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“INDICADORES BIOLÓGICOS DE
EXPOSIÇÃO AO BENZENO”
Comissão Nacional Permanente do Benzeno (CNPBz)
Profa Dra Solange Cristina Garcia
Laboratório de Toxicologia (LATOX)
Faculdade de Farmácia
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
EXPOSIÇÃO A ALTAS CONCENTRAÇÕES DE BENZENO
Carcinogenesis (2013) 34 (1): 2-9. doi: 10.1093/carcin/bgs382
LEUCEMIAS
- MIELÓIDE AGUDA
- NÃO LINFOCÍTICA AGUDA
EVIDÊNCIAS DE EFEITOS HEMATOTÓXICOS E
CÂNCER LINFOHEMATOPOIÉTICO
< 1 ppm
BAIXAS DOSES TAMBÉM SÃO PREOCUPANTES
ESTABELECIMENTO DE CRITÉRIOS
QUANTITATIVOS PARA INDICADORES BIOLÓGICOS
TORNAM-SE IMPRESCINDÍVEIS
DIMINUIR EXPOSIÇÃO A DOSES < 1 ppm PRECISAM
SER TRAÇADAS COMO METAS
INDICADORES DE EXPOSIÇÃO
TEMPO DE DIFERENTES
BIOMARCADORES DE EXPOSIÇÃO
5 (Henderson et al., 1989)
INDICADORES BIOLÓGICOS
BENZENO EXPIRADO
SANGUE
URINA
ADUCTOS DE PROTEÍNAS
Albumin adducts of benzene oxide (BO-Alb)
benzene oxide – Hb adducts
1,4-benzoquinone (1,4-BQ-Alb)
Rappaport S.M.,
et al. (2002) Albumin adducts of benzene oxide and 1,4-benzoquinone as measures of human benzene metabolism. Cancer Res., 62, 1330–1337.
Lin Y.S., et al.
(2007) Albumin adducts of electrophilic benzene metabolites in benzene-exposed and control workers. Environ. Health Perspect., 115, 28–34.
METABÓLITOS URINÁRIOS
ÁCIDO S-FENILMERCAPÚRICO
ÁCIDO TRANS, TRANS-MUCÔNICO
8
INTRODUÇÃO
BIOTRANSFORMAÇÃO DO BENZENO
(Adaptado Qu et al., 2005)
POLIMORFISMOS GST
12 Manini et al., Toxicology Letters 168, 2007.
QUAIS?
AMOSTRAS BIOLÓGICAS
MOMENTO DA COLETA
ESTABILIDADE
IMPORTÂNCIA DO ESTABELECIMENTO DE
CRITÉRIOS QUANTITATIVOS
INDICADORES BIOLÓGICOS DE
EXPOSIÇÃO AO BENZENO
BIOMARCADORES EM
FRENTISTAS DO RIO GRANDE DO SUL
PESQUISA AVALIAÇÃO DE RISCO
UM ÚNICO XENOBIÓTICO
MISTURAS
15
• IDENTIFICAÇÃO DO PERIGO
• AVALIAÇÃO DOSE-RESPOSTA
• AVALIAÇÃO DA EXPOSIÇÃO
Medida das exposições e
observação dos efeitos
Estudo dos mecanismos
Nova informação genômica
AVANÇOS NA PESQUISA/
PUBLICAÇÕES BIOMONITORAMENTO:
“BIOLOGICAL MONITORING,
OCCUPATIONAL HEALTH”
pubmed.gov
16
17
0 500 1000 1500
1980-1989
1990-1995
1996-2000
2001-2005
2006-2010
2011-2012
2011-2015
Biological monitoring, occupational health Y
ear
Publications
17
18 0 500 1000 1500 2000 2500 3000
1980-1990
1991-2000
2001-2010
438%
156%
GASOLINA
TOLUENO
XILENO
COMPOSTOS BTX
GRUPO DE RISCO
(Chen et al., 2008; Dougherty et al., 2008; Fundacentro, 2005; Keenan et al., 2010; Keretetse et al., 2008)
NÃO EXISTE LIMITE SEGURO DE EXPOSIÇÃO
O benzeno é reconhecidamente um agente CARCINOGÊNICO
classificado no grupo A1 pela Agência Internacional para
Pesquisa do Câncer (IARC).
20
A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que o risco de desenvolvimento
de leucemia é de cerca de seis casos por milhão entre as pessoas que
experimentam exposição de 1µg/m3 de benzeno ao longo da vida.
(ACGIH, 2011; Brasil, 1995; Sorensen et al., 2003)
HEMATOTÓXICO
Supressão das células progenitoras
hematopoiéticas.
Citopenia
(anemia, leucopenia e trombocitopenia).
IMUNOTÓXICO
Imunossupressão.
Alteração da resposta
imune (humoral e celular).
GENOTÓXICO
Danos de DNA
(alterações cromossômicas, hipo e hiperdiploidia,
troca de cromátides irmãs, quebras de fitas).
BENZENO
CARCINOGÊNICO (Leucemia Mielóide Aguda)
HEMATOTÓXICO (Aplasia Medular)
GENOTÓXICO (Dano de DNA)
IMUNOTÓXICO (Depressão do Sistema Imune)
Anemia
Leucopenia
Trombocitopenia
Oxidantes
Antioxidantes
ESTRESSE OXIDATIVO
23
MECANISMO DE TOXICIDADE
EROS Antioxidantes Enzimáticos
Antioxidantes Não-Enzimáticos
(Barreto et al., 2009; Badham et al., 2010; Snyder, 2007; Uzma et al., 2010)
BIOTRANSFORMAÇÃO
Peroxidação
Lipídica
Oxidação
Protéica
Dano
DNA
MECANISMO DE TOXICIDADE
Fatores Biológicos (sexo, idade).
Fatores Genéticos (polimorfismo genético).
Vias de Exposição.
Co-exposição.
Hábitos de vida (tabagismo, consumo de álcool).
Hábitos alimentares.
OBJETIVOS
Avaliar diferentes biomarcadores em frentistas do RS.
BIOMONITORAMENTO
BIOMARCADORES
Santa Cruz do Sul (n=5)
Santa Maria (n=3)
57 Frentistas
37 Frentistas
94 Frentistas
SANTA MARIA
57 Frentistas
n=54
n=56
n=57
Idade: 32,2 1,2 anos
Tempo Exposição: 7,9 1,3 anos
SANTA CRUZ 37 Frentistas
n=37
n=34
n=36
Idade: 31,3 1,5 anos
Tempo Exposição: 6,7 1,3 anos
BIOMONITORAMENTO
Biomarcadores Hematológicos
• Hemograma
• Enzima -Aminolevulinato Desidratase (ALA-D)
Biomarcadores de Genotoxicidade
• Ensaio Cometa
• Ensaio de Micronúcleo
BIOMONITORAMENTO
Biomarcadores Hepáticos
• Albumina
•Transaminases
Biomarcadores Renais
• Creatinina, Úreia, Ácido Úrico
• Microalbuminúria
• N-acetil-β-D-glicosaminidase (NAG)
Urinária
BIOMARCADOR DE EXPOSIÇÃO AO BENZENO
Valores expressos em mediana (intervalo interquartil).
Ácido trans, trans-mucônico urinário (AttM-U)
Fonte: Portaria n 34, 2001. MTE
1600 µg/g creatinina
ACGIH: Limite biológico 500 µg/g creatinina (BEI).
SANTA MARIA
AT
TM
UC
-U (
µg
/g c
rea
tin
ina
SANTA MARIA
AT
TM
UC
-U (
µg
/g c
rea
tin
ina
n=3
n=16
n=3
N=12
SANTA CRUZ DO SUL
BENZENO: AMOSTRADOR PASSIVO
BIOMONITORAMENTO
Biomarcadores Hematológicos
Frentistas
Sta Maria (n=54)
Frentistas Sta Cruz
do Sul (n=37)
Valores de
Referência
Eritrócitos (x106/mm3) 4,9 0,9 4,7 0,1 4,5 – 6,1
4,0 – 5,4
Hemoglobina (g/dL) 14,3 0,6 14,2 0,2 13,0 – 18,0
12,0 – 16,0
Hematócrito (%) 43,7 1,8 40,8 0,6 39,0 – 53,0
36,0 – 48,0
Leucócitos (x103/mm3) 7,2 0,8 7,6 0,3 3,6 – 11,0
Plaquetas (x103/mm3) 245,3 9,2 227,8 8,2 140,0 – 400,0
Valores expressos em média EP.
Hemograma
BIOMARCADORES HEMATOLÓGICOS
Hemograma: ERITRÓCITOS
n=4 n=4
n=4
HEMOGRAMA: HEMOGLOBINA
n=7
n=3
n=1
n=4
HEMOGRAMA: HEMATÓCRITO
n=4
n=4
n=2
n=3
HEMOGRAMA: LEUCÓCITOS
n=2
HEMOGRAMA: PLAQUETAS
ENZIMA -AMINOLEVULINATO DESIDRATASE
(ALA-D)
*p<0.05 *p<0.05
BIOMARCADORES DE GENOTOXICIDADE
Teste Cometa
*p<0.05 *p<0.05
BIOMARCADORES DE GENOTOXICIDADE
Micronúcleos
*p<0.05 *p<0.05
BIOMARCADORES DO SISTEMA IMUNOLÓGICO
Expressão de CD 80+ em monócitos
*p<0.05 *p<0.05
Expressão de CD 86+ em monócitos
*p<0.05 *p<0.05
AttM-U Tempo Exposição
ALA-D r= -0.40 (p<0.001)
r= -0.67 (p<0.001)
Cometa r= 0.26 (p<0.05) r= 0.40 (p<0.001)
Micronúcleos r= 0.49 (p<0.001) r= 0.52 (p<0.001)
CD80+ em
monócitos
r= -0.36 (p<0.01) r= -0.32 (p<0.01)
CD86+ em
monócitos
r= -0.41 (p<0.001) r= -0.56 (p<0.001)
CORRELAÇÕES
BIOMARCADORES HEPÁTICOS
Frentistas
Sta Maria (n=54)
Frentistas Sta
Cruz do Sul
(n=37)
Valores de
Referência
Albumina (g/dL) 4,6 0,1 4,9 0,1 3,5 – 5,5
AST (U/L) 25,1 1,3 24,2 1,1 10 – 37
ALT (U/L) 25,4 2,9 21,5 1,8 10 - 37
GGT (U/L) 30,1 3,0 31,6 3,8 7 - 45
5 - 25
Valores expressos em média EP.
BIOMARCADORES RENAIS
Frentistas
Sta Maria (n=54)
Frentistas Sta
Cruz do Sul
(n=37)
Valores de
Referência
Creatinina (mg/dL) 0,9 0,1 0,9 0,1 0,4 – 1,3
Uréia (mg/dL) 30,2 1,1 27,6 1,1 15 – 40
Ácido Úrico (mg/dL) 4,5 0,1 4,5 0,2 2,5 – 7,0
1,5 – 6,0 Valores expressos em média EP.
Marcadores Clássicos de Função Renal
BIOMARCADORES PRECOCES DE DANO RENAL
*p<0.05 *p<0.05
MICROALBUMINÚRIA
Biomarcadores Precoces de Dano Renal
*p<0.05 *p<0.05
N-Acetil-Glucosaminidase (NAG-U)
ANTIOXIDANTES EXÓGENOS
Frentistas
Sta Maria (n=54)
Frentistas Sta
Cruz do Sul
(n=37)
Valores de
Referência
Vitamina C (mg/L) 4,7 0,4 6,1 0,6 4 – 15
Vitamina E (µmol/L) 20,8 0,9 21,8 1,2 12 – 42
Retinol (µmol/L) 2,1 0,1 2,5 0,1 1,05 – 2,80
Licopeno (µmol/L) 0,9 0,1 0,8 0,1 0,4 – 0,6
β-Caroteno (µmol/L) 0,31 0,18 0,35 0,15 0,19 – 1,58 Valores expressos em média EP.
ÁCIDO TRANS, TRANS-MUCÔNICO URINÁRIO (AttM-U):
• Santa Maria: 5,3% AttM-U > 1600 µg/g creatinina
• Santa Cruz: 8,8% AttM-U > 1600 µg/g creatinina
HEMOGRAMA:
• Santa Maria:
7,4% Eritrócitos
18,5% Hb
9,3% Ht
3,7% Leucócitos
• Santa Cruz:
21,6% Eritrócitos
13,5% Hb
21,6% Ht
Inibição ALA-D: SM 24,2% e
SC 20,2
Comprometimento síntese hemoglobina: ANEMIA??
Sistema Imunológico Comprometido: CD86+ em monócitos
Sistema Renal: Alterações glomerulares e tubulares precoces
Dano de DNA: Cometa e MN
55
MATERIAIS E MÉTODOS
Grupos de Estudo
88 Indivíduos Grupo Não Exposto (n=28)
Indíviduos Não-Fumantes
Não Expostos Ocupacionalmente ao Benzeno
Grupo Exposto (n=60)
Frentistas de Postos de Gasolina/RS
• Não-Fumantes (n=44)
• Fumantes (n=16)
Tempo Exposição Mínimo 6 meses
Todos os participantes do estudo assinaram Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
Questionário sobre saúde em geral, estilo de vida, tabagismo e histórico ocupacional.
As amostras de urina e de sangue foram coletadas no final da jornada de trabalho após 3 dias consecutivos
de exposição.
56
MATERIAIS E MÉTODOS
Monitoramento Ambiental
Exposição Ambiental Individual aos Compostos BTX
Amostradores Passivos (SKC 575-002®) durante toda jornada de trabalho.
Dessorção com Diclorometano.
Cromatografia Gasosa/Detecção por Ionização de Chama.
57
RESULTADOS E DISCUSSÃO
~9,5 anos ~11, 3 anos
58
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Monitoramento Ambiental
1600 µg m-3
75400 µg m-3
434000 µg m-3
ACGIH
BAIXOS NÍVEIS DE EXPOSIÇÃO AOS COMPOSTOS BTX
r= 0.83; p<0.001
59
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Biomonitoramento
Biomarcadores de Exposição
500 µg g-1 creat.
Baixos Níveis de Exposição
(ACGIH, 2011)
1,6 g g-1 creat.
(r= 0.35; p<0.01; n= 88)
60
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Biomonitoramento
Biomarcadores Hematológicos
VALORES DE
REFERÊNCIA
61
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Biomonitoramento
Biomarcadores Hematológicos
Enzima -Aminolevulinato Desidratase (ALA-D)
#
*
#
*
# ** *
x
x Anemia
62
RESULTADOS E DISCUSSÃO
* *
** **
Outros Mecanismos
de Inibição
Inibição ALA-D
EROS
22% 30,3% 16%
Biomonitoramento
Biomarcadores Hematológicos
Enzima -Aminolevulinato Desidratase (ALA-D)
63
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Biomonitoramento
Biomarcadores Hematológicos: ALA-D
Envolvimento BENZENO e TOLUENO na inibição da ALA-D
64
RESULTADOS E DISCUSSÃO
+ Estudos são necessários para verificar o possível envolvimento da ALA-D no desenvolvimento
da anemia induzida pelo benzeno.
Biomonitoramento
Biomarcadores Hematológicos: ALA-D
Exposição Crônica
Benzeno
Inibição Síntese ALA-D
65
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Biomonitoramento
Biomarcadores do Sistema Imunológico
Moléculas de Adesão CD80 e CD86
Ativação Células T
Resposta Imune
Pacientes leucêmicos apresentam menor expressão de CD80 e CD86.
EXPOSIÇÃO OCUPACIONAL BENZENO X LEUCEMIA
CD80 e CD86
Mecanismo Patogênico
da Leucemia
(Chanan-Khan et al., 2011; Dai et al., 2009; Mohamed et al., 2012; Zhao et al., 2012)
BIOMONITORAMENTO
66
*
*
* * ** **
A
B
67
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Biomonitoramento
Biomarcadores do Sistema Imunológico: CD80 e CD86
Envolvimento BENZENO e TOLUENO na
supressão das moléculas de adesão
68
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Biomonitoramento
Biomarcadores do Sistema Imunológico: CD80 e CD86
BENZENO
69
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Biomonitoramento
Biomarcadores do Sistema Imunológico: CD80 e CD86
(r= -0.32; p<0.01; n= 88) (r= -0.56; p<0.001; n= 88)
+ Estudos são necessários para verificar o envolvimento do benzeno na regulação
da expressão de CD80 e CD86, e para verificar se estas moléculas podem atuar
como preditoras de alterações relacionadas ao desenvolvimento de leucemia.
70
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Biomonitoramento
Biomarcadores Hepáticos
Transaminases Hepáticas (AST e ALT)
VALORES DE
REFERÊNCIA
71
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Biomonitoramento
Biomarcadores Hepáticos: AST e ALT
Envolvimento BENZENO e TOLUENO
72
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Biomonitoramento
Biomarcadores Hepáticos: AST e ALT
BENZENO
73
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Biomonitoramento
Biomarcadores de Efeito: AST e ALT
(r= 0.66; p<0.01; n= 88) (r= 0.56; p<0.001; n= 88)
AST e ALT Ferramentas importantes no biomonitoramento contínuo de
trabalhadores expostos ao benzeno.
74
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Biomonitoramento
Biomarcadores Renais
Biomarcadores Clássicos de Função Renal Valores de Referência / p > 0,05
*
* **
**
A B
Microalbuminúria e NAG Biomarcadores de Dano Renal Precoce
75
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Biomonitoramento
Biomarcadores Renais
(r= 0.30; p<0.01; n= 88)
Alterações em Células
Glomerulares e Tubulares Renais
Biomarcadores importantes no biomonitoramento do benzeno.
(Franchini et al., 1983; Gonzalez-Yebra et al., 2006; Jarosinska et al., 2008; Ohno et al., 2007; Prozialeck et al., 2009)
76
77
MATERIAIS E MÉTODOS
Grupos de Estudo
Critérios de Exclusão
• Fumantes
• Doenças Diagnosticadas
• Tempo de Exposição Menor do que 6 Meses
•Uso de Medicamentos/vitaminas antioxidantes
• Análise não Realizada
105 Indivíduos
70 Trabalhadores Expostos a
Baixos Níveis de Benzeno
35 Indivíduos não Expostos
Ocupacionalmente
Frentistas (n=43) Controles (n=28)
78
Biomarcadores de Genotoxicidade
RESULTADOS E DISCUSSÃO
(r= 0.25; p<0.001; n= 71)
Falta de reparo das quebras nas
fitas de DNA contribui para a
formação de MN
(Angelini et al., 2011; Pandey et al., 2008)
Exposição Ocupacional ao Benzeno
79
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dano Protéico
* *
A B
Biomarcadores de Dano Oxidativo
80
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Biomarcadores de Dano Oxidativo
Dano Protéico
Benzeno Oxidação e Nitrosilação de Proteínas
Formação de 3-NT
Formação Peroxinitrito
Carbonilação Proteínas
Perda Função
Protéica
81
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Envolvimento do Estresse Oxidativo na Genotoxicidade
causada pelo Benzeno
(r= 0.59; p<0.001; n= 71) (r= 0.25; p<0.05; n= 71)
(r= 0.38; p<0.001; n= 71)
82
Antioxidantes Endógenos
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Inibição da SOD Inibição da CAT Inibição da GST
Ânions Superóxido Peróxido de
Hidrogênio
Peróxido de
Hidrogênio
(Otitoloju et al., 2011; Ulakoglu et al., 1998; Verma & Rana, 2011)
Formação Peroxinitrito
83
Antioxidantes Endógenos
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Envolvimento do benzeno na diminuição da defesa antioxidante do
organismo.
GSH e GST são depletadas com o objetivo de proteger o organismo das
EROs produzidas durante a biotransformação do benzeno.
GSH e GST biotransformação do benzeno ácido fenilmercaptúrico.
84
RESULTADOS E DISCUSSÃO
(r= -0.37; p<0.01; n= 71) (r= -0.25; p<0.05; n= 71)
A depleção dos mecanismos antioxidantes ocorre na tentativa de conter o desenvolvimento
de danos de DNA etiologicamente relacionada com o estresse oxidativo.
GSH e GST desempenham papel importante na proteção dos danos genéticos causados
pelo benzeno.
Indivíduos com baixos níveis de GSH e/ou atividade de GST podem estar menos
protegidos do que indivíduos com maior níveis destes antioxidantes.
(Fracasso et al., 2010)
85
Antioxidantes Exógenos
RESULTADOS E DISCUSSÃO
(r= -0.30; p<0.05; n= 71) (r= -0.34; p<0.01; n= 71)
86
RESULTADOS E DISCUSSÃO
TRIAGEM E BIOMONITORAMENTO DOS RISCOS OCUPACIONAIS
EXPOSIÇÃO OCUPACIONAL A BAIXAS CONCENTRAÇÕES DE BENZENO
ESTÃO FORTEMENTE ASSOCIADAS A ALTERAÇÕES PRECOCES
Sugerindo a contribuição para desenvolvimento de
patologias em longo prazo
87
CRITÉRIOS QUANTITATIVOS PARA O INDICADOR
BIOLÓGICO DE EXPOSIÇAO É IMPRESCINDÍVEL
88
OBRIGADA! LATOX - Laboratório de Toxicologia
UFRGS – Faculdade de Farmácia
Telefone: (51) 3308-5297