“INDICADORES BIOLÓGICOS DE EXPOSIÇÃO AO … · EXPOSIÇÃO AO BENZENO ... Cancer Res., 62,...

“INDICADORES BIOLÓGICOS DE

EXPOSIÇÃO AO BENZENO”

Comissão Nacional Permanente do Benzeno (CNPBz)

Profa Dra Solange Cristina Garcia

Laboratório de Toxicologia (LATOX)

Faculdade de Farmácia

Universidade Federal do Rio Grande do Sul

EXPOSIÇÃO A ALTAS CONCENTRAÇÕES DE BENZENO

Carcinogenesis (2013) 34 (1): 2-9. doi: 10.1093/carcin/bgs382

LEUCEMIAS

- MIELÓIDE AGUDA

- NÃO LINFOCÍTICA AGUDA

EVIDÊNCIAS DE EFEITOS HEMATOTÓXICOS E

CÂNCER LINFOHEMATOPOIÉTICO

< 1 ppm

BAIXAS DOSES TAMBÉM SÃO PREOCUPANTES

ESTABELECIMENTO DE CRITÉRIOS

QUANTITATIVOS PARA INDICADORES BIOLÓGICOS

TORNAM-SE IMPRESCINDÍVEIS

DIMINUIR EXPOSIÇÃO A DOSES < 1 ppm PRECISAM

SER TRAÇADAS COMO METAS

INDICADORES DE EXPOSIÇÃO

TEMPO DE DIFERENTES

BIOMARCADORES DE EXPOSIÇÃO

5 (Henderson et al., 1989)

INDICADORES BIOLÓGICOS

BENZENO EXPIRADO

SANGUE

URINA

ADUCTOS DE PROTEÍNAS

Albumin adducts of benzene oxide (BO-Alb)

benzene oxide – Hb adducts

1,4-benzoquinone (1,4-BQ-Alb)

Rappaport S.M.,

et al. (2002) Albumin adducts of benzene oxide and 1,4-benzoquinone as measures of human benzene metabolism. Cancer Res., 62, 1330–1337.

Lin Y.S., et al.

(2007) Albumin adducts of electrophilic benzene metabolites in benzene-exposed and control workers. Environ. Health Perspect., 115, 28–34.

METABÓLITOS URINÁRIOS

ÁCIDO S-FENILMERCAPÚRICO

ÁCIDO TRANS, TRANS-MUCÔNICO

8

INTRODUÇÃO

BIOTRANSFORMAÇÃO DO BENZENO

(Adaptado Qu et al., 2005)

POLIMORFISMOS GST

12 Manini et al., Toxicology Letters 168, 2007.

QUAIS?

AMOSTRAS BIOLÓGICAS

MOMENTO DA COLETA

ESTABILIDADE

IMPORTÂNCIA DO ESTABELECIMENTO DE

CRITÉRIOS QUANTITATIVOS

INDICADORES BIOLÓGICOS DE

EXPOSIÇÃO AO BENZENO

BIOMARCADORES EM

FRENTISTAS DO RIO GRANDE DO SUL

PESQUISA AVALIAÇÃO DE RISCO

UM ÚNICO XENOBIÓTICO

MISTURAS

15

• IDENTIFICAÇÃO DO PERIGO

• AVALIAÇÃO DOSE-RESPOSTA

• AVALIAÇÃO DA EXPOSIÇÃO

Medida das exposições e

observação dos efeitos

Estudo dos mecanismos

Nova informação genômica

AVANÇOS NA PESQUISA/

PUBLICAÇÕES BIOMONITORAMENTO:

“BIOLOGICAL MONITORING,

OCCUPATIONAL HEALTH”

pubmed.gov

16

17

0 500 1000 1500

1980-1989

1990-1995

1996-2000

2001-2005

2006-2010

2011-2012

2011-2015

Biological monitoring, occupational health Y

ear

Publications

17

18 0 500 1000 1500 2000 2500 3000

1980-1990

1991-2000

2001-2010

438%

156%

GASOLINA

TOLUENO

XILENO

COMPOSTOS BTX

GRUPO DE RISCO

(Chen et al., 2008; Dougherty et al., 2008; Fundacentro, 2005; Keenan et al., 2010; Keretetse et al., 2008)

NÃO EXISTE LIMITE SEGURO DE EXPOSIÇÃO

O benzeno é reconhecidamente um agente CARCINOGÊNICO

classificado no grupo A1 pela Agência Internacional para

Pesquisa do Câncer (IARC).

20

A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que o risco de desenvolvimento

de leucemia é de cerca de seis casos por milhão entre as pessoas que

experimentam exposição de 1µg/m3 de benzeno ao longo da vida.

(ACGIH, 2011; Brasil, 1995; Sorensen et al., 2003)

HEMATOTÓXICO

Supressão das células progenitoras

hematopoiéticas.

Citopenia

(anemia, leucopenia e trombocitopenia).

IMUNOTÓXICO

Imunossupressão.

Alteração da resposta

imune (humoral e celular).

GENOTÓXICO

Danos de DNA

(alterações cromossômicas, hipo e hiperdiploidia,

troca de cromátides irmãs, quebras de fitas).

BENZENO

CARCINOGÊNICO (Leucemia Mielóide Aguda)

HEMATOTÓXICO (Aplasia Medular)

GENOTÓXICO (Dano de DNA)

IMUNOTÓXICO (Depressão do Sistema Imune)

Anemia

Leucopenia

Trombocitopenia

Oxidantes

Antioxidantes

ESTRESSE OXIDATIVO

23

MECANISMO DE TOXICIDADE

EROS Antioxidantes Enzimáticos

Antioxidantes Não-Enzimáticos

(Barreto et al., 2009; Badham et al., 2010; Snyder, 2007; Uzma et al., 2010)

BIOTRANSFORMAÇÃO

Peroxidação

Lipídica

Oxidação

Protéica

Dano

DNA

MECANISMO DE TOXICIDADE

Fatores Biológicos (sexo, idade).

Fatores Genéticos (polimorfismo genético).

Vias de Exposição.

Co-exposição.

Hábitos de vida (tabagismo, consumo de álcool).

Hábitos alimentares.

OBJETIVOS

Avaliar diferentes biomarcadores em frentistas do RS.

BIOMONITORAMENTO

BIOMARCADORES

Santa Cruz do Sul (n=5)

Santa Maria (n=3)

57 Frentistas

37 Frentistas

94 Frentistas

SANTA MARIA

57 Frentistas

n=54

n=56

n=57

Idade: 32,2 1,2 anos

Tempo Exposição: 7,9 1,3 anos

SANTA CRUZ 37 Frentistas

n=37

n=34

n=36

Idade: 31,3 1,5 anos

Tempo Exposição: 6,7 1,3 anos

BIOMONITORAMENTO

Biomarcadores Hematológicos

• Hemograma

• Enzima -Aminolevulinato Desidratase (ALA-D)

Biomarcadores de Genotoxicidade

• Ensaio Cometa

• Ensaio de Micronúcleo

BIOMONITORAMENTO

Biomarcadores Hepáticos

• Albumina

•Transaminases

Biomarcadores Renais

• Creatinina, Úreia, Ácido Úrico

• Microalbuminúria

• N-acetil-β-D-glicosaminidase (NAG)

Urinária

BIOMARCADOR DE EXPOSIÇÃO AO BENZENO

Valores expressos em mediana (intervalo interquartil).

Ácido trans, trans-mucônico urinário (AttM-U)

Fonte: Portaria n 34, 2001. MTE

1600 µg/g creatinina

ACGIH: Limite biológico 500 µg/g creatinina (BEI).

SANTA MARIA

AT

TM

UC

-U (

µg

/g c

rea

tin

ina

SANTA MARIA

AT

TM

UC

-U (

µg

/g c

rea

tin

ina

n=3

n=16

n=3

N=12

SANTA CRUZ DO SUL

BENZENO: AMOSTRADOR PASSIVO

BIOMONITORAMENTO

Biomarcadores Hematológicos

Frentistas

Sta Maria (n=54)

Frentistas Sta Cruz

do Sul (n=37)

Valores de

Referência

Eritrócitos (x106/mm3) 4,9 0,9 4,7 0,1 4,5 – 6,1

4,0 – 5,4

Hemoglobina (g/dL) 14,3 0,6 14,2 0,2 13,0 – 18,0

12,0 – 16,0

Hematócrito (%) 43,7 1,8 40,8 0,6 39,0 – 53,0

36,0 – 48,0

Leucócitos (x103/mm3) 7,2 0,8 7,6 0,3 3,6 – 11,0

Plaquetas (x103/mm3) 245,3 9,2 227,8 8,2 140,0 – 400,0

Valores expressos em média EP.

Hemograma

BIOMARCADORES HEMATOLÓGICOS

Hemograma: ERITRÓCITOS

n=4 n=4

n=4

HEMOGRAMA: HEMOGLOBINA

n=7

n=3

n=1

n=4

HEMOGRAMA: HEMATÓCRITO

n=4

n=4

n=2

n=3

HEMOGRAMA: LEUCÓCITOS

n=2

HEMOGRAMA: PLAQUETAS

ENZIMA -AMINOLEVULINATO DESIDRATASE

(ALA-D)

*p<0.05 *p<0.05

BIOMARCADORES DE GENOTOXICIDADE

Teste Cometa

*p<0.05 *p<0.05

BIOMARCADORES DE GENOTOXICIDADE

Micronúcleos

*p<0.05 *p<0.05

BIOMARCADORES DO SISTEMA IMUNOLÓGICO

Expressão de CD 80+ em monócitos

*p<0.05 *p<0.05

Expressão de CD 86+ em monócitos

*p<0.05 *p<0.05

AttM-U Tempo Exposição

ALA-D r= -0.40 (p<0.001)

r= -0.67 (p<0.001)

Cometa r= 0.26 (p<0.05) r= 0.40 (p<0.001)

Micronúcleos r= 0.49 (p<0.001) r= 0.52 (p<0.001)

CD80+ em

monócitos

r= -0.36 (p<0.01) r= -0.32 (p<0.01)

CD86+ em

monócitos

r= -0.41 (p<0.001) r= -0.56 (p<0.001)

CORRELAÇÕES

BIOMARCADORES HEPÁTICOS

Frentistas

Sta Maria (n=54)

Frentistas Sta

Cruz do Sul

(n=37)

Valores de

Referência

Albumina (g/dL) 4,6 0,1 4,9 0,1 3,5 – 5,5

AST (U/L) 25,1 1,3 24,2 1,1 10 – 37

ALT (U/L) 25,4 2,9 21,5 1,8 10 - 37

GGT (U/L) 30,1 3,0 31,6 3,8 7 - 45

5 - 25

Valores expressos em média EP.

BIOMARCADORES RENAIS

Frentistas

Sta Maria (n=54)

Frentistas Sta

Cruz do Sul

(n=37)

Valores de

Referência

Creatinina (mg/dL) 0,9 0,1 0,9 0,1 0,4 – 1,3

Uréia (mg/dL) 30,2 1,1 27,6 1,1 15 – 40

Ácido Úrico (mg/dL) 4,5 0,1 4,5 0,2 2,5 – 7,0

1,5 – 6,0 Valores expressos em média EP.

Marcadores Clássicos de Função Renal

BIOMARCADORES PRECOCES DE DANO RENAL

*p<0.05 *p<0.05

MICROALBUMINÚRIA

Biomarcadores Precoces de Dano Renal

*p<0.05 *p<0.05

N-Acetil-Glucosaminidase (NAG-U)

ANTIOXIDANTES EXÓGENOS

Frentistas

Sta Maria (n=54)

Frentistas Sta

Cruz do Sul

(n=37)

Valores de

Referência

Vitamina C (mg/L) 4,7 0,4 6,1 0,6 4 – 15

Vitamina E (µmol/L) 20,8 0,9 21,8 1,2 12 – 42

Retinol (µmol/L) 2,1 0,1 2,5 0,1 1,05 – 2,80

Licopeno (µmol/L) 0,9 0,1 0,8 0,1 0,4 – 0,6

β-Caroteno (µmol/L) 0,31 0,18 0,35 0,15 0,19 – 1,58 Valores expressos em média EP.

ÁCIDO TRANS, TRANS-MUCÔNICO URINÁRIO (AttM-U):

• Santa Maria: 5,3% AttM-U > 1600 µg/g creatinina

• Santa Cruz: 8,8% AttM-U > 1600 µg/g creatinina

HEMOGRAMA:

• Santa Maria:

7,4% Eritrócitos

18,5% Hb

9,3% Ht

3,7% Leucócitos

• Santa Cruz:

21,6% Eritrócitos

13,5% Hb

21,6% Ht

Inibição ALA-D: SM 24,2% e

SC 20,2

Comprometimento síntese hemoglobina: ANEMIA??

Sistema Imunológico Comprometido: CD86+ em monócitos

Sistema Renal: Alterações glomerulares e tubulares precoces

Dano de DNA: Cometa e MN

55

MATERIAIS E MÉTODOS

Grupos de Estudo

88 Indivíduos Grupo Não Exposto (n=28)

Indíviduos Não-Fumantes

Não Expostos Ocupacionalmente ao Benzeno

Grupo Exposto (n=60)

Frentistas de Postos de Gasolina/RS

• Não-Fumantes (n=44)

• Fumantes (n=16)

Tempo Exposição Mínimo 6 meses

Todos os participantes do estudo assinaram Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

Questionário sobre saúde em geral, estilo de vida, tabagismo e histórico ocupacional.

As amostras de urina e de sangue foram coletadas no final da jornada de trabalho após 3 dias consecutivos

de exposição.

56

MATERIAIS E MÉTODOS

Monitoramento Ambiental

Exposição Ambiental Individual aos Compostos BTX

Amostradores Passivos (SKC 575-002®) durante toda jornada de trabalho.

Dessorção com Diclorometano.

Cromatografia Gasosa/Detecção por Ionização de Chama.

57

RESULTADOS E DISCUSSÃO

~9,5 anos ~11, 3 anos

58

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Monitoramento Ambiental

1600 µg m-3

75400 µg m-3

434000 µg m-3

ACGIH

BAIXOS NÍVEIS DE EXPOSIÇÃO AOS COMPOSTOS BTX

r= 0.83; p<0.001

59

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Biomonitoramento

Biomarcadores de Exposição

500 µg g-1 creat.

Baixos Níveis de Exposição

(ACGIH, 2011)

1,6 g g-1 creat.

(r= 0.35; p<0.01; n= 88)

60

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Biomonitoramento

Biomarcadores Hematológicos

VALORES DE

REFERÊNCIA

61

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Biomonitoramento

Biomarcadores Hematológicos

Enzima -Aminolevulinato Desidratase (ALA-D)

#

*

#

*

# ** *

x

x Anemia

62

RESULTADOS E DISCUSSÃO

* *

** **

Outros Mecanismos

de Inibição

Inibição ALA-D

EROS

22% 30,3% 16%

Biomonitoramento

Biomarcadores Hematológicos

Enzima -Aminolevulinato Desidratase (ALA-D)

63

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Biomonitoramento

Biomarcadores Hematológicos: ALA-D

Envolvimento BENZENO e TOLUENO na inibição da ALA-D

64

RESULTADOS E DISCUSSÃO

+ Estudos são necessários para verificar o possível envolvimento da ALA-D no desenvolvimento

da anemia induzida pelo benzeno.

Biomonitoramento

Biomarcadores Hematológicos: ALA-D

Exposição Crônica

Benzeno

Inibição Síntese ALA-D

65

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Biomonitoramento

Biomarcadores do Sistema Imunológico

Moléculas de Adesão CD80 e CD86

Ativação Células T

Resposta Imune

Pacientes leucêmicos apresentam menor expressão de CD80 e CD86.

EXPOSIÇÃO OCUPACIONAL BENZENO X LEUCEMIA

CD80 e CD86

Mecanismo Patogênico

da Leucemia

(Chanan-Khan et al., 2011; Dai et al., 2009; Mohamed et al., 2012; Zhao et al., 2012)

BIOMONITORAMENTO

66

*

*

* * ** **

A

B

67

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Biomonitoramento

Biomarcadores do Sistema Imunológico: CD80 e CD86

Envolvimento BENZENO e TOLUENO na

supressão das moléculas de adesão

68

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Biomonitoramento

Biomarcadores do Sistema Imunológico: CD80 e CD86

BENZENO

69

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Biomonitoramento

Biomarcadores do Sistema Imunológico: CD80 e CD86

(r= -0.32; p<0.01; n= 88) (r= -0.56; p<0.001; n= 88)

+ Estudos são necessários para verificar o envolvimento do benzeno na regulação

da expressão de CD80 e CD86, e para verificar se estas moléculas podem atuar

como preditoras de alterações relacionadas ao desenvolvimento de leucemia.

70

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Biomonitoramento

Biomarcadores Hepáticos

Transaminases Hepáticas (AST e ALT)

VALORES DE

REFERÊNCIA

71

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Biomonitoramento

Biomarcadores Hepáticos: AST e ALT

Envolvimento BENZENO e TOLUENO

72

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Biomonitoramento

Biomarcadores Hepáticos: AST e ALT

BENZENO

73

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Biomonitoramento

Biomarcadores de Efeito: AST e ALT

(r= 0.66; p<0.01; n= 88) (r= 0.56; p<0.001; n= 88)

AST e ALT Ferramentas importantes no biomonitoramento contínuo de

trabalhadores expostos ao benzeno.

74

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Biomonitoramento

Biomarcadores Renais

Biomarcadores Clássicos de Função Renal Valores de Referência / p > 0,05

*

* **

**

A B

Microalbuminúria e NAG Biomarcadores de Dano Renal Precoce

75

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Biomonitoramento

Biomarcadores Renais

(r= 0.30; p<0.01; n= 88)

Alterações em Células

Glomerulares e Tubulares Renais

Biomarcadores importantes no biomonitoramento do benzeno.

(Franchini et al., 1983; Gonzalez-Yebra et al., 2006; Jarosinska et al., 2008; Ohno et al., 2007; Prozialeck et al., 2009)

76

77

MATERIAIS E MÉTODOS

Grupos de Estudo

Critérios de Exclusão

• Fumantes

• Doenças Diagnosticadas

• Tempo de Exposição Menor do que 6 Meses

•Uso de Medicamentos/vitaminas antioxidantes

• Análise não Realizada

105 Indivíduos

70 Trabalhadores Expostos a

Baixos Níveis de Benzeno

35 Indivíduos não Expostos

Ocupacionalmente

Frentistas (n=43) Controles (n=28)

78

Biomarcadores de Genotoxicidade

RESULTADOS E DISCUSSÃO

(r= 0.25; p<0.001; n= 71)

Falta de reparo das quebras nas

fitas de DNA contribui para a

formação de MN

(Angelini et al., 2011; Pandey et al., 2008)

Exposição Ocupacional ao Benzeno

79

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Dano Protéico

* *

A B

Biomarcadores de Dano Oxidativo

80

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Biomarcadores de Dano Oxidativo

Dano Protéico

Benzeno Oxidação e Nitrosilação de Proteínas

Formação de 3-NT

Formação Peroxinitrito

Carbonilação Proteínas

Perda Função

Protéica

81

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Envolvimento do Estresse Oxidativo na Genotoxicidade

causada pelo Benzeno

(r= 0.59; p<0.001; n= 71) (r= 0.25; p<0.05; n= 71)

(r= 0.38; p<0.001; n= 71)

82

Antioxidantes Endógenos

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Inibição da SOD Inibição da CAT Inibição da GST

Ânions Superóxido Peróxido de

Hidrogênio

Peróxido de

Hidrogênio

(Otitoloju et al., 2011; Ulakoglu et al., 1998; Verma & Rana, 2011)

Formação Peroxinitrito

83

Antioxidantes Endógenos

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Envolvimento do benzeno na diminuição da defesa antioxidante do

organismo.

GSH e GST são depletadas com o objetivo de proteger o organismo das

EROs produzidas durante a biotransformação do benzeno.

GSH e GST biotransformação do benzeno ácido fenilmercaptúrico.

84

RESULTADOS E DISCUSSÃO

(r= -0.37; p<0.01; n= 71) (r= -0.25; p<0.05; n= 71)

A depleção dos mecanismos antioxidantes ocorre na tentativa de conter o desenvolvimento

de danos de DNA etiologicamente relacionada com o estresse oxidativo.

GSH e GST desempenham papel importante na proteção dos danos genéticos causados

pelo benzeno.

Indivíduos com baixos níveis de GSH e/ou atividade de GST podem estar menos

protegidos do que indivíduos com maior níveis destes antioxidantes.

(Fracasso et al., 2010)

85

Antioxidantes Exógenos

RESULTADOS E DISCUSSÃO

(r= -0.30; p<0.05; n= 71) (r= -0.34; p<0.01; n= 71)

86

RESULTADOS E DISCUSSÃO

TRIAGEM E BIOMONITORAMENTO DOS RISCOS OCUPACIONAIS

EXPOSIÇÃO OCUPACIONAL A BAIXAS CONCENTRAÇÕES DE BENZENO

ESTÃO FORTEMENTE ASSOCIADAS A ALTERAÇÕES PRECOCES

Sugerindo a contribuição para desenvolvimento de

patologias em longo prazo

87

CRITÉRIOS QUANTITATIVOS PARA O INDICADOR

BIOLÓGICO DE EXPOSIÇAO É IMPRESCINDÍVEL

88

OBRIGADA! LATOX - Laboratório de Toxicologia

UFRGS – Faculdade de Farmácia

Solange.garcia@ufrgs.br

Telefone: (51) 3308-5297