Introdução a Enzimologia. Introdução A manutenção da vida depende de um conjunto de reações...

Introdução a Enzimologia

IntroduçãoA manutenção da vida depende de um conjunto de reações químicas que devem atender duas exigências fundamentais: • precisam ser altamente específicas de modo a gerar produtos definidos• devem ocorrer a velocidades adequadas à fisiologia da célulaA insuficiência na produção ou na remoção de metabólitos pode levar a condições patológicas.

ENZIMAS

alto grau de especificidade por seu substrato

aceleram reações químicas

funcionam em soluções aquosas

a maioria funcionam em pH e temperatura fisiológicas

• As enzimas aceleram a velocidade de uma reação química sem serem consumidas no processo.• Como suas concentrações permanecem constantes eles são eficientes em pequenas quantidades.

Diferença entrea energia livre

de S e PCaminho da Reação

Energia de ativação com enzimaEne r

gia Energia de ativação sem enzima

SS PP

+ +Enzima Substrato Produto Enzima

• Enzimas são catalisadores que aumentam a velocidade da reação de 5 à 17 ordens de grandeza.

Anidrase carbônica

Estrutura das enzimas• Todas as enzimas são proteínas, como tal sua função depende da sua estrutura.

• A estrutura da enzima dependerá da sequência primária; secundária; terciária e quartenária.

Estrutura Primária

Formada pela sequência de aminoácidos unidos pela ligação peptídica.

Estrutura SecundáriaSe refere a arranjos particularmente estáveis entre os aminoácidos, gerando estruturas regulares recorrentes.

Estrutura TerciáriaDescreve todos os aspectos do enovelamento tridimensional de uma proteína.

Estrutura QuartenáriaOcorre quando uma proteína possui duas ou mais subunidades polipeptídicas.

A enzima é constituída por partes importantes:

Apoenzima – parte protéica de uma enzima sem quaisquer co-fatores ou grupos prostéticos.

Sítio ativo – região que forma a maquinaria para a reação química de catálise, é constituída por grupo de aminoácidos.

• Especificidade da enzima pelo substrato

Sítio catalítico – microambiente específico

• 40% forma similar;• enovelação: folhas beta pregueadas anti-paralelas + α-helice pequenas.

aa aa aa aa aa aaamino-teminal

carboxi-teminal

Hidrólise enzimática

elastase

aa apolares: Gly, Ala,Val

tripsina

aa positivos: Arg, Lys

quimiotripsina

aa aromáticos: Phe, Tyr, Trp

Modelos para explicar a formação do complexo Enzima-Substrato

Modelo chave e fechadura – o sítio catalítico é rígido e complementar à forma e ao tamanho do substrato.

Modelo encaixe induzido – o sítio catalítico não está totalmente pré-formado, a enzima se ajustaria ao substrato.

Catálise Ácido-Base – que ocorre com a participação de aminoácidos com cadeias laterais ionizáveis, capazes de doar ou liberar prótons durante a catálise para estabilizar os intermediários (H+, OH-).

Catálise Covalente – resulta do ataque nucleofílico ou eletrofílico de um radical do sítio catalítico sobre o substrato, ligando-o covalentemente à enzima e induzindo a sua transformação em produto.

Catálise por íons metálicos – metais firmemente ligados ao sítio catalítico interage entre a enzima e o substrato estabilizando o estado de transição.

Co-fator – molécula inorgânica pequena que uma apoenzima requer para a sua atividade.

Coenzimas – funcionam como aceptores de átomos ou de grupos funcionais. Durante a reação a coenzima e o substrato são alojados no sítio catalítico da enzima. O fato de as coenzimas estarem se renovando constantemente permite que sua concentração celular seja menor do que as concentrações do substrato.

Classificação das enzimasAs enzimas são classificadas de acordo com o tipo de reação que catalisam.

• Oxido-redutases – enzimas que catalisam reações de óxido-redução, transferência de elétrons.

lactato piruvato

lactato desidrogenase

• Transferases – catalisam a transferência de um grupamento de uma molécula a outra.

alaninaα-cetoglutarato L-glutamato

piruvato

alanina aminotransferase

• Hidrolases – catalisam a reação de hidrólise de uma única ou várias ligações covalentes por introdução de uma molécula de água.

peptidase

• Liases – catalisam reações de dupla ligação adicionando ou removendo grupamentos.

piruvato acetaldeído

piruvato carboxilase

• Isomerases – catalisam reações transferindo grupos dentro da mesma molécula formando isômeros.

Fosfoglicose isomerase

• Ligases – catalisam reações formando ligações do tipo C-C, C-S, C-O e C-N acopladas à quebra de ATP.

Acetil-CoA

acetil CoA carboxilase

Reações enzimáticas com mais de um substrato

Sequencial (formação do complexo ternário)

Pingue-pongue ou duplo deslocamento

Aspartato aminotransferase

Lactato desidrogenase

Creatina cinase

Fatores que afetam a velocidade enzimática Temperatura

Temperatura ótima

Ativação térmica

Desnaturação térmica

pH

Cada enzima tem seu pH ótimo

[E]

Velo

cida

de

da re

ação

Influência da concentração de enzima e substrato

tempo

[pro

duto

]2[S][S]

3[S]4[S]5[S]

Introdução à Cinética Enzimática• Estudo da velocidade da reação

- Quantidade de produto formado

- Quantidade de substrato transformado (sempre na unidade de tempo)

Pode ser medido por:

ou

tempo

[pro

duto

]

[S]

Velo

cida

de

da re

ação

Atividade enzimática pode ser medida pela velocidade da reação catalisada

Cinética enzimáticaRepresentação de uma reação enzimática em 2 etapas

E + S ES Pk1

k-1

k2

Após curto tempo - estabilidade dinâmica com relação a [E] e [ES] é alcançado

Para uma determinada [S] inicial, haverá um intervalo de tempo em que a velocidade da reação será relativamente constante, chamada de Vinicial, V0 ou simplesmente V da reação

Vo = K2 [ES] [Et]=[E] + [ES]

V de Formação de ES = K1 [E] [S] V de degradação de ES = K –1[ES] + K2 [ES]

Já que Formação de [ES] = Degradação de [ES]

K1 ([Et]-[ES]) [S] = K –1[ES] + K2 [ES] K1[S][Et] - K1[S][ES] = (K –1+ K2) [ES]

[ES] = [Et] [S]

[S] + (K –1+ K2) / k1)

Km

[ES] = [Et] [S] Se, V0 = k2 [ES]

Km + [S]

Então: V0 = k2 [Et] [S]

Km +[S]

Em V máxima [Et] = [ES]

Então V max = k2 [Et]

Sendo assim Vo = Vmax [S]

Km +[S]

Equação de Michaelis-Menten

Quando V = Vm

2

Km= [S]

Vm = 2

Vm . [S]

Km +[S]2 . [S]Km +[S] =

2 . [S] - [S] Km =

Uma propriedade importante:

Propriedades importantes de Km:• É numericamente igual a [S] na É numericamente igual a [S] na qual a velocidade da reação é qual a velocidade da reação é metade da Vmax.metade da Vmax.• Característico de cada enzima.Característico de cada enzima.• Reflete a afinidade da enzima pelo Reflete a afinidade da enzima pelo seu substrato.seu substrato.

Km = [S]

maxV1

[S]maxVmK

v1

1[S]

1 v

-1Km

11VVmaxmax

Gráfico Linewevear-Burk

Consequências importantes de Km

Km Afinidade da enzima pelo substrato

Km Afinidade da enzima pelo substrato

Vmáx

v

V/2

1/V

Km Km -1/Km -1/Km1/s[S]

Inibição enzimáticaInibidores de enzimas são moléculas que interferem com a catálise diminuindo ou interrompendo as reações enzimáticas. Quanto ao tipo de inibição:

• inibição inespecífica: diminuição da atividade de todas as enzimas por temperatura, pH ou agentes desnaturantes (ex. uréia).

• inibição específica: agente inibidor diminui a atividade de uma enzima específica ou de um grupo restrito de enzimas. A inibição pode ser irreversível ou reversível.

Inibidor CompetitivoInibidor análogo não metabolizável do substrato compete com o mesmo pelo sítio catalítico da enzima livre.

Km é modificado, mas Vmáx não é alterada.

É necessário de [S] maior para deslocar o inibidor.

1- sem inibidor

2- com inibidor [ I ]3- com inibidor 2[ I ]

Inibidor Não-CompetitivoInibidor se liga numa região deferente do sítio catalítico da enzima.

Vmáx diminui, mas o Km não é alterado.

[S] maior não diminui a inibição.

1- sem inibidor

2- com inibidor [ I ]3- com inibidor 2[ I ]

Inibidor IncompetitivoO inibidor se liga somente no complexo ES em sítio próprio.

Inibidor não possui semelhança estrutural com o substrato.

Km e Vmáx da enzima diminuem.

1- sem inibidor

2- com inibidor [ I ]3- com inibidor 2[ I ]

Exemplos de inibidores farmacológico

• 3'-azido-2',3'-didesoxitimidina (AZT)

• nevirapina

• sulfonamidas

Inibidor IrreversívelO inibidor se liga covalentemente a um grupo funcional da enzima formando um complexo estável.

Ácido acetil salicílico

Regulação da atividade enzimática das enzimas alostéricasFuncionam através da ligação não-covalente e reversível de um metabólito regulador (modulador)São maiores e mais complexas, possuem duas ou mais cadeias polipeptídicas.Não obedecem a cinética de Michaelis-Menten.Tipos de enzimas alostéricas: homotrópica (modulador é idêntico ao substrato); heterotrópica (modulador é diferente do substrato)

Um modulador alostérico pode ser tanto um inibidor quanto um ativador.

Aspartato Transcarbamilase (ATCase) – síntese de pirimidinas

Fosfofrutokinase 1 (PFK-1)

Regulação da atividade enzimática por modificação covalente reversível

Fosforilação – Regula inúmeros processos metabólicos ativando enzimas chaves das vias metabólicas.

A B C D E

-

Feedback negativo

Coordena o fluxo de enzimas por uma via metabólica.

Ativação proteolítica

Aplicações das enzimasSetor industrial – permitem usarem processos mais econômicos, diminuindo consumo de energia e recursos, mais confiáveis que poluem menos.

Saúde – são usadas para detectar algum tipo de doença, ou dano tecidual, ou como marcador de exames. Algumas doenças são causadas pela falta de enzimas (ex. fenilcetonúria; intolerância a lactose).

Infarto do miocárdio