Novas tecnologias para o diagnóstico da TB Ensaio da carga...

Novas tecnologias para o diagnóstico da TB

&

Ensaio da carga bacteriana molecular para o controlo do tratamento da TB

Khalide Azam

Maputo, 08 de Novembro de 2017

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Conteúdo da apresentação

Há mais de 1 século ...

Novas tecnologias para o diagnóstico laboratorial da TB

Ensaio da carga bacteriana molecular

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Há mais de 1 século ...

1882: Robert Koch 1882: Franz Ziehl & Friedrich Neelsen

Descrição do M. tuberculosis Invenção da coloração Ziehl-Neelsen

1931 Lowestein & 1932 Jensen

Cultura sólida (padrão-ouro)

1938: Hagemann

Uso da Auramina O na microscopia de

fluorescencia

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Novas tecnologias para o diagnóstico da TB endossadas pela

OMS nos últimos 10 anos

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2007: Cultura liquida BD MGIT 960

• Multiplica e isola as micobactérias

• Tempo de resposta longo

• Susceptível a contaminação

• Requer especiação

• Amostras pulmonares e extrapulmonares

• Permite a realização dos TSA

• Laboratórios de contenção de risco

• Padrão-ouro !!!

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2008: Line Probe Assay (LPA)- Genotype MTBDRplus -

• PCR baseado no ADN da bactéria

• Complexo MTB + Rifampicina e Isoniazida

• Resultado em 2-7 dias

• Amostras de expectoração positivas

• Requer salas específicas

• Pessoal altamente treinado

• Custo elevado (baixo que Xpert)

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2010: GeneXpert® MTB/RIF

• PCR baseado no ADN da bactéria

• Complexo MTB e Rifampicina

• Resultados em 1-2 dias

• Laboratórios de baixo risco

• Exigências operacionais (AC, UPS, calibração)

• Não recomendado para controlo de tratamento

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2011: Interferon-gamma release assay (IGRAs)- QuantiFERON-TB Gold-in Tube & T-SPOT.TB -

• ELISA baseado em sangue total

• Resultado em 24 horas

• Não distingue TB latente e TB activa

• Sensibilidade(~80%), especificidade(~70%)

• Custo elevado e complexo

• Não recomendado a substituir o PPD em países com baixosrecursos (alto peso TB e/ou HIV)

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2015: Lateral Flow – Urine Lipoarabinomanan Assay (LF-LAM)

• Teste rápido (25 minutos)

• Amostra de urina (60μL)

• Diagnóstico de TB activa em 2 grupos:

✓ PVHIV com sinais e sintomas de TB e CD4 ≤100 cells/μL

✓ PVHIV gravemente doente* independente de CD4 ouCD4 desconhecido

* frequência respiratória >30/min; 39°C, frequência cardíaca > 120/min; incapaz de andar sem ajuda

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2016: Loop-mediated isothermal amplification (TB-LAMP)

• PCR, menos 2 horas

• Laboratório de baixo risco - POC

• Diagnóstico da TB activa

• Amostra de expectoração

• Usado para adultos e crianças

• Valor desconhecido em PVHIV com sinais e sintomas de TB

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2016: Line Probe Assay (LPA)- Genotype MTBDRsl -

• Teste inicial em pacientes TB RIFresistente ou TB MR para detectarresistência a fluoroquinolonas e drogasinjectáveis de 2a linha, em vez de TSAfenotípico baseado em cultura

• Necessidade de TSA fenotípico paraconfirmar resistências a outras drogase monitorar a emergência de drogasresistentes durante o tratamento.

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Ensaio da carga bacteriana molecular para o controlo do

tratamento da TB

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Ensaio da carga bacteriana molecular (MBLA)

• Detecção de MTB 16S rRNA por qPCR

• Específico de MTB, não susceptível a contaminação

• Curvas padrão para quantificar a carga bacteriana

• Mede a mudança na carga bacteriana à medida que o paciente responde à terapia anti-TB

• A queda na carga bacteriana corresponde ao aumento do tempo para a positividade da cultura MGIT (TTP)

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Como o MBLA funciona?

Car

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TTP

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Tempo (semanas)

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Métodos

• 4 Locais: Maputo (Moçambique), Blantyre (Malawi), Mbeyae Moshi (Tanzania)

• 178 pacientes - baciloscopia ou Xpert MTB / RIF positivo

• Cultura (MGIT, LJ) tempo de positividade (TTP) vs (MBLA) -12 semanas (3 meses) acompanhamento

• Regime de tratamento (% dos pacientes):

• RHZE (68%), HRZQ (9%), HR20ZQ (9%), HR35ZE (10%), HR20ZM (10%)

• 1768 amostras analisadas em série

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Definições

• Resposta ao tratamento: mudança na carga bacteriana outempo de positividade da cultura

• Carga bacteriana: Taxa de alteração na carga bacterianadurante o período de tratamento

• Conversão: carga bacteriana zero ou cultura negativa semreversão para positivo durante o tratamento

• Falência: positividade da cultura no 5 ou 6 mês

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Resultados

• Gênero : 128 (72%) masculinos, 50 (28%) femininos

• HIV: 47 (26.4%) positivos

• TB Sensível: 164 (92%)

• TB Resistente

• 7 (4%) Z monoresistente

• 3 (1.7%) HZ poliresistente

• 4 (2.5%) MDR

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Reproducibilidade do MBLA nos laboratórios

Car

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0 C

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MBLA vs TTP Cultura líquidaC

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Visita de tratamento (semanas) Visita de tratamento (semanas)

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Inconsistência: MBLA vs Cultura líquidaC

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l)

Visita de tratamento (semanas) Visita de tratamento (semanas)

MBLA MGIT

Tem

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Cultura líquida perdido por contaminação

Time on treatment (weeks)

Pro

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de

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(%)

Visita de tratamento (semanas)

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Resposta ao tratamento

• A carga bacteriana (CB) diminuiu de 5,6 ± 1,3 na linha de base para 0,7 ± 0,4 log10CFU/ml na semana 12 do tratamento

• O TTP MGIT aumentou de 5 dias na linha de base para 25 dias na semana 12

• O declínio da CB foi correlacionada ao aumento do TTP Cultura líquida, p <0,001 (correlação de Spearmans)

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Resposta ao tratamento

• A carga bacteriana perdida foi de 0,7 ± 0,4 log10CFU/ml /semana

• 46% resposta rápida: 1,4 ± 0,4log10CFU/ml/semana

• 54% resposta lenta: 0,4 ± 0,4 log10CFU/ml/semana

• Resposta por perfil de resistência:

✓ TB susceptível: 0,6 ± 0,2 log10CFU / ml / semana

✓ Monoresistente (Z) TB: 0,7 ± 0,4log10CFU / ml / semana

✓ Poliresistente (HZ): 0,7 ± 0,3 log10CFU/ml/semana

✓MDR (RHZE): TB: 0,5 ± 0,1log10CFU/ml/semana

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Desfecho do tratamento

• 63% Curados (cultura negativa aos 5 e 6 meses)

• 27% Contaminados - Situação da TB desconhecida aos 5 e 6 meses

• 10% (17) Falência de tratamento (cultura positiva aos 5 e 6 meses)

Destes, os resultados na semana 8 foram:

✓ MBLA: 53% (9/17) como TB positivo

✓ MGIT: 12% (2/17) como TB positivo

✓ LJ: 0% (0/17) como TB positivo

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Conclusões

• Métodos rápidos para o diagnóstico e controlo detratamento da tuberculose são uma necessidade

•O MBLA:

✓ Determina a carga bacteriana e resposta ao tratamentoem tempo real

✓ Reproduzível em diferentes configurações laboratoriais

✓ Não necessita de testes extras para confirmar oresultado

✓ Baixa necessidade de biossegurança, poderia serrealizada em laboratórios de baciloscopia.

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Agradecimentos

• University of St. Andrews, UK

• University College London, UK

• University of Liverpool, UK

• University of Leicester, UK

• University of Munich, Germany

• Radboud University, Netherlands

• Instituto Nacional de Saúde, Mozambique

• Kilimanjaro Clinical Research Institute, TZ

• Mbeya Medical Research Institute, TZ

• College of Medicine, Malawi

PANBIOME consórcio

• Prof. Stephen H Gillespie, Dr. Wilber Sabiiti & Dr. Gerry Davies, United Kingdom

• Dr. Ilesh Jani, Dr. Nilesh Bhatt, Dr CelsoKhosa, Mr. Khalide Azam & Dr. Sofia Viegas, Mozambique

• Prof. Gibson Kibiki, Dr. Nyanda Elias Ntinginya, Mr. Davis Kuchaka & Mr. BarikiMtafya, Tanzania

• Dr. Margaret Khonga, Dr. Elizabeth Kampira, Mr. Aaron Mdolo & Ms. Mercy Kamdolozi, Malawi

Equipa de pesquisa

• Pacientes

Obrigado pela atenção