Marcadores Moleculares Rodrigo Rocha Latado. Marcadores fenotípicos Características do organismo -...

Marcadores Moleculares

Rodrigo Rocha Latado

• Marcadores fenotípicosCaracterísticas do organismo - Ex. cor da pele, cor e tipo

de cabelo, presença de pelos, etc...

• Marcadores bioquímicosPresença ou ausência de compostos - Ex. isoenzimas,

proteínas ou de polissacarídeos específicos, etc...

• Marcadores moleculares Presença ou ausência de sequências de DNA ou RNA -

Ex. genes ou regiões não-codificantes - alteração em uma ou mais bases nitrogenadas

USOS• Testes de paternidade

• Exames genéticos - aberrações cromossômicas ou SNP´s)

para Humanos, animais, plantas e microorganismos

• Causas forenses (criminais, patenteamento)

USOS• Estudos de fingerprinting

(impressões digitais) - Biochips de DNA

• Estudos básicos de genômica e proteômica

• Estudos ambientais (conservação de germoplasma, avaliação da diversidade genética)

USOS

• Estudos evolucionários e populacional

• Melhoramento animal e vegetal (seleção assistida, seleção de progenitores)

CLASSIFICAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES

Classificação por Tipo de Técnica

• Métodos sem uso de PCR• RFLP• VNTR

• Métodos com uso de PCR– PCR com primers arbitrários

• RAPD, AP-PCR, DAF; • Polimorfismo de Tamanho de Fragmento Amplificado AFLP;• ISSR• TRAP

– PCR sítio-específico• CAPS, SCAR• SSRs (microssatélites)• TGGE, SSCP, DGGE

Classificação por Número de Cópias da Seqüência Alvo

• Seqüência de poucas cópias - codificante• RFLP

• Seqüência com cópias repetidas• VNTR• SSRs (microssatélites) • ISSR

• Seqüência com número de cópias indefinido • RAPD, AP-PCR, DAF;• AFLP;• CAPS, SCAR• TRAP

MARCADORES MOLECULARES PARA

MELHORAMENTO DE PLANTAS

• Sucesso no melhoramento de plantas depende da capacidade de distinguir fatores genéticos herdáveis, dos ambientais

• Marcadores genéticos são unidades herdáveis simples

marcadorescromossoma

• Polimorfismo de DNA é resultado do acúmulo de mutações– pontual ou inserção/deleção– macro-rearranjos: translocações, inversões,

deleções

Ex. magnitude mutações pontuais:• Gene Opaco-2 : 1.933 pares de bases• 14% das bases polimorfismo• 26 fenômenos de Inserção/Deleção

• Marcadores genéticos, quando associados a características de interesse, aumentam a eficiência de seleção

R cromossoma

População de São Paulo9.291.000 habitantes em 2.600.000 domicílios

Como achar alguém? E se fosse Tokyo?

Aplicações no Melhoramento

• Mapeamento genômico – Seleção Assistida por Marcadores -

MAS

• Diversidade genética e filogenia• Caracterização de germoplasma• Identificação de acessos• Seleção de genitores

Histórico de Marcadores

1. 1970’s - ferramentas molecularesdesenvolvimento de vetores de clonagem; enzimas de restrição; polimerases; ligases; Southern (1977);

2. RFLP proposto por Botstein et al. (1980)descrito para humanos

3. PCR proposto por Mullis & Faloona (1987)

4. RAPD por Rafalski et al. (1990)

Histórico de Marcadores

5. Microssatélites em plantas por Akkaya et al. (1992)

6. AFLP por Zabeau & Vos (1993)

7. SCAR por Paran & Michelmore (1993)

8. Cho et al. (1999) - SNPs em Arabidopsis

DESCRIÇÃO DOS MARCADORES MOLECULARES

Marcadores Moleculares

• RFLP• RAPD, AP-PCR, DAF• PCR-específico - SSR, ISSR, CAPS,

SCARs• AFLP• SNPs

Restriction Fragment Length Polymorphism -

RFLP• RFLP examina diferenças no

tamanho de fragmentos de restrição de DNA específicos

• Polimorfismo deriva de mutação pontual, inserção, deleção

• Utiliza-se DNA celular total• Requer DNA puro, de alto peso

molecular

Metodologia de RFLP1 . Digerir DNA em fragmentos pequenos2. Separação dos fragmentos por gel

eletroforese3. Transferência de fragmentos de DNA

para filtro

Fonte: IPGRI

Metodologia de RFLP

4. Visualização dos fragmentos de DNA– sondas marcadas (32P) ou a frio

5. Análise dos resultados– bandas analisadas para alelos e/ou

presença/ausência– diferenças em padrão de bandas reflete

diferenças genéticas

A escolha de sonda/enzima de restrição é crucial

Fonte: IPGRI

digestão

1

1

52

34

2

5

43

DNA

Digestão de DNA Genômico e Separação em Gel

Separaçãoem gel

Transferência para Membrana de Nylon ou Nitrocelulose

1

2

3

4

5

Hibridização em Nylon ou Nitrocelulose

Interpretação de resultados

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4 5 6

Sítio alvo para sonda

Sítio de restrição

Inserção

Fonte: IPGRI

6 Kb

AHerança de RFLPs

8 Kb

B

6 Kb

F1

8 Kb

6 Kb 6 Kb

8 Kb

6 Kb

8 Kb 8 Kb

F2

RFLP em Cana de Açúcar

1 5 10 15 20

Fonte: CEBMEG

Vantagens e Desvantagens de RFLP

• Reprodutível• Marcadores co-dominantes• Simples

• Trabalhoso• Caro• Uso de sondas radioativas*

Fonte: IPGRI

Random Amplification of Polymorphic DNA - RAPD

• Amplifica seqüências anônimas de DNA usando primers arbitrários– 10 bases com >50% G+C

• PCR com um único primer• Método rápido para detecção de

polimorfismos• Marcador dominante• Problemas de reprodutibilidade

RAPD

AA

Aa

aa

AA Aa aa

Interpretação de RAPDs• Marcadores RAPD são anônimos• Dados binários (presença x

ausência)• RAPD são dominantes (AA = Aa)

• Problemas de co-migração– mesma banda, mesmo fragmento?– uma banda, um fragmento?

RAPD - resumo

• Rápido• Simples• Baixo custo• Sem uso de radioisótopos

• Marcador dominante• Problemas de reprodutibilidade• Problemas de interpretação

Fonte: IPGRI

RAPD - primer OPJ04 - Bananeira

1500 pb

RAPD - Feijoeiro

OPAM13

OPY04