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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
Pró – Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Faculdade de Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
MORFOMETRIA DO TRATO GENITAL MASCULINO: INFLUÊNCIA DO
PLASMA SEMINAL OBTIDO EM ÉPOCA SECA OU CHUVOSA SOBRE
ESPERMATOZÓIDES CAPRINOS
Ana Cláudia Nascimento Campos
Fortaleza – CE
2003
2
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
Pró – Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Faculdade de Veterinária Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
MORFOMETRIA DO TRATO GENITAL MASCULINO: INFLUÊNCIA DO PLASMA
SEMINAL OBTIDO EM ÉPOCA SECA OU CHUVOSA SOBRE ESPERMATOZÓIDES
CAPRINOS
Ana Cláudia Nascimento Campos
Fortaleza – CE
2003
3
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
Pró – Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Faculdade de Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
MORFOMETRIA DO TRATO GENITAL MASCULINO: INFLUÊNCIA DO PLASMA
SEMINAL OBTIDO EM ÉPOCA SECA OU CHUVOSA SOBRE ESPERMATOZÓIDES
CAPRINOS
Ana Cláudia Nascimento Campos
Tese apresentada à Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual do Ceará, como
requisito parcial para a obtenção do grau de
Doutor em Ciências Veterinárias
Área de concentração: Reprodução
Orientador: Dr. José Ferreira Nunes
Fortaleza-CE 2003
4
C198m Campos, Ana Cláudia Nascimento Morfometria do trato genital masculino: influência do
plasma seminal obtido em época seca ou chuvosa sobre os espermatozóides caprinos/ Ana Cláudia Nascimento Campos – 2003
85p.; 28 cm Orientador: José Ferreira Nunes Tese (Doutorado em Ciências Veterinárias) –
Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária. 1. Reprodução Animal – Ruminante. 2. Caprino I Título
CDD 636.0824
5
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
Pró – Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Faculdade de Veterinária
Curso de Doutorado em Ciências Veterinárias
Morfometria do trato genital masculino: influência do plasma seminal obtido em época
seca ou chuvosa sobre espermatozóides caprinos
Ana Cláudia Nascimento Campos APROVADA EM 30/04/2003 Banca examinadora:
____________________________ Prof. Dr. José Ferreira Nunes
Orientador __________________________________ _____________________________ Prof. Dr. Abisai de Oliveira Sousa Prof. Dr. Rômulo José Vieira Examinador Examinador _________________________________ _________________________________ Prof. Dr. Airton Alencar de Araújo Prof. Dr. Arlindo de Alencar Araripe Moura Co-orientador/ Examinador Examinador
________________________________ Prof. Dr. Arturo Bernardo Selaive Villarroel
Examinador
6
Ao meu esposo Daniel Campos de
Barros pelo imenso amor a mim
dedicado e apoio durante a
realização do doutorado e à minha
filha Dâmaris que está para
chegar, meu carinho e amor.
Dedico
7
“Procura conhecer o estado das tuas ovelhas, e cuida bem dos teus rebanhos, pois as
riquezas não duram para sempre, nem a coroa de geração em geração. Quando o feno for
removido, e aparecerem os renovos, e se recolherem as ervas dos montes, então os cordeiros
te proverão vestes, e os bodes o preço do campo. Haverá bastante leite de cabras para o teu
sustento e da tua casa e para o sustento das tuas criadas”
Provérbios 26: 23 - 27
8
AGRADECIMENTOS
A Deus pelo dom da vida, dando-me assim, a oportunidade de realizar este
trabalho e ânimo para lutar sempre.
Ao Dr. José Ferreira Nunes, professor, orientador e amigo, dedico o meu agradecimento.
Por seu constante incentivo e empenho para que este trabalho fosse realizado, e confiança na minha
capacidade profissional.
À Universidade Estadual Vale do Acaraú, ao Magnífico Reitor Teodoro Soares,
pela liberação para cursar o doutorado, aos colegas do Curso de Zootecnia, meus
agradecimentos também aos colegas de trabalho Fátima Révia Lima, Cláudia Goulart, Ângela
Vasconcelos, Fabianno Cavalcante e João Ambrósio de Araújo Filho pelo incentivo a cursar o
doutorado.
À Universidade Estadual do Ceará pela acolhida, particularmente à Coordenação
do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias.
À Fundação Cearense de Amparo à Pesquisa, pela bolsa de estudo concedida.
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias e
funcionários pelos ensinamentos, convivência e colaboração. Em especial às amigas Maria
Audália Carvalho e Emmanuelle Lima de Figueirêdo pela amizade e companheirismo.
Aos meus amigos Jurandir Ferreira da Cruz, Dárcio Ítalo Teixeira, Virgílio
Emanuel Vieira, Marcos Antonio Ferreira e Roberta Costa Ferreira pela imensa amizade que
cultivamos nesses anos de estudo.
Ao meu esposo Daniel Campos, pela compreensão, apoio e dedicação nos momentos
mais difíceis da minha vida, agradeço-lhe com todo o carinho do meu coração.
9
RESUMO
Este trabalho teve por objetivos avaliar o efeito da época do ano sobre (1) a morfometria do
trato genital masculino caprino; (2) a adição de plasma seminal (PS) na viabilidade e
morfologia dos espermatozóides epididimários (EE) e (3) a viabilidade do sêmen lavado (L) e
não lavado (NL), resfriado e armazenado a +4oC. (1) Assim, foram coletados 46 e 52 genitais
de machos caprinos na época seca e chuvosa, respectivamente. Os resultados demonstraram
que houve diferença significativa entre os parâmetros mensurados no período seco e chuvoso
(P<0,05), com exceção da vesícula seminal. (2) Espermatozóides foram coletados da cauda do
epidídimo, diluídos, divididos em 7 alíquotas e adicionados de PS. A adição do PS aumentou
significativamente a percentagem de espermatozóides móveis (PEM); algumas morfologias
espermáticas foram influenciadas pelo PS. (3) Foram utilizados 40 ejaculados (20 /seca e 20
/chuvosa). O efeito da presença do PS sobre a motilidade individual progressiva (MIP) e PEM
foi constatado no sêmen L. A época do ano afetou somente à MIP no sêmen L e NL. Uma
degradação significativamente inferior (P<0,02) foi constatada no sêmen L. Concluiu-se que
(1) os parâmetros morfométricos de caprinos SRD da região semi-árida do Nordeste do Brasil
são inferiores aos citados na literatura internacional, provavelmente devido à adaptação; (2)
que o PS exerceu ação sobre a sobrevivência e morfologia espermática, deduzindo-se um
efeito deletério na época seca e benéfico na época chuvosa sobre os EE (3) que o período do
ano e a presença de PS no Nordeste do Brasil não interferem na conservação do sêmen
caprino armazenado a 4oC.
10
ABSTRACT
The aims of this study was the effect of time year (1) the biometry from goat male
reproductive; (2) the effect of seminal plasma (SP) on the viability and morphology of goat
epididymal spermatozoa (ES) and (3) cooling and storage at 4oC on the viability of washed
and unwashed semen (1). Thus, 46 and 52 genitals were collected from bucks in dry and rainy
season, respectively. The results showed significant difference between the parameter
measured in dry and rainy season (P<0.05), except from seminal vesicle. (2) The spermatozoa
were collected from the epididymal cauda, diluted, divided into 7 aliquots and added to
seminal plasma. The addition of seminal plasma significantly increased percentage of motile
spermatozoa (PMS); some sperm morphology were affected on SP. (3) We used 40 ejaculates
(20 /dry and 20 / rainy). The effect of the presence of seminal plasma on progressive
individual motility (PIM) was observed for washed semen. The time of semen collection, was
observed only for PIM in both washed an unwashed sperm. A significantly lower degradation
(P <0.02) was observed in washed sperm. We conclude that (1) parameters morphometric
from crioula goat in Northeastern semi-arid Brazil are inferiors to the mentioned in the
international literature, it is probably a process of adaptation; (2) that seminal plasma affected
sperm survival and morphology, being a harmful effect in dry season and beneficial effect in
rainy season on ES and (3) the season of the year and the SP presence in the Northeast of
Brazil does not interfere significantly on conservation of goat sperm stored at 4oC.
11
SUMÁRIO
ABREVIAÇÕES E SÍMBOLOS ......................................................................................... 01
INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 02
REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................ 05
1. Anatomia do trato genital masculino de caprinos ......................................................... 05
2. Espermatogênese ......................................................................................................... 06
3. Espermatozóides epididimários .................................................................................... 08
3.1. Alterações adquiridas no espermatozóide durante o trânsito epididimário ........ 09
3.2. Alterações na motilidade espermática ................................................................. 09
3.3. Alterações na composição da membrana plasmática dos espermatozóides ........ 11
3.4. Alterações nas características superficiais da membrana plasmática dos espermatozóides ...................................................................................................................
12
3.5. Alterações da morfologia espermática ................................................................. 13
4. Principais constituintes do plasma seminal e sua ação sobre os espermatozóides durante a ejaculação .............................................................................................................
14
4.1. Principais eletrólitos do plasma seminal e sua importância sobre o metabolismo espermático ....................................................................................................
17
4.2. Proteínas e enzimas do plasma seminal e sua ação sobre os espermatozóides ... 19
4.3. Frutose e ácido cítrico no plasma seminal ........................................................... 20
5. Avaliação da qualidade do sêmen ................................................................................. 22
5.1. Teste de termorresistência ................................................................................... 23
5.2. Atividade de certas enzimas ................................................................................ 24
5.3. Concentração, volume, aparência e movimento em massa ................................. 25
5.4. Morfologia espermática .................... .................................................................. 26
5.5. Teste de habilidade de fertilização dos espermatozóides .................................... 27
5.6. Integridade acrossômica ..................................................................................... 27
6. Conservação do sêmen ................................................................................................. 30
6.1. Conservação do sêmen no estado líquido ............................................................ 32
6.2. Diluidores e constituintes utilizados na conservação do sêmen .......................... 34
6.2.1. Leite ............................................................................................................. 35
6.2.2. Glicerol ........................................................................................................ 35
12
6.2.3. Gema de ovo ................................................................................................ 36
6.3. Conservação do sêmen caprino ............................................................................. 37
6.4. Uso da água de coco como diluidor do sêmen dos animais domésticos ............... 38
JUSTIFICATIVA ................................................................................................................ 41
MATERIAL E MÉTODOS
Experimento 1: Parâmetros morfométricos do trato genital masculino de caprinos sem raça definida (SRD) criados no semi-árido Nordestino durante o período seco e chuvoso ..........................................................................................................................
42
Experimento 2: Ação do plasma seminal obtido durante a época seca ou chuvosa sobre a viabilidade e morfologia dos espermatozóides epididimários de caprinos .......
43
Experimento 3: Viabilidade do sêmen caprino lavado e não lavado diluído em água de coco e armazenado a 4 oC .........................................................................................
45
RESULTADOS
Experimento 1: Parâmetros morfométricos do trato genital masculino de caprinos sem raça definida (SRD) criados no semi-árido Nordestino durante o período seco e chuvoso ..........................................................................................................................
47
Experimento 2: Ação do plasma seminal obtido durante a época seca ou chuvosa sobre a viabilidade e morfologia dos espermatozóides epididimários de caprinos .......
49
Experimento 3: Viabilidade do sêmen caprino lavado e não lavado diluído em água de coco e armazenado a 4 oC .........................................................................................
52
DISCUSSÃO
Experimento 1: Parâmetros morfométricos do trato genital masculino de caprinos sem raça definida (SRD) criados no semi-árido Nordestino durante o período seco e chuvoso ..........................................................................................................................
56
Experimento 2: Ação do plasma seminal obtido durante a época seca ou chuvosa sobre a viabilidade e morfologia dos espermatozóides epididimários de caprinos .......
58
Experimento 3: Viabilidade do sêmen caprino lavado e não lavado diluído em água de coco e armazenado a 4 oC .........................................................................................
61
CONCLUSÕES ................................................................................................................... 66
PERSPECTIVAS ................................................................................................................. 67
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 68
ANEXOS
1
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AAT Aspartato aminotransferase
AF Anormalidade de flagelo
CASA Computer-Assisted Spermatozoa Motility Analysis oC Grau Celsius
Ca++ Íon cálcio
Cl- Íon cloro
cm Centímetros
DC Defeito de cabeça
DPI Defeito de peça intermediária
g Grama
GCD Gota citoplasmática distal
GCP Gota citoplasmática proximal
GPT Piruvato-glutâmico transferase
K+ Íon potássio
LDH Lactato desidrogenase
Mg++ Íon magnésio
mL Mililitros
MIP Motilidade individual progressiva
Na+ Íon sódio
NCD Descondensação da cromatina nuclear
P Probabilidade
PEM Percentagem de Espermatozóides Móveis
PO4-- Íon fosfato
pH Potencial de hidrogênio
sptz Espermatozóides
TDM Taxa de degradação da motilidade
UHT Tratamento ultra térmico
Zn++ Íon zinco
2
INTRODUÇÃO
Na região semi-árida do Nordeste do Brasil, os efeitos climatológicos são bem
delimitados, determinando duas épocas: seca e chuvosa, interferindo na disponibilidade de
alimentos, na temperatura e conseqüentemente influenciando a atividade sexual do macho
caprino e ovino deslanado (SILVA & NUNES, 1984). Segundo o COADS – NOA (USA) a
umidade relativa do ar na região metropolitana de Fortaleza na época chuvosa (março – maio)
é de 83% e na época seca (setembro – novembro) é 74%; na região do Inhamuns é de 75% na
época chuvosa e 45% na época seca. A velocidade dos ventos na época chuvosa é 16,9 km/h,
e na seca 30,7 km/h na região metropolitana de Fortaleza. É bem conhecido que temperaturas
elevadas exercem efeitos depressivos na qualidade do sêmen, podendo produzir alterações tais
como: elevação do pH e da percentagem de espermatozóides anormais, diminuição da
motilidade, da concentração espermática, do volume e da percentagem de espermatozóides
móveis (CORTEEL, 1981). Nesse sentido, o sistema termorregulador atua procurando manter
constante a temperatura intratesticular e assim manter a qualidade do sêmen (KASTELIC et
al., 1996). Nas condições semi-áridas, o fator temperatura parece ser o ponto fundamental das
variações quanti-qualitativas do sêmen caprino. A distribuição das chuvas ameniza as
temperaturas e contribuem ainda para uma maior disponibilidade de pastagens que
influenciam diretamente no aspecto nutricional dos animais (NUNES, 1988). A intensidade
pluviométrica no Nordeste brasileiro está diretamente relacionada com a qualidade e
disponibilidade das pastagens para os animais, assim as chuvas interferem indiretamente
sobre o comportamento reprodutivo (NUNES, 1988). O volume do ejaculado, que é uma
conseqüência do aumento de fluidos das glândulas anexas e epidídimo (CORTEEL, 1981)
está sob influência da época do ano, aumentando na época chuvosa (SILVA & NUNES,
1984). A época do ano não afeta de maneira significativa a morfologia espermática na espécie
caprina, entretanto durante o período seco, seus valores estiveram próximos aos índices
limites para um sêmen de boa qualidade (SILVA & NUNES, 1984). Portanto, a má nutrição
traz prejuízos para o processo da espermatogênese e contribui para a má qualidade do plasma
seminal.
3
Estudos sugerem que com melhoramento dos níveis de proteína na dieta melhora
as proteínas do plasma seminal, podendo ajudar na regulação das mudanças osmóticas e
capacidade tamponante do plasma seminal, que por sua vez, controla a atividade metabólica
dos espermatozóides (DIETZ & FLIPSE, 1969), sem contudo afetar a capacidade de produção
espermática (EL-AZAB et al., 1998). Estudos realizados no Rio Grande do Sul demonstraram
que a época do ano afetou significativamente a percentagem de espermatozóides anormais e
em menor grau, o volume e concentração espermática, quando os animais são mantidos em
pastagem natural, indicando que esta deficiência deve-se ao manejo alimentar e não ao
fotoperíodo (SELAIVE-VILLARROEL et al., 1985). É bem conhecido que tanto o tamanho
testicular quanto a eficiência da espermatogênese de carneiros estão em níveis elevados
durante a época sexual (fotoperíodo negativo) e que diminuem durante a época não sexual
(fotoperíodo positivo) (COLAS, 1980). Sabe-se também que um dos fatores limitantes na
reprodução caprina é a estacionalidade na produção e qualidade espermática (PÉREZ &
MATEOS, 1996). A amplitude destas variações estacionais varia substancialmente de acordo
com o indivíduo e a raça e representa a sensibilidade de cada animal ou raça aos fatores
ambientais (CORTEEL, 1975). Seria interessante especificar se a intensidade de mudanças
estacionais dentro do processo reprodutivo é mais importante em raças com um curto período
de acasalamento (raças que sofrem muita influência da estacionalidade) do que em animais de
raças que tem uma atividade cíclica anual mais longa (raças que sofrem pouca influência da
estacionalidade) (MANDIKI et al., 1998). A avaliação desta variabilidade é requerida para a
melhor utilização dos animais em um programa de inseminação artificial (MANDIKI et al.,
1998; PÉREZ & MATEOS, 1996).
Esta tese de doutorado teve por objetivos, portanto, comparar a morfometria do
trato genital masculino caprino nas épocas seca e chuvosa e avaliar se a época do ano (seca ou
chuvosa) determina diferenças quanto à qualidade do plasma seminal, com conseqüente
interferência sobre a motilidade, percentagem de espermatozóides móveis e morfologia
espermática.
Com o intuito de uma melhor compreensão dos eventos reprodutivos que ocorrem
no macho caprino nas condições do Nordeste do Brasil, a tese apresentará as seguintes
secções: revisão de literatura, onde serão abordados assuntos relacionados à anatomia do trato
genital masculino do caprino, espermatogênese, espermatozóides epididimários, plasma
4
seminal, análise da qualidade do sêmen, conservação do sêmen e diluidores empregados na
conservação das células espermáticas; Material e Métodos; Resultados; Discussão;
Conclusões; Perspectivas e Referências Bibliográficas. Em anexo seguem os artigos
originados dos experimentos de tese.
5
REVISÃO DE LITERATURA
1. ANATOMIA DO TRATO GENITAL MASCULINO DE CAPRINOS
O trato genital de caprinos é formado por um par de testículos, epidídimos,
bolsa escrotal, canais deferentes, glândulas anexas, uma uretra, pênis e prepúcio.
Os testículos estão inseridos na bolsa escrotal, apresentam forma ovóide e são
simétricos. Alguns pesquisadores afirmaram que o peso testicular varia segundo a raça, peso
vivo, estação e estado nutricional do animal, pois raças de maior porte tendem a apresentar
testículos mais desenvolvidos (BARIL et al., 1993; VILLAR FILHO et al., 1993). NÚÑEZ
(1993) observou que os pesos testiculares variaram de 150 a 180 g, enquanto NISHIMURA et
al. (2000) estudando caprinos nativos japoneses, com idade entre 12 a 24 meses, encontraram
pesos médios de 126,00 ± 6,3 g. BARIL et al. (1993) citam pesos de 101 g em caprinos
franceses nativos, todavia em raças de maior porte o peso pode variar de 80 – 300 g. O
comprimento testicular de acordo com NÚÑEZ (1993), variou de 7,5 a 11 cm, com largura de
4,7 cm. Nesses aspectos os estudos realizados em caprinos das raças Anglo-Nubiana, Alpina e
Canindé os comprimentos foram 7,75, 7,4 e 7,3 cm, respectivamente (VILLAR FILHO et al.,
1993).
Os epidídimos são compostos de um único túbulo enovelado que se inicia nos
cones eferentes com a função de transportar e armazenar espermatozóides até a ejaculação
(BARIL et al., 1993). Três partes sucessivas podem ser distinguidas: cabeça, corpo e cauda
(HAMAMAH, 1983). No ovino pesam de 20 – 30 g e o túbulo enovelado tem de 50 – 60 m
(THIBAULT & LEVASSEUR, 1991). O canal deferente tem início na cauda do epidídimo e
desemboca na uretra pélvica. Em pequenos ruminantes seu comprimento varia de 45 a 50 cm
(NÚNEZ, 1993).
A bolsa escrotal, na qual são encontrados os testículos, é pendular e conserva os
testículos a 4 à 7oC abaixo da temperatura corpórea. Esta regulação é assegurada por
mecanismos de troca térmica entre o sangue arterial e o venoso no cordão testicular, bem
6
como por numerosas glândulas sudoríparas na pele escrotal. A pele também contem alguns
termorreceptores que ativam os mecanismos corporais de termorregulação (MIES FILHO,
1987; BARIL et al., 1993).
As glândulas anexas são constituídas pelas ampolas vesiculares, glândulas
vesiculares, bulbouretrais e próstata. Elas contribuem com a maior parte do volume do
ejaculado (HAFEZ, 1995). As ampolas são dilatações da extremidade uretral do canal
deferente, que também é um lugar de armazenamento dos espermatozóides antes da
ejaculação (BARIL et al., 1993). Nos pequenos ruminantes as vesículas seminais e as
bulbouretrais são bem desenvolvidas em relação à próstata cuja parte externa está ausente e a
interna encontra-se disseminada na uretra pélvica (DELLMAN & BROWN, 1982). Estas
glândulas são de grande importância para a fisiologia do macho caprino, sendo que as
vesículas seminais são androgênicas dependentes, enquanto as bulbouretrais são prolactina
dependentes (NUNES, 1982). As vesículas seminais elaboram a maior parte do plasma
seminal, e estão situadas uma de cada lado da uretra pélvica. As glândulas de Cowper
(bulbouretrais) estão situadas na região caudal da uretra pélvica, dentro do músculo bulbo
esponjoso, sendo muito pequenas e em forma de feijão (DELLMAN & BROWN, 1982; MIES
FILHO, 1987) estas glândulas sintetizam um líquido viscoso e secretam uma enzima
denominada fosfolipase A (NUNES, 1982). A próstata é difusa e não penetra na curvatura
muscular da uretra (DELLMAN & BROWN, 1982).
NUNES (1982) encontrou diferenças significativas entre os pesos das vesículas
seminais nas épocas reprodutiva e não reprodutiva, sendo que os pesos foram maiores na
estação reprodutiva. FERNANDES (1994), em estudos realizados sobre a vesícula seminal
observou que os parâmetros de peso, espessura, largura e comprimento não diferiram entre os
períodos seco e chuvoso. NÚÑEZ (1993) relatou que o comprimento das vesículas seminais
variaram de 2,5 a 4 cm.
2. ESPERMATOGÊNESE
A espermatogênese pode ser definida como um processo altamente coordenado
e cíclico no qual espermatogônias diplóides diferenciam-se em espermatozóides haplóides
7
maduros (FRANÇA et al., 1999), ou como um processo cronológico prolongado pelo qual as
células-fonte (espermatogônias) dividem-se por mitose para sua própria manutenção em
número e para a produção cíclica de espermatócitos primários, que por sua vez sofrem meiose
para a produção de células haplóides (espermátides), as quais se diferenciam em
espermatozóides (JOHNSON et al., 2000). De qualquer modo, a espermatogênese efetua-se
nos testículos de modo permanente e contínuo a partir da puberdade (ERICKSON, 1985;
JOHNSON et al., 2000), tendo início quando os níveis hormonais de FSH e LH elevam-se e
ocorre o amadurecimento do eixo hipotâmico-hipofisário-gonádico (THIBAULT &
LEVASSEUR, 1991). No início da puberdade, as células - fonte espermatogoniais começam a
diferenciar-se e a proliferar para formar várias gerações de espermatogônias, marcando o
início da espermatogênese (PARKS et al., 2003).
O processo de espermatogênese consiste de três fases distintas: (1)
espermacitogênese que é a diferenciação e proliferação de células fontes espermatogoniais e
subseqüentemente de espermatogônias geradoras de espermatócitos primários (pré-
leptótenos); (2) meiose que inclui a primeira divisão redutora dos espermatócitos primários
(4N) a espermatócitos secundários (2N) e de espermatócitos secundários em espermátides
(1N) e (3) espermiogênese que é a diferenciação da espermátide em espermatozóide (PARKS
et al., 2003).
A eficiência da espermatogênese é estimada pelo número de espermatozóides
produzidos por grama de parênquima testicular e não é influenciada pela diferença no
tamanho testicular entre os animais (JOHNSON et al., 2000).
O ciclo espermatogênico (ciclo do epitélio seminífero) é uma série de mudanças
em uma dada área (região) do epitélio seminífero entre duas ondas do mesmo estágio (etapa)
de desenvolvimento (THIBAULT & LEVASSEUR, 1991), e a duração de cada ciclo
espermatogênico em caprinos é de 10,6 dias, considerando-se que a duração total da
espermatogênese dura cerca de 4,5 ciclos do epitélio seminífero, a duração da
espermatogênese nessa espécie é de 47,7 dias (FRANÇA et al., 1999).
Após o término da espermatogênese, os espermatozóides testiculares são liberados
das células de Sertoli e em seguida lançados no líquido do túbulo seminífero, onde por meio
8
da contração das células mióides dos túbulos seminíferos são transportados para a reti testis e
daí para o epidídimo (THIBAULT & LEVASSEUR, 1991). A degeneração das células
germinativas ocorre ao longo da espermacitogênese, e pode variar com o desenvolvimento
puberal, idade e espécie (JOHNSON et al., 2000). Os espermatozóides provenientes dos
testículos são imóveis e estas células adquirem motilidade potencial durante o trânsito
epididimário (JAISWAL & MAJUMDER, 1998).
3. ESPERMATOZÓIDES EPIDIDIMÁRIOS
Pesquisas realizadas em numerosos mamíferos (do camundongo ao elefante) têm
levado ao paradigma de que o epidídimo desempenha um importante papel na reprodução do
macho pela maturação e armazenamento espermático, bem como transporte a partir dos
testículos (JONES, 1999). Nesse sentido, o epidídimo é essencial para a reprodução normal
dos mamíferos, pois os espermatozóides que deixam os testículos são incapazes de fertilizar o
oócito, adquirindo esta potencialidade durante o trânsito epididimário (AMANN et al., 1993;
MÜLLER et al., 1997; JAISWAL & MAJUMDER, 1998). O mesmo é responsável pelo
transporte, maturação e armazenamento dos espermatozóides possuindo também funções
absortiva e secretora (WHITE, 1973).
Estudos comprovam que se o epidídimo for coletado logo após a morte do animal
e conservado sob condições ótimas de meio e temperatura (4 ºC), os espermatozóides
epididimários podem permanecer viáveis por até dois dias, onde a motilidade e capacidade de
penetração no oócito podem ser mantidas satisfatoriamente (KIKUTI et al., 1998).
Já é conhecido que o trânsito epididimário e a ejaculação são etapas cruciais na
maturação espermática de mamíferos (MÜLLER et al., 1997) e que o gameta masculino está
sob contínuo processo de modificação (THIBAULT & LEVASSEUR, 1991; AMANN et al.,
1993). A maturação dos espermatozóides ocorre no epidídimo; em seguida são misturados
com o fluido seminal durante a ejaculação; expostos ao ambiente do trato reprodutivo
feminino após a ejaculação; envolvidos no microambiente do oócito; e em seguida ocorre a
penetração no oócito e formação do pronúcleo masculino (KVIST, 1980; AMANN et al.,
1993). Ressalta-se ainda que, a célula espermática é altamente polarizada e especializada com
uma estrutura tripartida em cabeça, peça intermediária e cauda (YOSHIDA, 2000). Ela perdeu
9
sua habilidade de biossíntese, reparo, crescimento e divisão celular na fase final da
espermatogênese (YOSHIDA, 2000).
3.1. Alterações adquiridas no espermatozóide durante o trânsito epididimário
As informações sobre o epidídimo e as mudanças que ocorrem nos
espermatozóides durante sua passagem por este órgão têm sido descritas por diversos autores
(POULOS et al., 1974; DACHEUX et al., 1979; ACOTT & HOSKINS, 1981). Um
espermatozóide é considerado maduro quando ao ser depositado nas vias genitais for capaz de
fecundar um oócito, que por sua vez desenvolver-se-á até o nascimento de um indivíduo
viável (HAMAMAH, 1983). O termo maturação é empregado para descrever o processo
fisiológico pelo qual os espermatozóides adquirem a motilidade e poder fecundante durante
sua passagem pelo epidídimo (HAMAMAH, 1983).
O fluido epididimário que banha as células espermáticas é responsável pela
maturação destas células e o epitélio epididimário deve prover os biocatalíticos ou íons
necessários a este processo (AMANN et al., 1993). As mudanças ocorridas na maturação
durante o trânsito epididimário podem, possivelmente ser devido às alterações bioquímicas e
biofísicas que ocorrem durante este período (AMANN et al., 1993).
Ao longo do epidídimo, os espermatozóides sofrem mudanças quanto à motilidade
(JINDAL & PANDA, 1980; MÜLLER et al., 1997), composição da membrana plasmática,
mitocôndrias, componentes fibrosos e microtubulares da peça intermediária (POULOS et al.,
1974; ATREJA & ANAND, 1985; AMANN et al., 1993), morfologia (JINDAL & PANDA,
1980; MÜLLER et al., 1997), modificação do complexo DNA proteína do núcleo (AMANN
et al., 1993) e modificações das características superficiais (receptores) da membrana
plasmática do espermatozóide (HAMAMAH, 1983; AMANN et al., 1993).
3.2. Alterações na motilidade espermática
Em um estudo sobre a maturação do espermatozóide caprino durante o trânsito
através do epidídimo, JINDAL & PANDA (1980) demonstraram que os espermatozóides da
região da cabeça do epidídimo apresentavam um leve movimento de flagelo; no corpo, o
10
movimento era circular e na cauda apresentavam um movimento progressivo. Assim,
mudanças significativas na motilidade progressiva ocorreram entre o corpo e a cauda do
epidídimo.
Cerca de 1% dos espermatozóides da reti testis de carneiros são dotados de
movimento vibratório, esta proporção aumenta no corpo (5%), na cauda do epidídimo (70-
80%) e mantém-se no ejaculado (70-80%) (HAMAMAH,1983). Estes resultados são
similares aos de MÜLLER et al. (1997), que observaram 80% de células móveis no ejaculado
normal de carneiro.
MÜLLER et al. (1997) e JAISWAL & MAJUMDER (1998) demonstraram que na
região da cabeça epididimária os espermatozóides estão praticamente imóveis e na cauda
apresentam um lento movimento progressivo. Do ponto de vista bioquímico, um aspecto
muito intrigante do desenvolvimento da motilidade do espermatozóide é o mecanismo
específico por meio do qual a "proteína de motilidade progressiva" (FMP), sintetizada no
epidídimo, converte a agitação dos espermatozóides imaturos da cabeça do epidídimo em
movimento progressivo coordenado (ACOTT & HOSKINS, 1981). Os mesmos autores
concluíram que a FMP age como um iniciador para ativar os espermatozóides da cabeça a
apresentarem a motilidade progressiva. Estudos posteriores demonstraram que a FMP do
plasma epididimário e o íon bicarbonato têm se mostrado ativos para iniciar a motilidade dos
espermatozóides (JAISWAL & MAJUMDER, 1998).
ACOTT & HOSKINS (1981) sugeriram que o movimento progressivo dos
espermatozóides da cauda do epidídimo independe da FMP, apesar disso, estudos
demonstram que o fluido epididimário é rico em FMP (BAVISTER et al., 1978). Entretanto,
as bases bioquímicas de ação da FMP não são conhecidas (JAISWAL & MAJUMDER,
1998).
Estudos sobre a maturação espermática no epidídimo demonstraram haver
correlação entre a motilidade e a estação do ano, ou seja, a percentagem de células com
movimento progressivo no corpo do epidídimo foi significativamente mais baixa na
primavera do que no outono, demonstrando assim a influência do fotoperíodo (FOURNIER-
DELPECH et al. 1979).
11
3.3. Alterações na composição da membrana plasmática dos espermatozóides
POULOS et al. (1974) compararam a composição de fosfolipídeos dos
espermatozóides testiculares e do ejaculado, demonstrando que os espermatozóides
testiculares possuem duas vezes mais fosfolipídeos presentes na membrana plasmática que os
espermatozóides ejaculados.
Alguns estudos demonstraram que a quantidade de fosfolipídeos diminui
significativamente no espermatozóide durante o trânsito epididimário, observando-se assim,
uma menor quantidade de fosfolipídeos nos espermatozóides obtidos na cauda (ATREJA &
ANAND, 1985).
Estudos recentes afirmaram que os fosfolipídeos movem-se entre os folhetos
externo e interno da bicamada da membrana plasmática. Os mesmos autores demonstraram
que a atividade da enzima aminofosfolipídeo translocase e a distribuição assimétrica
fosfolipídica na bicamada são propriedades fundamentais da membrana plasmática dos
espermatozóides do epidídimo e do ejaculado do carneiro (MÜLLER et al., 1997).
POULOS et al. (1974) concluíram em seu trabalho que a maior alteração no
conteúdo e composição dos fosfolipídeos deve-se a três funções: (i) os ácidos graxos ligados
aos fosfolipídeos devem promover a maturação espermática, servindo como uma fonte de
nutrientes em um ambiente relativamente livre de açúcar; (ii) as maiores alterações na
composição de ácidos graxos antes da ejaculação pode conferir propriedades à membrana
espermática que são importantes à sobrevivência no trato reprodutivo feminino; (iii) e
finalmente, a perda de quantidade relativamente importante de ácido araquidônico, um
precursor das prostaglandinas, sugere um possível papel na maturação dos espermatozóides
de ovinos.
O fluido da cauda do epidídimo é capaz de inibir in vitro a reação acrossômica dos
espermatozóides (BAVISTER et al., 1978). A prevenção de mudanças acrossomais dos
espermatozóides no trato reprodutivo masculino são importantes para a preservação da
habilidade fertilizante dos mesmos, pois é necessário que o espermatozóide fertilizante
retenha intacto o acrossoma até que eles estejam em íntima proximidade com a massa celular
12
do cumulus oócito (BAVISTER et al., 1978). Assim, os resultados obtidos naquele estudo
indicaram que os componentes bioquímicos distintos do fluido da cauda do epidídimo são
particularmente responsáveis pela inibição da reação acrossômica, para que a mesma ocorra
em momento oportuno (BAVISTER et al., 1978).
Segundo HUNTER et al. (1978), o fluído da cauda do epidídimo contém um
constituinte ainda não identificado que retarda a capacitação espermática.
3.4. Alterações nas características superficiais da membrana plasmática dos
espermatozóides
As propriedades superficiais da membrana plasmática dos espermatozóides
respondem diferentemente ao fluido epididimário, dependendo da espécie animal (DOTT et
al., 1979). As alterações observadas sobre a superfície dos espermatozóides são necessárias
para prolongar a sobrevivência dos mesmos dentro do trato reprodutivo da fêmea, bem como
para expor ou formar sítios de ligação para investimentos do oócito (AMANN et al., 1993).
Ao mesmo tempo ocorrem modificações das membranas acrossômicas e plasmática para
estabilizar as estruturas que isolam o conteúdo acrossômico até o contato com a zona pelúcida
induzir a fusão das membranas (KVIST, 1980; AMANN et al., 1993). Em ovinos, a passagem
dos espermatozóides no epidídimo está associada a modificações na membrana plasmática,
sendo um dos eventos importantes no processo de maturação dos espermatozóides
(HAMAMAH, 1983).
Durante o trânsito epididimário os espermatozóides desenvolvem sítios de ligação
na membrana para a fixação com o oócito, pois o epidídimo assegura a diferenciação de
propriedades da superfície da cabeça do espermatozóide, conferindo-lhe a faculdade de se
fixar in vitro sobre a zona pelúcida do oócito (HAMAMAH, 1983). Esta diferenciação
membranária dos gametas realiza-se sob a influência de uma atividade epididimária regular
do meio (animal não castrado), em parte por via humoral pelos andrógenos de origem
testicular (HAMAMAH, 1983).
A fixação dos espermatozóides à zona pelúcida realiza-se pela membrana
plasmática que cobre a região mais anterior do acrossoma. A capacidade de adesão à zona
13
pelúcida é mais fraca nos espermatozóides testiculares; esta capacidade aumenta na cabeça
proximal do epidídimo onde 12% dos oócitos fixam-se e atingem 100% no corpo médio do
órgão (HAMAMAH, 1983).
Durante a maturação epididimária a perda de proteínas carregadas positivamente
ou de seus fragmentos catiônicos pode mudar a conformação e função dessas proteínas
membranárias (SUNDHEY et al., 1995). Os estudos indicam que nos caprinos as proteínas de
membrana tornam-se carregadas negativamente durante a maturação epididimária
(SUNDHEY et al., 1995). Também sugerem que as membranas espermáticas da cauda do
epidídimo diferem daquelas das células testiculares por haver proteínas lipofílicas de 35-170
kDa e proteínas iônicas de 70-130 kDa (SUNDHEY et al., 1995). Estas proteínas podem estar
envolvidas na maturação do espermatozóide e na fusão deste com a membrana do oócito
durante a fertilização (SUNDHEY et al., 1995).
3.5. Alterações da morfologia espermática
Um estudo morfológico dos espermatozóides de duas regiões diferentes do
epidídimo demonstrou que 53% das células da região da cabeça tinham gota citoplasmática
proximal como sinal de imaturidade, enquanto que somente 36% das células da cauda
apresentavam este problema. Em ambos os casos, o número de cabeças isoladas estava abaixo
de 6% (MÜLLER et al., 1997). Segundo JINDAL & PANDA (1980), em caprinos, na região
da cabeça epididimária, cerca de 65,47% dos espermatozóides apresentavam gotas
citoplasmáticas proximais e na cauda 11,20% apresentaram a mesma anomalia. Os mesmos
autores também observaram um aumento gradual na percentagem de espermatozóides com
gotas citoplasmáticas desprendidas, quando os espermatozóides moveram-se da cabeça para a
cauda do epidídimo.
A gota citoplasmática localiza-se próxima ao colo do espermatozóide quando os
mesmos deixam os testículos, e à medida que atravessam o epidídimo, a gota encontra-se,
muitas vezes, na peça intermediária (WHITE, 1973). JINDAL & PANDA (1980) relataram
que as gotas citoplasmáticas movem-se caudalmente ao longo dos espermatozóides à medida
que se deslocam pelo epidídimo, podendo constituir-se um impedimento ao movimento
flagelar normal.
14
No sêmen, muitas gotas destacam-se completamente do espermatozóide, entretanto, o
mecanismo envolvido ainda é desconhecido (WHITE, 1973), e normalmente, poucas células
apresentam gota citoplasmática no ejaculado normal (MÜLLER et al., 1997).
Durante o trânsito epididimário foi observado que o comprimento da cabeça dos
espermatozóides caprinos aumentou (JINDAL & PANDA, 1980). Tal fato pode ser atribuído
à formação de pontes de sulfeto que estabilizam a cromatina nuclear durante a passagem pelo
epidídimo (KVIST, 1980).
Em pequenos ruminantes há uma maior proporção de células com anormalidade
morfológica na cauda do epidídimo do que no ejaculado (JINDAL & PANDA, 1980;
HAMAMAH, 1983; MÜLLER et al., 1997). Entretanto, em gatos domésticos há uma alta
proporção de espermatozóides com anormalidade de flagelo no ejaculado, quando
comparados aos espermatozóides obtidos na cauda do epidídimo; tal característica pode ser
atribuída à influência da pressão osmótica quando os espermatozóides são misturados com o
fluido seminal durante a ejaculação (AXNÉR et al., 1998).
4. PRINCIPAIS CONSTITUINTES DO PLASMA SEMINAL E SUA AÇÃO SOBRE
OS ESPERMATOZÓIDES DURANTE A EJACULAÇÃO
Por várias razões, a bioquímica do plasma seminal dos mamíferos tem recebido
considerável atenção, seja pela sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial do
espermatozóide ou pelo fato de que alguns constituintes seminais tenham suas origens em
órgãos específicos, cujas concentrações são importantes para avaliar a capacidade secretora de
várias glândulas sexuais anexas, as quais dependem da produção de andrógenos pelos
testículos para desempenhar suas funções (MANN, 1974).
Há muito tempo que o sêmen tem sido objeto de intensas investigações
bioquímicas, mas apesar dos consideráveis avanços, os conhecimentos sobre a função do
plasma seminal ainda são obscuros. As modificações que ocorrem após o tratamento in vitro
ocasionam variações do metabolismo e/ou sobrevivência dos espermatozóides. Além disso, a
inexistência de mecanismos de eliminação das células espermáticas mortas submete os
15
gametas vivos a uma convivência com os produtos de sua decomposição (CORTEEL, 1980).
SKANDHAN (1981) reconheceu que as alterações de muitos dos componentes do plasma
seminal são responsáveis pela incapacidade de fecundação do gameta.
O plasma seminal contém uma variedade de constituintes bioquímicos, alguns dos
quais são relativamente específicos dentro do mecanismo de regulação da função do
espermatozóide, entretanto as exatas funções destes componentes seminais no controle da
motilidade espermática, ainda não estão bem elucidadas (STREZEZEK et al., 1992). O
contato com o fluido seminal desencadeia eventos preparatórios nos espermatozóides para a
fertilização (MÜLLER et al.,1997), pois os constituintes do plasma seminal são conhecidos
por modular uma variedade de funções espermáticas (CALVETE et al., 1994).
Alguns estudos demonstram haver diferenças na qualidade do ejaculado de
pequenos ruminantes entre as estações do ano em clima temperado (EATON & SIMMONS,
1952; COLAS, 1980; NUNES, 1982; COLAS, 1983; ROCA et al., 1992; TULI & HOLTZ,
1995), e muitos deles atribuíram tais diferenças ao fotoperíodo. Em ovinos, a freqüência de
coleta pode influenciar a composição iônica e a atividade enzimática no plasma seminal, bem
como, os parâmetros espermáticos e produção diária de espermatozóides (KAYA et al.,
2002).
Relatos em várias espécies sugerem que o plasma seminal contenha fatores que
influenciam a fertilidade do macho (AURICH et al.,1996). Estes estudos são geralmente
baseados na comparação do plasma seminal entre machos com fertilidade diferente (AURICH
et al.,1996) ou sobre o isolamento de fatores do plasma seminal que facilitam ou inibem a
capacitação espermática e a fertilização (OLLERO et al., 1997). AURICH et al. (1996)
demonstraram que a adição de plasma seminal de diferentes garanhões afetou a resistência de
espermatozóides em suportar a congelação e descongelação. HENAULT et al. (1995)
demonstraram que a adição de plasma seminal aos espermatozóides da cauda do epidídimo de
touros aumentou a fertilidade, quando comparado à fertilidade dos espermatozóides
epididimários sem a adição do plasma seminal.
Estudos previamente realizados demonstraram haver diferenças entre as
membranas espermáticas dos espermatozóides epididimários e do ejaculado, devido à
16
influência do plasma seminal (HENAULT et al., 1995). Estas observações sugerem que
alguns fatores presentes nas secreções das glândulas anexas aumentam a fertilidade de touros
de alta fertilidade ou alguns fatores que inibem a fertilidade estão presentes em animais de
baixa fertilidade (HENAULT et al., 1995). Nesse sentido, as secreções das glândulas anexas
dos touros e eqüinos são fatores determinantes para a fertilidade do macho (HENAULT et
al.,1995; AURICH et al.,1996).
DOTT et al. (1979) demonstraram que a incubação de espermatozóide em altas
taxas de diluição prejudica a motilidade, pois parece possível que haja algum fator essencial
associado à célula para o desempenho da função espermática e que a proximidade das células
é necessária para a provisão de níveis adequados deste fator. Tem sido sugerido que a
presença do plasma seminal de caprinos no meio de conservação interfere no comportamento
dos espermatozóides em suportar a congelação (CORTEEL, 1974).
Talvez a principal razão desse impasse seja devido à grande diversidade do plasma
entre as espécies, ocorrência e concentração de muitos constituintes seminais importantes
(RODGER, 1975). Alguns estudos demonstraram haver ampla variação nos níveis
bioquímicos de muitos constituintes do plasma seminal entre bovinos e bubalinos (DHAMI &
SAHNI, 1993). Esta variação pode ser responsável pelas notáveis diferenças na qualidade,
congelabilidade e fertilidade do sêmen nestas espécies (DHAMI & SAHNI, 1993). Esta
diversidade não é somente encontrada entre as espécies de mamíferos, mas também entre as
raças de uma mesma espécie, como observada em caprinos (EATON & SIMMONS, 1952;
PINHEIRO et al., 1996a). O problema é agravado pela falta de informação e
desconhecimento da fisiologia do espermatozóide in vivo. Estas limitações têm resultado em
contínua identificação de constituintes bioquímicos seminais e especulações sobre o papel de
cada novo constituinte (RODGER, 1975).
4.1. Principais eletrólitos do plasma seminal e sua importância sobre o metabolismo
espermático
Diversos eletrólitos estão presentes no plasma seminal, dentre os mais importantes
foram encontrados Na+, K+, Mg++ (GONZALES et al., 1984; PINHEIRO et al., 1996a); Cl-,
17
fosfatos (DHAMI & SAHNI, 1993) e Zn++ (KVIST, 1980). Os níveis de cloreto no sêmen
influenciam o potencial de membrana do espermatozóide e a motilidade em associação com
cátions. Os íons Cl-, Na+ e K+ estão diretamente relacionados com a manutenção da
excitabilidade dos espermatozóides, pH ótimo do sêmen e pressão osmótica constante dentro
e fora das células espermáticas (DHAMI & SAHNI, 1993). Em ovinos, a concentração de
íons Na+, Cl- e PO--4 no plasma seminal excedem àquelas do espermatozóide, enquanto a de
potássio, cálcio e magnésio são maiores no espermatozóide (ABDEL-RAHMAN et al., 2000).
Níveis mais altos de K+ e Ca++ no espermatozóide causam redução na atividade
espermática em ovinos nativos e Merinos. Os dados também sugerem uma relação recíproca
entre o conteúdo intracelular de K+, Ca++ e PO4-- com relação à percentagem de
espermatozóides vivos, onde uma percentagem mais alta de células vivas foram associadas
com altos níveis de K+ e Ca++ e baixa de PO4-- (ABDEL-RAHMAN et al., 2000).
Neste sentido, estudos demonstraram que algumas enzimas têm correlação direta
com o Na+ e K+, como por exemplo, a fosfatase ácida, indicando que a mesma tem importante
papel na atividade eletrolítica do sêmen (DHAMI & KODAGALI, 1987). A elevada
quantidade de íons PO--4 no plasma seminal revela a atividade da fosfatase alcalina em liberar
íons a partir dos processos metabólicos dos espermatozóides (DHAMI & SAHNI, 1993).
PINHEIRO et al. (1996b) constataram que os níveis de Ca++, PO--4 e Mg++ no
plasma seminal do macho caprino podem variar conforme a época do ano (seca ou chuvosa) e
a raça, sugerindo que a disponibilidade e qualidade do alimento entre os períodos chuvoso e
seco, provavelmente influenciam o equilíbrio eletrolítico do sêmen desta espécie. KAYA et
al. (2000) observaram que o aumento na freqüência de coleta de sêmen em ovinos provocou
um aumento significativo na concentração de Na+ e K+ no plasma seminal, todavia os níveis
de Ca++ e Mg++ reduziram marcadamente. No mesmo estudo, observou-se uma redução
progressiva da motilidade das células espermáticas no ejaculado e foi associado com as
concentrações de Na+ e K+.
O zinco é encontrado no próprio espermatozóide e no fluido seminal, onde sua
concentração é consideravelmente maior do que em qualquer outro fluido corporal. No
plasma seminal sua origem principal é a próstata (MANN & LUTWAK-MANN, 1981).
18
KVIST (1980) demonstrou que a presença do Zn++ no plasma seminal previne a
descondensação prematura da cromatina nuclear, preservando as células espermáticas para o
estágio apropriado da transferência nuclear do genoma do macho, ou seja, o Zn++ espermático
bloqueia a habilidade de descondensação da cromatina nuclear (NCD) do espermatozóide
ejaculado, até este cátion ser removido, em estágios posteriores à transferência do genoma
masculino.
KVIST (1980) sugere que o espermatozóide tem um mecanismo intrínseco para
NCD, o qual é preservado pela inibição temporária do Zn++, podendo ser reativada pela sua
remoção dentro do trato reprodutivo da fêmea. Este estudo também sugere que há uma
correlação direta entre o nível de zinco no fluido seminal e a motilidade do espermatozóide,
ressaltando que pequenas quantidades destes elementos são essenciais para a manutenção da
motilidade espermática. Uma fraca correlação positiva foi encontrada entre a percentagem de
espermatozóides com movimento circular ou movimento progressivo não linear e a
concentração de zinco (HENKEL et al., 1999). Portanto, a motilidade espermática é
significativamente influenciada pelo Zn, pois o Zn flagelar está localizado principalmente nas
fibras densas internas e estes elementos estruturais são quimicamente modificados durante a
maturação espermática epididimária (eliminação do Zn), pois um baixo conteúdo de Zn nas
fibras densas internas após o trânsito epididimário é requerido para realizar o enrijecimento
das mesmas (HENKEL et al., 1999). O enrijecimento das fibras pela formação de pontes
dissulfeto durante a maturação espermática no epidídimo parece ser uma etapa fisiológica
essencial para a geração da motilidade, especialmente a motilidade progressiva (HENKEL et
al., 1999).
A distribuição da maioria dos íons entre a fração espermática e o plasma seminal
poderá promover as bases para a variação da qualidade do sêmen e deverá ser considerada na
interpretação dos resultados obtidos na avaliação da fertilidade de ovinos (ABDEL-
RAHMAN et al., 2000).
4.2. Proteínas e enzimas do plasma seminal e sua ação sobre os espermatozóides
FRAZER & BUCCI (1996) afirmaram que o plasma seminal é composto de
açúcares, lipídios e minerais, bem como de um elevado teor de proteínas especiais, incluindo
19
enzimas, hormônios, fatores de crescimento, inibidores, imunossupressores, substâncias
ligadas a andrógenos, inibina e imunoglobulinas, onde a presença ou ausência de muitos
destes componentes pode estar envolvida com a fertilidade.
Estudos demonstraram que alguns componentes do plasma seminal são adsorvidos
sobre a superfície das células espermáticas durante a ejaculação, tais como as proteínas
(CALVETE et al., 1994; OLLERO et al., 1997), pois diversas proteínas estão presentes no
plasma seminal, cuja proporção pode variar entre os indivíduos de uma mesma espécie
(FRAZER & BUCCI, 1996).
Assim também, diferentes variedades de proteínas medeiam a ligação com a
heparina e a superfície espermática em diferentes espécies animais. A possibilidade de que a
maioria das proteínas heparina-ligantes do plasma seminal possa agir como fatores de
capacitação espécie-específico merecem maiores estudos (CALVETE et al., 1994).
Em eqüinos, o aumento da concentração de proteínas no sêmen pouco concentrado
diminui a congelabilidade do mesmo (BITTMAN & KOSINIAK 1992). Em touros, a
estimação dos níveis de lactato desidrogenase (LDH), aspartato aminotransferase (AAT),
fosfatase alcalina, fosfatase ácida e outras enzimas podem ser usadas para avaliar a qualidade,
descongelabilidade e fertilidade do sêmen, podendo assim ajudar na seleção de touros para
uso em inseminação artificial (DHAMI & KODAGALI, 1987). Em ovinos, uma intensa
atividade de coleta de sêmen resulta em um aumento na atividade de AAT e piruvato-
glutâmico transferase (GPT) no plasma seminal. Em contraste com a LDH que teve atividade
reduzida (KAYA et al., 2002).
Uma atividade elevada de AAT e GTP mensuradas no plasma seminal é indicativo
de dano ou de função alterada na membrana, que ocorre devido, provavelmente, a maturação
inadequada no epidídimo, como conseqüência do aumento da freqüência de coleta (KAYA et
al., 2002). Já a redução da atividade da LDH pode resultar da síntese reduzida no tecido
testicular e pode indicar distúrbios da função do parênquima testicular, bem como mudanças
no metabolismo espermático (KAYA et al., 2002).
20
As proteínas do plasma seminal exercem múltiplos efeitos sobre a função
espermática e desempenham um importante papel na capacitação dos espermatozóides,
traduzido por um complexo processo que habilita a célula espermática a penetrar, através da
zona pelúcida, por meio da reação acrossômica (CALVETE et al., 1994).
BITTMAN & KOSINIAK (1992) descreveram que a habilidade fertilizante do
espermatozóide seria, em grande parte, determinada pelas proteínas espermáticas localizadas
no acrossoma e peça intermediária, conhecidas como fonte de enzimas metabólicas
especialmente ativas, cujas liberações em grandes quantidades podem indicar danos na
membrana plasmática do espermatozóide.
Alguns aminoácidos presentes no plasma seminal de ovinos, tais como a taurina e
hipotaurina, parecem ter efeito positivo sobre a fertilidade. É possível que o melhoramento
observado nas características de motilidade de espermatozóides ovinos congelados na
presença da taurina possa ser devido a outros fatores que não sejam suas propriedades
antioxidantes (SÁNCHEZ-PARTIDA et al., 1997).
4.3. Frutose e ácido cítrico no plasma seminal
IBARRA & NAVARIDAS (1992) sugerem que a frutose seminal comporta-se como
um marcador das funções das vesículas seminais, sendo necessária à sobrevivência e à
motilidade inicial da célula espermática e que o ácido cítrico reflete a atividade secretora da
próstata, mesmo que sua função ainda não esteja bem conhecida. Todavia, acredita-se que o
ácido cítrico se comporte como um ativador da fosfatase ácida, sendo importante para a
manutenção do equilíbrio osmótico, juntamente com o potássio e o sódio, favorecendo desse
modo a atividade espermática.
O ácido cítrico é um dos principais constituintes do plasma seminal e apresenta
relação com os níveis de testosterona plasmática, ocorrendo em altas concentrações na
maioria das espécies de mamíferos, por constituir-se em um agente regulador necessário em
muitos sistemas bioquímicos, tendo portanto, elevada importância para o metabolismo e
motilidade espermática (POLAKOSKI & KOPTA, 1982).
21
A formação de frutose na vesícula seminal depende essencialmente de duas vias
metabólicas: uma que deriva da glicose sangüínea e outra que é conseqüência do metabolismo
do sorbitol (MANN, 1974). Esta se constitui num componente seminal importante para o
metabolismo do espermatozóide e seu nível reflete na qualidade espermática, na atividade
metabólica e na função normal secretora da glândula vesicular (DHAMI & SAHNI, 1993).
SINGH & PENBEY (1995), avaliando a correlação existente entre os níveis de
testosterona plasmática com a quantidade de alguns constituintes bioquímicos do plasma
seminal, observaram que altas concentrações do andrógeno, não somente conduziam a uma
melhor demonstração da libido, como também, eram responsáveis pela elevação dos níveis de
frutose e ácido cítrico no sêmen de caprinos. HIROE et al. (1960) afirmaram que a condição
de armazenamento do plasma seminal, a freqüência de ejaculações, o nível de glicose no
sangue e a condição nutricional podem interferir fortemente na produção e metabolismo da
frutose.
ROCA et al. (1993), observando o efeito da variação estacional sobre os níveis de
frutose e ácido cítrico no plasma seminal de caprinos da raça Murciana-Granadina, na
Espanha, constataram uma variação sazonal em ambos componentes do plasma seminal. Os
níveis de frutose e ácido cítrico foram mais altos no verão e outono (dias curtos) e mais baixo
na primavera (dias longos). O inverno foi considerado um período transicional.
PINHEIRO et al. (1996a), com o objetivo de determinar os parâmetros
bioquímicos normais no plasma seminal de caprinos criados no Nordeste do Brasil, em
machos das raças Alpina, Moxotó e mestiços Alpina-Moxotó, observaram que os valores
encontrados para frutose, ácido cítrico e proteína total foram inferiores na época seca.
Entretanto, em ambas as épocas, o tipo racial Moxotó mostrou valores sempre mais elevados,
correlacionando os níveis de frutose e ácido cítrico com a maior disponibilidade de alimento
ocorrida durante a época chuvosa.
5. AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DO SÊMEN
O método ideal para avaliar a fertilidade do reprodutor, além de sua habilidade de
produzir a gestação, é pelo exame do sêmen (HAFEZ, 1995). A avaliação da qualidade
22
espermática geralmente está ligada ao desejo de predizer a fertilidade dos reprodutores para
servirem nos rebanhos ou para serem utilizados em programas de reprodução programada
(MANUAL PARA EXAME ANDROLÓGICO E AVALIAÇÃO DE SÊMEN ANIMAL,
1998).
Por quase um século ou mais, clínicos e pesquisadores têm lutado para desenvolver
técnicas para predizer acuradamente a fertilidade das amostras seminais de um indivíduo
(AMANN & HAMMERSTEDT, 1993). DEN DAAS (1992) e HAFEZ (1995) citam que as
características do sêmen relacionadas à qualidade da população espermática presente na dose
inseminante são motilidade (teste de termorresistência), integridade da membrana, integridade
acrossômica, atividade de certas enzimas, concentração, volume e aspecto do sêmen,
movimento em massa (turbilhonamento), morfologia espermática, habilidade de ligar-se à
zona pelúcida do oócito e capacidade para fecundação in vitro. Nenhum teste único foi
desenvolvido para predizer acuradamente a fertilidade de um ejaculado individualmente, mas
quando vários testes são combinados cuidadosamente, os ejaculados podem ser selecionados
para utilização com potencial de apresentar a mais alta fertilidade (HAFEZ, 1995).
As características do sêmen são avaliadas não somente para predição da fertilidade
do touro ou do suíno, mas também para avaliar o modo de processamento do ejaculado no
laboratório (DEN DAAS, 1992). Um método confiante de mensuração do volume e
concentração do ejaculado é tão importante quanto às características da qualidade do sêmen,
especialmente para a preparação das doses inseminantes (DEN DAAS, 1992). Em ovinos,
uma redução no volume de sêmen, após submissão a um regime de coleta freqüente, indica
uma redução da função secretora das glândulas anexas (KAYA et al., 2002).
5.1. Teste de Termorresistência: Motilidade
A motilidade é rotineiramente avaliada pela estimação visual da percentagem de
células móveis, porém é um julgamento subjetivo (EATON & SIMMONS, 1952; DEN
DAAS, 1992).
Segundo CORTEEL (1981), a percentagem de espermatozóides móveis (PEM) e a
motilidade individual progressiva (MIP) são os parâmetros mais comumente utilizados para
23
mensurar a qualidade do sêmen. A MIP refere-se ao vigor ou intensidade de movimentação
linear dos espermatozóides, que é avaliada num escore de 0 – 5, onde zero corresponde à
ausência de espermatozóides móveis e cinco à máxima movimentação progressiva
(CORTEEL, 1974; 1981).
Os espermatozóides precisam de várias horas após a ejaculação ou inseminação
artificial para atingirem o local de fecundação na fêmea (HAFEZ, 1995). Seu poder
fecundante está conseqüentemente, em parte ligado à sua sobrevivência no trato genital da
fêmea (MIES FILHO, 1987). Esta observação tem levado a utilização de testes de
termorresistência à mesma temperatura corpórea da fêmea, in vitro para apreciar a
sobrevivência espermática. As condições de incubação variam com a espécie e com o tipo de
sêmen a testar (fresco ou congelado), mas em caprinos e ovinos, o sêmen é geralmente diluído
em concentração compreendida entre 80 e 300 x 106 sptz/ml, e colocado em banho-maria à 37
– 38oC (MANUAL PARA EXAME ANDROLÓGICO E AVALIAÇÃO DE SÊMEN
ANIMAL, 1998). A percentagem de células móveis e motilidade podem ser calculadas ao
início do teste e 2 – 3 horas após a incubação (BARIL et al., 1993).
Ao sêmen pós-descongelado, têm sido adicionadas algumas metilxantinas, como a
cafeína e a teofilina, que tendem a aumentar a motilidade dos espermatozóides de modo
significativo, mas não aumentam a percentagem de espermatozóides móveis e nem a
anormalidade acrossômica (SINHA et al., 1995). Neste experimento, foi encontrada uma
correlação significativa entre a motilidade após a adição das metilxantinas e a fertilidade
(SINHA et al., 1995).
À medida que a duração de incubação a 37oC prossegue, há o acúmulo de ácido
láctico e o valor de pH tende a diminuir, acidificando o meio. Levando assim, a um declínio
gradual na atividade metabólica. Neste estudo, o tipo de diluidor não pareceu afetar
significativamente o acúmulo de ácido láctico, e sim o tempo de conservação. Estas mudanças
no acúmulo de ácido láctico podem ser atribuídas à presença de flora microbiana no meio
diluidor (SINGH et al., 1982). O problema de contaminação e crescimento bacteriano do
material espermático durante o armazenamento do sêmen resfriado, e particularmente, quando
conservado a 10 –15oC foi amenizado após a descoberta e aplicação de antibióticos
(MAXWELL & SALAMON, 1993).
24
5.2. Atividade de certas enzimas
Alguns pesquisadores têm procurado métodos alternativos que apresentem
melhores correlações com a fertilidade que a motilidade. Dentre esses métodos tem surgido o
estudo do extravazamento enzimático de algumas enzimas metabólicas para o meio diluente
do sêmen congelado. Destas enzimas, encontram-se a lactato desidrogenase, a aspartato
aminotransferase, a fosfatase alcalina entre outras. Entretanto, na espécie ovina, até o
momento, os estudos não demonstraram resultados satisfatórios, não possibilitando assim o
uso desta técnica como único indicador da qualidade do sêmen, pois faltam respaldos
científicos que confirmem sua utilização como método alternativo mais eficaz que a análise
da motilidade espermática (PANGAWKAR et al., 1988; BORQUE & AYLLÓN, 1996;
UPRETI et al., 1996). Em algumas espécies como a suína, o nível de acrosina no meio
diluidor, após a descongelação do sêmen tem sido apontada como indicador da qualidade
espermática (GLOGOWSKI et al., 1998).
Há também um método recentemente desenvolvido denominado Computer-
Assisted Spermatozoa Motility Analysis (CASA) que analisa alguns parâmetros de
motilidade: velocidade curvilinear, velocidade média, velocidade linear, linearidade,
amplitude do movimento lateral da cabeça e número de espermatozóides móveis (BAILEY et
al., 1994). Todavia, os mesmos pesquisadores encontraram uma baixa correlação entre a
fertilidade e o CASA. Em caprinos a motilidade parece ser uma característica amplamente
individual, podendo ser afetada pela saúde ou condição do indivíduo no momento da coleta,
bem como pela técnica utilizada na coleta do sêmen (EATON & SIMMONS, 1952).
5.3. Concentração, volume, aparência e movimento em massa
O sêmen deve possuir uma aparência cremosa ou leitosa, com cor amarelada
(marfim), ou esbranquiçada nas espécies caprina e ovina (MANUAL PARA EXAME
ANDROLÓGICO E AVALIAÇÃO DE SÊMEN ANIMAL, 1998), que são indicativos de alta
concentração espermática. Geralmente, animais jovens e aqueles de menor tamanho dentro de
uma espécie produzem menores valores de sêmen (HAFEZ, 1995). Normalmente, o volume
do ejaculado varia de acordo com a espécie animal considerada e, dentro de uma mesma
25
espécie, a variação é muito ampla, correndo por conta do indivíduo, da raça, do número de
ejaculações sucessivas, a alimentação etc (MIES FILHO, 1987). Freqüentes ejaculações
resultam em menor volume, e quando dois ejaculados são obtidos consecutivamente, o
segundo usualmente apresenta menor volume (HAFEZ, 1995; KAYA et al., 2002). Volumes
pequenos não são prejudiciais, porém são acompanhados por baixa concentração espermática,
e o número de espermatozóides disponíveis é limitado (HAFEZ, 1995). Em caprinos, o
volume do ejaculado varia de 0,2 a 2,0 mL (MIES FILHO, 1987).
Uma determinação acurada do número de espermatozóides por mililitro de sêmen
26
5.4. Morfologia espermática
O sêmen da maioria dos machos apresenta alguns espermatozóides anormalmente
formados (HAFEZ, 1995). Nesse aspecto, a morfologia espermática tem sido identificada
como uma das características que podem ser usadas na predição da fertilidade espermática,
(BUENDÍA et al., 2002), assim a avaliação da qualidade do sêmen tem que considerar que a
competência funcional é determinada por vários fatores. A avaliação do estado morfológico e
motilidade do espermatozóide é indicação crucial de sua capacidade fertilizante (BLOTTNER
et al., 2001). A morfologia espermática, especialmente da cabeça, tem recebido considerável
atenção em relação à habilidade do espermatozóide em alcançar uma fertilidade normal
(AZIZ et al., 1998). Em caprinos o índice de anormalidade máxima permitida que não
interfira na fertilidade é 15% (MANUAL PARA EXAME ANDROLÓGICO E
AVALIAÇÃO DE SÊMEN ANIMAL, 1998).
As alterações morfológicas do espermatozóide podem atingir as diversas partes
constituintes como por exemplo, o acrossomo, núcleo, colo, peça intermediária, flagelo, e em
alguns casos, tomar duas ou mais partes da célula simultaneamente (MIES FILHO, 1987).
Estas alterações morfológica dos espermatozóides podem ser primárias, secundárias ou
terciárias (HAFEZ, 1995). As anormalidades primárias são devido à falha da
espermatogênese, enquanto que as secundárias ocorrem durante a passagem pelos epidídimos,
àquelas que ocorrem durante ou após a ejaculação são designadas anormalidades terciárias
(HAFEZ, 1995). COLAS (1980) classifica as anormalidades em: cabeças anormais
(microcefalia, cabeça piriforme, acrossoma danificado), cabeça sem flagelo, gota
citoplasmática proximal, gota citoplasmática distal, e anormalidade de flagelo (flagelo curvo,
quebrado, peça principal enrolada até antes da peça intermediária ou enrolada sobre a
intermediária). E quando um mesmo espermatozóide apresenta duas anormalidades, somente
a anormalidade mais grave é reconhecida (COLAS, 1980).
5.5. Teste de habilidade de fertilização dos espermatozóides
Os procedimentos-padrão para a análise de sêmen (concentração, morfologia e
motilidade espermática) são indicadores relativamente pobres da capacidade fertilizante dos
espermatozóides (HAFEZ, 1995). O método mais comumente utilizado é o teste do Hamster,
onde a avaliação da fertilidade espermática é baseada na penetrabilidade do espermatozóide
27
dentro da zona pelúcida do óvulo de hamster (HAFEZ, 1995). Outro teste descrito é a
inchação hipo-osmótica (HOS), baseado na avaliação da integridade funcional das membranas
espermáticas (CURRY & WATSON, 1994; HAFEZ, 1995). A manutenção da integridade da
membrana é importante devido à incapacidade dos espermatozóides em assegurar ou restaurar
a membrana celular quando ocorre dano na mesma. CURRY & WATSON (1994) sugerem
que diferenças na sensibilidade da membrana plasmática para o transporte de água entre as
espécies, e a existência de subpopulações sensíveis de espermatozóides de uma mesma
espécie, podem ser fator importante na determinação da crio-sobrevivência ótima do
espermatozóide. Rotineiramente, o uso do corante eosina ou um teste hipo-osmótico são
usados para avaliar a membrana espermática (DEN DAAS, 1992).
5.6. Integridade acrossômica:
O acrossoma é um lisossoma essencial para a função da célula espermática. A
reação acrossômica tem ocorrido no local de fertilização e é desencadeado pela condição local
ou ligação específica do espermatozóide à zona pelúcida (DEN DAAS, 1992). A reação
acrossômica está associada com múltiplos locais de fusão entre a membrana externa
acrossômica e a superfície da membrana plasmática, seguida por fenestrações da membrana e
formação de vesículas ligada à membrana sobre toda a superfície acrossômica (VARNER et
al., 1993). Após a reação acrossômica o conteúdo enzimático dos lisossomas é liberado (DEN
DAAS, 1992). A fertilização requer um número suficiente de espermatozóides
morfologicamente normais, motilidade espermática com a habilidade de reação acrossômica à
zona pelúcida e a cromatina intacta para o desenvolvimento do pro-núcleo após a penetração
do oócito (BLOTTNER et al., 2001).
A relação entre as características laboratoriais do sêmen e a fertilidade tem
freqüentemente demonstrado inconsistência. Uma das razões é que muitos estudos têm sido
desenvolvidos com um número definido de espermatozóides por inseminação (taxa de
diluição), pois a fertilidade é afetada pelo número de espermatozóides (DEN DAAS, 1992).
Tais alterações na taxa de diluição devem revelar uma diferente relação entre a característica
em questão e a fertilidade (DEN DAAS, 1992).
28
O sucesso em predizer a fertilidade é dificultado pelos aspectos (1) do
espermatozóide, (2) do processo de fertilização e (3) do acesso para avaliação in vitro da
qualidade espermática. A compreensão dos elementos “causa - problema” de cada aspecto é
necessária para a avaliação dos melhores procedimentos da análise espermática (AMANN &
HAMMERSTEDT, 1993).
(1) Para ter sucesso um espermatozóide necessita expressar ou suprimir
adequadamente, um número de atributos na seqüência temporal correta para alcançar a
fertilização. Alguns atributos são conhecidos como, por exemplo, morfologia aceitável,
metabolismo para a produção de energia, motilidade progressiva, capacidade para motilidade
hiperativada, membrana lipídica, proteínas de membrana e integridade das enzimas
acrossômicas, e outras que ainda permanecem desconhecidas (AMANN &
HAMMERSTEDT, 1993). Um ou mais atributos podem limitar a fertilidade de uma dada
célula, tais como o fator limitante dependente no espermatozóide, como os espermatozóides
são coletados e avaliados, e como os espermatozóides são utilizados (AMANN &
HAMMERSTEDT, 1993).
(2) Fertilização é um evento probabilístico relacionado com a presença de um
espermatozóide suficientemente fértil perto de um ovócito. Há duas probabilidades para a
capacidade fertilizante: i. que em cada espermatozóide, todos os atributos essenciais sejam
expressos no momento e local corretos; ii. que em cada população espermática total, deva
existir uma dada percentagem de células com potencial fertilizante completo (AMANN &
HAMMERSTEDT, 1993).
Um espermatozóide com atributos fertilizantes únicos que fecundem um ovócito e
seus aspectos probabilísticos, não refletem a população média de atributos. Os atributos
necessários para a fertilização dependem da metodologia adotada na fecundação in vitro, da
natureza do armazenamento e do local de deposição do sêmen na inseminação artificial, a
técnica de acasalamento empregada, como a monta natural, e de fatores próprios da fêmea. A
correta expressão de poucos atributos espermáticos é requerida na fecundação in vitro e a
inseminação artificial pode reduzir ou eliminar certas interações restritivas entre o ambiente
espermático e feminino (AMANN & HAMMERSTEDT, 1993). O uso preferencial de
espermatozóides da cauda do epidídimo que aqueles do ejaculado, espermatozóides
29
criopreservados que aqueles frescos, ou inseminação artificial intrauterina no lugar da
intracervical geralmente afetam o resultado de fertilidade (AMANN & HAMMERSTEDT,
1993).
(3) Toda amostra seminal contém uma população heterogênea de espermatozóides.
Nem todas as células espermáticas em uma população possuem o mesmo potencial
fertilizante, algumas são precoces ou tardias, considerando-se que outras nunca adquirem o
potencial fertilizante ou morrem antes do oócito está viável (AMANN & HAMMERSTEDT,
1993). Esta probabilidade facilita o sucesso na fertilização em mamíferos onde a passagem
através do trato reprodutivo da fêmea e possivelmente uma espera de vários dias são
requeridas antes da expressão do atributo final da função espermática incluindo ligação ao
oócito, penetração e provisão de um pro-núcleo masculino (AMMAN et al, 1993).
As provas tradicionais para a avaliação da qualidade espermática ignoram esta
heterogeneidade sendo, portanto, seriamente prejudicadas (AMANN & HAMMERSTEDT,
1993).
A avaliação in vitro ideal da qualidade espermática deveria qualificar
simultaneamente várias centenas ou preferencialmente, milhares espermatozóides em uma
dada amostra de uma série de atributos representando diferentes aspectos requeridos para a
fertilidade (AMANN & HAMMERSTEDT, 1993).
As mais importantes motivações biológicas e econômicas para a avaliação da
qualidade espermática são identificar machos com uma alta probabilidade de fertilidade
reduzida ou determinar se a fertilidade de um macho é aumentada ou diminuída (AMANN &
HAMMERSTEDT, 1993). Estas propostas para avaliação da qualidade espermática in vitro
têm sido e continuarão sendo importantes para a andrologia (AMANN & HAMMERSTEDT,
1993).
30
6. CONSERVAÇÃO DO SÊMEN
A inseminação artificial tem permanecido como o principal veículo para uma
rápida dispersão de genes e tem sido o método de escolha por criadores de todo o mundo para
melhorar a qualidade genética de seus rebanhos (VISHWANATH, 2003). Em bovinos
leiteiros, este constante nível de progresso genético é primariamente devido a avanços na
tecnologia do sêmen e à rápida aceitação da inseminação artificial para a difusão de genes
favoráveis na população bovina (VISHWANATH, 2003). Assim também, o constante
aumento da população mundial tem levado a uma contínua demanda para melhorar o nível
dos rebanhos (VISHWANATH, 2003).
O sêmen fresco diluído permanece viável por um período limitado de tempo (DE
PAUW et al., 2003a). Ao contrário de sua limitada vida in vitro os espermatozóides podem
permanecer viáveis por várias semanas quando armazenados na cauda do epidídimo
(SETCHELL et al., 1993). Em bovinos, o sêmen no estado líquido pode ser usado como um
método alternativo para a inseminação artificial em relação ao sêmen congelado-
descongelado, na condição que seu potencial fertilizante possa ser mantido por um mínimo de
dois dias e preferencialmente por quatro dias, podendo também ser facilmente transportado e
utilizado em local distante da coleta (VISHWANATH & SHANNON, 2000).
Nos últimos anos, a tecnologia de conservação do sêmen tem sido desenvolvida e
muitas pesquisas têm sido realizadas para prolongar a viabilidade in vitro e a fertilidade
potencial do sêmen líquido armazenado, pela alteração ou redução do metabolismo catabólico
espermático ou pelo aumento da estabilidade da membrana às injúrias térmicas ou outras
injúrias ambientais (FOOTE & PARKS, 1993; BATELLIER et al., 2001). Todavia, até o
momento nenhum melhoramento importante tem sido feito para aumentar a fertilidade
potencial do espermatozóide mais do que 3 – 5 dias, quando eles são armazenados em
ambiente líquido à altas taxas de diluição e à temperatura ambiente (SHANNON, 1997).
A conservação do sêmen geralmente requer uma redução ou parada do
metabolismo dos espermatozóides, prolongando assim a vida dos mesmos (SALAMON &
MAXWELL, 2000; YOSHIDA, 2000).
31
A importância da preservação de fontes genéticas para este milênio é amplamente
reconhecida, considerando-se que a conservação de sêmen terá maior contribuição com
aplicação potencial na pecuária, biotecnologia, conservação das espécies e medicina clínica,
os seguintes itens deverão ser destacados:
1. Troca (importação/ exportação) internacional de linhagens genéticas;
2. Conservação de sêmen manipulado (seleção sexual);
3. Conservação de linhagens genéticas superiores ou raça em via de extinção ou
linhagens transgênica (estabelecimento de um banco genético);
4. Suprir reserva em resposta à doenças-calamidades ou na coleta de sêmen
humano antes de quimioterapia ou radioterapia, coletando espermatozóides de forma não
fisiológica (epididimário ou testicular) e
5. Preservação de espécies ameaçadas de extinção (YOSHIDA, 2000).
A necessidade do uso de reprodutores por longos períodos ou em diferentes épocas
do ano estimula a pesquisa sobre armazenamento de sêmen sob condições artificiais
(SALAMON & MAXWELL, 2000). A combinação da temperatura de armazenamento,
composição química do diluidor e o controle higiênico são fatores-chave que afetam a
sobrevivência espermática (YOSHIDA, 2000). BATELLIER et al., (2001) afirmaram que o
sucesso no resfriamento e armazenamento do sêmen depende de múltiplos fatores, tais como:
a temperatura de armazenamento, composição do diluidor, taxa de diluição, número de
inseminações etc.
6.1. Conservação do sêmen no estado líquido
A tecnologia de resfriamento do sêmen é de grande interesse por ser capaz de
manter o sêmen fértil por 1 – 3 dias e por permitir o transporte (BATELLIER et al., 2001).
Entretanto, quando o sêmen é armazenado a baixas temperaturas, deve se ter
cuidado para não submeter os espermatozóides ao choque térmico (SALAMON &
MAXWELL, 2000), pois a preservação eficiente das células espermáticas com boa habilidade
fertilizante é de grande importância para a conservação do sêmen (YOSHIDA, 2000).
CHANTLER et al. (2000) mostraram que a separação dos espermatozóides do plasma
33
o estresse oxidativo (BATELLIER et al., 2001). De fato, as células espermáticas são
caracterizadas por sua capacidade incomum de gerar metabólitos oxigênio- reativos, que
causam peroxidação lipídica, especialmente durante a sobrevivência espermática
(SALAMON & MAXWELL, 2000; BATELLIER et al., 2001). Altos níveis de peroxidação
lipídica da membrana plasmática podem modificar grandemente a fluidez da membrana,
levando a modificações dramáticas na permeabilidade da membrana e morte celular
(BATELLIER et al., 2001). Os eventos acima são acompanhados pelo declínio no transporte
e sobrevivência dos espermatozóides no trato reprodutivo e redução da fertilidade
(SALAMON & MAXWELL, 2000; BATELLIER et al., 2001).
É possível que o processo de armazenamento líquido antecipe a maturação das
membranas espermáticas, aumentando então a proporção de células espermáticas capacitadas
e com acrossomas reagidos (SALAMON & MAXWELL, 2000). Espermatozóides
capacitados têm viabilidade reduzida e vida fértil limitada (SALAMON & MAXWELL,
2000) ou podem conferir incapacidade de fertilização se eles envelhecerem no trato
reprodutivo das fêmeas após inseminação cervical (MAXWELL & WATSON, 1996). É
portanto, provável que cuidados com resfriamento e reaquecimento do sêmen possam evitar
os problemas associados com o choque térmico sem comprometer os resultados de análise do
sêmen (CHANTLER et al., 2000).
Um aumento na pressão osmótica tem influência sobre a integridade da membrana
espermática, pois leva a uma desidratação celular, com conseqüente dano na membrana (DE
PAUW et al., 2003a). Os estudos também têm demonstrado que a idade do espermatozóide in
vitro leva a uma grande incidência de injúrias na mitocôndria do que no DNA nuclear (DE
PAUW et al., 2003a).
A concentração espermática também influencia grandemente a sobrevivência dos
espermatozóides, pois concentrações muito elevadas diminuem a sobrevivência espermática
(DE PAUW et al., 2003a). Além disso, a inexistência de mecanismos de eliminação das
células espermáticas mortas, submete os gametas vivos a uma convivência com os produtos
de sua decomposição (CORTEEL, 1980). Espermatozóides bovinos ejaculados e armazenados
preservam a integridade da membrana mesmo em concentrações mais baixas (DE PAUW et
34
al., 2003a). Sugerindo que houve uma redução na quantidade produtos metabólicos tóxicos ou
por uma exaustão mais lenta dos substratos a altas diluições (DE PAUW et al., 2003a).
6.2. Diluidores e constituintes utilizados na conservação do sêmen
Embora a frutose seja o único carboidrato simples presente no plasma seminal de
pequenos ruminantes, o espermatozóide também metaboliza glicose e manose quando estes
açúcares são incluídos no diluidor de armazenamento (SALAMON & MAXWELL, 2000).
Nenhum outro açúcar age como fonte de energia, mas vários tipos de açúcar tem sido
examinada por sua habilidade em preservar a motilidade espermática (SALAMON &
MAXWELL, 1993). Muitos investigadores usam glicose e frutose como componentes dos
diluentes. Alguns açúcares (sacarose e lactose) podem agir somente extracelularmente para
manter a pressão osmótica do diluente e integridade da membrana das células espermática
durante o armazenamento (SALAMON & MAXWELL, 2000).
Quase todos os trabalhos concentram o uso de tampões orgânicos, baseando-se que
estes têm melhor capacidade tampão, e que fosfato ou citrato não são tóxicos para as células
vivas, podendo penetrar na célula espermática agindo, desse modo, como tampão intracelular
contra mudança no pH, ou aumentando a tolerância da célula a um incremento intracelular de
cátions monovalentes (SALAMON & MAXWELL, 2000). Tampões orgânicos oferecem
aumento na tonicidade total do diluente, que é importante quando o sêmen é armazenado
(SALAMON & MAXWELL, 2000).
6.2.1. Leite
O leite integral, desnatado ou líquido tem também sido utilizado por muitos anos
como diluidor do sêmen caprino e ovino (SALAMON & MAXWELL, 2000; CORTEEL,
1974). O sucesso deste diluidor tem sido atribuído a sua fração protéica, que pode agir como
um tampão contra mudanças no pH e como um agente quelante contra a presença de metais
pesados (SALAMON & MAXWELL, 2000). Ele pode proteger parcialmente os
espermatozóides durante a redução da temperatura de armazenamento. O leite bovino tem
sido preferível ao leite de outras espécies (SALAMON & MAXWELL, 2000). Todavia, o
35
leite é um fluido biológico com uma composição complexa (mais de 100.000 moléculas) e
contém componentes que podem ser benéficos ou deletérios para a sobrevivência espermática
(BATELLIER et al., 2001). Além do mais, a concentração do componente protetor do leite
pode ser otimizada para melhorar o armazenamento do sêmen por longo período a
temperaturas positivas (BATELLIER et al., 2001).
Nos últimos anos, o leite conhecido comercialmente como longa vida (tratamento
ultra térmico – UHT) tem sido aprovado satisfatoriamente como diluidor do sêmen fresco e
também pela manutenção da viabilidade do espermatozóide durante o estado líquido
(SALAMON & MAXWELL, 2000).
6.2.2. Glicerol
O glicerol é a substância protetora mais comumente usada nos diluidores para a
congelação do sêmen. Assim, para a congelação do sêmen pelo método convencional lento, o
uso principalmente de diluidores hipertônicos (adição de glicerol), fez com que muitos
pesquisadores observassem que a concentração ótima de glicerol seria entre 6 – 8%
(SALAMON & MAXWELL, 2000).
O glicerol pode ser adicionado ao sêmen em uma fração diluente separada (2a
etapa – diluição) ou pela simples adição do diluidor contendo glicerol (uma etapa)
(SALAMON & MAXWELL, 2000).
6.2.3. Gema de ovo
A gema de ovo é um constituinte comum dos diluentes de sêmen, protege os
espermatozóides contra o choque térmico e confere proteção durante a congelação e
descongelação (SALAMON & MAXWELL, 2000).
Já foi demonstrado que a adição de gema de ovo ao diluidor teve efeito benéfico
sobre a percentagem de espermatozóides móveis no sêmen ovino, principalmente após rápido
resfriamento do sêmen de 10 e 5oC (FISER & FAIRFULL, 1986). Todavia, alguns estudos
36
indicam que a fração lipoprotéica de baixa densidade da gema de ovo é a fonte comum de
proteção do espermatozóide ovino contra os efeitos do armazenamento a +5oC (WATSON &
MARTIN, 1975). Os fosfolipídios da fração lipoprotéica da gema de ovo favorecem a
proteção da membrana da célula espermática (WATSON, 1981). Já a proteína da fração
lipoprotéica da gema de ovo serve para solubilizar o lipídio e ligá-lo à membrana da célula
(WATSON, 1981). Mais recentemente, MOUSSA et al. (2002) demonstraram que a fração
lipoprotéica da gema de ovo possui efetiva propriedade crioprotetora sobre os
espermatozóides congelados-descongelados de touros, pois melhor motilidade espermática foi
obtida com a adição da gema de ovo.
A ação de revestimento espermático em menos de 5 minutos com a gema de ovo
durante a diluição tem um importante efeito sobre várias características após quatro dias de
armazenamento em uma solução salina simples com pH 6 e 300 mOsm/ Kg (DE PAUW et
al., 2003a), já que melhoramentos foram realizados pela proteção adicional do
espermatozóide durante o armazenamento em meio contendo gema de ovo (DE PAUW et al.,
2003b).
Uma grande taxa de concentração de gema de ovo tem sido examinada em
diluentes para a congelação do sêmen ovino (SALAMON & MAXWELL, 2000). Os
trabalhos iniciais utilizaram 30-50%, mas subseqüentemente, os investigadores incluíram uma
taxa mais baixa de concentração no diluente (SALAMON & MAXWELL, 2000).
Avanços na tecnologia reprodutiva e melhor compreensão da fisiologia
reprodutiva dessas populações animais são necessárias para permitir a aplicação de técnicas
reprodutivas assistidas (YOSHIDA, 2000).
6.3. Conservação do sêmen caprino
Um dos principais problemas que tem interferido na expansão e aplicação da
inseminação artificial em caprinos é a qualidade do sêmen congelado, pois o processo de
congelação diminui a viabilidade das células espermáticas. Além disso, a presença de
fosfolipase A (IRITANI & NISHIKAWA, 1964) e possivelmente, lisofosfolipase (ATREJA
& ANAND, 1985) no sêmen caprino, catalisa a hidrólise de lecitinas em lisolecitinas
37
produzindo ácidos graxos livres (SNOW, 1985). As lisolecitinas, devido a sua ação detergente
sobre os lipídios da membrana plasmática, e os ácidos graxos são considerados tóxicos aos
espermatozóides (NUNES, 1982). Em adição, a lecitina é o fosfolipídio majoritário nas
membranas plasmáticas dos espermatozóides e está contida na gema de ovo, sendo portanto,
substratos perfeitos para a ação hidrolítica da fosfolipase (ROY, 1957).
ROY (1957) relatou a ação do plasma seminal sobre os elementos dos diluidores,
no caso, a gema de ovo, mesmo estando a baixas concentrações como 2,5%. No entanto, um
estudo sobre os fosfolipídios, antes e depois da congelação, revelou que os lipídios da gema
de ovo adicionados ao sêmen diluído não foram hidrolisados a lisofosfolipídeos e ácidos
graxos livres (CHAUAN & ANAND, 1990). Dentro deste contexto, desenvolveram-se linhas
de trabalho que preconizam a remoção do plasma seminal mediante centrifugação em solução
tampão (CORTEEL, 1974), em associação ao uso da gema de ovo no diluidor (TREJO et al.,
1987) ou em ausência de gema de ovo (CORTEEL, 1977).
RITAR & SALAMON (1982) demonstraram que a gema de ovo a uma
concentração de 9% no diluidor de sêmen caprino não lavado causou coagulação do meio
com morte dos espermatozóides após 24 h de incubação a 37oC. Os mesmos autores
demonstraram que concentrações maiores que 1,5% deprimiram a sobrevivência espermática
no sêmen não lavado após a descongelação.
A conservação do sêmen por períodos curtos é dependente da redução reversível
da motilidade e da atividade metabólica dos espermatozóides a baixas temperaturas
(MAXWELL & SALAMON, 1993; MACHADO & SIMPLÍCIO, 1995). No entanto, a
estocagem do sêmen refrigerado em diluidores à base de citrato – gema ou leite desnatado não
deve exceder oito horas, pois a partir deste momento mais de 50% da motilidade é perdida
(SAHNI, 1987) e a capacidade fecundante do sêmen resfriado decresce enormemente.
6.4. Uso da água de coco como diluidor do sêmen dos animais domésticos
A água de coco proveniente de um fruto com seis meses de idade apresenta
osmolaridade em torno de 500 milliosmoles e pH em torno de 4,5 a 5, que devem ser
corrigidos para a sua utilização como diluidor do sêmen (NUNES, 1987).
38
A água de coco também tem sido muito utilizada em biotecnologias relacionadas à
reprodução animal. Excelentes resultados têm sido obtidos com a utilização da água de coco
em estudos de preservação de sêmen de animais domésticos como caprinos (SALLES, 1989;
NUNES, 1998), ovinos (CRUZ, 1994), suínos (TONIOLLI & MESQUITA, 1990) e caninos
(SILVA et al., 1998). Entretanto, até o momento, não se tem o domínio dos protocolos de
conservação do sêmen, os quais utilizam a água de coco como diluidor do sêmen.
Muitas dificuldades têm sido encontradas, particularmente com a congelação de
sêmen de caprinos. É conhecido que durante a estação não sexual, em clima temperado, o
plasma seminal deprime fortemente a motilidade individual e a percentagem de
espermatozóides móveis, colhidos, congelados na estação sexual e descongelado na estação
não sexual (NUNES, 1982).
NUNES et al. (1982) demonstraram que esse efeito deletério do plasma seminal da
estação não sexual provém das glândulas bulbouretrais que durante essa estação tornam-se
hipertrofiadas e secretam grandes quantidades de fosfolipases do tipo A. Esta enzima age
sobre os fosfolipídios dos diluidores levando à formação de lisolecitinas e ácidos graxos, que
exercem ação tóxica sobre os espermatozóides. Esse efeito é exacerbado quando há interação
entre as enzimas fosfolipases e fosfolipídeos presentes no meio diluidor como o leite, e
plasma seminal, respectivamente. Foi demonstrado que a congelação do sêmen caprino
diluído em leite, contendo acima de 10 mg de fosfolipídios, causou a morte total dos
espermatozóides (NUNES et al. 1982). Portanto, diluidores pobres em fosfolipídeos poderiam
ser a solução evitando ou reduzindo os efeitos negativos causados pela fosfolipase A sobre o
sêmen de animais desta espécie (NUNES, 1987).
De acordo com NUNES (1987) a fertilidade de cabras inseminadas com sêmen
diluído em água de coco é superior àquela do leite.
Visando isolar a fração que atua sobre os espermatozóides, NUNES et al. (1994)
promoveram o fracionamento da água de coco, utilizando uma coluna de Sephadex G-25, a
um comprimento de onda de 210 nm, verificando quatro piques de saída, e recuperados em 60
tubos, sendo que o pique observado entre os tubos 20 e 30 corresponde à fração B, da qual
isolaram uma molécula pertencente ao grupo das auxinas, o ácido 3-Indol-Acético, substância
39
com atividade hormonal estimuladora de crescimento de vegetais, a qual demonstrou
atividade sobre o metabolismo do espermatozóide. A adição do ácido 3-Indol-Acético (IAA)
na composição dos diluentes convencionais de sêmen de diferentes espécies confere aos
espermatozóides um incremento na motilidade, aumentando a taxa de fertilidade, além de
permitir sua conservação durante períodos mais longos (TONIOLLI et al., 1995).
Tem sido observado que o IAA tem efeito benéfico sobre a integridade
morfológica do acrossoma do espermatozóide suíno, mas parece que outras moléculas
presentes na água de coco também participam desta atividade (TONIOLLI et al., 1996).
CRUZ (1994) obteve uma fertilidade significativamente superior com o uso de
sêmen preservado por 48 horas a +4oC em meio contendo o JYP - molécula ativa da água de
coco (40,74%) quando comparado com sêmen em meio à base de leite (14,81%). A
estabilização da água de coco tanto em forma líquida, como na forma de gel, facilitaria seu
emprego, assim como a sua difusão em trabalhos de inseminação artificial, tornando-se
fundamental no processamento do sêmen caprino (NUNES, 1988).
A água de coco poderá sofrer alterações em sua composição de acordo com o
estágio de maturação do fruto, ou ainda referente à variedade da planta (LAGUNA, 1996),
sendo de fundamental importância o seu estudo A utilização da água de coco proveniente de
frutos de diferentes idades, sobre a qualidade in vitro e a fertilidade do sêmen caprino poderá
contribuir de forma significativa para o entendimento de protocolos experimentais que
utilizarem a água de coco, recomendando-se assim, a sua estabilização ou padronização.
Atualmente, alguns estudos têm sido realizados com o desenvolvimento da água de coco em
pó, que é um produto mais estável, por apresentar pH e osmolaridade bem regulados
(SALGUEIRO et al., 2002).
40
JUSTIFICATIVA
Alguns estudos realizados na região semi-árida do Nordeste do Brasil
demonstraram não haver diferenças significativas na qualidade espermática entre a época seca
e chuvosa (SILVA & NUNES, 1984). Entretanto, a pouca diferença encontrada tem sido
atribuída quase que exclusivamente ao fator alimentação, ou seja, a carência alimentar no
período seco diminui a qualidade dos ejaculados, todavia os estudos não têm levado em
consideração se alguns componentes do plasma seminal podem aumentar ou diminuir seus
níveis, exercendo ou não ação benéfica sobre os espermatozóides.
Questiona-se se em clima tropical semi-árido em latitude sul, o plasma seminal
possa exercer o mesmo efeito deletério sobre os espermatozóides, como observado em clima
temperado e em latitude norte (NUNES et al., 1982).
Os procedimentos de lavagem prévia do sêmen antes da congelação são baseados
em estudos realizados em clima temperado que demonstram que há grande variação na
composição do plasma seminal entre a estação reprodutiva (sexual) e não reprodutiva (não-
sexual) (NUNES et al., 1982).
Entretanto, não há estudos demonstrando que no semi-árido do Nordeste
brasileiro, o plasma seminal comporta-se de modo semelhante ao observado em clima
temperado. A comprovação de que o plasma não exerce o mesmo efeito deletério sobre os
espermatozóides, eliminará a necessidade da lavagem prévia do sêmen caprino antes da
conservação, facilitando o manejo do material espermático, incrementando, provavelmente, a
fertilidade dos rebanhos.
41
MATERIAL E MÉTODOS
Experimento 1: Parâmetros morfométricos do trato genital masculino de caprinos sem
raça definida (SRD) criados no semi-árido Nordestino durante o período seco e chuvoso.
Foram coletados em abatedouros locais da região metropolitana de Fortaleza 46
genitais de machos caprinos sem raça definida (SRD), com idade média de 18 meses no
período seco (setembro – novembro) e 52 genitais no período chuvoso (março – maio), para
análise morfométrica do trato reprodutivo. Depois foram identificados, pesados e mensurados,
conforme a categoria da peça anatômica analisada. Ressalta-se que os genitais foram
dessecados e cortados para a separação dos diferentes componentes: testículos, epidídimos,
ductos deferentes, pênis e glândulas vesiculares.
Testículos
Foram identificados conforme sua topografia em direito e esquerdo, em seguida
pesados (sem epidídimos) individualmente em balança de precisão. Após, foram mensurados
com auxílio de paquímetro e fita métrica, quanto ao comprimento, espessura e diâmetro.
Epidídimos
Foram dessecados dos testículos, identificados com direito ou esquerdo e em
seguida pesados
Ductos deferentes
Foram destacados da cauda do epidídimo e mensurado quanto ao comprimento.
Pênis
Foi mensurado quanto ao comprimento.
Glândulas Vesiculares
Foram identificadas em direita ou esquerda, pesadas individualmente, e
mensuradas quanto a comprimento, largura e espessura.
42
Análise estatística
Os parâmetros de peso, largura, espessura e comprimento das diferentes estruturas
foram expressos em média e erro padrão (SEM) e submetidos ao teste t de Student não
pareado a 5% de probabilidade (Stat View, 5.0). Os dados foram comparados entre períodos e
entre os lados direito e esquerdo
Experimento 2: Ação do plasma seminal obtido durante a época seca ou chuvosa sobre a
viabilidade e morfologia dos espermatozóides epididimários de caprinos
Local do experimento
O experimento foi realizado no Laboratório de Tecnologia do Sêmen da Faculdade
de Veterinária do Ceará, Fortaleza, com latitude norte de 3o 43´ e longitude oeste de 38º30',
com temperatura média anual de 27o C, apresentando segundo a classificação de Koppen,
clima tropical.
Coleta dos espermatozóides epididimários
Os epidídimos foram obtidos em abatedouros locais de Fortaleza (de caprinos sem
raça definida, com 16.0 ± 6.0 meses de idade e circunferência escrotal de 34 ± 2,5 cm) e os
espermatozóides coletados diretamente da cauda do epidídimo através de uma incisão na parte
distal e recuperados em tubos de ensaio. Foram realizadas um total de 14 coletas e cada coleta
considerada uma repetição.
Plasma seminal
O plasma seminal foi obtido de vários pools de ejaculados de dois animais
vasectomizados sem raça definida coletado por meio de vagina artificial durante as épocas
seca e chuvosa, e armazenado a –196oC em nitrogênio líquido até ser adicionado aos
espermatozóides epididimários.
Teste de termorresistência
Os espermatozóides foram diluídos em uma solução composta de 50% de água de
coco e 50% de citrato de sódio a 2,5%, tendo osmolaridade e pH ajustados para 300
mOsmols, pH 6,8, respectivamente. Os espermatozóides epididimários foram diluídos a uma
43
concentração final de 400 x 106 sptz/ ml (espectrofotometria). Após a diluição foram
divididos em 7 alíquotas iguais de 100 µl (40 x 106 sptz). O plasma seminal de época seca ou
chuvosa foi adicionado em seis (6) delas nas seguintes proporções de 10, 20 ou 30 µl,
respectivamente, perfazendo os tratamentos 10C e 10S (10 µL de plasma seminal de época
chuvosa e seca, respectivamente / 100 µl de espermatozóides diluídos), 20C e 20S (20 µL de
plasma seminal de época chuvosa e seca, respectivamente / 100 µl de espermatozóides
diluídos), 30C e 30S (30 µL de plasma seminal de época chuvosa e seca, respectivamente/
100 µl de espermatozóides diluídos). Uma alíquota não foi adicionada de plasma seminal e
constituiu o tratamento controle (C). As amostras foram incubadas a 37oC em banho-maria e
avaliadas quanto à motilidade individual progressiva (MIP) e percentagem de
espermatozóides móveis (PEM) aos 5, 60 e 120 minutos de incubação pelo teste de
termoresistência (BARIL et al., 1993). A taxa de degradação da motilidade (TDM) foi
calculada ao final da incubação, utilizando a seguinte fórmula:
MIP 5 min – MIP 120 min
MIP 5 min
Morfologia espermática
Esfregaços de espermatozóides epididimários das diferentes amostras foram
realizadas aos 5 e 120 minutos de incubação a 37oC para mensuração das possíveis alterações
morfológicas provocadas pela ação do plasma seminal. Os esfregaços foram corados com
solução formada por eosina a 1%, nigrosina a 3% e citrato de sódio a 3%. Um total de 200
células foi avaliado em um microscópio de contraste de fase (aumento: X1000). As
morfologias foram classificadas segundo COLAS (1980) em normais (NO), defeito de cabeça
(DC), defeito de peça intermediária (DPI), gota citoplasmática proximal (GCP), gota
citoplasmática distal (GCD) e anormalidade de flagelo (AF) e patologia total (PT).
Análise estatística
Os resultados foram expressos em média e erro padrão (SEM), os parâmetros de
PEM, MIP, TDM e morfologia espermática, foram analisados após transformação arcoseno e
submetidos a ANOVA (P<0,05) pelo programa estatístico STAT VIEW (5,0).
TDM = x 100
44
Experimento 3: Viabilidade do sêmen caprino lavado e não lavado diluído em água de
coco e armazenado a 4 oC
Local do experimento
O experimento foi realizado no Laboratório de Tecnologia do Sêmen da Faculdade
de Veterinária do Ceará, Fortaleza, com latitude de 3o43´ e longitude oeste de 38º30', com
temperatura anual média de 27o C.
Elaboração do diluidor
O diluidor foi elaborado a partir da água de coco in natura, obedecendo ao
seguinte protocolo: 50% de água de coco e 50% de citrato de sódio a 2,5%, contendo ainda
2,5% de gema de ovo com osmolaridade ajustada para 300 milliosmoles e pH corrigido para
6,2 a 6,8.
Coleta e processamento do sêmen
O sêmen de quatro caprinos Saanen com idade média de dois anos foi coletado em
vagina artificial. Os animais permaneceram em manejo intensivo, recebendo volumoso
(capim elefante picado) ad libitum e 400g de um concentrado (18% PB) por. Após a coleta, o
sêmen foi imediatamente avaliado quanto ao volume (mL) e concentração espermática (109
sptz/ mL). Logo após a primeira avaliação, o sêmen foi diluído em água de coco a uma
concentração final de 200 x 106 sptz /mL, metade deste sêmen foi resfriado a +4oC
(tratamento: sêmen não-lavado) e a outra metade foi centrifugada (lavagem) para retirada do
plasma seminal sendo também resfriada a +4 oC (tratamento: sêmen lavado). A lavagem foi
realizada duas vezes utilizando-se a mesma solução diluidora (centrifugado a 550g / 15 min),
tendo-se o cuidado de manter o volume líquido do diluidor após cada lavagem, e assim
manter a mesma concentração espermática. Ambas amostras de sêmen foram avaliadas a 0,
24, 48 e 72 horas de resfriamento, onde pequenas amostras de 300 µl (60 x 106 sptz) foram
retiradas e submetidas ao TTR em banho-maria a 37 oC, avaliado-se quanto a motilidade
progressiva individual (MIP) e porcentagem de espermatozóides móveis (PEM), por meio do
TTR aos 5, 60, e 120 minutos de incubação.
Estas observações foram realizadas em microscopia ótica (microscópio de contraste de
fase) no aumento de 100X. Após cada incubação foram calculadas as médias de MIP e PEM
45
[(5 min + 60 min + 120 min)/3] e a taxa de degradação da motilidade (TDM) pela seguinte
fórmula:
TDM = MIP 5 min – MIP 120 min
MIP 5 min
Morfologia espermática
Esfregaços de sêmen das amostras de cada animal e dos diferentes tempos de
conservação (0, 24, 48 e 72 h) foram realizados aos 120 minutos de incubação a 37oC para
mensuração das possíveis alterações morfológicas provocadas pela ação do plasma seminal.
Os esfregaços foram corados com solução formada por eosina a 1%, nigrosina a 3% e citrato
de sódio a 3%. Um total de 200 células foi avaliado em um microscópio de contraste de fase
(aumento: X1000). A morfologia espermática foi classificada segundo COLAS (1980) em
normais (NO), defeito de cabeça (DC), defeito de peça intermediária (DPI), gota
citoplasmática proximal (GCP), gota citoplasmática distal (GCD) e anormalidade de flagelo
(AF) e patologia total (PT).
Para efeito de confiabilidade estatística, foram realizadas cinco repetições no
período chuvoso (abril e maio) e cinco no período seco (setembro e outubro), perfazendo um
total de 20 ejaculados no período chuvoso e 20 no período seco.
Análise estatística
Os parâmetros de MIP, PEM, TDM e morfologia espermática foram expressos em
média e erro padrão (SEM) e submetidos a ANOVA (P<0,05). Quando foi identificada
diferença entre os tratamentos os parâmetros foram submetidos ao teste Fisher´s PLSD a
P<0,05 (Stat View, 5.0). Ressalta-se que o delineamento experimental foi inteiramente
casualizado, onde cada ejaculado foi considerado uma repetição para comparações dentro de
cada tratamento. Os diferentes parâmetros foram comparados entre tratamentos (lavado x não
lavado), entre épocas (seca x chuvosa) e entre tempo de conservação (0, 24, 48 e 72 h) e todos
os parâmetros percentuais sofreram transformação em arcoseno e em seguida foram
submetidos aos testes citados anteriormente.
x 100
46
RESULTADOS
Experimento 1: Parâmetros morfométricos do trato genital masculino de caprinos sem
raça definida (SRD) criados no semi-árido Nordestino durante o período seco e chuvoso.
Os parâmetros testiculares demonstrados na tabela 1 foram diferentes
significativamente (P<0,05) entre os períodos seco e chuvoso, destacando-se resultados
superiores no período seco. Todavia, não houve diferença significativa (P>0,05) entre os
testículos direito e esquerdo.
Tabela 1: Média ± erro padrão (SEM) das dimensões dos testículos de caprinos tipo sem raça
definida (SRD) no Nordeste do Brasil no período seco (setembro – novembro) e chuvoso
(março – maio) de 2001.
Parâmetros testiculares (cm)
Espessura Comprimento Largura
Período do
ano direito esquerdo direito esquerdo direito esquerdo
seco 3.34 ±
0.081a
3.40 ±
0.074a
5.95 ±
0.11a
6.08 ±
0.10a
4.06 ±
0.08a
4.07 ±
0.069a
chuvoso 3.05 ±
0.074b
3.07 ±
0.69b
5.67 ±
0.11b
5.64 ±
0.10b
3.74 ±
0.08b
3.79 ±
0.071b
a,bletras diferentes com diferença significativa (P<0,05) – diferença entre linhas (entre
períodos do ano)
(P>0,05) – entre colunas
47
No tocante ao peso testicular (tabela 2) também foi constatada diferença
significativa (P<0,05) entre os dois períodos estudados.
Tabela 2: Média ± SEM dos pesos médios e totais dos testículos (T) e epidídimos (E) em
grama (g) de caprinos tipo sem raça definida (SRD) no Nordeste do Brasil no período seco
(setembro – novembro) e chuvoso (março – maio) de 2001.
Testículos Epidídimos Período do
ano direito esquerdo total (T) direito esquerdo total (E)
Seco 56.32 ±
2.56a
56.22 ±
2.43a
112,55±
4,96a
9.25 ±
2.43a
9.24 ±
0.46a
18,48±
0,93a
Chuvoso 48.87 ±
2.21b
48.90 ±
2.22b
96,90 ±
4,88b
6.71 ±
0.34b
6.69 ±
0.34b
13,41±
0,68b
a,bletras diferentes com diferença significativa (P<0,05) – diferença entre linhas (entre
períodos do ano)
Referente às glândulas vesiculares (tabela 3), não foram observadas diferenças
significativas (P>0,05) entre os parâmetros de peso, espessura, largura e comprimento entre
os períodos seco e chuvoso.
Tabela 3: Média ± SEM das glândulas vesiculares de caprinos tipo sem raça definida (SRD)
no Nordeste do Brasil no período seco e chuvoso
Glândulas Vesiculares
Peso (g) Espessura (cm) Largura (cm) Comprimento (cm)
Período
do ano direita esquerda direita esquerda direita esquerda direita esquerda
Seco 3.08 ±
0.38
2.80 ±
0.41
0.79 ±
0.049
0.77±
0.046
1.40±
0.068
1.36±
0.074
2.50 ±
0.123
2.54 ±
0.13
Chuvoso 2.66 ±
0.16
2.80 ±
0.15
0.76 ±
0.030
0.77 ±
0.02
1.39±
0.03
1.37±
0.036
2.31 ±
0.05
2.33 ±
0.06
P>0,05 – entre linhas e colunas
48
O comprimento do pênis e ductos deferentes (tabela 4) diferiram
significativamente (P<0,05) entre os períodos do ano.
Tabela 4: Média ± SEM do comprimento do pênis e do ducto deferente de caprinos tipo sem
raça definida (SRD) no Nordeste do Brasil no período seco e chuvoso
Comprimento do ducto deferente (cm) Período do ano Comprimento do pênis
(cm) direito esquerdo
Seco 25.62 ± 0.52a 34.81 ± 0.86 a 35.16 ± 0.94a
Chuvoso 23.46 ± 0.24 b 39.66 ± 0.95 b 39.8 ± 0.95 b
a,bletras diferentes com diferença significativa (P<0,05) – diferença entre linhas (entre
períodos do ano).
P>0,05 – entre colunas
Experimento 2: Ação do plasma seminal obtido durante a época seca ou chuvosa sobre a
viabilidade e morfologia dos espermatozóides epididimários de caprinos
O efeito da adição do plasma seminal de época seca ou chuvosa sobre a PEM
epididimários foi observado aos 5 e 60 min de incubação (tabela 1). No tocante a MIP,
nenhum efeito foi observado a nenhum momento da incubação ou qualquer dose do plasma
seminal.
A adição do plasma seminal aumentou significativamente a PEM no
tratamento10S (5 min) comparado ao controle, (P<0,05) no qual PEM foi maior após a adição
de plasma seminal (10S). Uma diferença significativa também foi observada entre os
tratamentos adicionado de plasma seminal de época chuvosa - 10C, 20C e 30C (P<0,05),
embora os tratamentos 20C e 30C não tenham diferido um do outro apresentaram uma maior
PEM. Diferença significativa também foi observado entre os tratamentos adicionados de
plasma seminal de época seca - 30S e 10S a 60 min (P<0,05), onde uma menor PEM foi
encontrada no tratamento que recebeu maior dose de plasma seminal (30S), sugerindo que
49
doses maiores de plasma seminal de época seca reduzem a viabilidade espermática à medida
que a incubação continua.
Tabela 1: (Média ± SEM). Efeito da adição do plasma seminal de época seca ou chuvosa
sobre a percentagem de espermatozóides móveis epididimários (PEM) após incubação a 37oC.
Tempo de incubação (min)
Tratamento 5 60 120
(controle) C 89,64 ± 0,82* 83,46 ± 2,49 76,25 ± 4,08
10C 90,71 ± 0,88a 86,78 ± 2,65 81,78 ± 3,80
20C 91,42 ± 0,81bc 86,78 ± 2,07 76,78 ± 3,69
Chu
vosa
30C 91,42 ± 1,32c 86,07 ± 1,97 78,57 ± 3,75
10S 92,14 ± 0,86** 87,14 ± 2,32a 78,57 ± 4,20
20S 88,92 ± 1,07 83,21 ± 1,86 78,21 ± 2,75
Seca
30S 87,64 ±1,79 80,00 ± 2,68b 75,41 ± 2,78
a,b letras diferentes, representa diferença significativa (P<0,05) entre tratamentos (linhas).
*,** representa diferença significativa (P<0,05) entre tratamentos (linhas).
O efeito da adição do plasma seminal de época seca ou chuvosa sobre os
espermatozóides epididimários não teve ação sobre a TDM (tabela 2), não se verificando
diferença significativa entre os tratamentos (P>0,05).
Tabela 2: (Média ± SEM). Efeito da adição do plasma seminal de época seca ou chuvosa
sobre a taxa de degradação da motilidade (TDM) de espermatozóides epididimários incubados
a 37oC.
Tratamentos
C 10C 10S 20C 20S 30C 30S
TDM (%) 8.88 ±
2.22
4,62 ±
2,54
5.55 ±
2.16
4.62 ±
2.14
5.55 ±
2.25
4.62 ±
5.71
7.77 ±
2.89
(P>0,05)
50
C: controle; 10C e 10S (10 µL de plasma seminal de época chuvosa e seca, respectivamente); 20C
e 20S (20 µL de plasma seminal de época chuvosa e seca, respectivamente); 30C e 30S (30 µL de plasma
seminal de época chuvosa e seca, respectivamente).
Com relação à morfologia espermática, alguns tratamentos diferiram entre si
(P<0,05). Aos 5 min de incubação, nenhum tratamento apresentou diferença na morfologia
espermática (NO, DC, DPI, GCP, GCD e AF). Exceto os tratamentos 20S (12,00 ± 1,74%) e
C (34,50 ± 10,56%) diferiram significativamente na PT (P<0,05), com um índice patológico
maior ocorrendo no tratamento C (Figura 1).
Figura 1: Efeito da adição do plasma seminal de época seca ou chuvosa sobre a patologia total
(PT) da morfologia espermática epididimária com 5 e 120 min de incubação a 37oC.
0
10
20
30
40
C 10S 10C 20S 20C 30S 30C
Tratamentos
% d
e e
sp
erm
ato
zó
ide
s
PT c/ 5 min
PT c/ 120 min
a,b letras diferentes representam diferença significativa (P<0,05) entre tratamentos
C: controle; 10C e 10S (10 µL de plasma seminal de época chuvosa e seca, respectivamente); 20C
e 20S (20 µL de plasma seminal de época chuvosa e seca, respectivamente); 30C e 30S (30 µL de plasma
seminal de época chuvosa e seca, respectivamente).
PT: patologia total
Aos 120 min de incubação, o número de células normais no tratamento 30S foi
menor que o observado nos demais tratamentos (tabela 3) (P<0,05). No que se refere ao DC,
somente o tratamento 30S diferiu do controle (C), onde a adição de plasma seminal aumentou
esta patologia (P<0,05). Concernente a GCD, os tratamentos 30S e 30C diferiram
significativamente do controle (P<0,05), com um grande número de espermatozóides com
GCD sendo observada no tratamento C. Nenhum efeito do plasma seminal foi observado
sobre a incidência de DPI, GCP, AF ou PT com 120 min de incubação.
b
a
51
Tabela 3: (Média ± SEM). Efeito da adição do plasma seminal de época seca ou chuvosa
sobre a morfologia espermática epididimária após 120 min de incubação a 37oC.
Tratamentos
Morfologia C 10C 10S 20C 20S 30C 30S
NO 184.28 ±
2.06b
190.92 ±
1.03b
184.57 ±
3.42b
181.42 ±
5.35b
178.28 ±
3.86b
182.57 ±
3.33b
147.14 ±
18.30a
DC 3.07 ±
0.91ª
3.85 ±
0.65
4.40 ±
1.45
11.85 ±
5.09
11.07 ±
3.39
7.85 ±
2.22
18.50 ±
8.03b
GCD 7.78 ±
2.03ª
2.00 ±
0.74
5.50 ±
2.29
3.57 ±
1.34
7.50 ±
2.87
5.78 ±
1.92b
2.57 ±
1.05b
a,b letras diferentes, representam diferença significativa (P<0,05) entre tratamentos (colunas)
(NO: Normais; DC: Defeito de cabeça; GCD: Gota citoplasmática distal).
C: controle; 10C e 10S (10 µL de plasma seminal de época chuvosa e seca, respectivamente); 20C e 20S (20 µL
de plasma seminal de época chuvosa e seca, respectivamente); 30C e 30S (30 µL de plasma seminal de época
chuvosa e seca, respectivamente).
Experimento 3: Viabilidade do sêmen caprino lavado e não lavado diluído em água de
coco e armazenado a 4 oC
Os resultados do experimento estão expressos nas tabelas 1 e 2.
Foi observada diferença na conservação entre o sêmen lavado e o não lavado nos
parâmetros de MIP e PEM no período chuvoso quando conservados a 0, 24 e 48 h (P< 0,001),
com resultados superiores no sêmen lavado (tabela 1). No período seco a MIP diferiu apenas
no sêmen conservado a 0h (P< 0,001), onde o melhor resultado foi observado no sêmen
lavado. No tocante a PEM, no período seco foram constatadas diferenças entre o sêmen
lavado e não lavado conservado por 0, 24 e 72 h (P< 0,001), resultados superiores
encontrados no sêmen lavado.
52
Tabela 1: Motilidade Individual Progressiva (MIP) e Percentagem de Espermatozóides
Móveis (PEM) do sêmen caprino lavado e não lavado conservado por 72 h a +4oC durante o
período chuvoso e seco e avaliado pelo Teste de Termorresistência (TTR).
TTR
MIP PEM
Época Época
Tempo de
resfriamento
Tratamento
chuvosa seca chuvosa seca
Não Lavado 3,67 ± 0,10aA* 3,17 ± 0,13aA** 68,61 ± 2,46aA 61,52 ± 3,62aA 0h
Lavado 4,07 ± 0,85b1* 3,78 ± 0,07b1** 79,90 ± 2,01b1 75,91 ± 2,09b1
Não Lavado 3,32 ± 0,10aB 3,21 ± 0,10AB 53,14 ± 3,10aB 51,11 ± 3,49aB 24h
Lavado 3,77 ± 0,07b2* 3,42 ± 0,092** 65,88 ± 2,63b2 60,26 ± 2,76b2
Não Lavado 3,05 ± 0,08aCBD 2,73 ± 0,15C 38,97 ± 3,28aCD 40,00 ± 3,89CD 48h
Lavado 3,62 ± 0,06b3,4 3,02 ± 0,093,4 65,43 ± 1,79b3,4 46,37 ± 2,693,4
Não Lavado 2,81 ± 0,13D 3,00 ± 0,07AD 40,51 ± 3,31D 34,79 ± 3,42aD 72h
Lavado 2,73 ± 0,114 2,84 ± 0,104 44,44 ± 2,814 46,66 ± 3,14b4
ab letras diferentes, comparação entre sêmen Não Lavado e Lavado P<0,001 A, B, C e D letras diferentes, comparação entre o sêmen Não Lavado (0, 24, 48 e 72 h) P<0,001 1, 2, 3 e 4 números diferentes, comparação entre o sêmen Lavado (0, 24, 48 e 72 h) P<0,001 *, ** no de asteriscos diferentes, comparação entre colunas: seca e chuvosa (P<0,01).
Também foi observado que o tempo de conservação diminuiu a viabilidade
espermática do sêmen lavado e não lavado. No sêmen não lavado a MIP, no período chuvoso,
foi superior a 0h quando comparada com os demais tempos de conservação (P< 0,001). No
período seco não houve diferença entre o sêmen conservado por 0 e 24 h (P< 0,001), todavia
deferiram significativamente daquele conservado por 48 h (P< 0,001). No que se refere a
PEM, também no sêmen não lavado, foi observado que tanto no período chuvoso como no
seco não houve diferença entre o sêmen conservado por 0 e 24 h, contudo ambos foram
superiores àquele conservado por 48 e 72 h (P< 0,001).
53
No sêmen lavado A MIP e a PEM tanto no período chuvoso como no seco foram
significativamente superiores no sêmen conservado a 0 h (P< 0,001), não havendo diferença
entre o sêmen conservado por 48 e 72 h (P> 0,001).
A época do ano mostrou efeito somente sobre a MIP do sêmen lavado e não lavado
conservado a 0 h e no sêmen lavado conservado a 24 h, com resultados superiores observados
no período chuvoso (P< 0,001).
A época do ano afetou a TDM do sêmen lavado, onde uma menor degradação foi
observada no período seco, com 72h / 4oC. No tocante ao tratamento dado ao sêmen antes do
resfriamento (lavagem ou não) uma degradação significativamente inferior (P<0,02) foi
constatada no sêmen lavado e conservado por 0 h (tabela 2).
Tabela 2: Taxa de Degradação da Motilidade (TDM) do sêmen caprino não lavado e lavado,
resfriado a 4oC e conservado por até 72 h.
Tempo de Conservação Período do ano Tratamento
0 h 24 h 48 h 72 h
Não lavado 35,11 ± 4,47a 20,91 ± 6,48 33,42 ± 9,84 16,66 ± 5,67 Seca
Lavado 15,43 ± 7,47b 21,45 ± 4,47 23,93 ± 5,06 11,20 ± 3,08a
Não lavado 31,10 ± 6,87 33,66 ± 9,22 16,04 ± 8,11 25,51 ± 10,71 Chuvosa
Lavado 27,37 ± 7,10 24,60 ± 7,19 25,50 ± 6,53 33,12 ± 7,60b
a,b Letras diferentes, comparação entre linhas (P< 0,02)
A época de coleta do sêmen (seca ou chuvosa) teve efeito sobre a morfologia
espermática, como células normais (NO) no sêmen lavado e conservado por 72 h, defeito de
cabeça (DC) no sêmen não lavado e conservado por 48 e 72 h, e patologia total (PT) no sêmen
lavado e conservado por 48 e 72 horas a +4oC, onde um maior número de NO e DC foi
observado na época seca, e PT na chuvosa (tabela 4).
No que se refere, ainda ao DC, às 72 h de conservação, uma diferença significativa
foi observada no tratamento dado ao sêmen (lavado ou não lavado), pois uma maior taxa de
anormalidade foi observada no sêmen lavado (P<0,02). No tocante ao tempo de conservação
(0, 24, 48 e 72h), não foi constatadas diferença significativa no período seco (P>0,05).
54
Todavia, no período chuvoso foi constatada diferença significativa (P<0,05) entre os
diferentes tempos de conservação apenas no sêmen submetido à lavagem, para as morfologias
NO, que diminuiu com a conservação, DC e PT, que aumentaram com a conservação (tabela
4).
Tabela 3: (Média ± SEM). Efeito da remoção ou não plasma seminal do sêmen caprino
conservado por 72 h a +4oC durante o período chuvoso e seco sobre a morfologia
espermática.
Normais (NO)
(no de células)
Defeito de cabeça (DC)
(no de células)
Patologia Total (PT)
(no de células)
Período
do ano
Tempo de
conservação
Lavado
Não
lavado
Lavado
Não
lavado
Lavado
Não
lavado
0 h 185,26 ±
1,56
178,94 ±
3,77
11,00 ±
1,71
16,68 ±
3,86
15,05 ±
1,66
21,05 ±
3,77
24 h 184,89 ±
1,27
184,81 ±
1,24
11,47 ±
0,90
12,81 ±
1,24
15,05 ±
1,29
15,18 ±
1,24
48 h 184,12 ±
2,05
177,63 ±
4,31
12,54 ±
2,22
20,45 ±
4,12A
15,37 ±
2,12
22,36 ±
4,30
Seca
72 h 184,46 ±
1,00 A
185,33 ±
1,78
11,86 ±
0,86
12,66 ±
1,58A
15,53 ±
1,00A
14,66 ±
1,78
0 h 183,68 ±
1,91a
183,83 ±
1,83
8,36 ±
1,35a
9,55 ±
1,18
15,84 ±
1,77a
16,77 ±
1,72
24 h 184,68 ±
1,83ab
180,06 ±
3,00
8,62 ±
1,71ab
12,31 ±
2,02
15,31 ±
1,83ab
20,00 ±
3,01
48 h 180,66 ±
2,25abc
178,93 ±
1,90
10,00 ±
1,67ab
10,60 ±
1,70B
19,33 ±
2,25abc
21,06 ±
1,90
Chu
vosa
72 h 176,88 ±
2,91cB
185,71 ±
3,20
13,66 ±
2,29*b
7,17 ±
1,40**B
23,11 ±
2,91cB
14,258 ±
3,20
*,** - comparação entre colunas (sêmen Lavado x Não lavado) a,b,c - comparação entre linhas (época chuvosa)
55
A,B - comparação entre linhas dentro do mesmo tempo de conservação (época seca x chuvosa)
56
DISCUSSÃO
Experimento 1: Parâmetros morfométricos do trato genital masculino de caprinos sem
raça definida (SRD) criados no semi-árido Nordestino durante os períodos seco e
chuvoso.
Os parâmetros testiculares demonstrados na tabela 1 foram diferentes
significativamente (P<0,05) entre os períodos seco e chuvoso, destacando-se resultados
superiores no período seco. Todavia, não houve diferença significativa (P>0,05) entre os
testículos direito e esquerdo. Estes dados estão de acordo com os achados por VILLAR
FILHO et al. (1993), onde demonstraram que o comprimento dos testículos direito e esquerdo
foram bastante homogêneos. Contudo, no presente estudo, esse parâmetro foi bem inferior ao
encontrado pelos citados autores, pois observaram 7,3 cm de comprimento testicular em
caprinos nativos da raça Canindé também criados no Nordeste do Brasil. Os resultados do
presente trabalho também foram inferiores aos citados por NÚÑEZ (1993), que relata um
comprimento testicular variando de 7,5 a 11 cm em caprinos nativos da Venezuela.
Entretanto, a largura testicular (4,5 cm) citado por NÚÑEZ (1993) foi similar àquela
encontrada neste trabalho durante o período seco no Nordeste do Brasil.
No tocante ao peso testicular (tabela 2) também foi constatada diferença
significativa (P<0,05) entre os dois períodos estudados, com resultados superiores no período
seco, apresentando-se todavia, inferiores aos citados por NÚÑEZ (1993) que foram de 150 a
180 g (ambos testículos). BARIL et al. (1993) demonstraram que o peso testicular em bodes
nativos adultos na França foi de 101 g (ambos testículos), dados semelhantes foram obtidos
no atual trabalho durante o período seco no Nordeste do Brasil. Não foi constatada diferença
significativa (P>0,05) entre o peso testicular e epididimário direito e esquerdo. Resultados
semelhantes foram encontrados por NISHIMURA et al. (2000) que também não constataram
diferença entre os referidos parâmetros, sendo semelhantes ainda aos achados por BARIL et
al. (1993) em caprinos da raça Alpina fora da estação não sexual. VILAR FILHO et al. (1993)
ressalta que raças de maior porte tendem a apresentar maiores pesos testiculares.
57
NISHIMURA et al. (2000) estudando o desenvolvimento testicular de caprinos
nativos japoneses (Tokara), animais que não apresentam estacionalidade, demonstraram que o
peso dos testículos não variou dos 12 aos 24 meses de idade, pesando em média 127 g (ambos
testículos). Estes resultados foram semelhantes aos encontrados no presente estudo durante o
período seco, que por sua vez foram superiores aos encontrados durante o período chuvoso.
Estudos conduzidos em três raças de ovinos em clima temperado demonstraram que o
desenvolvimento testicular ocorreu até 17 – 19 meses de idade, e que esse crescimento sofreu
influencia da estação do ano em clima temperado, ou seja tiveram melhor desenvolvimento na
primavera e verão (MANDIKI et al., 1998). Os mesmos autores encontraram diferença de
desenvolvimento entre raças, sugerindo haver diferentes sensibilidades aos fatores ambientais.
No tocante às vesículas seminais (tabela 3), não foram observadas diferenças
significativas (P>0,05) entre os parâmetros de peso, espessura, largura e comprimento entre
os períodos seco e chuvoso. Estes resultados foram similares àqueles encontrados por
FERNANDES (1994), onde não foi observada diferença significativa entre o peso e o
comprimento das glândulas coletadas nos períodos seco e chuvoso no Nordeste do Brasil,
contudo, os lobos direito e esquerdo foram mais pesados (3,1 e 3,6 g respectivamente) que o
encontrado no presente trabalho. Concernente ao comprimento das glândulas vesiculares,
também apresentou dimensão inferior ao encontrado por FERNANDES (1994), em caprinos
SRD. Estes resultados demonstram que a biometria das glândulas vesiculares se mantém
constante durante os períodos do ano no semi-árido nordestino do Brasil em caprinos SRD. O
comprimento das vesículas seminais foram também similares aos citados por NÚÑEZ (1993)
que relatou uma variação de 2,5 a 4 cm, entretanto, os parâmetros de espessura (1 a 1,5 cm) e
largura (2 a 2,5 cm) foram inferiores.
O comprimento do pênis e ductos deferentes (tabela 4) diferiram
significativamente (P<0,05) entre os períodos do ano. O pênis apresentou maior comprimento
no período seco, todavia foi inferior ao citado por NÚÑEZ (1993). Já no que se refere aos
ductos deferentes maiores dimensões foram observadas no período chuvoso, porém foi
inferior ao relatado por NÚÑEZ (1993), onde o referido autor observou uma variação de 45 a
50 cm de comprimento em caprinos na Venezuela.
58
Os resultados deste experimento sugerem que as diferenças encontradas entre os
períodos seco e chuvoso, com melhores dimensões no período seco para a maioria dos
parâmetros analisados, devam-se em parte, a uma necessidade de melhor sobrevivência
durante o período de escassez de alimentos, demonstrando talvez uma maior adaptabilidade
dos caprinos nativos às condições de aridez do Nordeste do Brasil. Todavia, sugere-se que
durante o período seco os animais sejam levados para o abate apresentando três ou quatro
meses de idade a mais que aqueles do período chuvoso, podendo assim ter sido responsável
pelos melhores resultados para a maioria dos parâmetros serem encontrados no período seco.
Experimento 2: Ação do plasma seminal obtido durante a época seca ou chuvosa sobre a
viabilidade e morfologia dos espermatozóides epididimários de caprinos
O presente estudo demonstrou que maiores doses de plasma seminal de época seca
tiveram efeitos desfavoráveis sobre a sobrevivência espermática (PEM – tabela 1), sugerindo
que a presença ou ausência de alguns componentes bioquímicos no plasma seminal parecem
interferir na sobrevivência espermática. Variação na presença, ausência ou concentração
crítica de certos componentes, provavelmente proteínas, no plasma seminal podem ser
responsáveis pela variabilidade destes efeitos sobre a sobrevivência espermática (MAXWELL
& JOHNSON, 1999). CORTEEL (1980) detectou a ocorrência de modificações após
tratamento in vitro, causando possíveis variações no metabolismo e/ ou sobrevivência
espermática.
Alguns experimentos têm demonstrado que o plasma seminal melhora a
motilidade e a sobrevivência espermática (DOTT et al., 1979; AZIZ et al., 1998; TONIOLLI
& COMBARNOUS, 1998; CASTELLINI et al., 2000). Todavia, no presente estudo não foi
observado efeito do plasma seminal sobre a MIP. Resultados similares foram encontrados por
NUNES (1982), demonstrando que a adição do plasma seminal de estação sexual (época
reprodutiva) não modificou a motilidade dos espermatozóides epididimários durante as duas
horas de incubação a 37oC, em animais estudados em latitude norte.
NUNES (1982) sugeriu que o plasma seminal é capaz de eliminar espermatozóides
e que parte das secreções das glândulas acessórias provoca extensiva morte celular. Por outro
59
lado, o plasma seminal pode prevenir a descondensação da cromatina nuclear, intervindo
assim na transferência do genoma masculino (KVIST, 1980).
Os resultados relatados por NUNES (1982) demonstraram que o plasma seminal
de estação não sexual (época não reprodutiva) teve efeito deletério sobre as células
espermáticas. O autor concluiu que o plasma seminal de estação não sexual, por ser rico em
fosfolipase A2 secretada pelas glândulas bulbo-uretrais, apresentou uma ação prejudicial sobre
sobrevivência espermática. Todavia, o plasma seminal de época seca apresentou uma
tendência negativa sobre a sobrevivência espermática (PEM – tabela 1). Estudos mais
profundos, especialmente sobre os componentes bioquímicos do plasma seminal, são
necessários para elucidar o modo de ação do plasma seminal de época seca ou chuvosa de
caprinos criados no Nordeste do Brasil.
Sugere-se que os efeitos sobre as PEM podem ser similares aos efeitos do plasma
seminal sobre os espermatozóides provenientes do epidídimo durante a ejaculação. Alguns
estudos têm demonstrado que durante a passagem dos espermatozóides pela uretra, os
mesmos recebem secreção das ampolas vesiculares, vesículas seminais, próstata e bulbo-
uretrais, ou seja, durante a ejaculação os espermatozóides adquirem alterações significativas
na membrana espermática (HENAULT et al., 1995), na motilidade (DHAMI & SANHI,
1993; HENKEL et al., 1999), na estabilidade da cromatina nuclear (KVIST, 1980), na
capacidade de ligar-se à zona pelúcida (CALVETE et al., 1994) dentre outras alterações que
são importantes para a aquisição de sua capacidade fecundante (CAMPOS et al., 2000).
CASTELLINI et al. (2000) observaram que a baixa concentração de plasma
seminal no meio diluidor afetou positivamente a sobrevivência de espermatozóides de coelhos
e os parâmetros de motilidade, com o efeito aparecendo imediatamente após a coleta e
aumentando durante a incubação a 37oC. Os autores demonstraram que os espermatozóides de
coelhos quando lavados e ressuspensos no TRIS ou com um conteúdo extremamente baixo de
plasma seminal perderam a motilidade e a viabilidade dentro de 1 – 3 horas.
Neste experimento observou-se que a PEM e MIP permaneceram acima de 75% e
4,0 (dado não mostrado) respectivamente, demonstrando que a presença ou ausência do
plasma seminal aos 60 e 120 min de incubação a 37oC não interferiram na qualidade dos
60
espermatozóides epididimários de caprinos. Entretanto, CASTELLINI et al. (2000),
demonstraram que a presença do plasma seminal é necessária para uma melhor conservação
in vitro em coelhos.
No tocante à taxa de degradação da motilidade (TDM) expressos na tabela 2, não
foi observada diferença significativa entre os diferentes tratamentos (P>0,05). Entretanto, foi
constatada uma tendência para uma menor TDM após a adição de plasma seminal de época
chuvosa. CASTELLINI et al. (2000) observaram que a presença de uma grande quantidade de
plasma seminal no meio de diluição aumentou a resistência dos espermatozóides de coelhos
durante a estocagem in vitro, bem como, suas características de motilidade. Resultados
similares foram observados neste experimento, sugerindo-se que o plasma seminal aumentou
a resistência dos espermatozóides epididimários de caprinos.
A tabela 3 e figura 1 mostram que algumas morfologias espermáticas foram
provocadas pelo plasma seminal (NO, DC, GCD e PT). Pesquisas têm relatado que a
motilidade pode permanecer viável mesmo que a membrana plasmática e o acrossoma não
estejam íntegros (HAFEZ, 1995), necessitando-se, portanto da avaliação morfológica
espermática. AURICH et al. (1996) demonstraram que a adição de plasma seminal aos
espermatozóides congelados – descongelados de eqüinos aumentou a percentagem de células
com membrana espermática intacta quando comparado a não adição de plasma seminal.
Alguns estudos têm demonstrado que o plasma seminal inibe a reação acrossômica
(KATSKA et al., 1996), ou seja, preserva a integridade das membranas plasmática e
acrossômica (MAXWEEL et al., 1996; MAXWEEL et al., 1998; MAXWEEL & JOHNSON,
1999), bem como, preserva a estabilidade da cromatina nuclear do espermatozóide (KVIST &
ELIASSON, 1980).
Foi demonstrado que o plasma seminal continha substâncias antioxidantes que
preservaram a função espermática (VAN OVERVELD et al., 2000). Entretanto, no presente
experimento a adição de plasma seminal (30 µL) de época seca aumentou significativamente
os DC (tabela 3), sugerindo que alguns componentes “protetores” das membranas
espermáticas presentes no plasma seminal estejam em níveis mais baixos que o necessário
para prover uma proteção adequada. HAIDL et al. (1993) afirmaram que a adição de plasma
seminal aos espermatozóides epididimários humanos aumentou o número de células com
61
flagelos normais. Este experimento também demonstrou que a adição do plasma seminal
aumentou significativamente a PEM no tratamento10S (5 min) comparado ao controle (C),
(P<0,05) no qual a PEM foi maior após a adição de plasma seminal (10S) (tabela 1). Este
resultado sugere que apesar das características motoras não terem sido danificadas
significativamente, outras funções espermáticas, todavia poderiam ter sido afetadas, sugerindo
que a motilidade somente não é confiável para predizer a condição fisiológica do
espermatozóide (CHANTLER et al., 2000). A importância da análise morfológica dos
espermatozóides, constatada nos diversos experimentos, sugere interferência na fertilidade,
sendo esta mais diretamente relacionada com o aspecto morfológico celular que com a
motilidade (AZIZ et al., 1998).
Experimento 3: Viabilidade do sêmen caprino lavado e não lavado diluído em água de
coco e armazenado a 4 oC
Estudos têm demonstrado o efeito positivo da lavagem sobre a motilidade do
sêmen caprino, mostrando que a remoção do plasma seminal foi benéfica na preservação da
integridade dos espermatozóides após a congelação (MEMON et al., 1985). Pois as secreções
das glândulas bulbo-uretrais promoveram diminuição na PEM, deterioração na qualidade do
movimento, danos ao acrossoma e morte celular dos espermatozóides caprinos diluídos no
leite desnatado (PELLICER- RUBIO et al. 1997). No presente estudo, o efeito da presença do
plasma seminal sobre a MIP foi observada até as 48 h de conservação a 4oC, no período
chuvoso e 0h do período seco, apresentando resultados superiores no sêmen lavado (tabela 1).
No tocante a PEM, o efeito da presença do plasma seminal foi observado até 48 h do período
chuvoso e a 0, 24 e 72h no período seco (P< 0,001), onde resultados superiores foram
constatados no sêmen lavado (tabela 1). PELLICER-RUBIO & COMBARNOUS (1998)
sugerem que a deterioração do espermatozóide na presença das secreções das glândulas
bulbo-uretrais em caprinos é devido à catálise de triglicerídeos hidrolisáveis e que as proteínas
aumentam esta atividade.
RIGBY et al. (2001) demonstraram que no sêmen eqüino a centrifugação para
remoção do plasma seminal não teve efeito aparente sobre as características de motilidade
após 48 h de resfriamento a +5oC, ou seja, o sêmen não centrifugado (não lavado) foi
62
semelhante ao sêmen centrifugado (lavado) e adicionado de 20% de plasma seminal.
Resultado semelhante foi encontrado no presente trabalho, onde não se constatou diferença
entre o sêmen lavado e o não lavado após 48h de resfriamento (tabela 1) no período chuvoso e
seco (exceto sobre a PEM – 72h), demonstrando que após este período a presença ou ausência
de plasma seminal não interferiu na qualidade espermática, ou já interferiu ao máximo. Estes
resultados sugerem que o plasma seminal foi um fator negativo na conservação do sêmen,
sugerindo-se que alguns componentes presentes no plasma seminal poderiam ter interagido
com os constituintes do diluidor, possivelmente a gema de ovo, exercendo ação tóxica sobre
os espermatozóides, interferindo assim na sobrevivência espermática. Já foi demonstrado que
a adição de gema de ovo ao diluidor teve efeito benéfico sobre a PEM no sêmen ovino,
principalmente após rápido resfriamento do sêmen para 10 e 5oC (FISER & FAIRFULL,
1986). Também foi demonstrado que concentrações superiores a 1,5% de gema de ovo no
diluidor deprimiram a sobrevivência espermática na pós-descongelação do sêmen caprino não
lavado (RITAR & SALAMON, 1982). Todavia, alguns estudos indicam que a fração
lipoprotéica de baixa densidade da gema de ovo é a fonte de proteção do espermatozóide
ovino contra os efeitos do armazenamento a 5oC (WATSON & MARTIN, 1975). WATSON
(1981) observou que os fosfolipídios da fração lipoprotéica da gema de ovo favoreceram a
proteção da membrana da célula espermática e que o componente proteíco da fração
lipoprotéica da gema de ovo serviu para solubilizar o lipídio e ligá-lo à membrana da célula
(WATSON, 1981). Mais recentemente, MOUSSA et al. (2002) demonstraram que a fração
lipoprotéica da gema de ovo possui efetiva propriedade crioprotetora sobre os
espermatozóides congelados-descongelados de touros, pois melhor motilidade espermática foi
obtida com a adição da gema de ovo. No presente estudo foi evidente a eficiência da gema de
ovo na conservação do sêmen caprino, pois no sêmen lavado foram observados os melhores
índices de qualidade espermática.
AHMAD et al. (1996) demonstraram que a remoção do plasma seminal do sêmen
de búfalo favoreceu a viabilidade do mesmo quando diluído no leite desnatado-gema de ovo-
glicerol após incubação a 37oC. BEDFORD et al. (1995) constataram que durante a
conservação do sêmen eqüino a +5oC e diluído em diferentes diluidores foi observada
interação deletéria entre o plasma seminal e a gema de ovo. Esta diminuição na motilidade
causada pela gema de ovo foi particularmente prevalente após longo período de
armazenamento (BEDFORD et al., 1995). Também constataram que a centrifugação do
63
sêmen é essencial se a gema de ovo é adicionada ao diluidor. Assim, a remoção do plasma
seminal e adição de gema de ovo ao sêmen diluído no leite desnatado provê altas
percentagens de células móveis após 48 horas de incubação a +5oC (BEDFORD et al., 1995).
Resultado semelhante foi observado no presente estudo, pois uma maior PEM e MIP foi
obtida no sêmen lavado. BRINSKO et al. (2000) afirmaram que a centrifugação e remoção
parcial do plasma seminal antes do resfriamento e armazenamento foi benéfico para os
espermatozóides eqüinos que sofreram uma excessiva redução na motilidade espermática
progressiva, especialmente quando o sêmen é resfriado e armazenado por mais de 24 h.
Resultado semelhante foi observado no presente trabalho, pois dois animais só apresentaram
boa conservação por mais de 24 horas quando o plasma seminal foi removido, sendo também
observado que o sêmen do animal que não se conservava bem durante o período chuvoso (não
lavado), apresentava excelentes resultados no período seco. O mesmo efeito aconteceu com
outro animal que apresentou excelentes resultados no período chuvoso sendo que no período
seco não foi possível conservar o sêmen (não lavado) por 24h, podendo-se atribuir estes
resultados a uma possível variação individual entre os reprodutores. Há uma considerável
evidência que o resfriamento, entre outros processos, altera a função espermática e que alguns
64
No tocante a época de coleta do sêmen (seca ou chuvosa) foi verificada diferença
significativa (P<0,05), somente quanto à MIP tanto no sêmen lavado e não lavado a 0 e 24 h
de conservação (tabela 1). Estes resultados demonstraram que o período de coleta do sêmen
não interferiu significativamente sobre a conservação do mesmo, sugerindo que os
componentes do plasma seminal de caprinos no semi-árido nordestino do Brasil não variam
entre os períodos seco e chuvoso.
A época do ano afetou a TDM do sêmen lavado, onde uma menor degradação foi
observada no período seco, com 72h / 4oC (tabela 2). Referente ao tratamento dado ao sêmen
antes do resfriamento (lavagem ou não) uma degradação significativamente inferior (P<0,02)
foi constatada no sêmen lavado (tabela 2). Estes resultados também contribuem para
demonstrar o efeito deletério do plasma seminal sobre a MIP.
O efeito da época de coleta do sêmen (seca ou chuvosa) sobre a morfologia (NO,
DC e PT) do sêmen lavado e não lavado, sugerem que há ligeira diferença na composição do
plasma seminal entre as épocas citadas, pois LA FALCI et al, (2002) sugerem que o plasma
seminal contem diferentes fatores que interferem na manutenção da viabilidade espermática e
que modula sua função, que por sua vez pode ser controlada por mudanças estacionais.
ROCA et al. (1997) observaram que a presença do plasma seminal preservou o número de
células com integridade acrossômica, ou seja, um maior número de alterações foi observado
no sêmen lavado.
Estudos conduzidos por AZERÊDO et al. (2001) demonstraram que a maior
incidência de defeitos menores (que parecem não interferir na fecundação – GCD, flagelo
pouco encurvado) foram significativamente influenciados pela presença do plasma seminal e
da congelação. Todavia, segundo os mesmos autores, no sêmen fresco não foi observado
efeito da presença ou ausência do plasma seminal. Resultado semelhante foi encontrado neste
trabalho onde o efeito da presença ou ausência do plasma seminal só foi observado após 72 h
de conservação, na anormalidade DC (tabela 4) e somente na época chuvosa (P< 0,04).
NUNES (1982) encontrou aspectos positivos da presença do plasma seminal nos
espermatozóides submetidos à congelação. Assim, os resultados encontrados trabalho
sugerem que para o resfriamento do sêmen caprino a presença ou ausência do plasma seminal
65
parecem não interferir negativamente sobre a morfologia espermática. Isto pode levar o sêmen
a ser conservado sem a lavagem prévia do plasma seminal. Sendo provável que a lavagem
espermática remova tanto os componentes que favoreçam, quanto os que desfavoreçam a
sobrevivência espermática. Além disso, na prática não se utiliza o sêmen após longo período
de conservação (72 h), pois os valores de motilidade espermática se encontram abaixo dos
indicados para uso em inseminação artificial.
66
CONCLUSÕES
1. Os parâmetros morfométricos de caprinos tipo SRD criados na região semi-
árida do Nordeste do Brasil são inferiores aqueles citados na literatura internacional. Estes
resultados demonstraram que o processo de adaptação de raças exóticas trazidas pelos
colonizadores portugueses ao longo destes 500 anos provocou uma diminuição do porte dos
caprinos, tornando-os mais rústicos, mostrando, todavia, características reprodutivas
satisfatórias, mesmo durante as épocas de escassez de alimentos.
2. O plasma seminal de época seca ou chuvosa afeta a sobrevivência e a
morfologia espermática, sugerindo-se que o plasma seminal é importante para que os
espermatozóides epididimários adquiram modificações funcionais e estruturais essenciais para
sua capacidade fertilizante. Nesse mesmo sentido, demonstrou-se que o plasma seminal de
época seca apresentou efeito deletério sofre os espermatozóide epididimários e o de época
chuvosa efeito benéfico. Estudos complementares sobre a composição do plasma seminal,
principalmente a presença da fosfolipase A2, darão uma melhor compreensão destes efeitos
deletérios observados in vitro.
3. O período do ano no Nordeste do Brasil não interfere significativamente na
conservação do sêmen caprino de animais da raça Saanen, quando estes são submetidos ao
manejo intensivo de criação, todavia recomenda-se a lavagem do sêmen quando se deseja
uma melhor qualidade espermática, pois o melhor período do ano para o beneficiamento do
sêmen caprino foi a época chuvosa.
67
PERSPECTIVAS
1. A morfometria do trato genital poderá ser realizada em outras espécies, como
nos ovinos, e assim, verificar se a época do ano afeta a morfometria do trato genital dessa
espécie.
2. Apesar da diferença encontrada entre os tratamentos, a qualidade do sêmen não
lavado não o inviabiliza para uso em programas de inseminação artificial, sendo
recomendado, todavia, testes de fertilidade para comprovação da eficiência do sêmen
submetido ao processo de conservação.
3. Recomendamos que este estudo também seja realizado com sêmen congelado,
pois a comprovação de que o plasma seminal poderá não interferir significativamente na
fertilidade, facilitará o processo de conservação do sêmen caprino.
4. Estudos bioquímicos mais aprofundados necessitam ser realizados para verificar
se há diferença significativa entre a composição do plasma seminal de época seca ou chuvosa,
e caso haja, que época seria mais adequada para a realização da congelação do sêmen.
5. Estes estudos com sêmen deveriam ser realizados com caprinos tipo SRD e
assim verificar se a época do ano tem interferência sobre a conservação do sêmen.
68
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