MÉÉÉTODOS DE ANTODOS DE ANTODOS DE ANÁ...

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MMMMÉÉÉÉTODOS DE ANTODOS DE ANTODOS DE ANTODOS DE ANÁÁÁÁLISES LISES LISES LISES MICROBIOLMICROBIOLMICROBIOLMICROBIOLÓÓÓÓGICOS GICOS GICOS GICOS PARA CONTROLE DE PARA CONTROLE DE PARA CONTROLE DE PARA CONTROLE DE

QUALIDADE DE QUALIDADE DE QUALIDADE DE QUALIDADE DE ALIMENTOSALIMENTOSALIMENTOSALIMENTOS

Controle de Qualidade na indústria Alimentos

USFM- 19/09/2009

QUALIDADE DE QUALIDADE DE QUALIDADE DE QUALIDADE DE ALIMENTOSALIMENTOSALIMENTOSALIMENTOS

Controle de Qualidade na indústria Alimentos

USFM- 19/09/2009

Msc. Vania Tronco

VERUS SEGURANÇA AMBIENTAL E ALIMENTAR

ESCOLHA DOS MÉTODOS

DE ANÁLISES

FERRAMENTAS PARA GARANTIR A

QUALIDADE DA SUA PRODUÇÃO

ESCOLHA DOS MESCOLHA DOS MÉÉTODOS TODOS

DE ANDE ANÁÁLISESLISES

FERRAMENTAS PARA GARANTIR A FERRAMENTAS PARA GARANTIR A

QUALIDADE DA SUA PRODUQUALIDADE DA SUA PRODUÇÇÃOÃO

ANANANANÁÁÁÁLISES LISES LISES LISES MICROBIOLMICROBIOLMICROBIOLMICROBIOLÓÓÓÓGICAS SÃO GICAS SÃO GICAS SÃO GICAS SÃO FUNDAMENTAIS PARA:FUNDAMENTAIS PARA:FUNDAMENTAIS PARA:FUNDAMENTAIS PARA:

- qualidade geral dos alimentos produzidos

- medidas profiláticas

-comercialização no mercado internacional e

nacional

- segurança alimentar

- qualidade geral dos alimentos produzidos

- medidas profiláticas

-comercialização no mercado internacional e

nacional

EFICIÊNCIA E EFICIÊNCIA E EFICIÊNCIA E EFICIÊNCIA E

RAPIDEZRAPIDEZRAPIDEZRAPIDEZ

EFICIÊNCIA E EFICIÊNCIA E EFICIÊNCIA E EFICIÊNCIA E

RAPIDEZRAPIDEZRAPIDEZRAPIDEZ

medidas tomadas na hora certa

Garantia de resultados

medidas tomadas na hora certa

Garantia de resultados

Conceitos básicos de prevenção e controle da contaminação alimentar e doenças transmitidas

alimentos sugerem:

• Melhorar qualidade higiênica de alimentos crus (BPP ou BPA);

• BPF utilizando tecnologias de processamento adequadas;

• BP em toda a cadeia alimentar.....

GAP - Boas Práticas Agrícolas

GMP GMP -- Boas PrBoas Prááticas de Fabricaticas de Fabricaççãoão

SSOP /PPOH(Sanitation Standard Operating Procedures ) PROCEDIMENTOS PADRONIZADOS DE

OPERAÇÃO DE SANITIZAÇÃO:

PRP - Programa de Redução de Patógenos

NOVOS MNOVOS MNOVOS MNOVOS MÉÉÉÉTODOS PARA TODOS PARA TODOS PARA TODOS PARA ANANANANÁÁÁÁLISES DE ALIMENTOSLISES DE ALIMENTOSLISES DE ALIMENTOSLISES DE ALIMENTOSNOVOS MNOVOS MNOVOS MNOVOS MÉÉÉÉTODOS PARA TODOS PARA TODOS PARA TODOS PARA ANANANANÁÁÁÁLISES DE ALIMENTOSLISES DE ALIMENTOSLISES DE ALIMENTOSLISES DE ALIMENTOS

1. simplificação dos tradicionais

2. atividade enzimática

3. atividade antigênica

4. moleculares

5. combinação

- capacidade física operacional

-volume de testes analíticos

- rastreabilidade

- validações internacionais, nacionais e internas

-rapidez na liberação de resultados

-Capacidade e custo de estocagem

- custo / benefício

ESCOLHA DO MESCOLHA DO MESCOLHA DO MESCOLHA DO MÉÉÉÉTODO TODO TODO TODO DIAGNDIAGNDIAGNDIAGNÓÓÓÓSTICOSTICOSTICOSTICO

Métodos RápidosMétodos RápidosMétodoRápido

Por que utilizar?

RapidezSeletiv idade

Aprovação SensibilidadePraticidade

Escolha

Métodos rápidos:

• Vantagens em tempo de análise e liberação de

resultados analíticos

• Possibilidade de eliminar etapas de trabalho intensivo

• Potencial para automação

• Sempre cumprem com procedimentos de incubação

ainda necessariamente

• ELISA e PCR são dominantes

• Falta de um procedimento comum de validação

• A maioria apresenta dificuldade de aceitação para fins

oficiais

Métodos rápidos:

• Avanços em Métodos de Contagens de células viáveis• Miniaturização e Kits de Diagnóstico, Técnicas de

Identificação Bioquímica• Métodos baseados em anticorpos• Separação Imunomagnética • Ensasios baseados em ácidos nucleicos• Biosensores• Microships• Citometria de Fluxo• Técnicas baseadas em Bacteriófagos• ATP bioluminescência• Bioluminescência adenilato quinase• Riboprinter e Pulse-Field Gel Electroforese

Os Métodos Microbiológicos

podem ser divididos em:

�“tradicionais”

(“convencionais”)

�métodos rápidos

IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA pode

ser feita por avaliação

características microbianas

IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA pode

ser feita por avaliação

características microbianas

FENOTÍPICAS

GENOTÍPICAS

FENOTÍPICAS

GENOTÍPICAS

METODOLOGIAS METODOLOGIAS

DISPONDISPONÍÍVEISVEIS

- Metodologia tradicional

- Padrão ouro

- “Kits” prontos

- ELISA tradicional

- ELISA – kit visual

ou automatizado.

O QUE CONSIGO

VISUALIZAR !

FENOTFENOTÍÍPICASPICAS

Problemas com os métodos tradicionais:

�Sensibilidade insuficiente�Especificidade: nem sempre ocorre(podem

haver falsos negativos)�Repetibilidade: nem sempre se o teste for

repetido por um mesmo operador inúmeras vezes se obtém o mesmo resultado

�Reprodutibilidade: capacidade de gerar resultados estatísticamente iguais (nem sempre ocorre)

Métodos convencionais:

• Os métodos convencionais usam a cultura de microrganismos em placas contendo ágar

• São laboriosos e consomem muito tempo operacional

• 84% de todos os testes são baseados na contagem de células viáveis

• Requerem controle de agências regulatórias nacionais e internacionais para controle oficial

TRADICIONAL TRADICIONAL ––limitalimitaçções provões provááveis:veis:

Depende da integridade fisiológica bacteriana

- Injúria, alterações - processamento;

- Controles - meios de cultura, pessoal e

equipamentos e tempo.

- Quantidade/qualidade

- provas bioquímicas;

- Padrão de decisão

- Chaves dicotômicas

TRADICIONALTRADICIONAL

MULTIPLICIDADE DE ETAPAS

LIMITAÇÕES

TRADICIONALTRADICIONAL

Dependendo do no. de análises:

- perigo de contaminação cruzada;

- muitas etapas a serem validadas;

- limitada área física e pessoal.

LIMITAÇÕES

TRADICIONALTRADICIONAL

BIOINDICADORES - KITS

- maior no. análises/dia

- diminuição de etapas validadas

- menor perigo de contaminação

- devem ser aprovados/validados

Métodos rápidos alternativos como Técnica fluorogênica: adiciona o MUG ( 4 metil umbeliferil beta-D-glucoronídeo):

• Através da enzima beta-glucoronidase (maioria das cepas de E.coli) o MUG é transformado em uma umbiliferona fluorescente quando observada na luz ultravioleta de onda longa (após 24 hs)

• Aplicação prática: esta determinação éfundamental na avaliação da condição higiênica do processamento de alimentos( a técnica tradicional tubos(NMP) muito lenta pode durar até 5 dias!

Métodos para Contagens de microrganismos:baseados na multiplicação

microbiana

• Método tradicional (plaqueamento);• Método de plaqueamento em espiral;• Placas Compact Dry;• Placas de Petrifilm;• Placas do Simplate;• Métodos alternativos: para NMP (técnica

fluorogênica);• Métodos alternativos: adição de substratos

cromogênicos:(adição de X-Gal, X-Gluc., Salmon.-Gal no isolamento de microrganismos)

COMPACTCOMPACTDRYDRY

Enzimas cromogênicas:

revela características

específicos de um grupo,

gênero ou espécie.

Placas de Compact Dry:

- Prontas para uso

- Reduz as horas de trabalho.

- Permite aumento de produtividade e eficiência.

- Uso em análises de matérias primas ou produtos acabados como

alimentos, bebidas, carne e outros.

VANTAGENS DO COMPACT VANTAGENS DO COMPACT DRYDRY

� Shelf life de 18 a 24 meses sem refrigeração.

� Atende às BPL - maior segurança por possuir tampa.

� A amostra se difunde sozinha e rapidamente pela placa, sem

necessitar de difusores ou outros instrumentos.

� Sem limite de empilhamento - menor espaço na incubadora.

- Espaço tridimensional - excelente crescimento dos bolores e

leveduras.

- Facilidade para checar ou repicar as colônias - forma idêntica

ao que faria nas placas tradicionais.

- Rápida manipulação – sem etapas de preparação de meios

de cultura, esterilização de vidraria, etc.

- Manual traduzido em vários idiomas, inclusive português.

VANTAGENS DO COMPACT DRYVANTAGENS DO COMPACT DRY

DISPONIBILIDADE

TCContagem

total

YMBolores eleveduras

ECColif. totaise E. coli

CFColiformes

termotolerantes

O QUE POSSO ANALISAR?

TCContagem total

YMBolores eleveduras

O QUE POSSO ANALISAR?

CFColiformes fecais

ECColiformes totaise E. coli

COMO ANALISAR?

As placas já

possuem tudo o que

você precisa!

É só abrir e adicionar 1mL da amostra ou da diluição e incubar pelos tempos/temperaturas recomendados!

Compact Dry TCCompact Dry TC

Para contagem total

de bactérias viáveis.

BactBactéérias formam colôniasrias formam colônias vermelhasvermelhas

Resultados em

24 a 48 horas

Compact Dry YMCompact Dry YM

Contagem de bolores

e leveduras.

Leveduras formam colôniasLeveduras formam colônias azuis ou azuis ou verdesverdes

Resultados em

3 a 5 dias

Compact Dry ECCompact Dry EC

Contagem de coliformes

totais e E. coli

E. coliE. coli forma colônia forma colônia azul azul Coliformes totais formam colônias Coliformes totais formam colônias vermelhasvermelhas

Resultados em

24 horas

Compact Dry CFCompact Dry CF

Contagem de coliformes

totais

Coliformes totais formam colônias Coliformes totais formam colônias esverdeadasesverdeadas

Resultados em

18-24 horas

APROVAAPROVAÇÇÕESÕES

Certificado Performance Tested Method AOAC:

- Compact Dry EC:110402

-Compact Dry CF:110401

-- Compact Dry TC: 010404

- Compact Dry YM:100401

Monitoramento de HigieneMonitoramento de HigieneMonitoramento de HigieneMonitoramento de Higiene

• Necessidade de se desenvolver métodos de

tempo real para monitorar procedimentos de

limpeza e higienização(detecção de resíduos de

matéria orgânica e ATP de células bacterianas

• Métodos devem ser baratos, robustos

• ATP bioluminescência

Sistema detecta:�ATP residual em superfícies�A molécula de ATP pode ser encontrada em

células viáveis; células não microbianas (sangue, carne..)

�Sistema rápido para monitoramento de higiene de processos produtivos na indústria alimentícia

�Sistema preventivo para tomada de medidas rápidas e efetivas(resultado em tempo real)

PRINCPRINCÍÍPIO DO TESTEPIO DO TESTE

TECNOLOGIA TECNOLOGIA

DEDE

RECICLAGEM RECICLAGEM

ESTABILIDADE !ESTABILIDADE !

Mecanismo da reação�Luciferina (LH2)+ATP+Mg++______enzima

luciferase ____forma___complexo ELH2+AMP+PP

�Em presença de oxigênio temos: oxiluciferina+AMP +CO2+ LUZ (medida com Luminômetro)

• AMP (Adenosina Monofosfato)• ATP( Adenosina Trifosfato)• PP (Pirofosfato)• ELH2 (complexo luciferase-luciferina-AMP)

LUMITESTERLUMITESTER

Passar o aplicador LuciPac na superfície previamente definida

REALIZANDO O TESTEREALIZANDO O TESTE

Voltar o aplicador no tubo e injetar o pino para abrir a cápsula dos reagentes.

Agitar o LuciPac várias vezes para que o líquido escoe .

REALIZANDO O TESTEREALIZANDO O TESTE

Colocar o LuciPac na câmara do Lumitester, fechar a tampa.

ENTER

REALIZANDO O TESTEREALIZANDO O TESTE

LENDO O RESULTADO!LENDO O RESULTADO!

Limiar 1 ou inferior A (aceito)

Limiar >1 e < 2 B (atenção)

Limiar 2 excedido C (rejeitado)

ENTER – LEITURA EM 10 SEGUNDOS !

RESUMINDO ...RESUMINDO ...

LEITURA DOS RESULTADOS !

10”

Imunoensaios:

• ELISA (com tecnologias diversas),

Imunocromatografia

• Sistemas totalmente automatizados

• Novos anticorpos recombinantes e técnicas de

impressão molecular para melhorar a

sensibilidade e versatilidade

Devem possuir

APROVAÇÃO !

FENOTFENOTÍÍPICASPICAS

ELISA KITELISA KIT

- Resultados - qualidade dos anticorpos;

- sensibilidade x especificidade;

- Relação quantitativa Ag x Ac – variabilidade;

- Nível de detecção – pode variar com o sorovar.

FACILITAM A ROTINA TESTES DE TRIAGEM !

ELISA ELISA -- KITKIT

- Resultados devem ser confirmados;

- Versatilidade quanto aos alvos;

- Capacidade operacional compatível

com o número de análises necessárias.

- LIMITAÇÕES - falsos positivos??

ELISA ELISA -- KITKIT

Fundamento dos testes ELISA:

REAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO• ELISA: Ensaios Imunoabsorventes de Enzima Ligada

1. Se adiciona a amostra suspeita

2. Ac primários não são facilmente removíveis da fase sólida

3. No caso de ser positiva, os Ag ficam presos aos Ac primários fixados

4. Ac primários selecionados se fixam

5. Se adicionan Ac secundários marcados com enzima contra Ag buscados

6. Os Ac secundários se unen ao AG

7. Se libera substrato complementar a enzima

8. Se o conjugado se formou, reage com o substrato por colorimetría

Lateral Flow System para

Listeria, Salmonellae E.coli O 157

Lateral Flow System para

Listeria, Salmonellae E.coli O 157

LFS™ Listeria sp

DuPont

Resultados em 40 a 42 horas.

Amostra +

meio LFS

suplemento

Incube

a 30ºC -

40 – 48

horas.

Ferva em BM por 5

minutos.

Adicione a fita LFS e aguarde 10 min.

Adicione a

amostra ao tubo.

Retire a fita e realize

a leitura.

(-)

(+)

LFS Listeria

LFS™ Listeria sp – minimize

etapas com confiabilidade

LFS™ E. Coli O:157rapidez na triagem

Resultado em 8 a 18 horas

LFS™ E. Coli O157resultados em 8 hs

Pese a

amostra

no meio

LFS.

Incube

a 42ºC

por 8 a

18 hs.

Ferva

em BM

por 5

minutos.

Adicione

a fita

LFS no

tubo

Adicione

0,5mL ao

tubo de

prova.

Após 10 min.

realize a leitura.

LFS Listeria

LFS™Salmonella

Resultados em

27 horas

LFS™ Salmonella

Amostra +

o meio

LFS

Incube

a 42oC /

8 a 18

hs.

Adicione

1mL do

TT Hajna

ao tubo.

Ponha a

fita LFS

no tubo.

Repique

1mL em TT

Hajna, -19

hs/42oC

Após 10 min

realize a leitura.

Teste de ELISA (lateral flow system):

MÉTODOS GENOTÍPICOS

- Segurança e rapidez nos resultados.

- Disponível para patógenos e bioindicadores.

METODOLOGIAS

DISPONÍVEIS

GENOTÍPICAS

- PCR tradicional

- PCR automatizado

- PCR “real time”

EFICIÊNCIA NA

DETECÇÃO !

- Dependente da seleção e qualidade do “primer”

- Necessidade de otimização das reações;

- Muitas e delicadas etapas.

GENOTÍPICOS – PCR tradicional

INCOMPATÍVEL COM A ROTINA DE UMA INDÚSTRIA

- Mão de obra especializada; ambiente adequado;

- Perigo de contaminação.

GENOTÍPICOS

PCR

tradicional

BAX SYSTEM

AUTOMATIZADO

UM MUNDO DE INOVAÇÕES

TECNOLÓGICAS DISPONÍVEL

PARA A GARANTIA DOS

ALIMENTOS !

- “Primers” já testados e validados;

- Aprovações e validações.PESQUISAS CONSTANTES GARANTINDO DIFERENÇAS

TECNOLÓGICAS !

BAX BAX –– PCR automatizadoPCR automatizado

Qualitativo /QuantitativoQualitativo /Quantitativo

FACILITA A ROTINA E DIMINUI INTERFERÊNCIAS !

Método de PCR para análises de patógenos

BAX SystemBAX System®®

Detecção de DNA ou RNA

• PCR automatizado

• PCR em tempo real

EFICIÊNCIA NA

DETECÇÃO !

BAXBAX®® SYSTEMSYSTEM

METODOLOGIAS

DISPONÍVEIS

GENOTÍPICAS

- PCR tradicional

- PCR automatizado

- PCR “real time”

EFICIÊNCIA NA

DETECÇÃO !

• “Primers” testados e validados;

• Aprovações e validações.

• PESQUISAS CONSTANTES

GARANTINDO DIFERENÇAS

TECNOLÓGICAS !

FACILITA A ROTINA

E DIMINUI INTERFERÊNCIAS !

BAXBAX®® SYSTEMSYSTEM

ETAPAS

- Pré-enriquecimento;

- Extração do DNA;

- Amplificação;

Resultados rastreáveis

POUCAS ETAPAS = MENOR no. DE CONTROLES E

VALIDAÇÕES INTERNAS

BAXBAX®® SYSTEMSYSTEM

Método automatizado e simplificado

•1. Prepare o DNA

•2. Amplifique o DNA

•3. Detecte o DNA

O que acontece com os tubos no Bax®?

INTRODUÇÃO

- O que é PCR?

Reação em Cadeia da Polimerase

Desenvolvido em 1983 por Kary Mullis.

Prêmio Nobel em Química – 1993;

Cópias idênticas de determinada sequência de

DNA

CONCEITOS - PCR

ANÁLISE

GENOTÍPICA

ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTATCCCAGAT

TAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGATATCTGCT

CONCEITOS - PCR

Cópias identicas da sequência

de DNA alvo

PRIMER

• Sequência especifica - sequencia do DNA alvo;

• Regiões altamente conservadas.

ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTATCCCAGAT

TAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGATATCTGCT

PRIMERS

Aumento da temperatura

ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTATAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGAT

TAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGAT

ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTA

Com o aumento da temperatura, a fita de Com o aumento da temperatura, a fita de DNA se separa.DNA se separa.

Como ocorre a reação?

Com a queda da temperatura, os primers Com a queda da temperatura, os primers se ligam a fita de DNA complementar.se ligam a fita de DNA complementar.

ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTATCCCAGAT

TAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGATATCTGCT

Temperatura mais Baixa

Como ocorre a reação?

Polimerase deDNA

dNTPs

Polimerase deDNA

ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTATCCCAGAT

AC A

Iniciador

Molécula de DNA en cuestión

TAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGATATCTGCT

ACA

Com o auxCom o auxíílio da Taq polimerase e os dNTPs a lio da Taq polimerase e os dNTPs a ccóópia da fita pia da fita éé iniciadainiciada

Como ocorre a reação?

2 cópias exatas da molécula de

DNA em questão

ATCTGCTGCTAATCCGATACGTGTCCCAAGGGTCTATAGACGACGATTAGGCTATGCACAGGGTTCCCAGAT

AmplificaçãoDe uma molDe uma moléécula de DNA cula de DNA

obtobtéémm--se 02 molse 02 molééculas idênticas!!culas idênticas!!

- “Primers” já testados e

validados;

- Aprovações e validações.

PESQUISAS CONSTANTES

GARANTINDO DIFERENÇAS

TECNOLÓGICAS !

BAX® SYSTEMSYSTEM

Qualitativo /QuantitativoQualitativo /Quantitativo

FACILITA A ROTINA E DIMINUI INTERFERÊNCIAS !

TRANSCRIPTASE

REVERSA - rRNA

RiboPrinter® System• Perfil genético Ribogrupo da bactéria ou

bolores e leveduras;• Técnica “Southern Blot” resultados em 8hrs;

• Biblioteca Nacional – Lanagro / MAPA;• Biblioteca atualizável – Mundial!

Como o RiboPrinter® System Funciona

COMO FUNCIONA:

• O DNA purificado sofre cortes por ação enzimática ( EcoRI ou PstI ou PvulI), neste processo de preparação do DNA.

• LISE – rompe a célula• DESPROTEINIZAÇÃO– limpa

debris• DIGESTÃO – enzima de

restrição (e.g., EcoRI) “corta”DNA em fragmentos específicos.

O QUE ACONTECE:

COMO FUNCIONA:

• Os fragmentos de DNA resultantes da ação enzimática são separados (por peso molecular) pelo processo de eletroforese em gel de agarose e transferidos para a membrana (Southern Blot), onde sofrem hibridização com a sonda de hibridização fluorescente, a qual seleciona os fragmentos originários da ação das enzimas de restrição.

COMO FUNCIONA:

• Os fragmentos ficam fixados na membrana e então a câmara CCD registra a imagem da membrana.

• É feita análise e interpretação dos dados.

Imagem Digitalizada

RiboPrint® Patterns Demonstra Claramente a Diferenciação

Identificação & Caracterização

Resultados:

• Após 8 horas têm-se a “impressão digital da bactéria”, sendo

possível identificar a real fonte de contaminação, melhorar ação de antibióticos mais específicos, fazer um estudo completo e confiável da taxonomia bacteriana e muito mais.

INDÚSTRIA ALIMENTOS NECESSITA MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS QUE SEJAM:

• Precisos

• Rápidos

• Fáceis de utilizar

• Flexíveis

• Confiáveis

• Econômicos

• Acompanhamento e suporte técnicos contínuos

VANTAGENS DOS MÉTODOS RÁPIDOS:

• Especificidade e confiabilidade;

• Aprovações e aceitações internacionais;

• Acompanhamento oficial de desempenho;