C. oxysporum 0 3 0 0 C. tenuissimum 0 0 1 0 Colletotrichum dematium 1 3 0 0 C. gloeosporioides 12 32 10 12 C. musae 31 26 40 11 Cordana musae 0 0 1 0 Curvularia eragrostidis 1 10 1 8 C. lunata var. aeria 0 5 1 0 C. oryzae 0 5 0 0 C. pallescens 0 5 2 1 C. prasadii 1 3 3 0 Deightoniella torulosa 1 36 7 9 Drechslera hawaiiensis 9 0 3 7 Fusarium solani 4 16 1 4 F. oxysporum 0 2 2 1 Glomerella cingulata 5 11 2 1 G. musarum 3 4 4 4 Guignardia mangifera 6 11 0 13 Mycosphaerella musicola 0 1 0 0 Nigrospora oryzae 3 25 8 14 Nodulisporium gregarium 32 3 0 5 Paecilomyces lilacinus 0 0 9 26 Periconia digitata 0 0 1 0 Papulospora halima 0 1 0 0 Pestalotiopsis maculans Phoma capitulum
3 0
4 0
7 1
7 0
P. tracheiphila 0 0 0 1 P. sorghina 0 0 0 1 Schizophyllum commune 0 1 0 0 Scolecobasidium humicola 0 2 0 8 Sporormiella minima 0 7 3 2 Tritirachium oryzae 0 10 2 2 Xylaria sp. 11 0 4 5 Xylaria aff. Hypoxylon 5 0 4 0 Número de unidades formadoras de
colônias/cultivar 147 305 134 165
O = Não ocorrência
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
86
Populações de endófitos mais similares (>60%) foram encontrados nas
cultivares ‘Pacovan’ X ‘Prata-Anã’ (65,5% de similaridade), ‘Pacovan’ X ‘Nanicão’
(65,3%) e ‘Prata-Anã’ X ‘Nanicão’ (61,2%). A similaridade entre as demais cultivares
foi menor que 50% (Tabela 11). Entre as cultivares estudadas, a similaridade entre as
espécies de fungos endofíticos foi considerada alta.
Tabela 11. Número de espécies associados e comuns e índice de similaridade de fungos
endofíticos (segundo Sørensen) isolados em quatro cultivares de bananeira (‘Pacovan’,
‘Prata-Anã’, ‘Nanicão’ e ‘Maçã’), no município de Belo Jardim/PE
Cultivares
N° de espécies
Índice de Similaridade
(%)
Associados a ‘Pacovan’ 29 _
Associados a ‘Prata-Anã’ 29 _
Associados a ‘Nanicão’ 20 _
Associados a ‘Maçã’ 16 _
Comuns Pacovan X Prata-Anã 19 65,5
Comuns a ‘Pacovan’ X ‘Nanicão’ 16 65,3
Comuns a ‘Pacovan’ X ‘Maçã’ 10 44,4
Comuns a ‘Prata-Anã’ X ‘Nanicão’ 15 61,2
Comuns a ‘Prata-Anã’ X ‘Maçã’ 11 48,8
Comuns a ‘Nanicão’ X ‘Maçã’ 8 44,4
Comuns a ‘Pacovan’ X ‘Prata-Anã’ X ‘Nanicão’ X
‘Maçã’
6 _
4.5. Influência da sazonalidade na ocorrência dos fungos endofíticos
A ocorrência dos fungos endofíticos foi maior no período chuvoso, com
formação de 448 colônias (59,7%), em relação ao período de estiagem, com 303
colônias (40,3%) (Tabela 12).
Na estação chuvosa foram identificadas 51 espécies de fungos endofíticos,
enquanto na estação de estiagem foram isoladas 32 espécies, com diferença significativa
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
87
na composição dos fungos, o que pode ser explicado pelo fato de que no verão a
temperatura, umidade e radiação ultravioleta são altas, afetando a esporulação, a
germinação e a entrada do fungo nas folhas de bananeira.
Tabela 12. Número de fungos endofíticos isolados de bananeira (Musa spp.) no
município de Belo Jardim/PE, em quatro coletas, na estação chuvosa e de estiagem
Período de coleta
Períodos de coleta Chuvosa Estiagem N° de espécies isoladas/coletas
Abril/2007 143 0 21
Setembro/2007 0 200 16
Janeiro/2008 0 103 16
Março/2008 305 0 30
Total de Unidades Formadoras de Colônias (UFC)
448 303 -
Frequência de ocorrência (%) 59,7 40,3 -
O = Não ocorrência
Observa-se na estação chuvosa maior número de UFC e maior diversidade de
fungos endofíticos. Alguns autores obtiveram maior frequência de fungos endofíticos na
estação de estiagem, diferindo dos resultados do presente estudo (Hallmann et al., 1998;
Gao et al., 2005).
Altas temperaturas reduzem o número de conídios viáveis e sua atividade varia
devido a mudanças na temperatura e disponibilidade de água (Virzo de Santo et al.,
1976). Condições ambientais afetam o crescimento dos fungos endofíticos (Griffin,
1994), que conforme Pelczar et al. (1996) crescem em ampla faixa de temperatura.
Segundo Fryar et al. (2004) diferenças sazonais podem alterar a diversidade fúngica.
Observa-se que a riqueza e a composição de fungos endofíticos estão relacionadas às
estações do ano.
Zaemey et al. (1994) e Pessoa et al. (2007) estudaram o efeito da temperatura e
de outras condições ambientais sobre o desenvolvimento de Colletotrichum musae, na
banana, havendo influência no crescimento fúngico. De acordo com Chillet et al.
(2006), aumento na temperatura e período chuvoso estão diretamente associados ao
crescimento de C. musae.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
88
4.6. Índice da velocidade de crescimento dos fungos endofíticos e fitopatógenos,
individualmente
A velocidade de crescimento dos fungos endofíticos variou de 0,07cm/dia a
0,53cm/dia. Em relação à velocidade e crescimento micelial os fungos endofíticos
foram separados em quatro grupos (Oliveira, 1991): A) dez espécies apresentaram
crescimento micelial de 7,0cm a 7,5cm, sendo consideradas fungos de crescimento
muito rápido, B) três foram classificadas como de crescimento rápido; C) cinco
apresentaram crescimento micelial lento; D) duas tiveram crescimento muito lento (1,0
e 1,5cm, respectivamente) (Tabela 13).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
89
Tabela 13. Índice da velocidade de crescimento micelial (IVCM) dos fungos
endofíticos isolados de folhas de bananeira, aos 14 dias de incubação, em meio BDA
Fungos endofíticos
Crescimento
micelial (cm)¹
IVCM
(cm/dia)² Grupos
Colletotrichum gloeosporioides 7,5 0,53 Muito rápido
Curvularia eragrostidis 7,5 0,53 Muito rápido
C. prasadii 7,5 0,53 Muito rápido
Guignardia mangifera 7,5 0,53 Muito rápido
Nigrospora oryzae 7,5 0,53 Muito rápido
Nodulisporium gregarium 7,5 0,53 Muito rápido
Pestalotiopsis maculans 7,5 0,53 Muito rápido
Curvularia lunata var. aeria 7,0 0,50 Muito rápido
Drechslera hawaiiensis 7,0 0,50 Muito rápido
Fusarium solani 7,0 0,50 Muito rápido
Alternaria alternata 6,0 0,42 Rápido
Xylaria sp. 5,5 0,39 Rápido
Xylaria af.hypoxylon 5,0 0,35 Rápido
Sporormiella minima 3,5 0,25 Lento
Paecilomyces lilacinus 3,0 0,20 Lento
Acremonium bacillisporum 2,0 0,14 Lento
Acremonium strictum 2,0 0,14 Lento
Acremonium polychoroma 2,0 0,14 Lento
Scolecobasidium humicola 1,5 0,10 Muito lento
Tritirachium oryzae 1,0 0,07 Muito lento
1. Média de três repetições.
2. Índice da velocidade de crescimento micelial, calculado com dados nas leituras de sétimo e 14° dias de
incubação, empregando-se a fórmula adaptada por Oliveira (1991).
O crescimento micelial de Alternaria alternata foi classificado como rápido,
confirmando os resultados de Larone (1995), porém, diferindo dos dados de Silva &
Melo (1999) que observaram crescimento lento e baixa esporulação para os isolados
estudados por eles.
A diferença no crescimento micelial varia, sendo característica genética inerente
a cada espécie (Lilly & Barnett, 1951). Dias (2002) relata que diferentes isolados
apresentam diferenças significativas na velocidade de crescimento micelial, em meio de
cultura. Segundo Carabi-Adell et al. (2003) geralmente o crescimento dos fungos
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
90
endofíticos é rápido. Em condições naturais, esses fungos muitas vezes são bons
colonizadores e crescem rapidamente in vitro. Os que crescem lentamente in vitro
muitas vezes não são bons colonizadores (Mejía et al., 2008).
O Índice da velocidade de crescimento micelial dos fitopatógenos variou de
0,07cm/dia a 0,50cm/dia. Os fitopatógenos foram separados em três grupos (Tabela 14):
A) Fusarium oxysporum, Deightoniella torulosa e Colletotrichum musae apresentaram
os maiores valores de crescimento micelial, sendo considerados de crescimento muito
rápido; B) Mycosphaerella musicola e Cladosporium musae apresentaram crescimento
rápido; C) Pseudocercospora musae teve crescimento muito lento (1,0cm/dia). P.
musae apresenta crescimento lento e baixa esporulação em substratos artificiais (Nagel,
1934; Dantas, 1948).
Tabela 14. Índice da velocidade de crescimento micelial dos fitopatógenos isolados de
folhas de bananeira com sintomas, em cultivo individual, aos 14 dias de incubação, em
meio BDA
Fitopatógenos
Crescimento
micelial (cm)¹
IVCM (cm/dia)² Grupos de
IVCM
Colletotrichum musae 7,0 0,50 Muito rápido
Deightoniella torulosa 7,0 0,50 Muito rápido
Fusarium oxysporum 7,0 0,50 Muito rápido
Mycosphaerella musicola 5,5 0,39 Rápido
Cladosporium musae 4,0 0,28 Rápido
Pseudocercospora musae 1,0 0,07 Muito lento
(¹) Média de duas repetições. (²) Índice da velocidade de crescimento, foi calculado com dados nas leituras de sétimo e 14° dias de incubação, empregando-se a fórmula adaptada por Oliveira (1991).
No presente trabalho alguns fungos endofíticos apresentaram velocidade de
crescimento micelial igual ou superior à dos fitopatógenos, destacando-se: Alternaria
alternata, Colletotrichum gloeosporioides, Curvularia eragrostides, C. lunata var.
aeria, C. prasadii, Drechslera hawaiiensis, Fusarium solani, Guignardia mangifera,
Nigrospora oryzae, Nodulisporium gregarium e Pestalotiopsis maculans (Tabela 14),
não diferindo entre si, porém, mostraram diferença significativa quanto aos demais
fungos endofíticos.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
91
Segundo Medeiros (1988), a capacidade dos fungos endofíticos de crescerem
mais rapidamente em relação aos fitopatógenos é característica comum, sendo
importante, por conferir maior possibilidade de competição por espaço e nutrientes,
onde os fungos de crescimento rápido têm mais chance de predominar no ambiente. A
taxa de crescimento micelial pode indicar uma maior capacidade para colonizar
substratos e competir pela habilidade saprofítica com outros fungos (Melo, 1998).
4.7. Avaliação da atividade antagônica dos fungos endofíticos contra fitopatógenos,
in vitro, em cultura pareada
Dos 20 fungos endofíticos testados, apenas nove (Alternaria alternata,
Colletotrichum gloeosporioides, Curvularia eragrostidis, C. lunata var. aeria, C.
prasadii, Fusarium solani, Guignardia mangifera, Nigrospora oryzae e Pestalotiopsis
maculans) conseguiram inibir em 100% o crescimento de Pseudocercospora musae,
recebendo nota 1 (antagonistas com alta capacidade para controle biológico). Os que
obtiveram notas 2 e 3 são considerados prováveis antagonistas, sendo indicados para o
controle biológico; porém os fungos endofíticos que obtiveram notas 4 e 5, não são
indicados como antagonistas de fitopatógenos da bananeira (Tabelas 2 e 15). Esses
resultados obtidos in vitro devem ser interpretados como de valor relativo para o
controle a nível de campo (Bettiol et al., 2009).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
92
Tabela 15. Classificação dos fungos endofíticos em relação à inibição de fitopatógenos,
segundo teste de antagonismo, em cultivo pareado, por 14 dias, em meio BDA
FF
FE
A
B
C
D
E
F
Acremonium bacillisporum 5 5 4 4 4 4
Acremonium strictum 5 5 4 4 4 4
Acremonium polychoroma 5 5 4 4 4 4
Alternaria alternata 4 3 1 2 3 1
Colletotrichum gloeosporioides
3 3 1 2 3 2
Curvularia eragrostidis 3 3 1 2 2 2
Curvularia lunata var. aeria
3 3 1 2 3 2
Curvularia prasadii 4 3 1 2 2 2
Drechslera hawaiiensis 4 4 2 4 3 3
Fusarium solani 3 3 1 3 3 2
Guignardia mangifera 4 4 1 2 3 2
Nigrospora oryzae 2 3 1 1 1 1
Nodulisporium gregarium 5 3 2 2 1 3
Paecilomyces lilacinus 4 3 2 3 3 3
Pestalotiopsis maculans 3 2 1 2 2 1
Scolecobasidium humicola 5 5 4 4 5 4
Sporormiella minima 4 5 2 4 5 4
Tritirachium oryzae 4 4 4 4 5 4
Xylaria sp. 5 4 4 3 4 4
Xylaria aff. hypoxylon 4 3 4 4 3 3
Os números 1 (100%), 2 (75%), 3 (50%), 4 (25%) e 5 (0%) referem-se às notas para classificação, conforme Bell et al. (1982).
FE= fungos endofíticos e FF= Fitopatógenos
A= Fusarium oxysporum, B= Colletotrichum musae, C= Pseudocercospora musae, D= Cladosporium
musae, E= Deightoniella totulosa e F= Mycosphaerella musicola
4.7.1. Comportamento antagônico dos fungos endofíticos isolados, em relação a
Fusarium oxysporum f. sp. cubense
Apenas Nigrospora oryzae obteve nota 2, por inibir o crescimento de Fusarium
oxysporum com sobreposição de hifas (Figura 6). Brown et al. (1998), informam que
Nigrospora apresenta potencial para controle biológico, por produzir o composto
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
93
bioativo, citocalasina. Colletotrichum gloeosporioides, Curvularia eragrostidis, C.
lunata var. aeria, Fusarium solani, Pestalotiopsis maculans e Xylaria aff. hypoxylon
receberam nota 3, por inibir o crescimento do fitopatógeno, colonizando cada um 50%
da superfície da placa, ocorrendo paralização do seu crescimento, sem sobreposição de
hifas. Gallo et al. (2007) isolaram de folhas sadias de Smallanthus sonchifolius,
Curvularia lunata var. aeria, testada in vitro sobre células humanas, que apresentou
citotoxicidade inibindo a proliferação dessas culturas e sendo considerada fonte
promissora de metabólitos secundários anticancerígenos. Aos demais isolados foram
atribuídas notas 4 e 5, com ausência de inibição de crescimento do fitopatógeno.
Provavelmente a falta de inibição por parte de Acremonium bacillisporum, A. strictum,
A. polychoroma, Scolecobasidium humicola, Sporormiella mínima e Tritirachium
oryzae, tenha ocorrido pelo fato destes fungos apresentarem crescimento lento.
Alternaria alternata, Curvularia prasadii, Drechslera hawaiiensis, Guignardia
mangifera, Nodulisporium gregarium, Paecilomyces lilacinus e Xylaria aff. Hypoxylon,
apesar de terem crescimento rápido, não inibiram Fusarium oxysporum, provavelmente
devido à produção de metabólitos por parte do Fusarium, que segundo Acuña et al.
(2005), produz diversos metabólitos como: tricotecenos, zearalenona, fumonisinas B1 e
B2. A. pollychoroma e Tritirachium oryzae produziram pigmentação no meio de
cultura, quando pareados com F. oxysporum f. sp. cubense.
Segundo Choudhury & Oliveira (1983) antagônicos não produtores de
pigmentação são mais eficientes no controle biológico, quando comparados com
produtores de pigmentos, o que foi confirmado por (Pessoa, 1986). Segundo Lilly &
Barnett (1951) e Cochrane (1958), nos fungos, alguns pigmentos são acumulados no
micélio e esporos, enquanto outros se difundem no meio de cultura. Os fatores
nutricionais que fazem com que os fungos produzam pigmentos no meio de cultura são
os microelementos essenciais, as fontes de carbono e nitrogênio, o pH inicial do meio e
a temperatura. Alguns pigmentos são conhecidos por serem antibióticos; outros, como o
caroteno, são provitaminas, mas em geral, as funções desses pigmentos permanecem
desconhecidas (Griffin, 1994).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
94
Figura 6. Pareamento de fungos endofíticos contra Fusarium oxysporum f. sp. cubense
(na parte inferior da placa de Petri), após 14 dias de crescimento, em meio BDA: 1.
Acremonium bacillisporum, 2. A. strictum, 3. A. pollychoroma, 4. Alternaria alternaria,
5. Colletotrichium gloeosporioides, 6. Curvularia eragrostidis, 7. C. lunata, 8. C.
prasadii, 9. Drechslera hawaiiensis, 10. Fusarium solani, 11. Guignardia mangifera, 12.
Nigrospora oryzae, 13. Nodulisporium gregarium, 14. Paecilomyces lilacinus, 15.
Pestalotiopsis maculans, 16. Scolecobasidium humicola, 17. Sporormiella mínima, 18.
Tritirachium oryzae, 19. Xylaria sp. e 20. Xylaria aff. hypoxylon.
A comparação da velocidade de crescimento micelial dos 20 fungos endofíticos
pareados com Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Figura 7) mostra variações no
diâmetro das colônias dos fungos endofíticos e fitopatógenos, destacando-se
Tritirachium oryzae (0,5cm), que apresentou menor crescimento micelial em relação à
Nigrospora oryzae (4,5cm), Pestalotiopsis maculans (3,7cm) e Curvularia eragrostidis
(3,5cm) que se destacaram com os maiores crescimentos miceliais.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
95
Figura 7. Comparação do crescimento micelial de 20 fungos endófitos pareados com Fusarium oxysporum f. sp. cubense, cultivados em BDA, aos 14 dias
0
2
4
6
8
10
12
Acremo
nium
bacillisporum
Acremo
nium
strictum
Acremo
nium
polyc
horoma
Alternaria
alternata
Colletotrichum
gloeosporio
ides
Curvula
ria eragrostidis
Curvular
ia lunata var. aeria
Curvula
ria pr
asadii
Drescherella h
awaiiensis
Fusariu
m solan
i
Guign
ardia m
usae
Nigrospora or
yzae
Nodulisporiu
m gregarium
Paecilomy
ces lilacin
us
Pesta
lotiop
sis macula
ns
Scole
cobasid
ium hu
micola
Sporormiella m
inima
Tritirachium
oryzae
Xylar
ia sp.
Xylar
ia af. hypoxylo
n
Fusariu
m oxysporum f. sp. c...
Crescimento micelial radial (cm)
Fitopatógeno
Endófito
4.7.2. Comportamento antagônico dos fungos endofíticos isolados, em relação a
Colletotrichum musae
Na comparação entre Colletotrichum musae e os 20 fungos endofíticos (Figura
8), apenas Pestalotiopsis maculans obteve nota 2, inibindo o crescimento micelial de C.
musae, sem sobreposição das hifas, devido provavelmente à produção de metabólitos.
Santos et al. (2008) isolaram ergosterol e peróxido de ergosterol de
Pestalotiopsis guepinii e quando os metabólitos foram testados isoladamente,
apresentaram potencial inibitório abaixo de 35%. Quando testados juntas houve
aumento na atividade inibitória. Os autores atribuem esses efeitos à existência de
sinergismo entre as substâncias testadas. Segundo Vokou et al. (2003), substâncias
químicas, quando em combinação aos pares, tendem a evidenciar maior potencial
inibitório do que quando testadas isoladamente. Alternaria alternata, Colletotrichum
gloeosporioides, Curvularia eragrostidis, C. lunata var. aeria, C. prasadii, Fusarium
solani, Nigrospora oryzae, Nodulisporium gregarium, Paecilomyces lilacinus e Xylaria
aff. hypoxylon receberam nota 3, por inibirem o crescimento do fitopatógeno, ocorrendo
paralização do seu crescimento, sem sobreposição de hifas.
Nuangmek et al. (2008) utilizaram Nodulisporium sp. como antagonista contra
Colletotrichum musae, in vitro, o qual apresentou resultados positivos. Segundo os
autores ocorreu inibição competitiva devido provavelmente ao rápido crescimento e
produção de antibiótico por Nodulisporium sp., destacando sua possibilidade como
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
96
agente de controle biológico para antracnose da banana. Segundo Polishook et al.
(2001), Nodulisporium sp. produz o ácido nodulispórico, com propriedade inseticida.
Aos demais isolados foram atribuídas notas 4 e 5, com ausência de inibição por
parte de Acremonium bacillisporum, A. strictum, A. polychoroma, Drechslera
hawaiiensis, Guignardia mangifera, Scolecobasidium humicola, Sporormiella mínima,
Tritirachium oryzae e Xylaria sp. Apesar de Drechslera hawaiiensis e Guignardia
mangifera terem crescimento muito rápido, não inibiram Colletotrichum musae, que
também apresenta crescimento muito rápido, devido provavelmente à produção de
metabólitos produzidos pelo fitopatógeno.
Figura 8. Pareamento de fungos endofíticos contra Colletotrichum musae (na parte
inferior da placa), após 14 dias de crescimento, em meio BDA: 1. Acremonium
bacillisporum, 2. A. strictum, 3. A. pollychoroma, 4. Alternaria alternaria, 5.
Colletotrichium gloeosporioides, 6. Curvularia eragrostidis, 7. C. lunata, 8. C.
prasadii, 9. Drechslera hawaiiensis, 10. Fusarium solani, 11. Guignardia mangifera, 12.
Nigrospora oryzae, 13. Nodulisporium gregarium 14. Paecilomyces lilacinus, 15.
Pestalotiopsis maculans, 16. Scolecobasidium humicola, 17. Sporormiella mínima, 18.
Tritirachium oryzae, 19. Xylaria sp. e 20. Xylaria aff. hypoxylon.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
97
Na comparação da velocidade de crescimento micelial dos 20 fungos endofíticos
pareados com Colletotrichum musae, aos 14 dias, observa-se variação no diâmetro das
colônias, destacando-se Acremonium strictum (0,7cm), com menor crescimento micelial
em relação à Pestalotiopsis maculans (4,5cm), que se destacou com maior crescimento
micelial (Figura 9). O maior crescimento micelial do possível antagonista não indica
atividade inibitória efetiva. No caso de Pestalotiopsis maculans a reação entre os
micélios (AXP) foi de impasse. Já Acremonium strictum pouco cresceu mas inibiu à
distância o crescimento do fitopatógeno. Acremonium é um agente de controle biológico
comprovado em várias culturas.
Figura 9. Comparação do crescimento micelial de 20 fungos endófitos pareados com Colletotrichum musae , cultivados em BDA, aos 14 dias
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Acremo
nium
bacillisporum
Acremo
nium
strictum
Acremo
nium
polyc
horoma
Alternaria
alternata
Colletotrichum
gloeosporio
ides
Curvula
ria eragrostidis
Curvular
ia lunata var. aeria
Curvularia prasadii
Drescherella h
awaiiensis
Fusariu
m solan
i
Guign
ardia m
usae
Nigrospora or
yzae
Nodulisporiu
m gregarium
Paecilomy
ces lilacin
us
Pesta
lotiop
sis maculans
Scolecobasidium
hum
icola
Sporormiella minim
a
Tritirachium
oryzae
Xylar
ia sp.
Xylar
ia af. hypoxylo
n
Colletotrichum
musae
Crescimento micelial radial (cm)
Fitopatógeno
Endófito
4.7.3. Comportamento antagônico dos fungos endofíticos isolados, em relação a
Pseudocercospora musae
Nos resultados obtidos no cultivo pareado com Pseudocercospora musae, os
fungos endofíticos (Figura 10), Alternaria alternata, Colletotrichum gloeosporioides,
Curvularia eragrostidis, C. lunata var. aeria, C. prasadii, Fusarium solani, Guignardia
mangifera, Nigrospora oryzae e Pestalotiopsis maculans obtiveram nota 1, inibindo o
crescimento micelial de P. musae, com sobreposição das hifas. Guignardia mangifera
apresentou potencial para controle de Pseudocercospora musae, porém eventualmente
G. mangifera pode tornar-se fitopatógeno. Ensaios futuros para testar o controle
biológico em campo mostram-se necessários. Drechslera hawaiiensis, Nodulisporium
gregarium, Paecilomyces lilacinus e Sporormiella minima, obtiveram a nota 2.
Acremonium bacillisporium, A. strictum, A. polychoroma, Scolecobasidium humicola,
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
98
Tritirachium oryzae, Xylaria sp. e Xylaria aff. hypoxylon obtiveram a nota 4 (Tabela 2 e
16).
Segundo Baker & Cook (1974), entre os efeitos dos fungos estão redução ou
paralização do crescimento micelial e germinação de conídios, distorções nas hifas e
endólise. A maioria dos fungos produz e secreta um ou mais compostos com atividade
antibiótica (Pal & Gardener, 2006).
Figura 10. Pareamento de fungos endofíticos contra Pseudocercospora musae (na parte
inferior da placa), após 14 dias de crescimento, em meio BDA: 1. Acremonium
bacillisporum, 2. A. strictum, 3. A. pollychoroma, 4. Alternaria alternaria, 5.
Colletotrichium gloeosporioides, 6. Curvularia eragrostidis, 7. C. lunata, 8. C.
prasadii, 9. Drechslera hawaiiensis, 10. Fusarium solani, 11. Guignardia mangifera, 12.
Nigrospora oryzae, 13. Nodulisporium gregarium 14. Paecilomyces lilacinus, 15.
Pestalotiopsis maculans, 16. Scolecobasidium humicola, 17. Sporormiella mínima, 18.
Tritirachium oryzae, 19. Xylaria sp. e 20. Xylaria aff. hypoxylon.
Hatory et al. (2004) isolaram de Sporormiella minima o composto FR171456,
que inibiu a síntese do colesterol em humanos, in vitro. Sporormiella produz
metabólitos secundários, como fitotóxicos, antifúngicos, antibactericidas e inibidores da
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
99
biossíntese de colesterol. Sporormiella mínima mostrou ação inibitória contra
Colletotrichum musae (Figura 8-17) e contra Pseudocercospora musae (Figura 10-19).
A comparação da velocidade de crescimento micelial dos 20 fungos endofíticos
pareados com Pseudocercospora musae (Figura 11) mostra variação no diâmetro das
colônias dos fungos endofíticos e fitopatógenos, destacando-se Tritirachium oryzae
(1,0cm) que apresentou o menor crescimento micelial em relação à Colletotrichum
gloeosporioides, Curvularia eragrostidis, C. lunata var. aeria, C. prasadii, Fusarium
solani, Guignardia mangifera, Nigrospora oryzae, todos com (7,0cm), que se
destacaram pelo maior crescimento micelial.
Figura 11. Comparação do crescimento micelial de 20 fungos endófitos pareados com Pseudocercospora musae , cultivados em BDA, aos 14 dias
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Acremo
nium
bacillisp
orum
Acremo
nium
strictum
Acremo
nium
polyc
horoma
Alternaria
alternata
Colletotrichum
gloeosporio
ides
Curvula
ria eragrostidis
Curvular
ia lunata var. aeria
Curvula
ria prasadii
Drescherella h
awaiiensis
Fusariu
m solan
i
Guign
ardia m
usae
Nigrospora oryzae
Nodulisporiu
m gregarium
Paecilomy
ces lilacin
us
Pesta
lotiopsis ma
culans
Scole
cobasid
ium hu
micola
Sporormiella minim
a
Tritirachium
oryzae
Xylar
ia sp.
Xylar
ia af. hypoxylo
n
Pseudocercospora musae
Crescimento micelial radial (cm)
Fitopatógeno
Endófito
4.7.4. Comportamento antagônico dos fungos endofíticos isolados, em relação a
Cladosporium musae
No cultivo pareado de Cladosporium musae com fungos endofíticos (Figura 12),
apenas Nigrospora oryzae obteve nota 1, inibindo o crescimento micelial de
Cladosporium musae, com sobreposição das hifas. Alternaria alternata, Colletotrichum
gloeosporioides, Curvularia eragrostidis, C. lunata var. aeria, C. prasadii, Guignardia
mangifera, Nodulisporium gregarium e Pestalotiopsis maculans obtiveram nota 2.
Fusarium solani, Paecilomyces lilacinus e Xylaria sp. obtiveram nota 3. Os demais
fungos foram classificados com a nota 4 (Tabelas 2 e 16).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
100
Figura 12. Pareamento de fungos endofíticos contra Cladosporium musae (na parte
inferior da placa), após 14 dias de crescimento, em meio BDA: 1. Acremonium
bacillisporum, 2. A. strictum, 3. A. pollychoroma, 4. Alternaria alternaria, 5.
Colletotrichium gloeosporioides, 6. Curvularia eragrostidis, 7. C. lunata, 8. C.
prasadii, 9. Drechslera hawaiiensis, 10. Fusarium solani, 11. Guignardia mangifera, 12.
Nigrospora oryzae, 13. Nodulisporium sp., 14. Paecilomyces lilacinus, 15.
Pestalotiopsis maculans, 16. Scolecobasidium humicola, 17. Sporormiella mínima, 18.
Tritirachium oryzae, 19. Xylaria sp. e 20. Xylaria aff. hypoxylon
Oh et al. (1999) isolaram Colletotrichum gloeosporioides endofiticamente de
Cryptocarya mandioccana, na Floresta Atlântica brasileira, e este isolado produziu
deoxiscitalona e tetralona. Estas substâncias apresentaram atividade antifúngica contra
Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum, comparável com atividade da
nistatina (Inácio et al., 2006). Os autores sugerem que a atividade apresentada pelos
metabólitos secundários produzidos por C. gloeosporioides está relacionada à função de
proteção do hospedeiro contra fitopatógenos, demonstrando o significado ecológico do
estudo deste fungo.
De acordo com Dennis & Webster (1971a), isolados de uma mesma espécie,
embora morfologicamente semelhantes, podem diferir fisiologicamente e atuar de
maneiras diferentes quanto ao antagonismo, dependendo das características fisiológicas
do fitopatógeno e da possível variabilidade genética inerente a cada isolado e existem
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
101
fatores externos como equilíbrio nutricional e influência da temperatura que afetam o
desenvolvimento dos fungos.
No pareamento, houve produção de substância avermelhada por Tritirachium
oryzae e Acremonium polychoroma no meio de cultura, resultando na formação de um
halo (Figura 12: n° 3 e 18) que não impediu o crescimento de Cladosporium musae;
porém, foram observadas alterações na coloração das colônias.
A comparação da velocidade de crescimento micelial dos 20 fungos endofíticos
pareados com Cladosporium musae, mostra variação no diâmetro das colônias dos
fungos endofíticos e fitopatógenos, destacando-se Tritirachium oryzae (0,5cm) que
apresentou o menor crescimento micelial em relação à Nigrospora oryzae (6,2cm), que
se destacou com maior crescimento micelial (Figura 13).
Figura 13. Comparação do crescimento micelial dos 20 fungos endófitos pareados com Cladosporium musae cultivados em BDA, aos 14 dias
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Acremo
nium
bacillisporum
Acremo
nium
stric
tum
Acremo
nium
polyc
horoma
Alternaria
alter
nata
Colletotrichum
gloeosporio
ides
Curvula
ria eragrostidis
Curvular
ia lunata var. aeria
Curvula
ria pr
asadii
Drescherella h
awaiiensis
Fusariu
m solan
i
Guign
ardia m
usae
Nigrospora or
yzae
Nodulisporiu
m gregarium
Paecilomy
ces lilacin
us
Pesta
lotiop
sis macula
ns
Scole
cobasid
ium hu
micola
Sporormiella m
inima
Tritirachium
oryzae
Xylar
ia sp.
Xylar
ia af. hypoxylo
n
Cladosporiu
m mu
sae
Crescimento micelial radial (cm)
Fitopatógeno
Endófito
4.7.5. Comportamento antagônico dos fungos endofíticos isolados, em relação a
Deightoniella torulosa
No cultivo pareado de Deightoniella torulosa com fungos endofíticos (Figura
14), apenas Nigrospora oryzae e Nodulisporium gregarium, obtiveram nota 1.
Curvularia eragrostides, C. prasadii, Nigrospora oryzae, Nodulisporium gregarium e
Pestalotiopsis maculans obtiveram nota 2, inibindo o crescimento micelial de D.
torulosa com sobreposição das hifas. Alternaria alternata, Colletotrichum
gloeosporioides, C. lunata var. aeria, Drechslera hawaiiensis, Fusarium solani,
Guignardia mangifera, Paecilomyces lilacinus e Xylaria aff. hypoxylon obtiveram nota
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
102
3. Acremonium bacillisporum, A. strictum, A. polychoroma, Scolecobasidium humicola,
Sporormiella mínima, Tritirachium oryzae e Xylaria sp. obtiveram notas 4 e 5 (Tabela 2
e 16).
Figura 14. Pareamento de fungos endofíticos contra Deightoniella torulosa (na parte
inferior da placa), após 14 dias de crescimento, em meio BDA: 1. Acremonium
bacillisporum, 2. A. strictum, 3. A. pollychoroma, 4. Alternaria alternaria, 5.
Colletotrichium gloeosporioides, 6. Curvularia eragrostidis, 7. C. lunata, 8. C.
prasadii, 9. Drechslera hawaiiensis, 10. Fusarium solani, 11. Guignardia mangifera, 12.
Nigrospora oryzae, 13. Nodulisporium gregarium, 14. Paecilomyces lilacinus, 15.
Pestalotiopsis maculans, 16. Scolecobasidium humicola, 17. Sporormiella mínima, 18.
Tritirachium oryzae, 19. Xylaria sp. e 20. Xylaria aff. hypoxylon.
A comparação da velocidade de crescimento micelial dos 20 fungos endofíticos
pareados com Deightoniella torulosa mostrou variação no diâmetro das colônias dos
fungos endofíticos e fitopatógenos, onde, Tritirachium oryzae (0,5cm) apresentou
menor crescimento micelial em relação à Nigrospora oryzae (6,0cm), que se destacou
com maior crescimento micelial (Figura 15).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
103
Figura 15. Comparação do crescimento micelial de 20 fungos endófitos pareados com Deightoniella torulosa , cultivados em BDA, aos 14 dias
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Acremo
nium
bacillisp
orum
Acremo
nium
strictum
Acremo
nium
polyc
horoma
Alternaria
alternata
Colletotrichum
gloeosporio
ides
Curvula
ria eragrostidis
Curvularia
lunata var. aeria
Curvula
ria prasadii
Drescherella h
awaiiensis
Fusariu
m solan
i
Guignardia musae
Nigrospora oryzae
Nodulisporiu
m gregarium
Paecilomy
ces lilacin
us
Pesta
lotiopsis ma
culans
Scole
cobasid
ium humicola
Sporormiella minim
a
Tritirachium
oryzae
Xylaria
sp.
Xylar
ia af. hypoxylo
n
Deigh
toniella torulosa
Crescimento micelial radial (cm)
Fitopatógeno
Endófito
4.7.6. Comportamento antagônico dos fungos endofíticos isolados, em relação a
Mycosphaerella musicola
No cultivo pareado de Mycosphaerella musicola com fungos endofíticos (Figura
16), Alternaria alternata, Nigrospora oryzae e Pestalotiopsis maculans obtiveram nota
1, inibindo o crescimento micelial de M. musicola, com sobreposição das hifas.
Colletotrichum gloeosporioides, Curvularia eragrostidis, C. lunata var. aeria, C.
prasadii, Fusarium solani e Guignardia mangifera obtiveram nota 2. Drechslera
hawaiiensis, Nodulisporium gregarium, Paecilomyces lilacinus e Xylaria aff. hypoxylon
obtiveram nota 3. Notas 4 e 5 foram obtidas pelos seguinte fungos endofíticos:
Acremonium bacillisporum, A. strictum, A. polychoroma, Scolecobasidium humicola,
Sporormiella minima, Tritirachium oryzae e Xylaria sp. (Tabelas 2 e 16).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
104
Figura 16. Pareamento de fungos endofíticos contra Mycosphaerella musicola (na parte
inferior da placa), após 14 dias de crescimento, em BDA: 1. Acremonium bacillisporum,
2. A. strictum, 3. A. pollychoroma, 4. Alternaria alternaria, 5. Colletotrichium
gloeosporioides, 6. Curvularia eragrostidis, 7. C. lunata, 8. C. prasadii, 9. Drechslera
hawaiiensis, 10. Fusarium solani, 11. Guignardia mangifera, 12. Nigrospora oryzae,
13. Nodulisporium sp., 14. Paecilomyces lilacinus, 15. Pestalotiopsis maculans, 16.
Scolecobasidium humicola, 17. Sporormiella mínima, 18. Tritirachium oryzae, 19.
Xylaria sp. (19) e 20. Xylaria aff. (17)
A comparação da velocidade de crescimento micelial dos 20 fungos endofíticos
pareados com Mycosphaerella musicola mostrou variação no diâmetro das colônias dos
fungos endofíticos e fitopatógenos. Tritirachium oryzae (0,7cm) apresentou o menor
crescimento micelial em relação à Nigrospora oryzae (5,7cm), que se destacou com
maior crescimento micelial (Figura 17).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
105
Figura 17. Comparação do crescimento micelial de 20 fungos endofíticos pareados com Mycosphaerella musicola , cultivados em BDA, aos 14 dias
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Acremo
nium
bacillisporum
Acremo
nium
stric
tum
Acremo
nium
polyc
horoma
Alternaria
alternata
Colletotrichum
gloeosporio
ides
Curvula
ria er
agrostidis
Curvular
ia lunata var. aeria
Curvula
ria pr
asadii
Drescherella h
awaiiensis
Fusariu
m solan
i
Guign
ardia m
usae
Nigrospora or
yzae
Nodulisporiu
m gregarium
Paecilomy
ces lilacin
us
Pesta
lotiop
sis maculans
Scolecobasidium
humicola
Sporormiella m
inima
Tritirachium
oryzae
Xylar
ia sp.
Xylar
ia af. hypoxylo
n
Mycosphaerella musico
la
Crescimento micelial radial (cm)
Fitopatógeno
Endófito
Weller (1988) cita como fatores responsáveis pelo desempenho de um
biocontrolador, a perda da competitividade ecológica devido à alteração de alguma
característica do fungo, variação na colonização pelo antagonista e interferência de
fatores bióticos e abióticos. Geralmente biocontroladores não alcançam percentuais
elevados (Silva et al., 2008) e o biocontrole raramente dá bons resultados (Bettiol,
1991).
4.8. Produção de metabólitos voláteis por fungos endofíticos contra
Pseudocercospora musae
Acremonium bacillisporum e A. strictum foram os únicos que inibiram o
crescimento micelial de Pseudocercospora musae (Figuras 18, 19 e 20), no teste de
inibição por volatilidade, provavelmente pela produção de substâncias no meio, visto
que não houve contato micelial entre os fungos. Representantes do gênero Acremonium
produzem substâncias voláteis (White Jr. & Cole, 1985), que inibem o crescimento
fúngico (Hawker, 1950).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
106
Figura 18. Teste de volatilidade entre Pseudocercospora musae (colônias na parte
inferior das placas). a) Acremonium bacillisporum; b) Acremonium strictum, mostrando
inibição de crescimento micelial do fitopatógeno
Acremonium polychoroma, Alternaria alternata, Xylaria sp. e Curvularia lunata
var. aeria não foram capazes de inibi o crescimento micelial do fitopatógeno, porém,
Pseudocercospora musae produziu exsudato, nos quatro pareamentos (Figura 19),
indicativo de alteração na fisiologia do fitopatógeno.
Figura 19. Teste de volatilidade entre Pseudocercospora musae (colônias na parte
inferior das placas). a) Acremonium pollychoroma; b) Alternaria alternata; c) Xylaria
sp.; d) Curvularia lunata var. aeria, mostrando produção de exsudato e um halo escuro
por parte do fitopatógeno.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
107
Fusarium solani e Nigrospora oryzae alteraram o crescimento micelial do
fitopatógeno no teste de volatilidade, mas ultrapassando a divisória da placa, com
contato direto entre os fungos. Assim não é possível sugerir que os fungos endofíticos
produziram substâncias bioativas. Ocorreu, porém, produção de exsudato nas colônias
do fitopatógeno (Figura 20). A produção de exsudato por parte do fitopatógeno torna o
resultado obtido neste trabalho interessante e merecedor de investigações mais
aprofundadas.
Figura 20. Teste de inibição entre Pseudocercospora musae (colônias na parte inferior
das placas). a) Fusarium solani; b) Nigrospora oryzae, mostrando produção de exsudato
e inibição do crescimento micelial do fitopatógeno
Colletotrichium gloeosporioides, Curvularia eragrostidis, C. prasadii,
Drechslera hawaiiensis, Guignardia mangifera, Nodulisporium gregarium,
Paecilomyces lilacinus, Pestalotiopsis maculans, Scolecobasidium humicola,
Sporormiella mínima, Tritirachium oryzae e Xylaria aff. hypoxylon, não apresentaram
inibição sobre o crescimento micelial de Pseudocercospora musae, portanto não
apresentando poencial para controle biológico da Sigatoka amarela, pelo teste de
produção de metabólitos voláteis, embora, também se mostrados promissores pelo teste
de pareamento.
4.9. Produção de metabólitos voláteis por fungos endofíticos contra Colletotrichum
musae
Colletotrichum gloeosporioides, Nodulisporium gregarium, Nigrospora oryzae,
Alternaria alternata e Tritirachium oryzae inibiram parcialmente o crescimento micelial
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
108
de Colletotrichum musae (Figura 21). Os demais fungos endofíticos não apresentaram
qualquer alteração no crescimento micelial do fitopatógeno. Estudando C. musae
proveniente de frutos de bananeira, Couto (2002), observou a produção de lipase,
amilase, celulase e protease nos isolados testados, variando de acordo com o substrato
utilizado e com o período de incubação.
Figura 21. Teste de volatilidade entre Colletotrichum musae (colônias na parte superior
das placas) e: a) Colletotrichum gloeosporioides; b) Nodulisporium gregarium; c)
Nigrospora oryzae; d) Alternaria alternata; e) Tritirachium oryzae, mostrando inibição
parcial do crescimento micelial do fitopatógeno
4.10. Produção de metabólitos voláteis por fungos endofíticos contra
Mycosphaerella musicola
O antagonismo contra Mycosphaerella musicola (Figura 22) revelou inibição do
crescimento micelial frente à Curvularia prasadii, Paecilomyces lilacinus, Fusarium
solani e Xylaria sp., sendo observado alterações tanto na coloração como na forma das
colônias do fitopatógeno. Mangenot & Diem (1979) citam CO2 e amônia como
substâncias voláteis produzidas por antagonistas e seus efeitos em fungos pode ser
estimulante ou inibitório.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
109
Figura 22. Teste por volatilidade entre Mycosphaerella musicola (colônias na parte
superior das placas) e: a) Curvularia lunata var. aeria; b) Paecilomyces lilacinus; c)
Fusarium solani; d) Xylaria sp., mostrando alterações das colônias do fitopatógeno
4.11. Produção de metabólitos voláteis por fungos endofíticos contra Cladosporium
musae
Alternaria alternata, Drechslera hawaiiensis e Curvularia eragrostidis inibiram
o crescimento micelial de Cladosporium musae (Figura 23), provavelmente pela
produção de substâncias voláteis, já que não houve contato micelial entre fungos. Os
demais fungos endofíticos não foram capazes de inibir o crescimento do fitopatógeno.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
110
Figura 23. Teste de volatilidade entre Cladosporium musae (colônias na parte superior
das placas) e: a) Alternaria alternata; b) Drechslera hawaiiensis; c) Curvularia
eragrostidis, mostrando inibição parcial das colônias do fitopatógeno
4.12. Produção de metabólitos voláteis por fungos endofíticos contra Fusarium
oxysporum f. sp. cubense
Nigrospora oryzae, Pestalotiopsis maculans, Paecilomyces lilacinus e
Nodulisporium gregarium produziram pouca inibição no crescimento micelial de
Fusarium oxysporum f. sp. cubense, provavelmente pela produção de substâncias
voláteis, já que não houve contato entre os fungos. Foram observadas alterações na
coloração das colônias tanto do fitopatógeno quanto dos fungos endofíticos (Figura 24).
Fusarium tem a capacidade de produzir uma variedade de micotoxinas, sendo as
mais importantes: tricotecenos, fumonisinas, fusariotoxina, moniliformina e o ácido
fusárico (Santin et al., 2001). O ácido fusárico possui a capacidade de aumentar a
toxicidade de outras micotoxinas (Bacon et al., 1995).
Pestalotiopsis é frequentemente citado na literatura como produtor de compostos
bioativos (Rodrigues et al., 2000; Li & Strobel, 2001; Strobel et al., 2002).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
111
Figura 24. Teste de inibição por volatilidade entre Fusarium oxysporum f. sp. cubense
(colônias na parte superior das placas) e: a) Nigrospora oryzae; b) Pestalotiopsis
maculans; c) Paecilomyces lilacinus; d) Nodulisporium gregarium
De um modo geral, o potencial antagônico dos fungos endofíticos foi variado
apresentando pouca eficiência para controle biológico. Porém, é interessante ressaltar a
importância desses resultados, devido ao fato dos fungos endofíticos ocuparem o
mesmo nicho dos fitopatógenos dentro da planta, podendo ser considerados homólogos
ecológicos.
O entendimento sobre a ecologia do fitopatógeno e do antagonista é necessária
para o pleno sucesso do controle biológico. Muitos fungos, quando preservados, podem
perder ou reduzir sua capacidade patogênica, diminuindo a eficiência e a credibilidade
do controle (Grigoletti Jr. et al, 2000).
O antagonista é importante para que o biocontrole seja efetivo contra
fitopatógenos, pois as chances de sucesso nos programas de controle biológico estão no
isolamento e na seleção de microrganismos antagônicos eficientes, porém, segundo
Ghini & Nakamura (2001) nem sempre apresentam correlação com os resultados
obtidos em condições de campo.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
112
Explicações podem ser levantadas para justificar a ineficácia de alguns dos
fungos endofíticos testados. Segundo Melo & Faull (2000), as associações
micoparasíticas são afetadas por fatores ambientais como temperatura, pH, umidade,
tipo de solo, radiação solar e nutrição. Os fungos endofíticos isolados e selecionados
para controlar certos fitopatógenos, possivelmente expressariam ou não seus potenciais
biotecnológicos.
Pode-se também considerar que interações fitopatógeno/antagonista/ambiente
podem ser desfavoráveis ao aparecimento do antagonismo in vitro, sendo necessários
estudos in vivo e in sito.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
113
5. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos neste trabalho permitem concluir que:
� Os 24 gêneros e 40 espécies de fungos endofíticos isolados de folhas sadias de
bananeira comportam-se tanto como sapróbios quanto fitopatógenos.
� Acremonium polychoroma, Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides,
Colletotrichum gloeosporioides, C. musae, Deightoniella torulosa, Fusarium
solani, Nigrospora oryzae, Nodulisporium gregarium, Paecilomyces lilacinus,
Pestalotiopsis maculans e Guignardia mangifera apresentam frequência
abundante.
� Acremonium bacillisporum, A. strictum, A. polychoroma, Nodulisporium
gregarium, Paecilomyces lilacinus, Guignardia mangifera, Pestalotiopsis
maculans, Drechslera hawaiiensis, Glomerella musarum, Tritirachium oryzae,
Scolecobasidium humicola, Curvularia eragrostidis, C. oryzae, C. prasadii, C.
pallescens, C. lunata var. aeria, Xylaria aff. hypoxylon, Cladosporium
tenuissimum, Periconia digitata, Papulospora halima, Phoma capitulum, P.
sorghina, P. tracheiphila e Schizophyllum commune e Colletotrichum dematium
são citados pela primeira vez como endófitos em bananeira.
� As folhas velhas de bananeira apresentam-se mais colonizadas por fungos
endofíticos, em relação às novas e intermediárias.
� Das quatro cultivares testadas, a ‘Pacovan’ é mais propícia à colonização por
fungos endofíticos.
� No período chuvoso ocorre maior frequência de fungos endofíticos em folhas de
bananeira.
� Nigrospora oryzae, Pestalotiopsis maculans e Nodulisporium gregarium são mais
eficientes nos testes de antagonismo in vitro contra os fitopatógenos testados.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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� Acremonium bacillisporum, A. strictum, A. polychoroma, Alternaria alternata,
Xylaria sp., Curvularia lunata var. aeria, C. eragrostidis, Paecilomyces lilacinus,
Fusarium solani e Drechslera hawaiiensis inibem o crescimento micelial de
fitopatógenos, com provável produção de metabólitos voláteis.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
115
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abreu, L.M. 2005. Diversidade de fungos endófitos associados à planta parasita Phoradendron perrottetti (DC.) Eichler e sua hospedeira Tapirira guianensis Aubl. Lavras, Brasil, 86p. (Dissertação. Universidade Federal de Lavras). Acuña, A., Lozano, M.C., García, M.C., Diaz, G.J. 2005. Prevalence of Fusariu species of the Liseola section on selected Colombian animal feedstuffs and their ability to produce fumonisins. Mycopathologia 160 (1): 63-66. Agrios, G.N. Plant Pathology. 2005. 5 ed. San Diego: Academic Press.
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ANEXOS
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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SCHIZOPHYLLUM COMMUNE FRIES ISOLADO COMO
ENDÓFITO DE FOLHAS DE BANANEIRA (MUSA spp.) EM
PERNAMBUCO, BRASIL ²
² Trabalho aceito para publicação, como: Assunção, M.M.C.; Cavalcanti, M.A.Q.; Menezes, M. 2009. Schizophyllum commune Fries isolado como endófito de folhas de bananeira (Musa spp.) em Pernambuco, Brasil. Revista Agrotrópica.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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SCHIZOPHYLLUM COMMUNE FRIES ISOLADO COMO
ENDÓFITO DE FOLHAS DE BANANEIRA (MUSA spp.)
EM PERNAMBUCO, BRASIL
RESUMO
Objetivando isolar endófitos de folhas de bananeiras (Musa spp.) aparentemente sadias,
utilizou-se a técnica de isolamento por fragmentação do tecido vegetal. Dentre os
isolados, foi identificado Schizophyllum commune Fries. Trata-se da primeira referência
deste fungo como endófito de bananeira para o Brasil e para o mundo.
Palavras-chave: Endófito, Musa, Basidiomycota, Schizophyllum commune.
ABSTRACT
Aiming at to isolate endophyte of leaves of banana trees (Musa spp.), seemingly
healthy, the isolation technique was used by fragmentation of the vegetable fabric.
Among the isolated ones, it was identified Schizophyllum commune Fries. It is treated of
the first reference of this mushroom as banana tree endophyte to Brazil and for the
world.
Key words: Endophyte, Musa spp., Basidiomycota, Schizophyllum commune.
Introdução
A bananeira (Musa spp.) é uma planta de grande importância econômica e social,
tanto no Brasil como no mundo (Brasil et al., 2000). A bananicultura brasileira
apresenta características que a diferencia das principais regiões produtoras do mundo,
em relação à diversidade climática, ao sistema de exploração, ao uso de cultivares,
formas de comercialização e exigências do mercado consumidor (Silva, 2000).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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Fungos endofíticos colonizam intra e/ou intercelularmente tecidos sadios de plantas,
durante todo seu ciclo de vida ou parte dele, sem causar doença (Petrini, 1991). Os
endófitos estão na forma micelial, em associação biológica com a planta (Bacon, 2000).
Portanto, para que seja um endófito, as hifas devem estar dentro do tecido vegetal
(Maheshwari, 2006). Azevedo & Araújo (2007) definem endófito, como os que podem
ou não crescer em meios de cultura, habitando o interior de tecidos vegetais sem causar
prejuízos ao hospedeiro.
Fungos de vários grupos, principalmente anamorfos de Ascomycota, têm sido
identificados como endófitos. Em relação aos Basidiomycota, poucos estudos os
mencionam como endófitos (Wang et al., 2005) especialmente em regiões tropicais
(Vallinga, 2004). Entre esses, há menção de Schizophyllum commune Fries (Agaricales),
fungo cosmopolita, que ocorre em todos os continentes, exceto na Antártica (Cooke,
1961), reconhecido como eficiente degradador de matéria orgânica (Fernandes et al.,
2005).
Tabata et al.. (1981) citam schizophyllan, produzida por S. commune, como
antitumoral. O fungo também produz escleroglucana, um polissacarídio extracelular,
utilizado na indústria (Barbosa et al., 2004) e posteriormente denominado esquizofilana
(Corradi et al., 2006). S. commune é relatado causando infecções fúngicas em humanos
(Roh et al., 2005), sinusite é a mais freqüente, ocorrendo por inalação dos basidiósporos
(Lacaz et al., 1996). O consumo de S. commune ocorre na Tanzânia (Harkonen et al.,
1993), Índia (Longvah and Deosthale, 1998), Golfo do México (Ruan-Soto et al., 2004)
e Nigéria (Adejoye et al., 2007; Oso, 1977). Registros sobre o consumo parecem estar
restritos a zonas tropicais (Olivo Aranda and Herrera, 1994).
Na natureza, S. commune apresenta-se com frutificação acinzentada a
esbranquiçada, crescendo em grupos sobre troncos de árvores vivas ou mortas, postes,
ferrovias e cercas de madeira, em regiões temperadas e tropicais. Esta espécie tem sido
utilizada para investigações biológicas, especialmente sobre genética, devido à
facilidade do cultivo e rápido desenvolvimento (Herrera and Ulloa, 1998).
No Brasil e no mundo não existem trabalhos referentes ao isolamento de S.
commune como endófito de bananeira. Este trabalho relata a ocorrência de S. commune
como endófito, isolado de folhas sadias de bananeira, contribuindo e fornecendo
subsídios para o desenvolvimento de pesquisas futuras.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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Material e Métodos
Área de estudo
Foi procedido o isolamento de endófitos, de bananeiras cultivadas na
microrregião de Taboquinha (7º26’00” S, 39º50’36” W.), município de Belo
Jardim/Pernambuco, com altitude de 650m, temperatura média de 23C e precipitação de
955,6mm anuais O clima do local segundo a classificação de Köppen é do tipo Bshs,
quente semi-árido (FIAM, 1997).
Isolamento e coletas
A coleta do material vegetal foi realizada no mês de março (período chuvoso) de
2008. Três folhas (nova, intermediária e velha) de duas bananeiras da cultivar ‘Prata’,
aparentemente sadias, coletadas aleatoriamente, colocadas separadamente em sacos de
papel e transportadas em 24h ao laboratório.
Para isolamento dos endófitos, utilizou-se a técnica de isolamento por
fragmentação do tecido vegetal (Araújo et al., 2005). Cada folha lavada com água
corrente e sabão. Com auxílio de um furador de rolha metálico esterilizado, de 6mm de
diâmetro, foram feitos 36 discos por folha, perfazendo um total de 108 discos por
planta, totalizando 216 discos. Os discos foliares, retirados das regiões centrais e
periféricas da folha, foram imersos por 1min em álcool a 70%, em seguida imersos por
1 a 2min em solução aquosa de hipoclorito de sódio (1:3) e por ultimo, submetidos a
duas lavagens consecutivas em água destilada esterilizada (Pereira et al., 1993). Com
auxílio de uma pinça flambada, em câmara asséptica, fez-se a transferência dos discos
foliares para placas de Petri contendo meio BDA (batata-dextrose-ágar) suplementado
com antibiótico azitromicina 250mg (100mg/l). Cada placa recebeu seis discos
distribuídos eqüidistantes. As placas foram incubadas em temperatura ambiente (TA
28ºC ± 2ºC) e examinadas diariamente, durante vinte dias. Inóculos dos fungos
crescidos nas bordas dos discos foram transferidos, para placas de Petri contendo meio
de cultura batata-dextrose-ágar (BDA).
Resultados e Discussão
Dentre as espécies isoladas, foi identificado Schizophyllum commune
(Agaricomycetes, Agaricales, Schizophyllaceae) (Kirk et al., 2008).
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Em estudos preliminares com endófitos de banana (Musa acuminata) em Hong
Kong e na Austrália, Brown et al. (1998) isolaram os seguintes Basidiomycota:
Armillaria tabescens (Scop.) Emel, Marasmiellus semiustus (Berk. & M.A. Curtis)
Singer, Uredo musae Cummins e Uromyces musae Henn. e um Ascomycota
Haplobasidion musae M.B. Ellis.
Jesus & Bononi (1991) citam a ocorrência de Schizophyllum commune em
diferentes espécies florestais vivas como: Alexa grandiflora Ducke, Aspidosperma
obscurinervium Azambuja, Brosimum rubescens Taubert, Brosimum sp. Trec, Carapa
guianensis (Aubl.) Steud., Cedrelinga integrifolia Ducke, Hymenae intermedia Linn,
Licaria sp. (Louro), Tabebuia amara (Vahl) Nich., Vataireopsis heteroptera Ducke.
Schizophyllum commune foi isolado como endófito do caule de Eucalipto niten,
na Austrália e Inglaterra (Fisher et al., 1993) e como endófito de folhas de Pinus
tabulaeformis, na China (Wang et al., 2005).
O isolamento de S. commune em folhas maduras de Tecton grandis L., durante a
estação chuvosa, na Tailândia, foi relatado por Chareprasert et al... (2006); a
identificação foi baseada na presença de grampo de conexão e na produção de
basidioma no meio de cultura. No presente trabalho o isolamento de S. commune
ocorreu também em folhas maduras e no período chuvoso. Os resultados estão
conforme a maioria das pesquisas, com outras plantas hospedeiras de outras localidades,
nas quais folhas maduras tendem a apresentar maior freqüência de endófitos (Bussaban
et al., 2001).
Os endófitos constituem um grupo caracterizado por poucas espécies dominantes
ou acidentais que são representadas por apenas um ou dois isolados entre centenas (Bills
& Polishook, 1992). Neste trabalho, o isolamento de S. commune pode ser considerado
acidental, visto que ocorreu apenas em um disco dos 36 semeados em meio de cultura.
Provavelmente o isolamento esteja relacionado às condições pluviométricas e à
disponibilidade de matéria orgânica em decomposição presente no bananal.
Schizophyllum commune está sendo descrito pela primeira vez para o Brasil
como endófito de bananeira, havendo apenas três ocorrências para o mundo (Austrália,
Tailândia e China) como endófito em outros hospedeiros. Portanto esta é a primeira
ocorrência para o Brasil e a quarta para a comunidade científica, contribuindo para
estudos em estimativas regionais e globais.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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Agradecimentos
O primeiro autor agradece a Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de
Pernambuco (Facepe), pela bolsa concedida.
Literatura citada
ADEJOYE, O.D.; ADEBAYO-TAYO, B.C.; OGUNJOBI, A.A.; AFOLABI, O.O. 2007. Physicochemical Studies on Schizophyllum commune (Fries) a Nigerian Edible. Fungus 2:73-76. ARAÚJO, L.A.; LIMA, A.O.S.; AZEVEDO, J.L.; MARCON, J.; SOBRAL, J.K.; LACAVA, P.T. 2005. Manual de Isolamento de Microrganismos endofíticos. Departamento de Genética. 3 ed. Piracicaba, São Paulo, Brasil. AZEVEDO, J.L.; ARAÚJO, W.L. 2007. Endophytic fungi of tropical plants: diversity and biotechnological aspects. In: Ganguli, B.N.; Deshmukh, S.K. (eds). Fungi multifacetated microbes. Anamaya Publishers, New Delhi. pp.189-207. BACON, C.W. 2000. Isolation, culture and maintenance of endophytic fungi of glasses. In: Labeda, D.P. (ed). Isolation of biotechnological organisms from nature. McGraw-Hill, New York, USA. pp.259-282. BARBOSA, A.M.; CUNHA, P.D.T.; PIGATTO, M.M.; CORRADI, S.M.L. 2004. Produção e Aplicações de Exopolissacarídeos Fúngicos. Semina: Tech. Ex. 251: 29-42. BILLS, G.F.; POLISHOOK, J.D. 1992. Recovery of endophytic fungi from Chamaecyparis thyroides. Sydowia 44:1-12. BRASIL, E.C.; OEIRAS, A.H.L.; MENEZES, A.J.E.A.; VELOSO, C.A.C. 2000. Desenvolvimento e produção de frutos de bananeira em resposta à adubação nitrogenada e potássica. Pesquisa Agropecuária Brasileira 35:2407-2414. BROWN, K.B.; HYDE, D.; GUEST, D.J. 1998. Preliminary studies on endophytic fungal communities of Musa acuminata species complex in Hong Kong and Australia. Fungal Divers 1:27-51. BUSSABAN, B.; LUMYOUNG, S.; LUMYOUNG, P.; MCKENZIE, E.H.C.; Hyde, K.D. 2001. Endophytic fungi from Amomum siamense. Canadian Journal of Botany 74: 103-114. CHAREPRASERT, S.; PIAPUKIEW, J.; THIENHIRUM, S.; WHALLEY, A.J.S.; SIHANONTH, P. 2006. Endophytic fungi of teak leaves Tectona grandis L. and rain tree leaves Samanea saman Merr. World Journal Microbiol Biotechnol 22: 481- 486. COOKE, W.B. 1961. The genus Schizophyllum. Mycologia 53:575-599. CORRADI, S.M.L.; MARTINEZ, P.F.; IZELI, N.L.; SILVA, I.R.; VASCONCELOS, A.F.D.; CARDOSO, M.S. 2006. Caracterização química de glucanas fúngicas e suas aplicações biotecnológicas. Química Nova 29:85-92. FERNANDES, L.; LEITE, C.L.; ESPÓSITO, E.; REIS, M.M. 2005. In vitro wood decay of Eucalyptus grandis by the Basidiomycete fungus Phellinus flavomarginatus. IBBS 55:187-193. FIAM .1997. Perfil municipal do interior de Pernambuco, Recife, Brasil. FISHER, P.J.; PETRINI, O.; SUTTON, B.C. 1993. A comparative study of fungal endophytes in leaves xylem and bark of Eucalyptus in Austrália and England. Sydowia 45:338-345.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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ASCOMYCOTAS ENDOFÍTICOS EM FOLHAS DE BANANEIRA (MUSA spp.), NO MUNICÍPIO DE BELO JARDIM, PERNAMBUCO, BRASIL ²
² Trabalho a ser submetido para publicação na Mycotaxon, como:Assunção, M.M.C.;Cavalcanti, M.A.Q.; Menezes, M. Ascomycotas endofíticos em folhas de bananeira (Musa spp.), no município de Belo Jardim, Pernambuco, Brasil.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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Ascomycotas endofíticos em folhas de bananeira (Musa spp.), no município de Belo Jardim, Pernambuco, Brasil
Resumo - Com o objetivo de isolar endófitos de folhas de bananeiras (Musa spp.)
aparentemente sadias das cultivares (‘Pacovan’, ‘Nanicão’, ‘Maçã’ e ‘Prata-Anã’),
utilizando a técnica de isolamento por fragmentação do tecido vegetal, foram isoladas e
identificadas às espécies de Ascomycota: Glomerella musarum, G. cingulata,
Guignardia musae, Mycosphaerella musicoa, Sporormiella minima e Xylaria aff.
hypoxylon.
Palavras-chave: Endófito, Musa spp., Ascomycota.
Introdução
A banana é cultivada em todos estados brasileiros, desde a faixa litorânea até os
planaltos do interior (Brasil et al. 2000). Sua forma de cultivo varia, desde plantios sem
uso de tecnologia, na maioria dos estados (Souza & Torres Filho, 1999) até com
tecnologias modernas (CEPEA, 2008). A bananicultura brasileira apresenta
características que a diferenciam das regiões produtoras do mundo, tanto em relação à
diversidade climática, quanto ao uso de cultivares e forma de comercialização (Silva,
2000). O Brasil destaca-se com produção anual de 7.098.353 milhões de toneladas, em
área cultivada de 519.187 mil hectares (IBGE, 2009), o que coloca o país como segundo
maior produtor mundial e segundo em área plantada no mundo, perdendo apenas para a
Índia (FAO, 2009).
Fungo endofítico é aquele que habita o interior dos tecidos aéreos do hospedeiro, pelo
menos durante uma fase do seu ciclo de vida. Desempenham variadas e estreitas
relações ecológicas, sem demonstrar sintomas visíveis. Essa característica dificulta sua
avaliação, havendo necessidade de isolamento e cultivo em laboratório (Araújo et al.
2005). Arnold (2007) define fungos endofíticos, como grupo diversificado de
Ascomycota e seus anamorfos, definido pela ocorrência no interior de tecidos de plantas
assintomáticos, presente em todas as plantas terrestres, desde o ártico até os trópicos.
Poucos são os trabalhos relacionados com diversidade, quantidade de hospedeiros e
distribuições geográficas dos fungos endofíticos, principalmente em regiões tropicais.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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Regiões tropicais, como Agreste de Pernambucano, apresentam biodiversidade,
porém, pouco estudada. Embora a região produza banana, quase nada se sabe sobre
fungos endofíticos associados à cultura. O conhecimento das espécies e suas
interrelações são importantes no processo de avaliação da biodiversidade e o papel que
os fungos desempenham no ecossistema. Este trabalho teve como objetivo isolar e
identificar fungos endofíticos pertencentes ao Filo Ascomycota, de folhas
aparentemente sadias de bananeira (Musa spp.), do Município de Belo
Jardim/Pernambuco.
Materiais e Métodos
Caracterização das áreas de coletas Belo Jardim ocupa 754Km² da área total do estado de Pernambuco. Considerado
brejo de altitude (Melo & Andrade, 1961). Vegetação formada por Floresta
subcaducifólia. Precitipação pluviométrica média anual de 955,6 milímetros. Altitude
média em torno de 650m ao nível do mar. Coordenadas geográficas 8º20’58”, 4 de
latitude sul, 36º22’50”, 8 de longitude O. Gr.–rumo NO ((FIAM, 1997). Do ponto de
vista climático é uma região considerada intermediária entre áreas de clima úmido
(Zona da Mata) e seco (Sertão) (Cabral et al., 2004), com período chuvoso (março a
julho) e seco (setembro a fevereiro) (Salgueiro, 2005). Solo classificado como
Podzólicos Amarelo e Vermelho-Amarelo (PA e PV), com variadas profundidades e
texturas, presença de cascalhos, relevo movimentado (CONDEPE/FIDEM, 2005).
Foram realizadas quatro coletas, duas na estação chuvosa e duas na estação seca, nos
sítios Araçá, Freixeira, Taboquinha e Serra dos Ventos, ambas de microprodutores de
banana do município do Belo Jardim/Pernambuco. De cada localidade foram coletados,
quatro exemplares de bananeira, de cultivares diferentes (‘Pacovan’, ‘Nanicão’, ‘Maçã’
e ‘Prata-Anã’), adultas em fase de produção, e utilizadas três folhas (nova, intermediária
e velha), totalizando 12 folhas (por coleta). As folhas aparentemente sadias, sem
manchas ou qualquer tipo de lesão causada por insetos ou danos mecânicos, foram
acondicionadas separadamente, em sacos de papel, fechados e etiquetados, levados
dentro de 24 horas ao laboratório de Micologia para processamento.
Isolamento de tecido foliar da bananeira
No laboratório, cada folha foi lavada com água corrente e sabão, utilizando-se para
isolamento a técnica por fragmentação do tecido vegetal (Araújo et al. 2005). Com
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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auxílio de um furador metálico esterilizado (6mm de diâmetro), foram feitos 36 discos
por folha, um total de 108 discos por planta obtendo-se assim 216 discos para cada
cultivar, perfazendo um total de 1728 discos em quatro coletas. Após desinfestação,
com auxílio de uma pinça flambada e em câmara asséptica, fez-se transferência dos
discos foliares para placas de Petri, contendo meio batata-dextrose-ágar (BDA)
suplementado com solução de antibiótico cloranfenicol 500mg (100mg/Lˉ¹). Cada placa
recebeu seis discos, distribuídos eqüidistantes, incubados a temperatura de laboratório
(28ºC±2ºC), examinadas diariamente, até 30 dias.
Identificação dos fungos isolados
Identificações em nível de gênero e espécie foram realizadas com fungos purificados,
quando necessário, utilizou-se a técnica de cultivo em lâmina (Riddell, 1950),
utilizando-se também bibliografias especializadas (Ellis, 1976; Sutton, 1980; Dennis,
1957; Sivanesan, 1984; Hanlin & Menezes, 1996).
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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Resultados e Discussão
Foram identificadas seis espécies de Ascomycota endofíticos, em folhas
aparentemente sadias, de bananeira: Glomerella musarum, G. cingulata, Guignardia
musae, Mycosphaerella musicoa, Sporormiella minima e Xylaria aff. hypoxylon.
Chave para Ascomycota endofítico em folhas de bananeira (Musa spp.), em
Pernambuco/Brasil.
1’ Ascomas produzidos em estromas clavados em meio de cultura......................Xylaria aff. hypoxylon
1” Ascomas não produzidos em meio de cultura ................................................................................... 2
2’ Ascomas do tipo peritécio, ascos unitunicados................................................................................... 3
2” Ascomas do tipo pseudotécio, ascos bitunicados............................................................................... 4
3’ Anamorfo Colletotrichum gloeosporioides/conídios 9-24 X 3-4,5µ...................Glomerella cingulata
3” Anamorfo Colletotrichum musae/conídios 12-17 X 4,5-5,5µ.............................Glomerella musarum
4’ Ascos obclavados, aparafisados, ascósporos 1-septados, hialinos ...... .......Mycosphaerella musicola
4” Ascos cilíndricos a clavados, ascósporos unicelulares ou multicelulares.......................................... 5
5’ Pseudotécios imersos, ascósporos unicelulares, hialinos.........................................Guignardia musae
5” Pseudotécios superficiais, ascósporos multicelulares, escuros,..........................Sporormiella mínima
Glomerella cingulata (Stoneman) Spaulding & H. Schrenk (1903)
Glomerella musarum Petch (1917)
Espécies de Glomerella são encontradas como parasitas ou sapróbios em tecidos de
plantas vasculares (Hanlin & Menezes, 1996). Demonstram certa especificidade por
determinados órgãos vegetais (Clay & Schardl, 2002). É um gênero conhecido como
cosmopolita, abundante nos trópicos, com ampla gama de hospedeiros (Holliday, 1980).
Caracteres morfológicos, como forma, tamanho dos conídios, apressórios e hospedeiros
são utilizados para classificar os estádios anamórficos correspondentes ao gênero
colletotrichum (Sutton, 1992), porém esses marcadores morfológicos são insuficientes
para separar todas as espécies, tendo se recorrido recentemente a marcadores
moleculares.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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Glomerella cingulata (Stonem) Spauld. & Schrenk (Anamorfo: Colletotrichum
gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc.) foi isolado endofiticamente de folhas de Musa
acuminata, por Brown et al. (1998), em Hong Kong e Austrália. É citado como fungo
endofítico, em folhas de outros vegetais, Glycine max (L.) merr., na argentina (Larran et
al., 2002); Viguiera arenaria (Asteraceae), como espécie dominante (Guimarães, 2007).
Glomerella musarum (Anamorfo: Colletotrichum musae (Berk. & Curt.) von Arx.).
Causa antracnose em frutos de banana (Musa spp.), sendo de comum ocorrência onde a
bananeira é cultivada (Wardlaw, 1972) e possuindo ampla distribuição geográfica.
Economicamente é importante por causar prejuízos em pós-colheita (Jeffries et al...
1990). Assunção et al. (2007) isolaram a espécie no Brasil de folhas de bananeira (Musa
spp.), com sintomas de doença. Trabalhos disponíveis na literatura (Couto & Menezes,
2004; Sponholz et al. 2004; Pessoa et al. 2007), estão relacionados com estadio
anamórfico, causando antracnose, porém, não há relato até o momento, de G. musarum
como fungo endofítico de Musa spp., sendo este o primeiro registro deste fungo como
endófito desta cultura.
Guignardia musae Racib., Bull. int. Acad. Sci. Lett. Cracovie, Cl. sci. math. nat.
(1909).
Espécies de Guignardia são geralmente sapróbias ou semiparasitas de folhas
(Sivanesan, 1984) e também como endofíticas em diferentes espécies de plantas. no
brasil, o gênero guignardia tem sido detectado em plantas, porém sem determinação
específica, não havendo trabalhos publicados sobre a especificidade do fungo com
relação aos hospedeiros nem sobre a diversidade genética das populações do fungo em
cada hospedeiro (Wickert et al. 2009).
No Japão, espécies de Guignardia foram isoladas de folhas saudáveis de 94 espécies
de plantas pertencentes a 69 diferentes gêneros (Okane et. al. 2003), levando a supor
que o número de hospedeiros de Guignardia no Brasil é elevado.
Há relatos de Guignardia como endofítico, a partir de diferentes plantas
aparentemente sadias (Carroll & Carroll, 1978; Petrini, 1986; Madriz et al. 1991; Nag
Raj, 1993; Penna, 2000; Glienke-Blanco et al. 2002). Espécies de Guignardia são
isoladas endofiticamente de Musa spp., entre elas: G. cocoicola e G. citricarpa em
folhas de Musa acuminata, na Tailândia (Photita et al. 2001); G. mangiferae, no Novo
Gales (Baayen et al. 2002). Liberato et al. (2009) cita que, ao contrário de G. citricarpa,
não há evidência da existência endofítica de G. mangifera, não sabendo se G. musae
pode causar infecções assintomáticas em folhas de bananeira.
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
167
O isolamento de Guignardia musae, no presente trabalho, como endofítico da
bananeira constitui nova informação.
Mycosphaerella musicola R. Leach ex J.L. Mulder (1976)
Mycosphaerella musicola (anamorfo Pseudocercospora musae (Zimm.) Deighton)
(Jones, 2003), causador da doença Sigatoka amarela, constitui-se um dos principais
problemas da bananicultura no Brasil (Pereira et al., 2003).
A presença de Mycosphaerella musicola isolada endofiticamente na cultivar
‘Pacovan’, no período chuvoso e em folha nova, comprova que fungos endofíticos
vivem assintomáticos nos vegetais, como patógeno latentes. E a passagem de endófito
para fitopatógeno depende das condições ambientais, principalmente temperatura, que
segundo Pereira et al. (1999), temperaturas baixas (21°C) limitam o desenvolvimento de
doença.
Trata-se da primeira ocorrência de M. musicola como endofítico, em folhas de
bananeira; também não existem relatos do anamorfo Pseudocercospora musae como
endofítico em vegetais.
Sporormiella minima (Auersw.) S.I. Ahmed & Cain (1970).
Espécies de Sporormiella são comumente encontradas em vários tipos de estrume
animal, no solo, madeira, vegetais em decomposição e raramente, no humano.
Ascósporos podem ser encontrados em amostras antigas de solo e sedimentos, sendo
instrumentos úteis na paleoecologia (Burney et al. 2003). Pereira et al. (1999) isolaram
como fungo endofítico, em Musa acuminata, no Estado de São Paulo, Brasil.
Xylaria aff. hypoxylon
Dentre espécies endofíticas isoladas de plantas tropicais, o grupo taxonômico com
maior frequência de isolamento pertence à família Xylariaceae (Carmona et al. 2009).
Sua identificação é problemática, devido à raridade com que seus teleomorfos são
formados em meio de cultura. Os anamorfos produzidos apresentam similaridade entre
si, tornando-se necessária a combinação de caracteres morfológicos com análises
bioquímicas para diferenciação (Rodrigues et al. 1993). Segundo Rodrigues (1994),
Xylaria apresenta biologia intrigante, constância de isolamento e alta frequência em
relação a outros fungos endofíticos de folhas, nos trópicos. A espécie endofítica de
Xylaria apresenta características associadas com mutualismo e não parasitismo latente.
Suas relações simbióticas são pouco conhecidas (Davis et al. 2003).
Vários trabalhos registram o gênero Xylaria como fungo endofítico em folhas, de
diferentes espécies vegetais. Xylaria foi isolada de açaizeiro (Euterpe oleracea)
ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...
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(Rodrigues, 1991); Quercus e Sylvatica (Fagaceae), Betula, Corylus e Alnus
(Betulaceae), Acer (Sapindaceae); Fraxinus (Oleaceae), Rhizophora e Bruguiera
(Rhizophoraceae); Avicennia (Avicenniaceae), Picea e Pinus (Pinaceae) e Nicotiana
(Solanaceae), coníferas, monocotiledôneas (Brunner & Petrini, 1992); Schefflera
(Araliaceae) (Laessøe & Lodge, 1994); hepáticas (Hymenoscyphus ericae) (Duckett &
Read, 1995); bromélias e samambaias (Richardson & Currah, 1995); Manilkara
bidentata (Sapotaceae) (Lodge et al., 1996); Lepanthes (Orchidaceae) (Bayman et al.,
1997); Manilkara (Sapotaceae) e Casuarina (Casuarinaceae) (Bayman et al., 1998);
Heisteria (Olacaceae) e Ouratea (Ochnaceae) (Arnold et al., 2000), palmeira, Euterpe,
Trachycarpus e Livistona (Arecaceae) (Guo et al., 2001); carvalho (Collado et al.,
2002); hepática (Davis et al., 2003), rosa (Rosa hybrida) (Salazar & García, 2005);
Tectona grandis L. e Samanea saman Merr. (Chareprasert et al. 2006), Eremanthus
erythropappus (DC.) Macleish (candeia) (Magalhães et al., 2008). Estas informações
sugerem que distribuição de Xylaria não depende da geografia nem da morfologia e da
origem do hospedeiro.
Poucos são os trabalhos relacionados ao isolamento de Xylaria como fungo
endofítico em folhas de bananeira. Existe uma referência para o Brasil (Pereira et al.,
1999), e outras para Hong Kong e Austrália (Brown et al. 1998) e Tailândia (Photita et
al., 2001), ambas para Musa acuminata.
Segundo San Martín & Rogers (1995), espécies de Xylaria passam parte do seu ciclo
de vida como endofíticas, não havendo estudos da sua fisiologia e seu papel no
hospedeiro. De acordo com Rogers (2000), o papel de Xylaria isolado como endófito, é
que, o fungo se alterna entre hospedeiros: em determinado hospedeiro, ocorre como
fungo endofítico, em outro como sapróbio ou fitopatógeno, ou que endófitos existem
apenas como endófitos, tendo-se especializado para este ambiente.
Agradecimentos
O primeiro autor agradece á Fundação de Amparo á Ciência e Tecnologia do Estado de
Pernambucoco (FACEPE), pela concessão da bolsa de estudo (Processo Nº-BPG–0001–
2.12/07).
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Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Pós-graduação em Biologia de Fungos, 2010.
Inclui bibliografia e anexos.
1. Fungos 2. Fungos fitopatogênicos 3. Microrganismos – Cultura e meio de cultura 4. Banana I. Título. 579.5 CDD (22.ed.) UFPE/ CCB – 2010- 072
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