Imunologia Clínica Imunoensaios - Precipitação. Anticorpos Monoclonais: A utilização de...

Imunologia Clínica

Imunoensaios - Precipitação

Anticorpos Monoclonais: Anticorpos Monoclonais:

• A utilização de anticorpos como ferramentas de identificação

de estruturas tem sido cada vez mais freqüente,

principalmente no diagnóstico clínico.

• O uso de misturas de anticorpos tem aplicação limitada –

múltipla especificidade e heterogeneidade da resposta imune

humoral.

• Soro policlonal: Muitos tipos diferentes de anticorpos

produzidos por vários clones de linfócitos B, específicos para

diferentes antígenos.

Como resolver esse problema????Como resolver esse problema????

Anticorpos Monoclonais: Anticorpos Monoclonais:

• Georges Koller e Cesar Milstein (1975): Descreveram a 1ª

técnica para a obtenção de anticorpos homogêneos ou

monoclonais de especificidade definida.

• Ganharam o Prêmio Nobel em 1984.

Imunização com o antígeno

Células do baço Clone de LB + Mieloma (Tumor de LB), não

secretor de anticorpos

Hibridoma: Podem ser mantidas in vitro indefinidamente e irão continuar secretar

anticorpos com especificidade definida. Esses anticorpos são MONOCLONAIS.

IMUNOPRECIPITAÇÃO

• As técnicas manuais de precipitação atualmente em uso são

realizadas em meio gelificado, o que facilita a leitura e reduz

os volumes necessários para a interação. No entanto

requerem períodos de horas ou dias para a migração

molecular e a formação do imunocomplexo.

• A técnica pode ser automatizada (turbidimetria e

nefelometria). São técnicas muito mais sensíveis.

Técnicas baseadas na reação de precipitação: Técnicas baseadas na reação de precipitação:

1. Imunodifusão:

• Baseia-se na difusão de substâncias solúveis ao acaso em meio

gelificado como o ágar ou gel de agarose. Enquanto as moléculas

estão livres continua ocorrendo difusão, ao se formarem IC (alto PM),

ficam imobilizados no gel, permitindo a visualização.

• A máxima precipitação ocorre na zona de equivalência.

Podem ser classificadas em:

• Imunodifusão Simples: O Ac ou o Ag está fixado ao gel, enquanto o

outro migra até a formação do IC.

• Imunodifusão Dupla: Ambos os reagentes estão livres para mover em

direção ao outro e precipitar.

• O movimento pode ser linear ou radial.

1.a. Imunodifusão simples em uma dimensão (linear)

• 1946 - Oudin (França).

• Difusão simples em tubo.

Antígeno + Gel

Antígeno

O tubo é selado e deixado à temperatura constante por

aproximadamente 1 semana.

AgAc Imunocomplexo

Princípio: Relação quantitativa

entre a quantidade de Ag

presente no poço e o anel de

precipitação resultante.

Tempo de incubação: 48 a 72 h

Diâmetro do halo [ ] Ag

1.b. Imunodifusão radial simples

1.b. Imunodifusão radial simples

1.c. Imunodifusão dupla de Ouchterlony

• Nesta técnica os dois componentes, antígeno e

anticorpo difundem-se radialmente em todas as

direções, a partir de orifícios no meio gelificado, e

se encontram formando linhas ou arcos de

precipitação.

• Limitação:

• Requer 18 a 24 horas de difusão para que a

reação se processe.

• Baixa sensibilidade.

Amostra 1: negativa; Amostra 2: positiva; Poços: Padrão

1.c. Imunodifusão dupla de Ouchterlony

Técnicas baseadas na reação de precipitação: Técnicas baseadas na reação de precipitação:

2. Imunoeletroforese:

2.a. Eletroforese:

• Técnica que permite a separação das proteínas de acordo com

sua carga. O suporte de eletroforese é inerte e não influencia o

fluxo das moléculas no campo elétrico.

• Suporte: papel, agarose ou acetato de celulose (corrida de

eletroforese em tempo mais curto - 60 a 90 minutos).

• O soro ou outro material biológico é aplicado na origem e

fracionado por cerca de 90 minutos, usando um tampão alcalino.

A seguir as fitas são coradas para se detectar as proteínas e

lidas em densitômetro, que converte o padrão em picos

permitindo a quantificação.

2.a. Eletroforese:

2.a. Eletroforese:

2.b. Imunoeletroforese:

• A técnica combina a eletroforese e difusão dupla em meio

gelificado, em tempos distintos, com alto poder resolutivo.

+ +- -Amostra (Ag)

Eletroforese

a b dc

Soro

a b dc

Difusão

Aa

Bb

Dd

Cc

Técnicas baseadas na reação de precipitação: Técnicas baseadas na reação de precipitação:

3. Eletroimunodifusão:

3.a. Eletroimunodifusão Simples Linear (Laurell ou Foguete)

3.b. Eletroimunodifusão Dupla Linear ou Contra-

imunoeletroforese.

• Na eletroimunodifusão, a migração do antígeno e do anticorpo

é dirigida por um campo elétrico, aumentando a velocidade de

formação do imunocomplexo e a sensibilidade em relação à

difusão natural.

Soro - Anticorpo

Gel contendo o antígeno

-

+

3.a. Eletroimunodifusão Simples Linear (Laurell ou Foguete)

Linha de precipitação

3.b. Eletroimunodifusão Dupla Linear ou Contra-imunoeletroforese.

Automação dos ensaios de

precipitação

Nefelometria

• Uma das características das soluções coloidais é a pronunciada

dispersão de luz.

• Quando um feixe de luz incidente atravessa um meio contendo

partículas, essas interferem com a passagem da luz, fazendo com

que seja dispersa em todas as direções.

Mistura homogênea – Não há dispersão da luz.

Mistura coloidal

Nefelometria

Suspensão Ag-Ac

Fonte de luz

Lentes que captam os raios

dispersos

Lentes focalizadoras

Detector

•Os raios de uma fonte

de luz de alta intensidade

(lâmpadas de halôgenio,

laser) são dirigidos por

lentes focalizadoras e

passam através da

amostra contendo os ICs.

Os raios que emergem

em ângulo de 70º são

dirigidos por outra lente

para o detector

eletrônico.

• O sinal é

matematicamente

relacionado à

concentração do Ag ou

Ac.

Nefelometria

• A nefelometria é totalmente automatizada, de fácil realização, rápida e

precisa.

• Ideal: Nefelômetros que subtraiam ruído de fundo (background), causados

por amostras lipêmicas ou hemolisadas.

• Emprega pequenos volumes de amostra e tem alta sensibilidade.

• Pode ser aplicada nas determinações de proteínas de significado clínico em

qualquer fluído corporal.